JPH02177883A - シュードモナス属細菌の培養法 - Google Patents

シュードモナス属細菌の培養法

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性の高いシュードモ
ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌を高収率且つ大
量に生産する方法に関するものである。
近年、微生物、酵素またはそれらを固定化して種々の単
位化学反応や複合化学反応の触媒として利用しようとす
る動きが、盛んになってきてしする。
ニトリルヒドラターゼは、二ｌ・リル頻を水和して相当
するアミド類を生成させる酵素として知られており（Ａ
ｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　　４６１１６５
　（１９８２）参照〕、その具体的利用例として二１−
リルヒドラタゼを有する細菌を用いて炭素数２〜４の二
Ｉ・リルから対応するアミドを生成させることが提案さ
れている〔特公昭５９−３７９５１号公報、八ｇｒｉｃ
、　ＢｉｏｌＣｈｅｍ、　４６１１８３　（１９８２）
参照）。また、ごれらの菌の培養方法として幾つかの方
法が提案されている〔特公昭６１−４３９９６、同６１
−４３９９７、同６１−４３９９８、同６１−４３９９
９各号公報参照〕。
□間」１尤− このような活性を有する細菌を工業的規模で利用するた
めには、細菌を大量に生産しなければならず、そのため
培養槽をビーカースケールのものから適宜スケールアッ
プをする必要がある。
しかしながら、シュードモナス属に属しニトリルヒドラ
ターゼを産生ずる能力を有する木細菌は、菌体増殖およ
び活性発現のために通気攪拌等により好気的条件下（酸
素供給速度３．５ｋｇ−０□７ｍ３・ｈｒ程度）で培養
をしなくてはならないが、その培養に容量の大きな培養
槽を使用したところ、所定培養時間での菌濃度、初期活
性が共に低下し、培養槽のスケールアップが満足に行え
ず、ニトリルヒドラターゼ活性の発現が不充分であった
。
このような現象が何に起因するのかは定かではないが、
培養中上記酸素供給速度を維持するに際し、培養槽のス
ケールアンプに伴う攪拌翼による剪断力の増大が直接あ
るいは間接的に菌の生育に何らかの影響を与えているも
のと考えられる。
いずれにセよ、この点が解決されなければ本細菌の培養
を工業的に実施することはできない。
能力を有する細菌を剪断力印加条件−「に培養してニト
リルヒドラターゼ酵素活性を有する細菌菌体を製造する
に際し、培地中に水溶性銅化合物を存在させることを特
徴とするシュードモナス属細菌の培養法である。
羞□束 本発明においては、特に、攪拌翼による培養系の攪拌を
伴う容量の大きな培養槽、例えば５００ρ以上の槽で本
細菌の培養を行うに際して、培地に銅イオンを存在さ−
Ｕると培養成績が著しく向上する。後記実施例に示すよ
うに、７００２の培養槽を使用した例においては水溶性
銅化合物を添加する本発明は上記の点に解決を与えるこ
とを目的とし、培養槽の装置的な改造を伴わず、培地に
微量の水溶性銅化合物を添加するという極めて容易且つ
実用的な手段によって、この目的を達成しようとするも
のである。
すなわち、本発明は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄ。
ｍｏｎａｓ）属に属しニトリルヒドラターゼを産生ずる
位培養液当りのニトリルヒドラターゼ活性は、驚くべき
ことに実に２，３５倍に向上した。この水溶性銅化合物
添加による単位培養液当りのニトリルヒドラターゼ活性
の増大は菌体の濃度の増大および菌体自体の活性の増大
に因るものであが、このような水溶性銅化合物の添加効
果は、フラスコ振盪培養等のビーカースケールでの培養
結果からは全く予想し難い特異的なものである。
本発明において使用する細菌は、ニトリルヒドラターゼ
活性を有し、ニトリル、特にアクリロニトリルを水和し
て対応アミド、特にアクリルアミ５１号公報に記載のシ
ュードモナス・クロロラフイスＢ２３（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ　Ｂ２３）　　（
微工研条寄第１８７号およびソニートモナスｓｐ、　Ｐ
ｓｉ（Ｐｓａｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、　ＰＳＩ）　　
（微工研条寄第１８８号〕などを挙げることができる。
これら両画の詳細は同公報に記載されている。
一丞】１１測」２制御□ 本発明において使用する水溶性銅化合物としては、銅の
無機塩、有機酸塩、錯塩等が代表的なものであり、具体
的には、塩化銅、硫酸銅、硝酸銅、酢酸銅、酒石酸銅、
銅（ＩＴ）アセチルアセトナート、銅（ＩＩ　）ＥＤＴ
＾等が挙げられる。これらは単独Ｇこあるいは混合して
使用してもよく、培地中に銅換算で０，５〜５ｍｇ／ｊ
２程度、好ましくは１〜３ｍｇ／ρ程度存在させればよ
い。
基１ 本発明の培養は、通常５００２以上の培養槽を用い、ニ
トリルヒドラターゼ活性を有するシュードモナス属細菌
をグルコース、フラグＩ・−ス、シュクロース、デキス
トリン、グリセリン、エタンラム、尿素などの窒素源、
酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、カゼイン分解物、
ペプトンなどの有機栄養源、リン酸塩、マグネシウム塩
、カリウム塩、鉄塩、その他の微量金属塩などの無機栄
養源、さらに酵素誘導剤としてアクリルアミド、メタク
リルアミド、クロトンアミド、ｎ−ブチルアミド、プロ
ピオニトリル、イソブチロニ１−リル、プロピオンアミ
ドおよびイソブチルアミドなどを含有する培地に接種し
、水溶性銅化合物の存在下に好気的条件にて行う。
培地のｐ＋＋は６〜９程度、好ましくは７〜８程度、培
養温度は２０〜３７°Ｃ程度、好ましくは２５〜３０°
Ｃ程度、通気条件は０．５〜１．Ｏｖｖｍ程度、培養時
間は１〜３日程度で充分である。
なお、培養系に与えられる剪断力に関し、該剪断力は培
養槽の容量の増大、これに伴う攪拌翼径の増大により大
きくなるが、これは−船釣に攪拌翼先端の周速度を指標
として表すことができる。
３．０ｍ／ｓｅｃ、　、１０００℃槽の場合、約３．０
〜４．０ｍ／ｓｅｃ。
である。本発明においては、攪拌翼先端の周速度が約２
．５ｍ／ｓｅｃ、以上となるような系において特に有効
である。
培養終了後の菌体の回収ないし利用、あるいはニトリル
ヒドラターゼの回収ないし利用は、前記特公昭５９−３
７９５１号公報の記載、あるいは後記実施例の記載に従
って行うことができる。
′　　　　　　　−へ−一一〜−〜 洟」１グー 下記の前培養条件で生育させたシコ、−トモナス・クロ
ラフイスＢ−２３（微工研条寄第１８７号〕菌の培養液
４．３リツトルを下記本培養条件で培養してニトリルヒ
ドラターゼ活性を調べた。
（１）菌の培養 ■前培養条件 培地組成：ペプトン５ｇ／２、酵母エキス３ｇ／　１麦
芽工キス３ｇ／　１２　、グルコース５ｇ／　ｊ２ｐＨ
７，２ 培養温度　：２５’Ｃ 通気、撹拌：　Ｉｖｖｍ、２００ｒｐｍ培養時間　：２
４時間 培養槽容量　：　２ＯＮ　（２４５φ×４５ＯＬ）培養
仕込液量＝１３！ 攪拌翼：６枚ディスクタービン付平型攪拌翼（１１５φ
）１段 へ ■本培養条件 培地組成：ンユークロス３０ｇ／　１．、味液２０ｇ／
　Ｉ！。
メタアクリルアミド９．５ｇ／β ＭｇＳＯ４・７１１２０１ｇ／ｉＶ、、Ｆｅ５０．．７
＋１２００．０５ｇ／　Ｅ　、Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ／　ｌ
Ｋ１−１２Ｐ０．１ｇ／ｌ Ｃｕ５Ｏｚ　・５１１２０　５ｍｇ／　ｌ１ｐｌ＋７．
８ 培養温度　：２５°Ｃ 培養時間　＝４８時間 培養槽容量　ニア００ρ（８００φｘ　１５６０Ｌ）培
養仕込液量：５ｏｏｚ 攪拌翼二６枚ディスクタービン付平型攪拌翼（２６０φ
）２段 （２）ニトリルヒドラターゼ活性の測定培養液０．１　
ｍｌと１／２０　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，７）４．９
０ｍ１とを混合し、これにさらに５．０重量％のアクリ
ロニトリルを含む１／２０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，７
）５　ｍｌを加えて、１０°Ｃで１０分間反応させ、菌
体を濾別してからガスクロマトグラフィーで生成したア
クリルアミド（ＡＡ）を定量することにより行った。
活性は、比活性（Ｓ、Ａ、）および全活性（Ｔ、Ａ、）
　ｉ、こついて調べた。これらは下記の通りに定義され
る。
Ｓ、Ａ、　：μモルＡＡ／＋ｎｇ菌体／分子、Ａ、　：
μモルＡＡ／ｍＥ培養液／分ｉ笠貰 本培養培地にＣｕ５Ｏａ・５１１□０を添加しなかった
以外の条件は上記実施例と同一条件にて培養を行った。
培養時間４８時間後の培養結果は表−１に示す通りであ
った。
表−１

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属しニ
    トリルヒドラターゼを産生する能力を有する細菌を剪断
    力印加条件下に培養してニトリルヒドラターゼ酵素活性
    を有する細菌菌体を製造するに際し、培地中に水溶性銅
    化合物を存在させることを特徴とするシュードモナス属
    細菌の培養法。
JP63329333A 1988-12-28 1988-12-28 シュードモナス属細菌の培養法 Expired - Lifetime JPH0822221B2 (ja)

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