JPH02173000A - ネオ糖タンパク質およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ネオ糖タンパク質の合成および使用に関する
。モノシアロラクトースおよびジシアロラクトースは、
牛初乳（ｂｏｖｉｎｅ　ｃｏｌｏｓむｒｕｍ）から単離
され、そしてカップリング剤により担体タンパク質とし
てのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合される。ネオ
糖タンパク質はワクチンとして、そして更にレクチン発
現性腫ｙ１（Ｉｅｃｔｉｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｔ
ｕｍｏｒ）の部位検出および治療用のリガンドとして適
している。

ガングリオシド、すなわちジアール酸を含有するグリコ
スフィンゴ脂質は疎水性セラミド部分と親水性炭水化物
とで構成される原形質膜脂質（ｐｌａｓｍａ　ｍｅｍｂ
ｒａｎｅ　１ｉｐｉｄｓ）である。グリコスフィンゴ脂
質はスフィンゴシンと長鎖脂肪酸とで構成されるセラミ
ド部分により外側原形質膜にそのオリゴサツカライド鎖
が細胞外空間に突出するように係留されている。それら
は細胞表面に細胞を区別する種特異的なパターン形成す
ることから、それらは細胞事象において生物学的に重要
な機能を有していると考えられ、る。

グリコスフィンゴ脂質はすべての哺乳動物細胞に典型的
なものであるが、はんの小量しか通常は存在しない。ジ
アール酸を含有するグリコスフィンゴリピド、すなわち
ガングリオシドは、ニューロン原形質膜上に特に集中し
ている。ガングリオシドはまた神経外胚葉起源の腫瘍（
例えば黒色腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫など）の細胞
表面に強力に発現する。これらガングリオシドの一部は
正常哺乳動物細胞上に存在するが、そのほか脳および神
経線維にも、比較的小量にしかすぎないが存在するもの
である。このため関連のガングリオシドＧＭ２、ＧＩ４
３、ＣＤ２およびＧＤ３が腫瘍関連抗原として興味深い
ものとなってきている。これらのガングリオシドを標的
抗原とする神経外胚葉起原の腫瘍の腫瘍免疫療法の可能
性も様々な研究陣により研究されつつある。今日まで２
つの異なるアプローチがとられ、幾分の成功を収めてい
る。

１、適宜のガングリオシドに対する単クローン抗体の使
用、および ２、適宜のガングリオシドによる能動免疫。

精製０Ｍ２ガングリオシドに対する抗体は黒色腫患者に
おいては生じ得ないことが研究により示された。バチル
ス・カルメツドーグニリン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａｌ
ｍｅｔｔｅ−Ｇｕ６ｒｉｎ　；　ＢＣＧ）またはサルモ
ネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｎｎｅｓ
ｏｔａ）などのアジュバントが用いられそして患者をシ
クロホスファミドで前処理してはじめてガングリオシド
ＧＭ２に対するＩｇＭ抗体が誘発された（　Ｌｉｖｉｎ
−ｇｓｔｏｎ　ａｔ　ａｌ、　（１９８７）　、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８４゜２９１１〜２
９１５）。更に、ＧＭ２ガングリオシド含量の高いヒト
またはマウス黒色腫または星状細胞腫細胞系統より成る
全細胞ワクチンを黒色腫患者に注射したところ１ｇＭア
イソタイプの抗−ＧＭ２抗体が誘導された（Ｌｉｖｉｎ
ｇｓｔｏｎ　ｅＬ　ａｌ、１ｏｃ。

ｃ１１、）。

黒色腫患者についての今日までの研究は、ガングリオシ
ドＧＭ２に対する抗体の力価増大が生存時間の増大と相
関することを示している。

ガングリオシドワクチンを設計する上での主たる問題は
精製ガングリオシドの免疫原性が低い点およびそれらを
単離することの困難さである。ガングリオシドＧＭ３お
よびＧ（）３の糖部分、すなわちそれぞれモノシアロラ
クトースおよびジシアロラクトースが牛初乳から容易に
取得され得ることも知られていた。我々は、カプリング
試薬によりＩＳＡに結合させたモノシアロラクトースお
よびジシアロラクトースがそれぞれガングリオシドＧ）
４３およびＧＤ３に対して生成させた単クローン抗体と
反応することを見出した。逆に、前述のネオ糖タンパク
質はガングリオシドＧＭ３およびＣＤ３と反応する抗体
を生成させることができ、従って特異的睡瘍免疫療法の
ためのワクチンとして適している。更に、それらは例え
ばレクチン発現性腫瘍組織の部位検出および治療のため
のリガンドとしても適している。

従って、本発明は、 ａ）グリコスフィンゴ脂質の糖部分、好ましくはモノシ
アロラクトースまたはジシアロラクトースと酵素を含む
担体タンパク質、好ましくはヒト血清アルブミンとより
成るネオ糖タンパク質、 ｂ）好ましい出発物質が糖源としての牛初乳であるその
製造方法、 Ｃ）および、ワクチンとしての、あるいは例えば腫瘍診
断の一部としてのコンペテイテイプラジオイムノアツセ
イでガングリオシドを検出するための診断助剤としての
、またレクチン発現性腫瘍の治療また診断剤としての使
用 に関する。

本発明は更に、実施例および特許請求の範囲中に含まれ
る。

実施例 ■、牛初乳からのモノシアロラクトースおよびジシアロ
ラクトースの単離 牛初乳をｖ、Ｎ１ｃｏｌａｉの方法にわずかな改変を加
えて旭理した（ｖ、Ｎ１ｃｏｌａｉｘボン大学学位論文
、１９７１年）。

牛初乳（１ｏＱ）を遠心分離して脂肪を除きそしてタン
パク質を冷却下に５０％アセトンで沈澱させた。改めて
遠心分離、上溝を回転蒸発器でもとの１八。容になるま
で濃縮した。

粗製画分を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１５カラムに通して
塩を除き、そして糖陽性およびクロライド陰性画分を合
一し、濃縮した。個々の糖をＱ、１Ｍ　Ｔｒｉｓ／　Ｈ
ＣＱ緩衝液（ｐＨ７，５）中のＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ　Ａ−２５カラムでのイオン交換により塩化ナトリ
ウム勾配を用いて分離した。適宜の糖部分を合一し、濃
縮し、そして５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１５カラムに通し
て塩を除去した。

カラム後処理段階で得られた各画分中の糖の検出は、エ
ールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）およびアンスロン試験に
より、または溶媒混合物ピリジン／酢酸エチル／氷酢酸
／水（６：　３　：　１　：　３）を用いたシリカゲル
プレートでの薄層クロマトグラフィで分画しそしてその
プレートにレゾルシノールを噴霧することにより行った
。

２゜　カプリング剤５ＰＤＰによるモノシアロラクトー
スおよびジシアロラクトースのヒト血清アルブミン（Ｈ
ＳＡ）への結合 糖をタンパク質に結合させるにはいくつかの可能性があ
る。例えば糖をタンパク質の遊離ニブシロン−アミノ−
リジル基に直接結合させることもできれば、あるいはま
たホモ−またはへテロニ官能性カプリング剤を介して結
合させることもできる。

以下、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ
）グロピオネート（ＳＰＤＰ）をカプリング剤として用
いたカプリング反応を説明する。

反応工程は実質的に公表された方法（Ｊ、Ｃａｒｌ−ｓ
ｓｏｎ　ｅｔ　ａ！、（１９７８）、　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、Ｊ、１７３．７２３〜７３７）に対応する。

ａ）モノシアロラクトースおよびジシアロラクトースの
還元アミノ化 ナトリウムシアノボロハイドライドを添加したメタノー
ル性酢酸アンモニウム溶液中でモノシアロラクトースお
よびダシアロラクトース中のグルコースのＣ１原子を還
元アミノ化するためにＷｉｅｇａｎｄｔ法を用いた（Ｈ
，Ｗｉｅｇａｎｄｔ、　Ｗ、ＺｉｓｇＪａｒ。

（１９７４）Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、３５５．１１〜１８）。

還元アミノ化された糖誘導体はＢｉｏｇｅｌ　　Ｐ２カ
ラムで精製した。

以下％　Ｒ１およびＲ２は次の通り定義される：ル過剰
の５ＰＤＰを用いて行った。室温での反応時間は２〜１
２時間であった。

略　語・Ｇａｌ：　　　　ガラクトースＮｅｕＡｃ：　
　Ｎ−アセチルノイラミン酸ｂ）還元アミノ化糖と５Ｐ
ＤＰとの反応この誘導体化は０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩
衝液＋Ｏ，１Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７，５）中で３〜
５倍モ糖−ＮＨ，−５ＰＤＰ誘導体はＢｉｏｇｅｌ　Ｐ
ＺカラムでＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび未反応
５ＰＤＰから分離した。その誘導体に５ＰＤＰが混入し
ているときは、極性が漸増する溶媒混合物を用いて溶出
される小型シリカゲルカラムで付加的精製工程を行った
。

ｃ）　　ＩＳＡの５ＰＤＰとの反応 タンパク質誘導体化は糖誘導体化と同様の条件下０．１
Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）中、遊離ニゲシ
ロン−アミノリジル基に基づき、３〜５倍モル過剰の５
ＰＤＰを用いて行った。

反応は室温で行い、そして反応時間は１〜２時間であっ
た。

タンパク質−５ＰＤＰ誘導体は５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−
２５カラムにかけ以後の反応のための緩衝液（０，１Ｍ
燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６、Ｓ　ｍＭ　ＥＤＴＡ）
で溶出して分離した。

ｄ）　　ｌ５Ａ−ＳＰＤＰ誘導体の還元ｌ５Ａ−ＳＰＤ
Ｐ誘導体中に誘導体化により新たに導入されたジスルフ
ィド橋を２５ｍＭジチオトレイトールを添加した０、１
Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）、５　ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ中で還元し２−チオピリドンを除去した。タンパク質
の固有のジスルフィド橋はこれらの反応条件下では還元
されない。

還元されたＩＳＡ−５ＰＤＰ誘導体を、５ｅｐｈａｄｅ
ｘ　Ｇ−２５カラムにかけ０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ６）、５　ｍＭ　ＥＤＴＡを溶出緩衝液として
用いて分離した。

ｅ）糖およびタンパク質誘導体のカプリング還元された
ＩＳＡ−３ＰＤＰ誘導体を直ちに糖−ＮＨ，−５ＰＤＰ
誘導体と反応させた：糖−ＮＨ！−５ＰＤＰ誘導体はタ
ンパク質中のニブシロン−アミノリジル基に基づき２〜
５倍モル過剰で用い、そして反応時間は室温で２４〜４
８時間であった。

カプリング生成物またはネオ糖タンパク質は５ｅｐｈａ
ｄｅｘ　Ｇ−２５のカラムクロマトグラフィによる他の
反応生成物から分離した。

前述の手順においては、還元アミノ化種は５ＰＤＰを介
してタンパク質の遊離ニブシロン−アミノリジル基に結
合される。代替となるもう一つの可能性はタンパク質の
ジスルフィド橋を還元し、そしてそのシスティン残基の
遊離状態となったスルフヒドリル基に還元アミノ化種を
５ＰＤＰを介して結合させることである。

３、中間生成物同定のための検出方法 中間生成物同定のために次の検出方法を選択使用した： Ａ）モノシアロラクトースおよびジシアロラクトースお
よび相当する誘導体の場合 ａ）以下の溶媒すなわち ピリジン／酢酸エチル／氷酢酸／水（６：３：ｌ：３） クロロホルム／メタノール１０．２％水性塩化カルシウ
ム（６０：３５：８） 中のシリカゲルＧ−６０プレートでの薄層クロマトグラ
フィでの移動挙動における、および沃素蒸気、ニンヒド
リンおよびレゾルシノールによるバンドの染色性におけ
る還元アミノ化および５ＰＤＰ−誘導体化後の変化。

ｂ）　ノイラミン酸測定を１．２−ジアミノ−４，５−
ジメトキシベンゼンでわずかに改変しくＳ。

Ｈａｒａ　ａｔ　ａｌ、（１９８６）　Ｊ、Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒａｐｈｙ　３７７゜１１１−１１９）モして
２−チオピリドンをジチオトレイトールで脱離させるこ
とによる５ＰＤＰ　−誘導体化の定量。５ＰＤＰ−誘導
体化種の量に対応する２−チオピリドンの遊出量はラム
ダ−３４３ｎｍの波長における吸光度増加を光度計で測
定することにより測定でき、またその濃度はランバート
・ビーアの法則を用いて算出することができる。ラムダ
−３４３ｎｎ＋における２−チオピリドンのモル吸光係
数は７．０６Ｘ１０３Ｍ−’　Ｘ　ｃｍ−”である（Ｄ
、Ｒ，Ｇｒａｓｓｅｔｔｉ　＆　Ｊ、Ｆ。

Ｍｕｒｒａｙ、（１９６７）　Ａｒｃｈ、Ｂｊｏｃｈｅ
ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、ｌ１９゜４１〜４９）。

ｃ）　　Ｊ、Ｌｅｃｈｎｅｒ　ｅＬ　ａｌ、（１９８５
）Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０゜８６０〜８６６
の方法による、還元アミノ化および５ＰＤＰ−誘導体化
後の個々の糖誘導体のＧＣ分析。

Ｂ）　ＩＳＡの場合 ａ）　タンパク質測定はＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッ
セイを用いて行った。

ｂ）　　５ＰＤＰ誘導体化は、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク
質アッセイを用いたタンパク質測定、およびジチオトレ
イトールを用いた２−チオピリドンの脱離により定量し
た。結合５ＰＤＰ量に対応する放出２−チオピリドンは
波長ラムダ−３４３ｎｍにおける吸光度増加を光度計で
測定することにより測定し、そして濃度はランバート・
ベールの法則により算出した。λ−３４３ｎｍにおける
２−チオピリドンのモル吸光係数は７．０６ＸＩＯ″Ｍ
−’Ｘｃｍ−’である（ＧｒａｓｓｅｔＬｉ　＆　Ｍｕ
ｒｒａｙ。

１ｏｃ、ｃ１１、）。

ｃ）　　ＨＳＡおよびＨＳＡ−ＳＰＤＰ誘導体はＳＤＳ
ゲル電気泳動（クーマシープル染色）において異なる移
動挙動を示す。

４、ジシアロラクトースーＩＳＡ接合体（コンジュゲー
ト）の合成 特徴的な実験用混合物において、２ｍＱのメタノール性
酢酸アンモニウム溶液中のｌＯｒＩｒｇ（１０，７５μ
１ＩｏＩ２）のジシアロラクトースを２０ｍｇのナトリ
ウムシアノボロハイドライドを添加して還元アミノ化し
た。その還元アミノ化種をＢｉｏｇｅｌ　　Ｐ２カラム
で精製し、次いでｌ　３ｒｓＱの０．１Ｍ燐酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７，５）中で、１０５０μＱのエタノー
ルに溶解した１３ＩＩＩｇの５ＰＤＰと反応させ、そし
てジシアロラクトースーＮＨ，−５ＰＤＰ誘導体をＢｉ
ｏｇｅｌ　　Ｐ２カラムおよびシリカゲルカラムで精製
した。

１．２−ジアミノ−４，５−ジメトキシベンゼンによる
ノイラミン酸測定およびジチオトレイトールを用いた２
−チオピリドンの脱離により測定された収率はジシアロ
ラクトースの使用量の約５０％（４，８〜５．２ｕｍｏ
！：ｔ）であった。

ＩＳＡの誘導体化には、５．６１１１ｇの５ＰＤＰを４
５０μαのエタノールに溶解し、そして５５５０μａの
Ｏ，１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）中の６ｍ
ｇのＵＳＡに添加した。５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カ
ラムでの精製により、Ｉ（ＳＡ　１分子あたり４５〜５
３ＳＰＤＰ分子という誘導体化度を有する約４゜８１１
９のＩＳＡ　−５ＰＤＰ誘導体が得られた。

ＩＳＡ　−５ＰＤＰ誘導体中に新たに導入されたジスル
フィド橋は０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液＋５ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ（ｐＨ６）中の２５ｍＭジチオトレイトールを用
いて分解した。反応時間は室温で１時間であった。５ｅ
ｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラムでの精製後、還元された
ｌ５Ａ−ＳＰＤＰ誘導体を直ちに０．１Ｍ燐酸ナトリウ
ム緩衝液＋５　ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ６）中でジシアロ
ラクトースーＮＨ，−５ＰＤＰ誘導体と反応させた。そ
のカプリング反応は光度計で、２−チオピリドンの脱離
による波長ラムダ−３４３ｎｍにおける吸光度増によっ
てフォローすることができる。２４〜′４８時間後吸光
度の更なる増加はなく、カプリング反応は完了した。

カプリング生成物を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５で精製
することによりＩＳＡ　１分子あたり３０〜３３ジシア
ロラクト一ス分子で誘導体化された２、１〜２　、５１
１９のジシアロラクトースーＩＳＡ接合体が得られた。

カプリング生成物の誘導体化度は１．）Ｂｉｏ−Ｒａｄ
タンパク質アッセイを用いたタンパク質測定により、お
よび２ａ、）１．２−ジアミノ−４，５−ジメトキシベ
ンゼンを用いたカプリング生成物中のノイラミン酸の測
定により、ｂ）波長ラムダ−３４３ｎｍにおける吸光度
を測定しそして適宜のパラメータをランバート・ベール
式に代入することにより（最終カプリング段階における
）放出２−チオピリドンの濃度を算出することにより、
およびｃ）、ａ）およびｂ）に記載の方法を用いて回収
された未反応ジシアロラクトースーＮｌ’ｌ、−５ＰＤ
Ｐ誘導体の濃度を測定することにより測定した。

５、　ジシアロラクトースーＩＳＡ接合体の免疫学的反
応 カプリング生成物（ジシアロラクトースーＩＳＡ接合体
）を次いで、単りローン抗−ＧＤ３抗体を用いたＢｉｏ
−Ｄｏｔアッセイで試験した：　ｍＡｂ　７０４／１６
およびｍＡｂ　６２４／２５３　（いずれもＧＤ３ガン
グリオシドに対するもの）のいずれもがネオ糖タンパク
質と反応した。

また、非還元条件下での５ＤＳ−ゲル電気泳動および引
き続きウェスタンブロッティングを行った後も、単クロ
ーン抗体ｍＡｂ　７０４／１６およびｍＡｂ６２５／２
５３のジシアロラクトースーＩＳＡ接合体との反応を示
すことができた。

マウスでの免疫実験は、ジシアロラクトース−ＩＳＡ接
合体がＧＤ３ガングリオシドよりも相当に免疫原性が高
い、すなわち、より強い体液性免疫応答を誘発すること
を示した。

特許出願人　　ベーリングヴエルケ・アクチェンゲゼル
シャフト 外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）グリコスフインゴ脂質の糖部分が担体タンパク質に
   結合したネオ糖タンパク質。 ２）糖部分がモノシアローまたはジシアロラクトースで
   ある請求項１記載のネオ糖タンパク質。 ３）担体タンパク質がヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）で
   ある請求項１または２記載のネオ糖タンパク質。 ４）糖を担体タンパク質に結合させることにより成る請
   求項１、２または３記載のネオ糖タンパク質の製造方法
   。 ５）糖を担体タンパク質に共有結合的に結合させること
   より成る請求項１、２または３記載のネオ糖タンパク質
   の製造方法。 ６）ＳＰＤＰがカプリング剤として用いられる請求項５
   記載のネオ糖タンパク質の製造方法。 ７）牛初乳が糖源として用いられる請求項４、５または
   ６記載のネオ糖タンパク質の製造方法。 ８）請求項１、２または３記載の、または請求項４、５
   、６または７記載の方法で得られるネオ糖タンパク質の
   ワクチンとしての使用。 ９）請求項１、２または３記載の、または請求項４、５
   、６または７記載の方法で得られるネオ糖タンパク質の
   診断剤としての使用。 １０）請求項１、２または３記載のネオ糖タンパク質の
   ガングリオシド検出のためのコンペテイテイブラジオイ
   ムノアツセイへの使用。 １１）請求項１、２または３記載のネオ糖タンパク質を
   含有するワクチン。