JPH02174691A - モノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体Info
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- JPH02174691A JPH02174691A JP1243599A JP24359989A JPH02174691A JP H02174691 A JPH02174691 A JP H02174691A JP 1243599 A JP1243599 A JP 1243599A JP 24359989 A JP24359989 A JP 24359989A JP H02174691 A JPH02174691 A JP H02174691A
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- Japan
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- cell
- cells
- cancer
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はヒトの肺癌等の診断及び治療に有用なモノクロ
ーナル抗体に関する。
ーナル抗体に関する。
（従来の技術）
ＫＯｈｌｅｒ等の方法に基づき、癌に対するモノクロー
ナル抗体について種々の研究が行なわれており、ヒトの
癌の診断に利用しようとする試みが多くなされている。
ナル抗体について種々の研究が行なわれており、ヒトの
癌の診断に利用しようとする試みが多くなされている。
（発明が解決しようとする問題点）
現在のところ、ヒトの肺癌の診断用のモノクローナル抗
体の作成は多く試みられているが、その特異性において
実用的両値のあるモノクローナル抗体はまだ見出されて
いない。
体の作成は多く試みられているが、その特異性において
実用的両値のあるモノクローナル抗体はまだ見出されて
いない。
（問題点を解決するための手段）
本発明省らは、ヒトの癌特に肺癌の組織診断等に有用な
実用化可能な七ツクローナル抗体について鋭意研究を行
なった結果、本発明を完成した。
実用化可能な七ツクローナル抗体について鋭意研究を行
なった結果、本発明を完成した。
即ら本発明は、
「（１〉 ヒト肺小細胞癌に存在する２５Ｘ１０３タ
ルトンの分子ｍのタンパク質抗原と抗原抗体反応をし、
次の性質を有するｌｑＧ、アイソタイプに属するモノク
ロ−犬ル抗体Ｎ Ｅ −２５，。
ルトンの分子ｍのタンパク質抗原と抗原抗体反応をし、
次の性質を有するｌｑＧ、アイソタイプに属するモノク
ロ−犬ル抗体Ｎ Ｅ −２５，。
１ ヒトの肺小ｍ胞癌、神経膠腫及び神経芽細胞腫と反
応する。
応する。
２、ヒトの神経、甲状腺及びｎ１腎の正常組織と反応す
る。
る。
３ ヒＩ−の肺、食道、胃、小腸、大腸、腎臓の正常組
織と反応しない。
織と反応しない。
■ ヒトの正常上皮細胞及びＥ皮由来癌細胞に存在する
３５Ｘ１０３ダルトンの分子Ｍのタンパク質抗原と抗原
抗体反応をし、次の性質を有するＩ（ＪＧ１アイソタイ
プに属するＬツクローナル抗体ＰＥ−１、ヒトの肺癌、
胃癌、大腸癌、乳癌、肝胆道癌と反応する。
３５Ｘ１０３ダルトンの分子Ｍのタンパク質抗原と抗原
抗体反応をし、次の性質を有するＩ（ＪＧ１アイソタイ
プに属するＬツクローナル抗体ＰＥ−１、ヒトの肺癌、
胃癌、大腸癌、乳癌、肝胆道癌と反応する。
２、ヒトの神経膠腫、神経芽１１１胞腫、肉腫、リンパ
腫と反応しない。
腫と反応しない。
３ ヒトの肺、甲状腺、食道、胃、小腸、大腸の正常上
皮組織と反応する。」 に関するものである。
皮組織と反応する。」 に関するものである。
なお、以下の説明において述べる１１１１１１、組織等
は特にことわりのない限りと１・の細胞、組織等を示す
。
は特にことわりのない限りと１・の細胞、組織等を示す
。
本発明のＮＥ−２５抗体及びＰＥ−３５抗体のイムノグ
ロブリン（１（１）のアイソタイプはＩｑＧｌである。
ロブリン（１（１）のアイソタイプはＩｑＧｌである。
又、ＮＥ−２５抗体が反応する抗原（ＮＥ−２５抗原）
は肺小細胞癌に存在し、Ｎ［−２５抗原は２５Ｘ １０
”ダルトンの分子量のタンパク質抗原である。一方、Ｐ
Ｅ−３５抗体が反応する抗原（ＰＥ−３５抗原）は正常
上皮細胞及び上皮由来癌細胞に存在し、Ｐ Ｅ −３５
抗原は３５Ｘ １０３ダルトンの分子量のタンパク質抗
原である。
は肺小細胞癌に存在し、Ｎ［−２５抗原は２５Ｘ １０
”ダルトンの分子量のタンパク質抗原である。一方、Ｐ
Ｅ−３５抗体が反応する抗原（ＰＥ−３５抗原）は正常
上皮細胞及び上皮由来癌細胞に存在し、Ｐ Ｅ −３５
抗原は３５Ｘ １０３ダルトンの分子量のタンパク質抗
原である。
ＮＥ−２５抗体の各種培Ｉ！ｌｌｌ１胞株に対する反応
性については、肺小細胞癌に関しては大部分の細胞株で
陽性を示し、神経性腫１（神１１ Ｂ Ｍ及び神経芽細
胞腫）に関してはほとんど全ての細胞株で陽性を示す。
性については、肺小細胞癌に関しては大部分の細胞株で
陽性を示し、神経性腫１（神１１ Ｂ Ｍ及び神経芽細
胞腫）に関してはほとんど全ての細胞株で陽性を示す。
又、ＮＥ−２５抗体の各種腫瘍組織に対する反応性につ
いては、肺小ｍ胞癌に関しては大部分の症例で陽性を示
し、神経性！！瘍（神軽膠腫及び神経芽ＩＩＩ胞Ｉｌ！
＞に関してはほとんど全ての症例で陽性を示し、肺扁
平上皮癌、肺腺癌、肺大細胞癌に関してはほとんどの症
例で陰性を示す。ＮＥ−２５抗体の正常組織に対する反
応性については神経、甲状腺及びｎ１腎等と反応性がみ
られ、肺、食道、胃、小腸、大腸、腎臓等とは反応性が
認められない。
いては、肺小ｍ胞癌に関しては大部分の症例で陽性を示
し、神経性！！瘍（神軽膠腫及び神経芽ＩＩＩ胞Ｉｌ！
＞に関してはほとんど全ての症例で陽性を示し、肺扁
平上皮癌、肺腺癌、肺大細胞癌に関してはほとんどの症
例で陰性を示す。ＮＥ−２５抗体の正常組織に対する反
応性については神経、甲状腺及びｎ１腎等と反応性がみ
られ、肺、食道、胃、小腸、大腸、腎臓等とは反応性が
認められない。
一方、ＰＥ−３５抗体の各種培ｉｓ胞殊に対する反応性
については、肺小絹Ｉ１１癌、ｌｌ１Ｉｉ扁平上皮癌、
肺腺癌に関しては大部分のｍ胞株で陽性を示し、胃癌、
大腸癌、膵臓癌、肝胆道癌、乳癌、胃癌に関してはほと
んどの細胞株で陽性を示すが、神経性腫瘍（神経Ｂ腫及
び神経芽細胞腫）、肉腫、リンパ腫に関してはほとんど
全ての細胞株で陰性を示す。又、ＰＥ−３５抗体の各種
腫瘍組織に対する反応性については、肺癌、胃癌、大腸
癌、膵臓癌、肝ＩＩ［１道癌、乳癌に関してはほとんど
の症例で陽性を示し、神経性腫瘍（神経Ｆｉｔ！ｉ及び
神経芽細胞腫）肉腫、リンパ腫に関してはほとんど全て
の症例で陰性を示す。Ｐ Ｅ −３５抗体の正常組織に
対する反応性については、気管支、食道、胃、小腸、大
腸等の上皮や甲状腺と反応がみられた。
については、肺小絹Ｉ１１癌、ｌｌ１Ｉｉ扁平上皮癌、
肺腺癌に関しては大部分のｍ胞株で陽性を示し、胃癌、
大腸癌、膵臓癌、肝胆道癌、乳癌、胃癌に関してはほと
んどの細胞株で陽性を示すが、神経性腫瘍（神経Ｂ腫及
び神経芽細胞腫）、肉腫、リンパ腫に関してはほとんど
全ての細胞株で陰性を示す。又、ＰＥ−３５抗体の各種
腫瘍組織に対する反応性については、肺癌、胃癌、大腸
癌、膵臓癌、肝ＩＩ［１道癌、乳癌に関してはほとんど
の症例で陽性を示し、神経性腫瘍（神経Ｆｉｔ！ｉ及び
神経芽細胞腫）肉腫、リンパ腫に関してはほとんど全て
の症例で陰性を示す。Ｐ Ｅ −３５抗体の正常組織に
対する反応性については、気管支、食道、胃、小腸、大
腸等の上皮や甲状腺と反応がみられた。
ＮＥ−２５抗体はその正常組織及びＩＩｉ瘍組織組織け
る反応性より神経細胞及び神経内分泌＠胞への分化に伴
って表視される分化抗原を党議していると考えられ、一
方、Ｐ Ｅ −３５抗体は汎上皮性抗原とでも言うべき
抗原に反応性を示し、神経内分泌細胞への分化を示した
肺癌とされる肺小細胞癌。
る反応性より神経細胞及び神経内分泌＠胞への分化に伴
って表視される分化抗原を党議していると考えられ、一
方、Ｐ Ｅ −３５抗体は汎上皮性抗原とでも言うべき
抗原に反応性を示し、神経内分泌細胞への分化を示した
肺癌とされる肺小細胞癌。
大部分には両抗原が認められた。Ｎ Ｅ −２５抗体及
びＰＥ−３５抗体は肺癌の免疫１１織学的検査に有用な
抗体である。
びＰＥ−３５抗体は肺癌の免疫１１織学的検査に有用な
抗体である。
本発明のモノクローナル抗体は公知の方法例えハＫＯｈ
ｌｅｒとＨｉｌｓｔｅｉｎの方法［Ｎａｔｕｒｃ ２５
６．４９５−４９７ｆ１９７５）］やｕｅｄａらの方法
［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉＵＳＡ ７
８５１２２−５１２６（１９８１）］ ！：従ツｒ作製
ｔル、 トができる。
ｌｅｒとＨｉｌｓｔｅｉｎの方法［Ｎａｔｕｒｃ ２５
６．４９５−４９７ｆ１９７５）］やｕｅｄａらの方法
［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉＵＳＡ ７
８５１２２−５１２６（１９８１）］ ！：従ツｒ作製
ｔル、 トができる。
例えば本発明のモノクローナル抗体は次のようにして製
造することができる。本発明のモノクローナル抗体が認
識する抗原（例えば肺癌細胞、神経性腫［［１１１３１
等）でマウス又はクツｌ−等の動物を免疫し、免疫され
た動物から抗体産生細胞を得、これとミエローマ細胞と
を融合し、得られたハイブリドーマから本発明のモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これ
を培養し抗体を回収づる。免疫法、融合法、ハイブリド
ーマの選択、抗体の回収等は公知の常法により行なうこ
とができる。
造することができる。本発明のモノクローナル抗体が認
識する抗原（例えば肺癌細胞、神経性腫［［１１１３１
等）でマウス又はクツｌ−等の動物を免疫し、免疫され
た動物から抗体産生細胞を得、これとミエローマ細胞と
を融合し、得られたハイブリドーマから本発明のモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これ
を培養し抗体を回収づる。免疫法、融合法、ハイブリド
ーマの選択、抗体の回収等は公知の常法により行なうこ
とができる。
更に詳しくは、例えば次のようにして本発明の七ツクロ
ーナル抗体を製造することができる。
ーナル抗体を製造することができる。
まず、マウスを肺癌細胞、神経性腫瘍細胞等で免疫する
。免疫する動物はマウスに隔らず、ラット等のネズミ科
の動物又はその他の動物を使用してもよいが、通常はマ
ウスを用いることが好ましい。この免疫用マウスとして
は、ＢΔ１、Ｂ／ｃ系マウス、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスと
他系マウスとのＦ１マウス等が用いられる。
。免疫する動物はマウスに隔らず、ラット等のネズミ科
の動物又はその他の動物を使用してもよいが、通常はマ
ウスを用いることが好ましい。この免疫用マウスとして
は、ＢΔ１、Ｂ／ｃ系マウス、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスと
他系マウスとのＦ１マウス等が用いられる。
マウスに対して肺癌細胞等を数日〜数週間おきに数回接
種する。その後マウスより肺臓を１＆出し、常法により
牌細胞（抗体産生細胞を含む）を採取する。
種する。その後マウスより肺臓を１＆出し、常法により
牌細胞（抗体産生細胞を含む）を採取する。
ミエローマ細胞どしては同種の動物のものを用いること
が好ましく、マウス牌細胞を融合の相手とツる場合には
、マウスミエローマ細胞を用いる。
が好ましく、マウス牌細胞を融合の相手とツる場合には
、マウスミエローマ細胞を用いる。
ＦＡ ４に、 的ニ４３ ＨＯＰＣ−２１，ＮＳ／１
［Ｎａｔｕｒｅ、 ２５６．４９５−４０７（１９７５
）］ 、 ５Ｐ２１０−Ａ（１１４［Ｎａｔｕｒｅ、
２７７、１３１−１３３［（＋９７９１］ 、 ５１９
４１５．ＸＸＯ，ＢＵ、１ ［Ｊ、Ｅｘｐ、Ｈｅｄ、
ユ旦３１３−３２８（１９７８）］などが用いられる。
［Ｎａｔｕｒｅ、 ２５６．４９５−４０７（１９７５
）］ 、 ５Ｐ２１０−Ａ（１１４［Ｎａｔｕｒｅ、
２７７、１３１−１３３［（＋９７９１］ 、 ５１９
４１５．ＸＸＯ，ＢＵ、１ ［Ｊ、Ｅｘｐ、Ｈｅｄ、
ユ旦３１３−３２８（１９７８）］などが用いられる。
牌細胞とミエローマ細胞は１対 １〜１０対１の割合で
涙合し、融合は例えばＨａ（Ｊ！ （約０．８５％）
、ジメヂルスルホキシド［１０〜２０％（Ｖ／Ｖ） ］
および分子１１０００〜６０００のポリエチレングリコ
ールを含むリン酸緩衝液（ｐｌ＋７．２〜７．４）中で
行う。
涙合し、融合は例えばＨａ（Ｊ！ （約０．８５％）
、ジメヂルスルホキシド［１０〜２０％（Ｖ／Ｖ） ］
および分子１１０００〜６０００のポリエチレングリコ
ールを含むリン酸緩衝液（ｐｌ＋７．２〜７．４）中で
行う。
融合は例えば、両細胞を３５〜３７℃で１〜３分間イン
キュベートすることによって行う。
キュベートすることによって行う。
ハイブリドーマの選択は、例えばヒボキサンチン（１，
３〜１．４ ａｙ／ｄρ）、アミノプテリン（１８〜２
０埒／ｄρ）、チミジン（３７５〜４００埒／ｄｆ！＞
、ストレプトマイシン（５０〜１００ Ｍ／ｒｄ ）
、ペニシリン（５０〜１００１１ｉ位／ｄ）、グルタ
ミン（３，５〜４．０び／１）、牛胎児血清（１０〜２
０％）を含む基礎培地を用い、成育してくるｌｉｌ胞ど
して選択する。
３〜１．４ ａｙ／ｄρ）、アミノプテリン（１８〜２
０埒／ｄρ）、チミジン（３７５〜４００埒／ｄｆ！＞
、ストレプトマイシン（５０〜１００ Ｍ／ｒｄ ）
、ペニシリン（５０〜１００１１ｉ位／ｄ）、グルタ
ミン（３，５〜４．０び／１）、牛胎児血清（１０〜２
０％）を含む基礎培地を用い、成育してくるｌｉｌ胞ど
して選択する。
基礎培地としては、初物細胞の培養に一般に使用されテ
ィるＩＩＰＨＩＩＧ、１０培地、ＥａｇｌｅのＨＥＭ培
地などが用いられる。
ィるＩＩＰＨＩＩＧ、１０培地、ＥａｇｌｅのＨＥＭ培
地などが用いられる。
ハイブリドーマのクローン化は限界希釈法にて少なくと
も３回繰返して行うのが好ましい。
も３回繰返して行うのが好ましい。
本発明の抗体を産生ずるハイブリドーマの選択は、分泌
される抗体の反応性を調べ前記と同じ反応性を有する抗
体を産生ずるハイブリドーマを選択し、そのＨＨする抗
原分子が前記分子借を示すことを確認することにより行
なわれつる。
される抗体の反応性を調べ前記と同じ反応性を有する抗
体を産生ずるハイブリドーマを選択し、そのＨＨする抗
原分子が前記分子借を示すことを確認することにより行
なわれつる。
ハイブリドーマを通常の初物細胞の培養と同様にして培
養すれば、培地中に本発明の抗体が生産される。例えば
、２〜５Ｘ１０Ｇのパイブリトーン細胞をストレプトマ
イシン（５０〜１００Ｒ／ｍ）、ペニシリン（５０〜１
００単位／ｌｄ） グルタミン（３５〜４０ｇ／ρ）
、牛胎児血清（１０〜２０％）を含むＩＭＰ）１１１６
４０培地１０〜２０７を用い、フラスコ内で９５％ｃｏ
−ｓ％０２存在下、３５・〜３７℃、３〜７日間培養す
ることによって培養液中に抗体が分泌、蓄積される。
養すれば、培地中に本発明の抗体が生産される。例えば
、２〜５Ｘ１０Ｇのパイブリトーン細胞をストレプトマ
イシン（５０〜１００Ｒ／ｍ）、ペニシリン（５０〜１
００単位／ｌｄ） グルタミン（３５〜４０ｇ／ρ）
、牛胎児血清（１０〜２０％）を含むＩＭＰ）１１１６
４０培地１０〜２０７を用い、フラスコ内で９５％ｃｏ
−ｓ％０２存在下、３５・〜３７℃、３〜７日間培養す
ることによって培養液中に抗体が分泌、蓄積される。
よたハイブリドーマ細胞をブリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎ
ｅ）処理のヌードマウスまたはＢＡＬＢ／ｃマウスの腹
腔内に移植して増殖することにより腹水中に本発明の抗
体を蓄積させることができる。即ち、これらマウス腹腔
内にブリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ、２，６．１０．１
４ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙ＋ ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ、
米国７ ルｔ”） ７チ社製）０．５・〜１ ｄを注射
し、その後２〜３週目に腹腔に５〜１０×１０６個のハ
イブリドーマ細胞を移植する。
ｅ）処理のヌードマウスまたはＢＡＬＢ／ｃマウスの腹
腔内に移植して増殖することにより腹水中に本発明の抗
体を蓄積させることができる。即ち、これらマウス腹腔
内にブリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ、２，６．１０．１
４ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙ＋ ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ、
米国７ ルｔ”） ７チ社製）０．５・〜１ ｄを注射
し、その後２〜３週目に腹腔に５〜１０×１０６個のハ
イブリドーマ細胞を移植する。
通常７〜１０日復に腹水が貯溜し、これを採取する。
本発明のモノクローナル抗体の １標識した肺小細胞
１！！１ｓｃＬｃ−３＾を用いた免疫沈畔反応による分
子量測定で（よ、ＮＥ−２５抗原は２５ｘ １０ ダ
ルトンを呈し、又、ＰＥ−３５抗原は３５Ｘ １０”ダ
ルトンを呈した。
１！！１ｓｃＬｃ−３＾を用いた免疫沈畔反応による分
子量測定で（よ、ＮＥ−２５抗原は２５ｘ １０ ダ
ルトンを呈し、又、ＰＥ−３５抗原は３５Ｘ １０”ダ
ルトンを呈した。
免疫沈陪反応：
標的細胞として肺小細胞癌培養株５ＣＬＣ−３Ａ ２ｘ
１０７個を２００Ｉ１５Ｉのアイオ゛ドグン存在下で０
．５ｍＣ１のＮａ１２５．で標識する。
１０７個を２００Ｉ１５Ｉのアイオ゛ドグン存在下で０
．５ｍＣ１のＮａ１２５．で標識する。
これら標識した細胞を０１〜１％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０
を用いて可溶化し、その細胞抽出物（１〜１０Ｘ １０
５ＣｐＨｌ）をモノクローナル抗体（１〜１０屑）と４
℃にて６〜１２時間反応させ、第２次抗体として５〜２
０ＩＪｉの家兎抗マウスイムノグロブリン（Ｃａｐｐｅ
１社、米国）と４℃で３００分間反応せ、ざらに４℃
で１時間スタフィロコッカス・アウレウス（ＣＯｌｌｌ
ａｎ １株）と反応さじ免疫ｉｌｔ降物を作製し、５Ｏ
８−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により解析する
。
を用いて可溶化し、その細胞抽出物（１〜１０Ｘ １０
５ＣｐＨｌ）をモノクローナル抗体（１〜１０屑）と４
℃にて６〜１２時間反応させ、第２次抗体として５〜２
０ＩＪｉの家兎抗マウスイムノグロブリン（Ｃａｐｐｅ
１社、米国）と４℃で３００分間反応せ、ざらに４℃
で１時間スタフィロコッカス・アウレウス（ＣＯｌｌｌ
ａｎ １株）と反応さじ免疫ｉｌｔ降物を作製し、５Ｏ
８−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により解析する
。
本発明モノクローナル抗体の生物学的活性は実施例に示
した。実施例中に用いたマウス混合血球吸ｆ１ 試Ｍ
［ＨＯＩＪＳＯ−１ｉＸｅｄ ｈｅｍａｄｓｏｒｐｔｉ
ｏｎ ａｓｓａｙ、 ＭＭ ＨＡ ］法は’Ｆ記の方法
に従い、マイクロプレー１、［Ｉ’ａｌｃｏｎ社、３０
４０ ］にｉ Ｆｔ Ｉｆ ｔＢ 培Ｗｔ マタＬＬ
浮’ｆｆｉ［飽を付着させた標的細胞へのＩＲ示細胞の
付着の有無でＵ察する。指示細胞としては、ヒツジ赤血
球とマウス抗ヒツジ赤血球抗体を反応させた後、さらに
家兎抗マウスイムノグロブリン血清を反応させたものを
用いる。
した。実施例中に用いたマウス混合血球吸ｆ１ 試Ｍ
［ＨＯＩＪＳＯ−１ｉＸｅｄ ｈｅｍａｄｓｏｒｐｔｉ
ｏｎ ａｓｓａｙ、 ＭＭ ＨＡ ］法は’Ｆ記の方法
に従い、マイクロプレー１、［Ｉ’ａｌｃｏｎ社、３０
４０ ］にｉ Ｆｔ Ｉｆ ｔＢ 培Ｗｔ マタＬＬ
浮’ｆｆｉ［飽を付着させた標的細胞へのＩＲ示細胞の
付着の有無でＵ察する。指示細胞としては、ヒツジ赤血
球とマウス抗ヒツジ赤血球抗体を反応させた後、さらに
家兎抗マウスイムノグロブリン血清を反応させたものを
用いる。
マウス混合血球吸る試験［Ｍ−ＭＨＡ］ ：Ｍ−ＭＨＡ
はＥｓｐｍａｒｋとＦａｇｒｅｕｓの原法（＾ｃｔａＰ
ａｔｈｏ１．Ｈｉｃｒｏｂｉｏ１．５ｃａｎｄ、５ｕｐ
ｐ１．υ；４ ２５８−２６２１９６２＞を改良して行
う。
はＥｓｐｍａｒｋとＦａｇｒｅｕｓの原法（＾ｃｔａＰ
ａｔｈｏ１．Ｈｉｃｒｏｂｉｏ１．５ｃａｎｄ、５ｕｐ
ｐ１．υ；４ ２５８−２６２１９６２＞を改良して行
う。
指示赤血球の作製法は以下の通りである。
洗滌羊赤血球２駕浮遊液と等量の１０００１＠希釈マウ
ス抗羊赤面球抗体（Ｂ＾ＬＢ／Ｃマウスに羊赤血球を過
免疫して作製）とを２４℃にて４５分間反応させ洗滌後
再び２ｘ浮遊液として等量の２００倍希釈家兎抗マウス
イムノグロブリン（Ｃａｐｐｅ１社、米国）を２４℃に
て４５分間反応させた後、２回洗滌後再び２％浮遊液と
したムのをいわゆるＭ−Ｍ ｌ−１△の指示赤血球とし
て用いる。
ス抗羊赤面球抗体（Ｂ＾ＬＢ／Ｃマウスに羊赤血球を過
免疫して作製）とを２４℃にて４５分間反応させ洗滌後
再び２ｘ浮遊液として等量の２００倍希釈家兎抗マウス
イムノグロブリン（Ｃａｐｐｅ１社、米国）を２４℃に
て４５分間反応させた後、２回洗滌後再び２％浮遊液と
したムのをいわゆるＭ−Ｍ ｌ−１△の指示赤血球とし
て用いる。
Ｍ −Ｍ Ｈ△検査法の手法としては、被検索細胞は、
ハイブリドーマ細胞培養上清またはハイプリドーマ細胞
接種ＢＡＬＢ／ｃマウスもしくはＢＡＬＢ／ｃ山来ヌー
ドマウス腹水と２４℃にて４５分間反応させ、抗体を洗
滌除去後、０．２％指示羊赤血球と２４℃にて４５分間
反応させ、軽く一度リン［衝液生理食塩水（ＰＢＳ）で
洗滌後光学的顕微鏡下、指示赤血球のロゼツト形成の有
無にて判定する。
ハイブリドーマ細胞培養上清またはハイプリドーマ細胞
接種ＢＡＬＢ／ｃマウスもしくはＢＡＬＢ／ｃ山来ヌー
ドマウス腹水と２４℃にて４５分間反応させ、抗体を洗
滌除去後、０．２％指示羊赤血球と２４℃にて４５分間
反応させ、軽く一度リン［衝液生理食塩水（ＰＢＳ）で
洗滌後光学的顕微鏡下、指示赤血球のロゼツト形成の有
無にて判定する。
又、実施例中、本発明のモノクローナル抗体選定のため
の各種組織の染色及び本発明のモノクローナル抗体によ
る各ｇ！！１１の染色は、１ｌｓｕ、Ｓ、Ｈ，等ｒｔ）
方’Ｑ （Ｊ、 Ｈｉ ｓｔｏｃｈｅｍ、 Ｃｙｔｏ
ｃｈｅｍ、 ２９．５７７〜５８０．１９８１ ）に準
じてアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体法（
ＡＢＣ法）にＪ：るアセトン固定、凍結切片の染色によ
り行なった。即ち肺癌組織等の凍結切ハを１０％正常豚
面清を含むＰＢＳにて３０分間処理した模、抗体を含む
溶液と室温で２時間反応させ、更に４℃で一夜反応させ
た。そしてＰＢＳで１５分間洗滌した後、ビオチン化抗
マウス免疫グロブリン（７，５ｎ／ｄ）にて３０分間処
理した。これをＰＢＳで１５分間洗滌しＩζ後、アビジ
ン叶−ごオチン化ベルオキシダーピ複合体と室温で３０
分間処理した。これをＰＢＳで１５分間洗滌した後ジア
ミノベンチジン溶液（５０ｍ！Ｆジアミノベンチジン、
０．００６％Ｈ２０２。
の各種組織の染色及び本発明のモノクローナル抗体によ
る各ｇ！！１１の染色は、１ｌｓｕ、Ｓ、Ｈ，等ｒｔ）
方’Ｑ （Ｊ、 Ｈｉ ｓｔｏｃｈｅｍ、 Ｃｙｔｏ
ｃｈｅｍ、 ２９．５７７〜５８０．１９８１ ）に準
じてアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体法（
ＡＢＣ法）にＪ：るアセトン固定、凍結切片の染色によ
り行なった。即ち肺癌組織等の凍結切ハを１０％正常豚
面清を含むＰＢＳにて３０分間処理した模、抗体を含む
溶液と室温で２時間反応させ、更に４℃で一夜反応させ
た。そしてＰＢＳで１５分間洗滌した後、ビオチン化抗
マウス免疫グロブリン（７，５ｎ／ｄ）にて３０分間処
理した。これをＰＢＳで１５分間洗滌しＩζ後、アビジ
ン叶−ごオチン化ベルオキシダーピ複合体と室温で３０
分間処理した。これをＰＢＳで１５分間洗滌した後ジア
ミノベンチジン溶液（５０ｍ！Ｆジアミノベンチジン、
０．００６％Ｈ２０２。
１〜リスバッファーｐＨ７，６）にて５〜１０分間反応
させた。ｍ胞核をヘマトキシリンにて染色後、通常の方
法で封入し検鏡した。
させた。ｍ胞核をヘマトキシリンにて染色後、通常の方
法で封入し検鏡した。
（実施例）
実施例 １
（ＰＥ−３５抗体の製造）
８週令のＪＩＢＡＬＢ／ｃマウスを初回５×１０６個の
師事細胞癌培養株（肺小細胞癌Ｊ８養株細胞５ＣＬＣ−
斯と５ＣＬＣ−３１４を１°１に混合した細胞集団）で
皮下に免疫し、その１ケ月後より ２週間の間隔で２回
腹腔内に各々 １×１０７個の細胞を注入し免疫を行っ
た。なお、師事細胞癌培養株５ＣＬＣ−３Ａ及びＳＣ１
，Ｃ−８Ｈはいずれも愛知県がんセンターで樹立した株
である。
師事細胞癌培養株（肺小細胞癌Ｊ８養株細胞５ＣＬＣ−
斯と５ＣＬＣ−３１４を１°１に混合した細胞集団）で
皮下に免疫し、その１ケ月後より ２週間の間隔で２回
腹腔内に各々 １×１０７個の細胞を注入し免疫を行っ
た。なお、師事細胞癌培養株５ＣＬＣ−３Ａ及びＳＣ１
，Ｃ−８Ｈはいずれも愛知県がんセンターで樹立した株
である。
最終免疫より３日後に肺臓を取り出し、ステンレスメツ
シュを通すことにより細胞懸濁液を作製した。このＣＯ
Ｘ １０ 個の牌ｌｌ！胞と２．Ｏｘ １０７個の８
−アザグアニン耐性ミエローマｍ Ｉｌｌ Ｐ３− Ｎ
Ｓ１＾（１４／１（ＮＳ／１）を混合し、遠沈後沈渣に
１ｄの４７．５％ポリエヂレングリコール（平均分子ω
４０００ ）を加え、２分間ゆるやかに撹拌した。洗浄
後、細胞混合液を１０％牛脂児血清を含むＲＰ旧培地（
完全ＲＰ）Ｉ＋培地）に憇濁し、９６ウエルマイクロ培
養プレートに １ウェル当り１０６個の割合で０．１ｄ
ずつ分注した。２４時１１］１、ヒボキサンチン１００
μＨ１アミノプテリン０４μＨ１チミジン１６μＨを含
む完全Ｉ′ＩＰ旧培地（ＨＡＴ培地）を０． ＩＩＩｄ
ｌ加えた。
シュを通すことにより細胞懸濁液を作製した。このＣＯ
Ｘ １０ 個の牌ｌｌ！胞と２．Ｏｘ １０７個の８
−アザグアニン耐性ミエローマｍ Ｉｌｌ Ｐ３− Ｎ
Ｓ１＾（１４／１（ＮＳ／１）を混合し、遠沈後沈渣に
１ｄの４７．５％ポリエヂレングリコール（平均分子ω
４０００ ）を加え、２分間ゆるやかに撹拌した。洗浄
後、細胞混合液を１０％牛脂児血清を含むＲＰ旧培地（
完全ＲＰ）Ｉ＋培地）に憇濁し、９６ウエルマイクロ培
養プレートに １ウェル当り１０６個の割合で０．１ｄ
ずつ分注した。２４時１１］１、ヒボキサンチン１００
μＨ１アミノプテリン０４μＨ１チミジン１６μＨを含
む完全Ｉ′ＩＰ旧培地（ＨＡＴ培地）を０． ＩＩＩｄ
ｌ加えた。
培養開始後退２回培養上清０．１Ｉｌｉ！を捨て、ＩＩ
ＡＴ培地０． ｌｄを加えた。１４日後よりウェルに融
合細胞の出現が観察されはじめた。
ＡＴ培地０． ｌｄを加えた。１４日後よりウェルに融
合細胞の出現が観察されはじめた。
その後置ウェルの培養上清を取り出し、前述のＭ−ＭＨ
Ａ′ｔｈにより師事細胞癌と反応する抗体が産生されて
いるか否かを確かめ、抗体産生が陽性を示したウェル中
のハイブリドーマを限界希釈法により３回クローニング
を繰り返した。即ち、細胞を５０個／Ｉｄあるいは１０
個／ｄに希釈し、あらかじめフィダーｍ胞がまかれた９
６ウエルマイクロ培畏プレートに０．１．ｊずツ分ｔＦ
： Ｌ、ＨＴ ＠ １１！Ｉ （１００μＨヒボキサン
チンと１６μＨチミジンを合む完全ＢＰ旧１８地〉によ
り２週間培養した。１ウエルに １個のハイブリドーマ
コロニーが形成された場合をクローンとして取り出した
。これらクローンから、前述のＭ −Ｍ ｌ−Ｉ Ａ法
及びＡＢＣＩにより、前記Ｐ「−３５抗体の旬に示した
各細胞及び組織に対する反応性を有する抗体を分泌して
いるハイブリドーマクローンを選択した。このようにし
て得られたハイブリドーマの産生ずる抗体をＰ Ｅ −
３５抗体と命名した。
Ａ′ｔｈにより師事細胞癌と反応する抗体が産生されて
いるか否かを確かめ、抗体産生が陽性を示したウェル中
のハイブリドーマを限界希釈法により３回クローニング
を繰り返した。即ち、細胞を５０個／Ｉｄあるいは１０
個／ｄに希釈し、あらかじめフィダーｍ胞がまかれた９
６ウエルマイクロ培畏プレートに０．１．ｊずツ分ｔＦ
： Ｌ、ＨＴ ＠ １１！Ｉ （１００μＨヒボキサン
チンと１６μＨチミジンを合む完全ＢＰ旧１８地〉によ
り２週間培養した。１ウエルに １個のハイブリドーマ
コロニーが形成された場合をクローンとして取り出した
。これらクローンから、前述のＭ −Ｍ ｌ−Ｉ Ａ法
及びＡＢＣＩにより、前記Ｐ「−３５抗体の旬に示した
各細胞及び組織に対する反応性を有する抗体を分泌して
いるハイブリドーマクローンを選択した。このようにし
て得られたハイブリドーマの産生ずる抗体をＰ Ｅ −
３５抗体と命名した。
このハイブリドーマをマウスの８！２腔内に投与する次
の方法で増殖させＰ Ｅ−３５抗体を開度した。
の方法で増殖させＰ Ｅ−３５抗体を開度した。
即ち、マウス腹腔内にブリスタン０．５−注射し、その
４！！２週目の腹腔に５Ｘ １（１６個のハイブリドー
マ細胞を移植し、１０日後に腹水を採取した。
４！！２週目の腹腔に５Ｘ １（１６個のハイブリドー
マ細胞を移植し、１０日後に腹水を採取した。
実施例 ２
（ＮＥ−２５抗体の製造）
８週令の雌８＾ＬＢ／Ｃマウスに手術材料より１りられ
た神経芽細胞腫細胞（１１１３４） ５ｘ ｉｏ６個
を皮下に注入し、１つ列後より２週間の間隔で２回腹腔
内に各々 ｌｘ １０７個のＩＩｌ胞を注入し免疫を行
った。
た神経芽細胞腫細胞（１１１３４） ５ｘ ｉｏ６個
を皮下に注入し、１つ列後より２週間の間隔で２回腹腔
内に各々 ｌｘ １０７個のＩＩｌ胞を注入し免疫を行
った。
最終免疫より３日後に肺臓を取り出し、ステンレスメツ
シュを通すことにより細胞懸濁液を作製シタ。コ（Ｄ
５ｘｌＯ個（７）Ｐｓｉｌｌ胞トｌＸ１０１（［１）Ｎ
Ｓ／１を混合し、実施例１と同様にして細胞融合、クロ
ーン化を行ない、前ｉ［のＭ −Ｍ ＨＡ法及びＡＢＣ
法により、前記ＮＥ−２５抗体の欄に示した８細胞及び
組織に対する反応性を右する抗体を分泌しているハイブ
リドーマクローンを選択した。このようにして得られた
ハイブリドーマの産生する抗体をｌ’４Ｅ−２５抗体と
命名した。このハイブリドーマを実施例１と同様にして
培養し、抗体を量産した。
シュを通すことにより細胞懸濁液を作製シタ。コ（Ｄ
５ｘｌＯ個（７）Ｐｓｉｌｌ胞トｌＸ１０１（［１）Ｎ
Ｓ／１を混合し、実施例１と同様にして細胞融合、クロ
ーン化を行ない、前ｉ［のＭ −Ｍ ＨＡ法及びＡＢＣ
法により、前記ＮＥ−２５抗体の欄に示した８細胞及び
組織に対する反応性を右する抗体を分泌しているハイブ
リドーマクローンを選択した。このようにして得られた
ハイブリドーマの産生する抗体をｌ’４Ｅ−２５抗体と
命名した。このハイブリドーマを実施例１と同様にして
培養し、抗体を量産した。
実施例 ３
各癌及び正常組織又は細胞とＮＥ−２５抗体、ＰＥ−３
５抗体との反応を調べるために、前記Ｍ−ＭＨＡ ｔｌ
及びΔＢＣ法により試験を行った。結果を表１、表２及
び表３に示した。
５抗体との反応を調べるために、前記Ｍ−ＭＨＡ ｔｌ
及びΔＢＣ法により試験を行った。結果を表１、表２及
び表３に示した。
表ｉ ＮＥ−２５抗体、ＰＥ−３５抗体の各種培養細
胞株に対する反応性（４４−８１１八法による）表２
ＮＥ−２５抗体、ＰＥ−３５抗体の各種腫瘍組織に対
する反応性（ＡＢＣ法による） 表３ ＮＥ−２５抗体、ＰＥ−３５抗体の正常組織又
は細胞に対する反応性（ＡＢＣ法による） クルチッキイ細胞のみ陽性 皮質および髄質が陽性 ランゲルハンス島のみ陽性 ハラサル小体および髄質胸腺上皮が陽性血球凝集法によ
る Ｍ−ＭＨＡ法による 実施例 ４ 本発明のモノクローナル抗体のイムノグロブリンのアイ
ソタイプを知るため、本発明のモノクローナル抗体を寒
天ゲル内で、マウス１ｇの各アイソタイプ（Ｉｐ八、
Ｉ（３Ｍ、 ［ＯＧｌ、 ［（ＩＯ２，、Ｉ（ＪＧ２ｂ
、 ｌ０Ｇ３ ）に対するウサギ抗血清に対して沈降反
応を行なった。
胞株に対する反応性（４４−８１１八法による）表２
ＮＥ−２５抗体、ＰＥ−３５抗体の各種腫瘍組織に対
する反応性（ＡＢＣ法による） 表３ ＮＥ−２５抗体、ＰＥ−３５抗体の正常組織又
は細胞に対する反応性（ＡＢＣ法による） クルチッキイ細胞のみ陽性 皮質および髄質が陽性 ランゲルハンス島のみ陽性 ハラサル小体および髄質胸腺上皮が陽性血球凝集法によ
る Ｍ−ＭＨＡ法による 実施例 ４ 本発明のモノクローナル抗体のイムノグロブリンのアイ
ソタイプを知るため、本発明のモノクローナル抗体を寒
天ゲル内で、マウス１ｇの各アイソタイプ（Ｉｐ八、
Ｉ（３Ｍ、 ［ＯＧｌ、 ［（ＩＯ２，、Ｉ（ＪＧ２ｂ
、 ｌ０Ｇ３ ）に対するウサギ抗血清に対して沈降反
応を行なった。
その結果、本発明のモノクローナル抗体ＮＥ２５及びＰ
Ｅ−３５１，２いずれもＩＱＧｉと判明した。
Ｅ−３５１，２いずれもＩＱＧｉと判明した。
実施例 ５
実施例１で用いた肺小細胞癌治療株に対する反応性をＭ
−ＭＨＡ法により検討したところＮＥ−２５抗体及びＰ
Ｅ −３５抗体の反応性は、いずれの場合も、ヌラミ
ニダ−Ｑ （ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｃ）で処理した
ものでは変化がなく、又、１００℃、５分処理により反
応性が失活した。
−ＭＨＡ法により検討したところＮＥ−２５抗体及びＰ
Ｅ −３５抗体の反応性は、いずれの場合も、ヌラミ
ニダ−Ｑ （ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｃ）で処理した
ものでは変化がなく、又、１００℃、５分処理により反
応性が失活した。
以上の結果よりＮＥ−２５抗体及びＰＥ−３５抗体はい
ずれもタンパク質抗原を認識する抗体であることがわか
る。
ずれもタンパク質抗原を認識する抗体であることがわか
る。
実施例 ６
前２の免疫沈降反応によりＮＥ−２５抗原どＰＥ３５ｉ
ｉ’Ｃ原の分子量を測定した所、ＮＥ−２５抗原は２５
Ｘ １０３ダルトンを呈し、又、Ｐ Ｅ −３５抗原は
３５Ｘ１０３ダルトンを早した。
ｉ’Ｃ原の分子量を測定した所、ＮＥ−２５抗原は２５
Ｘ １０３ダルトンを呈し、又、Ｐ Ｅ −３５抗原は
３５Ｘ１０３ダルトンを早した。
（ｙ′！明の効果）
本発明のモノクローナル抗体は肺癌の小細胞癌と非小細
胞癌の免疫組織学的鑑別に特に有用である。又、肺小細
胞癌治療への応用可能な抗体である。
胞癌の免疫組織学的鑑別に特に有用である。又、肺小細
胞癌治療への応用可能な抗体である。
沫代理人ブ［Ｆ！士 中 村
至
Claims (1)
- （１）ヒトの正常上皮細胞及び上皮由来癌細胞に存在す
る３５×１０＾３ダルトンの分子量のタンパク質抗原と
抗原抗体反応をし、次の性質を有するＩｇＧ＿１アイソ
タイプに属するモノクローナル抗体ＰＥ−３５。 １、ヒトの肺癌、胃癌、大腸癌、乳癌、肝胆道癌と反応
する。 ２、ヒトの神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫、リンパ腫と
反応しない。 ３、ヒトの肺、甲状腺、食道、胃、小腸、大腸の正常上
皮組織と反応する。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1243599A JPH02174691A (ja) | 1989-09-21 | 1989-09-21 | モノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1243599A JPH02174691A (ja) | 1989-09-21 | 1989-09-21 | モノクローナル抗体 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61056358A Division JPS62212399A (ja) | 1986-03-14 | 1986-03-14 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02174691A true JPH02174691A (ja) | 1990-07-06 |
| JPH0320239B2 JPH0320239B2 (ja) | 1991-03-18 |
Family
ID=17106212
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1243599A Granted JPH02174691A (ja) | 1989-09-21 | 1989-09-21 | モノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02174691A (ja) |
-
1989
- 1989-09-21 JP JP1243599A patent/JPH02174691A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0320239B2 (ja) | 1991-03-18 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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