JPH02177887A - グルコース―６―リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 - Google Patents
グルコース―６―リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子Info
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- JPH02177887A JPH02177887A JP63334629A JP33462988A JPH02177887A JP H02177887 A JPH02177887 A JP H02177887A JP 63334629 A JP63334629 A JP 63334629A JP 33462988 A JP33462988 A JP 33462988A JP H02177887 A JPH02177887 A JP H02177887A
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- phosphate
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、新規なグルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ遺伝子および該遺伝子を用いたグルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼの製造法に関する。
ーゼ遺伝子および該遺伝子を用いたグルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼの製造法に関する。
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下、Ｇ６
ＰＤＨと略すことがある）は、グルニス−６−リン酸と
ＮＡＤまたはＮＡＤＰ （以下、ＮＡＤ （Ｐ）という
）からグルコノラクトン−６リン酸と還元型ＮＡＤ （
Ｐ）（ＮＡＤ （ＰＩＩＨ〕を生成する酵素反応を触媒
する酵素であり、動植物界に広く分布し、動物組織では
、副腎皮質、肺臓、授乳中の乳腺などに活性が高い。こ
れらの酵素のうち、精製されたと報告のあるものとして
は、乳腺由来のＧ ６ Ｐ Ｄ ＨＣＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、２３６，７５４−７５８（１９６１） ） 、
肝臓由来のＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、
５５，４００−４０８（１９５３）） 、赤血球由来の
０６ ＰＤＨ（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２２４．１０
４７−１０６４（１９５７）、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、９，１２６−１３１（１９６６） 、 Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ、２４１．４９６６４９７６（１９６６）
） 、ビール酵母（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２１．
６６７−７９（１９５５） ） 、キャンディダ・ユー
ティリティス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）由来の
Ｇ６ ＰＤＨ（Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、ｃｈｅｍ、３５０
，６２６−６３４（１９６９） 、 Ｂｉｏｃｈｉｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ １９１５０９−５１６（１
９６９）） 、ロイコノストック゛メセンテロイデス（
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅＳ
）、アゾトバクタ−・ビネランディ （Ａｚｏｔｏｂａ
ｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ ）およびシュードモ
ノナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ）由来のＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈ
（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ５１ｍｏ１．１，３２８−３３４（
１９５５）〕などが知られている〔酵素ハンドブック、
６０２頁、朝倉書店、 １９８４年版、第１版第３刷〕
。また、バチルス属（Ｂａｃｉ ｌ１ｕｓ）に属する微
生物由来の０６ＰＤＨも知られている〔八ｒｃｈ、Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ 、９８．２７５−２８７（１９７４）
、特公昭６３−４３０７９号公報〕。
ＰＤＨと略すことがある）は、グルニス−６−リン酸と
ＮＡＤまたはＮＡＤＰ （以下、ＮＡＤ （Ｐ）という
）からグルコノラクトン−６リン酸と還元型ＮＡＤ （
Ｐ）（ＮＡＤ （ＰＩＩＨ〕を生成する酵素反応を触媒
する酵素であり、動植物界に広く分布し、動物組織では
、副腎皮質、肺臓、授乳中の乳腺などに活性が高い。こ
れらの酵素のうち、精製されたと報告のあるものとして
は、乳腺由来のＧ ６ Ｐ Ｄ ＨＣＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、２３６，７５４−７５８（１９６１） ） 、
肝臓由来のＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、
５５，４００−４０８（１９５３）） 、赤血球由来の
０６ ＰＤＨ（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２２４．１０
４７−１０６４（１９５７）、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、９，１２６−１３１（１９６６） 、 Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ、２４１．４９６６４９７６（１９６６）
） 、ビール酵母（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２１．
６６７−７９（１９５５） ） 、キャンディダ・ユー
ティリティス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）由来の
Ｇ６ ＰＤＨ（Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、ｃｈｅｍ、３５０
，６２６−６３４（１９６９） 、 Ｂｉｏｃｈｉｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ １９１５０９−５１６（１
９６９）） 、ロイコノストック゛メセンテロイデス（
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅＳ
）、アゾトバクタ−・ビネランディ （Ａｚｏｔｏｂａ
ｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ ）およびシュードモ
ノナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ）由来のＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈ
（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ５１ｍｏ１．１，３２８−３３４（
１９５５）〕などが知られている〔酵素ハンドブック、
６０２頁、朝倉書店、 １９８４年版、第１版第３刷〕
。また、バチルス属（Ｂａｃｉ ｌ１ｕｓ）に属する微
生物由来の０６ＰＤＨも知られている〔八ｒｃｈ、Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ 、９８．２７５−２８７（１９７４）
、特公昭６３−４３０７９号公報〕。
また、ヒトＧ６ ＰＤＨおよびラットＧ ６ Ｐ Ｄ
Ｈの遺伝子の塩基配列については報告されている〔Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ ８３．
４１５７−４１６０１９８６）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １６．７７４６（１９８
８） ）。
Ｈの遺伝子の塩基配列については報告されている〔Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ ８３．
４１５７−４１６０１９８６）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １６．７７４６（１９８
８） ）。
０６ Ｐ Ｄ Ｈは、臨床診断、例えば心筋梗塞の診断
のためのタレアチンギナーゼ定量用の酵素として用いら
れており極めてを用な酵素である。Ｇ６ＰＤＨを臨床診
断試薬として使用するには、長期安定性および熱安定性
が求められている。従来Ｇ６ ＰＤＨは、Ｇ６ＰＤＨ生
産菌により生産していたが、これらの製造法にはいくつ
かの問題点があった。すなわち、これらのＧ ６．Ｐ
Ｄ・Ｈ生産菌は、０６ＰＤＨ生産性が低く、安価に大量
の酵素を供給することが困難であること、また、共存す
る他の酵素例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼやラク
テートデヒドロゲナーゼなどの除去が困難である等であ
った。
のためのタレアチンギナーゼ定量用の酵素として用いら
れており極めてを用な酵素である。Ｇ６ＰＤＨを臨床診
断試薬として使用するには、長期安定性および熱安定性
が求められている。従来Ｇ６ ＰＤＨは、Ｇ６ＰＤＨ生
産菌により生産していたが、これらの製造法にはいくつ
かの問題点があった。すなわち、これらのＧ ６．Ｐ
Ｄ・Ｈ生産菌は、０６ＰＤＨ生産性が低く、安価に大量
の酵素を供給することが困難であること、また、共存す
る他の酵素例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼやラク
テートデヒドロゲナーゼなどの除去が困難である等であ
った。
本発明者らは、上記問題点に関し鋭意研究の結果、後記
のバチルス属に属する微生物より０６ＰＤ Ｈを構成す
るポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を単
離精製し、その詳細なりＮＡ（ポリデオキシリボ核酸）
の−次構造及び構成する該酵素のアミノ酸配列の一次構
造を決定した結果、本発明のＤＮＡ塩基配列およびアミ
ノ酸配列は、前記ヒトＧ６ＰＤ［イおよびラットＧ ６
Ｐ Ｄ Ｈの遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列と
比較してその構成や相同性において異なり、新規物であ
ることを確認し、本発明を完成するに至った。
のバチルス属に属する微生物より０６ＰＤ Ｈを構成す
るポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を単
離精製し、その詳細なりＮＡ（ポリデオキシリボ核酸）
の−次構造及び構成する該酵素のアミノ酸配列の一次構
造を決定した結果、本発明のＤＮＡ塩基配列およびアミ
ノ酸配列は、前記ヒトＧ６ＰＤ［イおよびラットＧ ６
Ｐ Ｄ Ｈの遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列と
比較してその構成や相同性において異なり、新規物であ
ることを確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
Ｎ末端側より第１Ｍで表されるアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡ。
るＤＮＡ。
Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列を保持する
ことを特徴とするヘクター、 Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列をコードす
る宿主にとって外来性であるＤＮＡを保持することを特
徴とする形質転換体、 Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列をコードす
る宿主にとって外来性であるＤＮＡを保持する形質転換
体を培養して、該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめ、該培
養物からグルコース−６リン酸デヒドロゲナーゼを採取
することを特徴とするグルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼの製造法、 および、Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列か
らなるポリペプチド。
ことを特徴とするヘクター、 Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列をコードす
る宿主にとって外来性であるＤＮＡを保持することを特
徴とする形質転換体、 Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列をコードす
る宿主にとって外来性であるＤＮＡを保持する形質転換
体を培養して、該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめ、該培
養物からグルコース−６リン酸デヒドロゲナーゼを採取
することを特徴とするグルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼの製造法、 および、Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列か
らなるポリペプチド。
本発明において、第１図で表されるアミノ酸配列はその
Ｎ末端側およびＣ末端側にアミノ酸残基またはポリペプ
チド残基を含む場合であってもよく、Ｎ末端側であるＴ
ｈｒの上流にはさらに一個または複数のアミノ酸残基を
有してもよく、そのアミノ酸残基としてはＭｅｔまたは
シグナルペプチドが挙げられ、またＣ末端側のＩｌｅの
下流には、さらに−個以上のアミノ酸残基を有してもよ
い。
Ｎ末端側およびＣ末端側にアミノ酸残基またはポリペプ
チド残基を含む場合であってもよく、Ｎ末端側であるＴ
ｈｒの上流にはさらに一個または複数のアミノ酸残基を
有してもよく、そのアミノ酸残基としてはＭｅｔまたは
シグナルペプチドが挙げられ、またＣ末端側のＩｌｅの
下流には、さらに−個以上のアミノ酸残基を有してもよ
い。
本発明の第１図で表されるアミノ酸配列をコードする新
規なりＮＡは、そのＮ末端側およびＣ末端側のアミノ酸
残基またはポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各
アミノ酸に対応する一連のコドンのうちのいずれか１個
のコドンからなるＤＮＡであればよい。
規なりＮＡは、そのＮ末端側およびＣ末端側のアミノ酸
残基またはポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各
アミノ酸に対応する一連のコドンのうちのいずれか１個
のコドンからなるＤＮＡであればよい。
上記ＤＮＡの代表例として、５゛末端側より第２図で表
される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。
される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。
該ＤＮＡは、５゛末端の上流側にアミノ酸をコードする
コドンを１個以上有したものでもよく、ＴＡＡ、ＴＡＧ
およびＴＧＡ以外のコドンであればよい。さらに、好ま
しくはＡＴＧまたはＡＴＧ以外の開始コドンまたはシグ
ナルペプチドに対応するコドンを有したものを挙げるこ
とができる。３″末端たるＡＴＡの下流側には、アミノ
酸をコードするコドンを１個以上有するかまたは翻訳終
止コドンを有するかのいずれでもよく、更に、その３゛
末端側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有する
場合には、このアミノ酸をコードするコドンの３゛末端
に翻訳終止コドンを有することが好ましい。
コドンを１個以上有したものでもよく、ＴＡＡ、ＴＡＧ
およびＴＧＡ以外のコドンであればよい。さらに、好ま
しくはＡＴＧまたはＡＴＧ以外の開始コドンまたはシグ
ナルペプチドに対応するコドンを有したものを挙げるこ
とができる。３″末端たるＡＴＡの下流側には、アミノ
酸をコードするコドンを１個以上有するかまたは翻訳終
止コドンを有するかのいずれでもよく、更に、その３゛
末端側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有する
場合には、このアミノ酸をコードするコドンの３゛末端
に翻訳終止コドンを有することが好ましい。
第１図に示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡまた
は第２回に示されたＤＮＡは、例えば、Ｇ６ＰＤＨを生
産する０６ＰＤＨ遺伝子の供与体である微生物より該微
生物のＤＮＡを分離精製した後、超音波、制限酵素など
を用いて切断した該ＤＮＡと切断してリニヤ−にした発
現ベクターとを両ＤＮＡの平滑または接着末端部におい
てＤＮＡリガーゼなどにより結合閉環させ、斯くして得
られた組換えＤＮＡヘクターを複製可能な宿主微生物に
移入した後、ヘクターのマーカーと０６ＰＤ Ｈの活性
とを指標としてスクリーニングして取得した組換えＤＮ
Ａヘククーを保持する微生物を培養し、該培養菌体から
該組換えＤＮＡヘククーを分離精製し、次いで該組換え
ＤＮＡヘクターからＧ６ＰＤＨ遺伝子であるＤＮＡを取
得すればよい。
は第２回に示されたＤＮＡは、例えば、Ｇ６ＰＤＨを生
産する０６ＰＤＨ遺伝子の供与体である微生物より該微
生物のＤＮＡを分離精製した後、超音波、制限酵素など
を用いて切断した該ＤＮＡと切断してリニヤ−にした発
現ベクターとを両ＤＮＡの平滑または接着末端部におい
てＤＮＡリガーゼなどにより結合閉環させ、斯くして得
られた組換えＤＮＡヘクターを複製可能な宿主微生物に
移入した後、ヘクターのマーカーと０６ＰＤ Ｈの活性
とを指標としてスクリーニングして取得した組換えＤＮ
Ａヘククーを保持する微生物を培養し、該培養菌体から
該組換えＤＮＡヘククーを分離精製し、次いで該組換え
ＤＮＡヘクターからＧ６ＰＤＨ遺伝子であるＤＮＡを取
得すればよい。
ＤＮＡの供与体である供与微生物は、好ましくは、後記
の分類学的性状を有するバチルス エスピー ＨＴ−３
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ、ＨＴ３、微工研条寄第２
１７２号（ＦＥＲＭ ＢＰ２１７２））を利用すると
よい。
の分類学的性状を有するバチルス エスピー ＨＴ−３
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ、ＨＴ３、微工研条寄第２
１７２号（ＦＥＲＭ ＢＰ２１７２））を利用すると
よい。
前述のバチルス・エスピー・ＨＴ−３株の分類学的性状
は以下のとおりである。
は以下のとおりである。
■、生育の特徴
■普通寒天斜面培地
生育良好で線状（Ｆｉｌｉｆｏｒｍ）に生育する。黄土
色〜灰白色を呈するが、可溶性色素は産生じない。
色〜灰白色を呈するが、可溶性色素は産生じない。
■普通寒天平面培地
円形で金縁、丘状（Ｃｏｎｖｅｘ）のコロニーを形成す
る。黄土色〜灰白色を呈するが、可溶性色素は産生じな
い。
る。黄土色〜灰白色を呈するが、可溶性色素は産生じな
い。
■ＢＣＰミルク培地
変化なし。
■液体培地（ペプトン水）
生育良好で一様に混濁する。
■、形態の特徴
端の丸いまっずく又はやや曲がった桿菌で単独又は二連
たまに短連類し、Ｔｏｄｐｏｌｅｌｉｋｅ ｃｅｌｌや
球状細胞が混在する。大きさは、桿状細胞で０．５〜０
．８ Ｘ ２．０〜３．０μｍ、球状細胞で１４μｍ、
桿状細胞の端又は北端に大きさ０．５〜０．８ Ｘ ２
．０〜３．０１１ｍの内生胞子を形成するが胞子によっ
て細胞はふくらまない。周毛で運動する。
たまに短連類し、Ｔｏｄｐｏｌｅｌｉｋｅ ｃｅｌｌや
球状細胞が混在する。大きさは、桿状細胞で０．５〜０
．８ Ｘ ２．０〜３．０μｍ、球状細胞で１４μｍ、
桿状細胞の端又は北端に大きさ０．５〜０．８ Ｘ ２
．０〜３．０１１ｍの内生胞子を形成するが胞子によっ
て細胞はふくらまない。周毛で運動する。
■、生理的生化学的特徴
ダラム染色； →
ＫＯＨ反応；
カプセル形成
抗酸性染色；
ＯＦテスト： ０（酸化）
嫌気下での生育；
好気下での生育
生育温度 ５２゛Ｃ；
４５℃・
３７℃
生育ｐＨ９，ｏ；
８．０・
５．２：
４．７；
ｍｌ塩性 ０％；
１０％。
カタラーゼ産生ニ
オキンダーゼ産生；
ウレアーゼ産生（ＳＳＲ）；
ウレアーゼ産生（Ｃｈｒｉｓ）； （−ト）インドール
産生； 硫化水素（酢酸鉛紙） アセトイン産生； ＭＲテスト； 硝酸塩還元； →− ＋ 脱窒反応： ゲラチン分解； デンプン分解； →− カゼイン分解；（＋） エスタリン分解； ＋ セルロース分解； チロシン分解； （±） 利用性テスト（シモンズ培地） クエン酸塩； マレイン酸塩； リンゴ酸塩ニ ゲルコン酸塩： プロピオン酸塩； マロン酸塩 コハク酸塩； 利用性テス１〜（クリステンゼン培地）クエン酸塩； マレイン酸塩 リンゴ酸塩； グルコン酸塩； プロピオン酸塩。
産生； 硫化水素（酢酸鉛紙） アセトイン産生； ＭＲテスト； 硝酸塩還元； →− ＋ 脱窒反応： ゲラチン分解； デンプン分解； →− カゼイン分解；（＋） エスタリン分解； ＋ セルロース分解； チロシン分解； （±） 利用性テスト（シモンズ培地） クエン酸塩； マレイン酸塩； リンゴ酸塩ニ ゲルコン酸塩： プロピオン酸塩； マロン酸塩 コハク酸塩； 利用性テス１〜（クリステンゼン培地）クエン酸塩； マレイン酸塩 リンゴ酸塩； グルコン酸塩； プロピオン酸塩。
マロン酸塩；
コハク酸塩；
グルコースよりガスの産生；
糖より酸の産生（Ｎ源としてＮｌ１４ＨｚＰＯａを使用
）アドニトール； Ｌ（＋）アラビノース・ ＋ セロビオース・ ＋ ヅルシトール： メソ・エリスリトール； フラクトース； ＋ ガラクト−ス・ 十 グルコース； ＋ グリセリン； 十 イノシトール； →− イヌリン； ラクトース； マルト−ス； →− マンニトール： ＋ マンノース； ＋ メレジトース； 十 ノリビオース； 十 ラフィノース； →− Ｌ（＋） ラムノース； Ｄリボース； ＋ サリシン； ＋ しソルボース； ソルビトール； デンプン； ト ４ノッカロース： → トレハロース、 ＋ キシ＋１−ス゛ ） 〔十 陽性、（＋）属菌性、−陰性〕 ■４本菌株の主性状 本菌株はダラム陽性の端の丸い桿菌で単独又は短連鎖す
る細菌でカタラーゼ産生の芽胞形成菌、グルコースを酸
化的に分解し酸を産生ずる。
）アドニトール； Ｌ（＋）アラビノース・ ＋ セロビオース・ ＋ ヅルシトール： メソ・エリスリトール； フラクトース； ＋ ガラクト−ス・ 十 グルコース； ＋ グリセリン； 十 イノシトール； →− イヌリン； ラクトース； マルト−ス； →− マンニトール： ＋ マンノース； ＋ メレジトース； 十 ノリビオース； 十 ラフィノース； →− Ｌ（＋） ラムノース； Ｄリボース； ＋ サリシン； ＋ しソルボース； ソルビトール； デンプン； ト ４ノッカロース： → トレハロース、 ＋ キシ＋１−ス゛ ） 〔十 陽性、（＋）属菌性、−陰性〕 ■４本菌株の主性状 本菌株はダラム陽性の端の丸い桿菌で単独又は短連鎖す
る細菌でカタラーゼ産生の芽胞形成菌、グルコースを酸
化的に分解し酸を産生ずる。
■１本菌株の同定
以」二の本菌株の主性状（ダラム陽性、カタラゼ産生、
芽胞形成）より、本菌株はバチルス属に属するものと同
定され、本菌株をバチルス エスピー ＨＴ−３株（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ、Ｉ（Ｔ−３、微工研条寄第２
１７２号（ＦＥＩ’；ＩＭ ＢＰ−２１７２）と命名
し、寄託した。
芽胞形成）より、本菌株はバチルス属に属するものと同
定され、本菌株をバチルス エスピー ＨＴ−３株（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ、Ｉ（Ｔ−３、微工研条寄第２
１７２号（ＦＥＩ’；ＩＭ ＢＰ−２１７２）と命名
し、寄託した。
遺伝子の供与体である微生物から由来するＤＮＡを採取
するには以下の如く行う。例えば、上述した供与体であ
る微生物のいずれかを、液体培地で約１〜３日間通気攪
拌培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌し、次い
でこれを溶菌させることによって０６ Ｐ Ｄ Ｈ遺伝
子を含有する溶菌物を調製する。溶菌方法としては、例
えばリゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵
素による処理が施され、必要によりプロテアーゼなどの
他の酵素やラウリル硫酸すｌ・リウムなどの界面活性剤
が併用され、ざらに細胞壁の物理的破壊法である凍結融
解やフレンチプレス処理を上述の溶菌法との組み合せで
行ってもよい。
するには以下の如く行う。例えば、上述した供与体であ
る微生物のいずれかを、液体培地で約１〜３日間通気攪
拌培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌し、次い
でこれを溶菌させることによって０６ Ｐ Ｄ Ｈ遺伝
子を含有する溶菌物を調製する。溶菌方法としては、例
えばリゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵
素による処理が施され、必要によりプロテアーゼなどの
他の酵素やラウリル硫酸すｌ・リウムなどの界面活性剤
が併用され、ざらに細胞壁の物理的破壊法である凍結融
解やフレンチプレス処理を上述の溶菌法との組み合せで
行ってもよい。
このようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離、精製
するには、常法に従って、例えばフェノール抽出による
除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理
、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わ
せることにより行うことができる。
するには、常法に従って、例えばフェノール抽出による
除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理
、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わ
せることにより行うことができる。
分離精製された微生物ＤＮＡを切断する方法は、例えば
、超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができ
るが、得られるＤＮＡ断片とヘクターとの結合を容易な
らしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配
列に作用する、例えば、ＥｃｏＲＩ 、 ｌＩｉｎｄｍ
、 Ｂａｍ１（Ｉなどの■型制限酵素が適している。
、超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができ
るが、得られるＤＮＡ断片とヘクターとの結合を容易な
らしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配
列に作用する、例えば、ＥｃｏＲＩ 、 ｌＩｉｎｄｍ
、 Ｂａｍ１（Ｉなどの■型制限酵素が適している。
ヘクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しう
るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として
構築されたものが適している。
るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として
構築されたものが適している。
ファージとしては、例えば、エシェリヒア・コリ （Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする
場合には、λｇｔ・λＣ１λｇｔ・λＢなどが使用でき
る。
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする
場合には、λｇｔ・λＣ１λｇｔ・λＢなどが使用でき
る。
また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コ
リを宿主微生物とする場合にはｐＢＲ３２２ｐＢＲ３２
５、ｐＡｃＹｃ１８４． ｐｌＪｃ１２． ｐＵｃ
１３． ｐＵｃ］８ｐＵｃ１９などが、バチルス・ズ
ブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）を宿
主微生物とする場合にはｐＵＢｌｌｏ 、ｐＣ］９４な
どが使用でき、さらに、エシェリヒア・コリおよびザノ
カロマイセス・セレビシアなどの二種以上の宿主微生物
体内で自律的に増殖可能なシャトルヘクターを利用する
こともできる。
リを宿主微生物とする場合にはｐＢＲ３２２ｐＢＲ３２
５、ｐＡｃＹｃ１８４． ｐｌＪｃ１２． ｐＵｃ
１３． ｐＵｃ］８ｐＵｃ１９などが、バチルス・ズ
ブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）を宿
主微生物とする場合にはｐＵＢｌｌｏ 、ｐＣ］９４な
どが使用でき、さらに、エシェリヒア・コリおよびザノ
カロマイセス・セレビシアなどの二種以上の宿主微生物
体内で自律的に増殖可能なシャトルヘクターを利用する
こともできる。
このようなヘクターを、先に述べた０ ６ Ｐ Ｄ Ｈ
遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限
酵素と同じ制限酵素で切断して、ヘクター断片を得るこ
とが好ましい。
遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限
酵素と同じ制限酵素で切断して、ヘクター断片を得るこ
とが好ましい。
微生物ＤＮＡ断片とヘクター断片とを結合させる方法は
、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例
えば、微生物ＤＮＡ断片の接着末端とヘクター断片の接
着末端とのアニーリングの後、適当なりＮＡリガーゼの
作用により微生物ＤＮＡ断片とヘクター断片との組換え
ＤＮＡを作成する。必要ならば、アニーリングの後、宿
主微生物に移入して、生体内のＤＮＡリガーゼを利用し
組換えＤＮＡを作成することもできる。
、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例
えば、微生物ＤＮＡ断片の接着末端とヘクター断片の接
着末端とのアニーリングの後、適当なりＮＡリガーゼの
作用により微生物ＤＮＡ断片とヘクター断片との組換え
ＤＮＡを作成する。必要ならば、アニーリングの後、宿
主微生物に移入して、生体内のＤＮＡリガーゼを利用し
組換えＤＮＡを作成することもできる。
宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定かつ自律的に
増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質が発現のできるも
のであればよく、例えば、宿主微生物がエシェリヒア
コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリＤ Ｈ
１、エシェリヒア・コリＨＢＩＯ１，エシェリヒア・コ
リＷ３１１０エシエリヒア・コリＣ６００等が利用出来
る。
増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質が発現のできるも
のであればよく、例えば、宿主微生物がエシェリヒア
コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリＤ Ｈ
１、エシェリヒア・コリＨＢＩＯ１，エシェリヒア・コ
リＷ３１１０エシエリヒア・コリＣ６００等が利用出来
る。
宿主微生物に組換えＤＮＡを移入する方法としては、例
えば、宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場
合には、カルシウムイオンの存在下で紐換えＤＮＡの移
入を行い、またハヂルス属に属する微生物の場合には、
コンピテントセル法またはリポソーム組換えＤＮＡのプ
ロトプラスト宿主細胞内への電気的な融合移入法などを
採用することができ、さらにマイクロインジェクション
法を用いてもよい。
えば、宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場
合には、カルシウムイオンの存在下で紐換えＤＮＡの移
入を行い、またハヂルス属に属する微生物の場合には、
コンピテントセル法またはリポソーム組換えＤＮＡのプ
ロトプラスト宿主細胞内への電気的な融合移入法などを
採用することができ、さらにマイクロインジェクション
法を用いてもよい。
宿主微生物への目的組換えＤＮＡ移入の有無についての
選択は、目的組換えＤＮＡを保持するヘクターのマーカ
ー、例えば薬剤耐性マーカーとＧ６ Ｐ Ｄ Ｈを発現
し得る微生物を検索すればよく、例えば、薬剤耐性マー
カーに基づく選択培地で生育し、且つＧ ６ Ｐ Ｄ
Ｈを生成する微生物を好ましくは、発色系を用いてｊＭ
択ずればよい。
選択は、目的組換えＤＮＡを保持するヘクターのマーカ
ー、例えば薬剤耐性マーカーとＧ６ Ｐ Ｄ Ｈを発現
し得る微生物を検索すればよく、例えば、薬剤耐性マー
カーに基づく選択培地で生育し、且つＧ ６ Ｐ Ｄ
Ｈを生成する微生物を好ましくは、発色系を用いてｊＭ
択ずればよい。
上記の遺伝子操作に一般的に使用される量的関係は、供
与微生物からのＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡを０．１
〜１０μｇに対し、制限酵素を約１〜］Ｏｕ、リガーゼ
約３００ｕ、その他の酵素約１〜１０ｕ程度が例示され
る。
与微生物からのＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡを０．１
〜１０μｇに対し、制限酵素を約１〜］Ｏｕ、リガーゼ
約３００ｕ、その他の酵素約１〜１０ｕ程度が例示され
る。
かくして得られた形質転換体である微生物例えば、エシ
ェリヒア属に属し、エシェリヒア・コリに属する微生物
は、栄＃培地に培養されることにより多量の０６ Ｐ
Ｄ ｌ−１を安定して産生じ得る。形質転換体を具体的
に例示すれば、第２図に示されたＤＮＡをプラスミドｐ
ＡｃＹｃ１８４ （Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １３４、
１１４Ｈ１９８１））に組み込み、宿主微生物エシェリ
ヒア・コリＤ Ｈ１（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、、ｅｔ
ａｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ、ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ（１９８２）、５０４
−５０６）にトランスフォーメーションしＧ６ＰＤＨを
作成する微生物を選択して得たエシェリヒア・コリＤＨ
１・ｐＧ６ＰＤＨ１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
ＤＨＩ・ｐ Ｇ ６ Ｐ Ｄ Ｈ１、微工研条寄第
２］７４号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１７４）が挙げられ
る。
ェリヒア属に属し、エシェリヒア・コリに属する微生物
は、栄＃培地に培養されることにより多量の０６ Ｐ
Ｄ ｌ−１を安定して産生じ得る。形質転換体を具体的
に例示すれば、第２図に示されたＤＮＡをプラスミドｐ
ＡｃＹｃ１８４ （Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １３４、
１１４Ｈ１９８１））に組み込み、宿主微生物エシェリ
ヒア・コリＤ Ｈ１（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、、ｅｔ
ａｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ、ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ（１９８２）、５０４
−５０６）にトランスフォーメーションしＧ６ＰＤＨを
作成する微生物を選択して得たエシェリヒア・コリＤＨ
１・ｐＧ６ＰＤＨ１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
ＤＨＩ・ｐ Ｇ ６ Ｐ Ｄ Ｈ１、微工研条寄第
２］７４号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１７４）が挙げられ
る。
このようにして−度選択された組換えＤＮＡは、該組換
えＤＮＡを保持する形質転換微生物から取り出され、他
の宿主微生物に移入することも容易に実施できる。また
さらに、該組換えＤＮＡから制限酵素などにより切断し
て０６ Ｐ Ｄ Ｈを構成するポリペプチドのアミノ酸
配列をコードするＤＮＡを切出し、前記と同様な方法に
より切断して得られる他の開環ベクター末端とを結合さ
せて新規な特徴を有する組換えＤＮＡを作製して、他の
宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
えＤＮＡを保持する形質転換微生物から取り出され、他
の宿主微生物に移入することも容易に実施できる。また
さらに、該組換えＤＮＡから制限酵素などにより切断し
て０６ Ｐ Ｄ Ｈを構成するポリペプチドのアミノ酸
配列をコードするＤＮＡを切出し、前記と同様な方法に
より切断して得られる他の開環ベクター末端とを結合さ
せて新規な特徴を有する組換えＤＮＡを作製して、他の
宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
該組換えＤＮＡや該組換えＤＮＡを含むベクタ等の選択
は、第１図に示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
または第２図に示されたＤＮＡの塩基配列の一部に基づ
き作成したプローブを用い、コロニーハイブリダイゼー
ションを行うことによることもできる。
は、第１図に示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
または第２図に示されたＤＮＡの塩基配列の一部に基づ
き作成したプローブを用い、コロニーハイブリダイゼー
ションを行うことによることもできる。
また、本発明のＧ６ＰＤＨは公知の遺伝子操作手段によ
りペプチドの変異をなしてもよく、このようなムティン
のＤＮＡは、本発明のＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈ遺伝子から遺
伝子工学的手法により作製される人工変異遺伝子を意味
し、この人工変異遺伝子は部位特異的塩基変換法および
目的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮＡ断片で置
換するなどの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得ら
れ、斯くして取得された人工変異遺伝子のうち特に優れ
た性質を有するＧ ６ Ｐ Ｄ ＨムティンＤＮＡにつ
いては最終的にはこのムティンＤＮＡをベクターに挿入
せしめて組換えＤＮＡを作成し、これを宿主微生物に移
入させることによって、０６ＰＤＨムテインの製造が可
能である。Ｇ６ＰＤＨをコードするＤＮＡを含むベクタ
ーの具体的な例示としては、エシェリヒア・コリＤＨＩ
・ｐＧ６ＰＤＨ１より採取したプラスミド（ｐ０６ＰＤ
Ｈ１と命名）が挙げられる。プラスミドｐ０６ＰＤＨ１
の制限酵素開裂地図は、第３図に示される通りであった
。
りペプチドの変異をなしてもよく、このようなムティン
のＤＮＡは、本発明のＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈ遺伝子から遺
伝子工学的手法により作製される人工変異遺伝子を意味
し、この人工変異遺伝子は部位特異的塩基変換法および
目的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮＡ断片で置
換するなどの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得ら
れ、斯くして取得された人工変異遺伝子のうち特に優れ
た性質を有するＧ ６ Ｐ Ｄ ＨムティンＤＮＡにつ
いては最終的にはこのムティンＤＮＡをベクターに挿入
せしめて組換えＤＮＡを作成し、これを宿主微生物に移
入させることによって、０６ＰＤＨムテインの製造が可
能である。Ｇ６ＰＤＨをコードするＤＮＡを含むベクタ
ーの具体的な例示としては、エシェリヒア・コリＤＨＩ
・ｐＧ６ＰＤＨ１より採取したプラスミド（ｐ０６ＰＤ
Ｈ１と命名）が挙げられる。プラスミドｐ０６ＰＤＨ１
の制限酵素開裂地図は、第３図に示される通りであった
。
上述の方法によって得られたＧ６ＰＤＨを構成するポリ
ペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列
は、５ｃｉｅｎｃｅ ２１４ １２０５−１２１０ （
１９８１年）に示されているジデオキシ法で解読し、ま
たＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈを構成するポリペプチドの全アミ
ノ酸配列は、塩基配列より予測決定した。また、以下の
方法により培養精製した該０６ Ｐ Ｄ Ｈであるポリ
ペプチドを用いて、液相プロティンシーケンサ−（ベッ
クマン社製：ＢＥＣＫＭＡＮ ｓｙｓｔｅｍ ８９
０ＭＢ）によりそのＮ末端アミノ酸配列を決定し、少な
くとも該Ｇ６ＰＤＨのＮ末端アミノ酸配列が、予測決定
されたアミノ酸配列の一部と一致することを確認した。
ペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列
は、５ｃｉｅｎｃｅ ２１４ １２０５−１２１０ （
１９８１年）に示されているジデオキシ法で解読し、ま
たＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈを構成するポリペプチドの全アミ
ノ酸配列は、塩基配列より予測決定した。また、以下の
方法により培養精製した該０６ Ｐ Ｄ Ｈであるポリ
ペプチドを用いて、液相プロティンシーケンサ−（ベッ
クマン社製：ＢＥＣＫＭＡＮ ｓｙｓｔｅｍ ８９
０ＭＢ）によりそのＮ末端アミノ酸配列を決定し、少な
くとも該Ｇ６ＰＤＨのＮ末端アミノ酸配列が、予測決定
されたアミノ酸配列の一部と一致することを確認した。
形質転換体により該０６ Ｐ Ｄ Ｈを製造するに当た
っては、該形質転換体を栄養培地で培養して菌体内また
は培養液中に該Ｇ ６ Ｐ Ｄ Ｈを産生せしめ、培養
終了後、得られた培養物を濾過または遠心分離などの手
段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法ま
たはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に
応してＥＤＴＡおよび／または適当な界面活性剤等を添
加して該Ｇ６ＰＤ Ｈを可溶化し、水溶液として分離採
取する。この様にして得られた該０６ Ｐ Ｄ Ｈの水
溶液を濃縮するか、または濃縮することなく硫安分画、
ゲル濾過、アフィニティークロマＩ・グラフィー等の吸
着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
により処理して、純度のよい該０６ Ｐ Ｄ Ｈを得る
ことができる。
っては、該形質転換体を栄養培地で培養して菌体内また
は培養液中に該Ｇ ６ Ｐ Ｄ Ｈを産生せしめ、培養
終了後、得られた培養物を濾過または遠心分離などの手
段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法ま
たはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に
応してＥＤＴＡおよび／または適当な界面活性剤等を添
加して該Ｇ６ＰＤ Ｈを可溶化し、水溶液として分離採
取する。この様にして得られた該０６ Ｐ Ｄ Ｈの水
溶液を濃縮するか、または濃縮することなく硫安分画、
ゲル濾過、アフィニティークロマＩ・グラフィー等の吸
着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
により処理して、純度のよい該０６ Ｐ Ｄ Ｈを得る
ことができる。
特に、エシェリヒア・コリ等の適当な宿主微生物を選択
すれば、上記工程に加熱処理工程を付加することがより
好ましく、例えば、培養液や菌体破壊・可溶化物を６０
゛Ｃ１１６時間加熱処理すると、０６ＰＤＨの精製工程
が極めて簡略することができるとともに、該Ｇ ６ Ｐ
Ｄ Ｈを臨床診断等に用いるときに問題となる夾雑酵
素が効率よく除かれ、夾雑酵素の影響のない極めて優れ
た特性のあるＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈが得られる。夾雑酵素
としては、ＮＡＤ （Ｐ）Ｈオキシダーゼ、ラクテート
デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グル
コースイソメラーゼ、ＡＴＰａ ｓ ｅ、アルカリフォ
スファターゼ、フォスフォグルコムターゼ、ヘキソース
−６−フォスフェートイソメラーゼ、ＮＡＤ （Ｐ）ヌ
クレオシダーゼ、マレイドデヒドロゲナーゼ、ザクシネ
イＩ・デヒドロゲナーゼ等が挙げられるが、本発明にお
いては、特に、取り除くことが難しく、臨床診断等に用
いるときに問題となるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼとラ
フチー１−デヒドロゲナーゼの夾雑酵素について、０６
Ｐ Ｄ Ｈ活性１００単位に対し、夾雑酵素であるＮ
ＡＤ （Ｐ）Ｈオキシダーゼとラクテートデヒドロゲナ
ーゼの活性が０．０００１単位以下であるＧ ６１）
Ｄ ＋−１を得ることができる。
すれば、上記工程に加熱処理工程を付加することがより
好ましく、例えば、培養液や菌体破壊・可溶化物を６０
゛Ｃ１１６時間加熱処理すると、０６ＰＤＨの精製工程
が極めて簡略することができるとともに、該Ｇ ６ Ｐ
Ｄ Ｈを臨床診断等に用いるときに問題となる夾雑酵
素が効率よく除かれ、夾雑酵素の影響のない極めて優れ
た特性のあるＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈが得られる。夾雑酵素
としては、ＮＡＤ （Ｐ）Ｈオキシダーゼ、ラクテート
デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グル
コースイソメラーゼ、ＡＴＰａ ｓ ｅ、アルカリフォ
スファターゼ、フォスフォグルコムターゼ、ヘキソース
−６−フォスフェートイソメラーゼ、ＮＡＤ （Ｐ）ヌ
クレオシダーゼ、マレイドデヒドロゲナーゼ、ザクシネ
イＩ・デヒドロゲナーゼ等が挙げられるが、本発明にお
いては、特に、取り除くことが難しく、臨床診断等に用
いるときに問題となるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼとラ
フチー１−デヒドロゲナーゼの夾雑酵素について、０６
Ｐ Ｄ Ｈ活性１００単位に対し、夾雑酵素であるＮ
ＡＤ （Ｐ）Ｈオキシダーゼとラクテートデヒドロゲナ
ーゼの活性が０．０００１単位以下であるＧ ６１）
Ｄ ＋−１を得ることができる。
形質転換体である微生物の培養形態はその栄養生理的性
質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多くの場
合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気攪拌培養
を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物
の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素
源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例え
ばグルコース、サッカロース、ラクトース、マルトース
フラクトース、糖蜜、などが使用される。窒素源として
は利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン
、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物などが使
用される。その他、リン酸塩、炭酸塩２硫酸塩、マグネ
シウム、カルシウムカリウム、鉄、マンガン、亜鉛など
の塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に
応じて使用される。
質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多くの場
合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気攪拌培養
を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物
の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素
源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例え
ばグルコース、サッカロース、ラクトース、マルトース
フラクトース、糖蜜、などが使用される。窒素源として
は利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン
、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物などが使
用される。その他、リン酸塩、炭酸塩２硫酸塩、マグネ
シウム、カルシウムカリウム、鉄、マンガン、亜鉛など
の塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に
応じて使用される。
培養温度は微生物が発育し、０６ Ｐ Ｄ Ｈを生産す
る範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合
、好ましくは２０〜４２“Ｃ程度である。
る範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合
、好ましくは２０〜４２“Ｃ程度である。
培養時間は、条件によって多少異なるが、Ｇ６ＰＤＨが
最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を
終了すればよく、通常は１２〜４８時間程度である。培
地ｐＨは菌が発育し、０６ＰＤＨを生産する範囲で適宜
変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６，０〜８０程度で
ある。
最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を
終了すればよく、通常は１２〜４８時間程度である。培
地ｐＨは菌が発育し、０６ＰＤＨを生産する範囲で適宜
変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６，０〜８０程度で
ある。
培養物中の０６ Ｐ Ｄ Ｈは、菌体を含む培養液その
ままを採取し、利用することもできるが、一般には常法
に従って、０６ Ｐ Ｄ Ｈが培養液中に存在する場合
には、濾過、遠心分離などにより０６ＰＤＨ含有溶液と
微生物菌体とを分離した後に利用される。０６ＰＤＨが
菌体内に存在する場合には、得られた培養物を−ｃｉ過
または遠心分離などの手段により、菌体を採取し、次い
でこの菌体を機械的方法またはリヅチームなどの酵素的
方法で破壊し、また必要に応してＥＤＴＡ等のキレ−１
・剤および／または界面活性剤を添加して０６ Ｐ Ｄ
Ｈを可溶化し水溶液として分離採取する。
ままを採取し、利用することもできるが、一般には常法
に従って、０６ Ｐ Ｄ Ｈが培養液中に存在する場合
には、濾過、遠心分離などにより０６ＰＤＨ含有溶液と
微生物菌体とを分離した後に利用される。０６ＰＤＨが
菌体内に存在する場合には、得られた培養物を−ｃｉ過
または遠心分離などの手段により、菌体を採取し、次い
でこの菌体を機械的方法またはリヅチームなどの酵素的
方法で破壊し、また必要に応してＥＤＴＡ等のキレ−１
・剤および／または界面活性剤を添加して０６ Ｐ Ｄ
Ｈを可溶化し水溶液として分離採取する。
この様にして得られたＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈ含有溶液を、
例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸すｌ・リ
ウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えば
メタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱
法により沈澱せしめればよい。
例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸すｌ・リ
ウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えば
メタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱
法により沈澱せしめればよい。
次いでこの沈澱物を、水に溶解し、半透膜にて透析せし
めて、より低分子量の不純物を除去することができる。
めて、より低分子量の不純物を除去することができる。
また吸着剤あるいはゲル濾過剤などによるゲル濾過、ア
フィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー等により精製し
、これらの手段を用いて得られるＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈ含
有溶液から、減圧濃縮凍結乾燥等の処理により精製され
た０６ＰＤＩ］が得られる。
フィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー等により精製し
、これらの手段を用いて得られるＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈ含
有溶液から、減圧濃縮凍結乾燥等の処理により精製され
た０６ＰＤＩ］が得られる。
以上の製造法により得られる０ ６ Ｐ Ｄ Ｈとじて
例えば下記の諸物性を有するＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈが例示
される。
例えば下記の諸物性を有するＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈが例示
される。
（１）活性測定法
■Ｇ６ＰＤＨ活性４１１１定法
反応液
０．２ＭＩＪン酸八ンフへ −（ｐＨ７，５） ０
．２ｍ ＊１０χ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
０．０５ｍｎ１χ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０００，１
ｍ ｊ！１０ｍＭ ＮＡ Ｄ Ｐ
Ｏ，１，ｍ １２１００ｕ／ｍ Ａジアホラーゼ
０．０５ ｍ １０．２５％ Ｎ Ｂ Ｔ
０．１ｍ ！！０．１Ｍグルコー
ス−６−リン酸 ３２ｍｆｆ蒸留水
ＱＪｍ６ 操作 上記の組成の反応液］、Ｏｍｊ！を試験管に分取し、３
７℃１３分間予備加温した後、酵素液２゜μβを加え３
７°ｃ、１０分間反応を行い、反応後、２．０ｍ＋２の
０．ＩＮ ＨＣｊ！を加えて反応を停止し、生した紫
色を５５０ｎｍの波長にて比色定量する。１分間に１μ
ｍｏｌｅのグルコース−６リン酸を酸化しグルコノラク
トン−６−リン酸お生する活性を１単位（Ｕ）とした。
．２ｍ ＊１０χ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
０．０５ｍｎ１χ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０００，１
ｍ ｊ！１０ｍＭ ＮＡ Ｄ Ｐ
Ｏ，１，ｍ １２１００ｕ／ｍ Ａジアホラーゼ
０．０５ ｍ １０．２５％ Ｎ Ｂ Ｔ
０．１ｍ ！！０．１Ｍグルコー
ス−６−リン酸 ３２ｍｆｆ蒸留水
ＱＪｍ６ 操作 上記の組成の反応液］、Ｏｍｊ！を試験管に分取し、３
７℃１３分間予備加温した後、酵素液２゜μβを加え３
７°ｃ、１０分間反応を行い、反応後、２．０ｍ＋２の
０．ＩＮ ＨＣｊ！を加えて反応を停止し、生した紫
色を５５０ｎｍの波長にて比色定量する。１分間に１μ
ｍｏｌｅのグルコース−６リン酸を酸化しグルコノラク
トン−６−リン酸お生する活性を１単位（Ｕ）とした。
■ＮＡＤ （Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性測定法反応液
８０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ ハソフｙ − （ｐ
Ｈ８．５） ０．５ｍ １０、６ｍＭ ＮＡＤ （
Ｐ） Ｈ ０．５ｍ１２操作 上記の組成の反応液１．０ｍｆｆを２．０ｍβ容石英セ
ルに入れ３７℃５分間インキュベー１・する、５０００
ｕ／ｍ＃に３周製した０ ６ Ｐ Ｄ Ｈ溶液０、２ｍ
ρを添加攪拌し３７℃においてＡ３４０の減少を経時的
に測定する（ΔＡ）。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの活
性は、１分間当り１μｍｏｌｅのＮＡＤ （Ｐ）Ｈの減
少を１単位（Ｕ）とした。
Ｈ８．５） ０．５ｍ １０、６ｍＭ ＮＡＤ （
Ｐ） Ｈ ０．５ｍ１２操作 上記の組成の反応液１．０ｍｆｆを２．０ｍβ容石英セ
ルに入れ３７℃５分間インキュベー１・する、５０００
ｕ／ｍ＃に３周製した０ ６ Ｐ Ｄ Ｈ溶液０、２ｍ
ρを添加攪拌し３７℃においてＡ３４０の減少を経時的
に測定する（ΔＡ）。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの活
性は、１分間当り１μｍｏｌｅのＮＡＤ （Ｐ）Ｈの減
少を１単位（Ｕ）とした。
Ｔ；反応時間
６、２２； ＮＡＤ （Ｐ）ＨのＡ：＋４０における吸
光度■ラクテートデヒドロゲナーゼ活性測定法反応液 ０、２Ｍ ＴｒｉｓｉｌＣＩ ハソフｙ − （ｐＨ
８．５） ０．２ｍ （１０、 ＩＭ ピルビン酸
ナトリウム Ｑ．１ｍ．ｅ３ｍＭ ＮＡＤ
（Ｐ） Ｈ ０．１．ｍｎ蒸留水
Ｑ，６ｍ ７！操作 上記の組成の反応液１、Ｏｍρを２．０ｍｌ容石英セル
に入れ３７℃５分間インキュベートする、５０００ｕ／
ｍ６に調製したＧ６ＰＤＨｉ液０、 ２ｍｆｆｉを添
加攪拌し３７℃においてＡ３４０の減少を経時約６こ測
定する（八Ａ）。ラクテートデヒドロゲナーゼの活性は
、１分間当り１μｍｏｌｅのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を１
単位（Ｕ）とした。
光度■ラクテートデヒドロゲナーゼ活性測定法反応液 ０、２Ｍ ＴｒｉｓｉｌＣＩ ハソフｙ − （ｐＨ
８．５） ０．２ｍ （１０、 ＩＭ ピルビン酸
ナトリウム Ｑ．１ｍ．ｅ３ｍＭ ＮＡＤ
（Ｐ） Ｈ ０．１．ｍｎ蒸留水
Ｑ，６ｍ ７！操作 上記の組成の反応液１、Ｏｍρを２．０ｍｌ容石英セル
に入れ３７℃５分間インキュベートする、５０００ｕ／
ｍ６に調製したＧ６ＰＤＨｉ液０、 ２ｍｆｆｉを添
加攪拌し３７℃においてＡ３４０の減少を経時約６こ測
定する（八Ａ）。ラクテートデヒドロゲナーゼの活性は
、１分間当り１μｍｏｌｅのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を１
単位（Ｕ）とした。
Ｔ；反応時間
６、２２；ＮＡＤ （Ｐ）ＨのＡ ３ ４ ０における
吸光度（２）理化学的性質 （ａｌ 作用；グルコース−６−リン酸とＮＡＤ （
Ｐ）からグルコノラクトン−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）
Ｈを生成する酵素反応を触媒する酵素である。
吸光度（２）理化学的性質 （ａｌ 作用；グルコース−６−リン酸とＮＡＤ （
Ｐ）からグルコノラクトン−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）
Ｈを生成する酵素反応を触媒する酵素である。
（ｂｌ ｉ質性異性；少なくとも、グルコース−６〜
リン酸に特異的に作用する。
リン酸に特異的に作用する。
基質 相対活性（％）グルコース−６
−リン酸 １００マンノース−６−リン酸
３８．５ガラクト−ス−６−リン酸 １９
．３フルクト−ス−６−リン酸 Ｏグルコース
−１−リン酸 Ｏグルコサミン−６−リン
酸 ０６−ホスホグルコン酸 ０
補酵素 ）（ｍ値（ｍＭ）ＮＡＤＰ
約８．３ＸＩＯ−３ＮＡＤ 約
１．２ （ｃｌ 至適ｐ Ｈ； ８〜９、 種々のｐ Ｈ値の緩衝液を用いて、前述の酵素活性測定
法に従い、測定した結果、ｐ ｌ−１８〜９の範囲に至
適ｐ Ｈを有していた。
−リン酸 １００マンノース−６−リン酸
３８．５ガラクト−ス−６−リン酸 １９
．３フルクト−ス−６−リン酸 Ｏグルコース
−１−リン酸 Ｏグルコサミン−６−リン
酸 ０６−ホスホグルコン酸 ０
補酵素 ）（ｍ値（ｍＭ）ＮＡＤＰ
約８．３ＸＩＯ−３ＮＡＤ 約
１．２ （ｃｌ 至適ｐ Ｈ； ８〜９、 種々のｐ Ｈ値の緩衝液を用いて、前述の酵素活性測定
法に従い、測定した結果、ｐ ｌ−１８〜９の範囲に至
適ｐ Ｈを有していた。
＋ｔｊｌ 等電点；６，１±０．６
アンフオライン ビーエージ−ブレート（八ＭＰＩＩＯ
ＬＩＮＥ ＰＡＧＰＬＡＴＥ ； Ｌ Ｋ Ｂ社製）を
用いる等電点電気泳動法により測定した結果、ｐＴ６．
ｌ±０．６に等電点を有する。
ＬＩＮＥ ＰＡＧＰＬＡＴＥ ； Ｌ Ｋ Ｂ社製）を
用いる等電点電気泳動法により測定した結果、ｐＴ６．
ｌ±０．６に等電点を有する。
（ｅ＋ 熱安定性：約６５℃１１５分間処理で安定で
ある。
ある。
４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｎハソフｙ−（ｐＨ７，５
）中で１５分間各温度で処理すると、約６５℃以下の温
度で約１００％の残存活性を有し、７０℃で約７０％の
残存活性を有する。
）中で１５分間各温度で処理すると、約６５℃以下の温
度で約１００％の残存活性を有し、７０℃で約７０％の
残存活性を有する。
（ｆ）ｐＨ安定性、 ｐ ｌ−Ｔ ６〜８（７０℃１１
５分間）において安定である。
５分間）において安定である。
試験ｐ Ｈ緩１１ｊ液は、ｐＨ４，，５〜６．５までは
４０ｍＭ ＤＭＧ（ジメチルグルタル酸）ハソファー
、ｐｌ（ｅ、Ｏ〜８．０までは４０ｍＭリン酸ハソファ
ー、ｐＨ７，０〜９．０までは４０ｍＭトリス塩酸緩衝
液を用いた。
４０ｍＭ ＤＭＧ（ジメチルグルタル酸）ハソファー
、ｐｌ（ｅ、Ｏ〜８．０までは４０ｍＭリン酸ハソファ
ー、ｐＨ７，０〜９．０までは４０ｍＭトリス塩酸緩衝
液を用いた。
ｆｇｌ 分子量；約２７０．０００、ＴＳＫ−Ｇｅ１
． Ｇ３０００ＳＷカラムクロマトグラフイーによる
。標準蛋白質として、オボアルブミン ４
５，０００生血端アルブミン ６７．０００
アルドラーゼ（ウサギ筋肉）１５０，０００カクラーゼ
（牛肝臓＞ ２１０，０００を用いた。測定さ
れた分子量と塩基配列との比較から零Ｇ ６ Ｐ Ｄ
Ｈは、ポリペプチドの４〜６量体の会合物と推定される
。
． Ｇ３０００ＳＷカラムクロマトグラフイーによる
。標準蛋白質として、オボアルブミン ４
５，０００生血端アルブミン ６７．０００
アルドラーゼ（ウサギ筋肉）１５０，０００カクラーゼ
（牛肝臓＞ ２１０，０００を用いた。測定さ
れた分子量と塩基配列との比較から零Ｇ ６ Ｐ Ｄ
Ｈは、ポリペプチドの４〜６量体の会合物と推定される
。
ｆｈ） 阻害剤；Ｍｎ”、Ｃｕ”、／ｌ”の存在によ
り活性の阻害を受ける。
り活性の阻害を受ける。
本明細書に記載のアミノ酸、ペプチド、核酸、核酸関連
物質、その他に関する略号は、それらの当該分野におけ
る慣用略号に基づくもので、それらの例を以下に列記す
る。またすべてのアミノ酸は１５体を示すものとする。
物質、その他に関する略号は、それらの当該分野におけ
る慣用略号に基づくもので、それらの例を以下に列記す
る。またすべてのアミノ酸は１５体を示すものとする。
ＤＮＡ ： デオキシリボ核酸
ＲＮＡ ： リボ核酸
Ａ 、 アデニン
Ｔ ： チミン
Ｇ ： グアニン
Ｃ： シトシン
Ａｌａ −アラニン
ｒｇ
ｓｎ
ｓｐ
ｙｓ
ｌｎ
ｌｕ
１ ｙ
ｉ Ｓ
１ｅ
ｅ ｕ
ｙｓ
ｅ ｔ
ｈｅ
Ｐｒ。
ｅｒ
ｈｒ
ｒｐ
ｙｒ
ａｌ
〔実施例〕
アルギニン
アスパラギン
アスパラギン酸
システィン
グルタミン
グルタミン酸
グリシン
ヒスチジン
イソロイシン
ロイシン
リジン
メチオニン
フェニルアラニン
プロリン
セリン
スレオニン
トリプトファン
チロシン
ハリン
以下、実施例を挙げて本発明の詳細な説明するが、本発
明はこれらによって何ら限定されるものではない。
明はこれらによって何ら限定されるものではない。
実施例１ 〔染色体ＤＮＡの分離〕
Ｂａｃｉｌ目ｕｓ ｓｐ、 Ｔｌ１−３株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−２１７２）の染色体ＤＮＡを次の方法で分離し
た。同菌株を１５０ｍｌ！の普通ブイヨン培地で５０℃
−晩振盪培養後遠心（３０００ｒｐｍＩＯ分）により集
菌した。１０％サッカロース、５０ｒｎＭトリス塩酸（
ｐＨ８，０）５０ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ溶液５ｍＡ
のリゾチーム溶液（１０ｍｇ／１ｎｌ）を加えて３７℃
、１５分間保温し、次いで１ｍβの１０％ＳＤＳ （ド
デシル硫酸ナトリウム）溶液ヲ加えた。この懸濁液に等
量のクロロホルムフェノール混液（１，：１）を加え、
攪拌混合し、１００００ ｒ ｐ ｍ ３分の遠心で水
層と溶媒層に分け、水層を分取した。この水層に２倍量
のエタノールを静かに重層し、ガラス棒でゆっくり攪拌
しながらＤＮＡをガラス棒にまきつかせて分離した。こ
れを１０ｍρの１０ｍＭ＋−リス塩酸（ｐＨ８０） 、
１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ溶液（以下７゛Ｅと略す）
で溶解した。これを等量のクロロホルム−フェノール混
液で処理後、遠心により水層を分取し、２倍量のエタノ
ールを加えて上記の方法でもう一度ＤＮＡを分離し、２
ｍ１ｌのＴＥで溶解した。
ＢＰ−２１７２）の染色体ＤＮＡを次の方法で分離し
た。同菌株を１５０ｍｌ！の普通ブイヨン培地で５０℃
−晩振盪培養後遠心（３０００ｒｐｍＩＯ分）により集
菌した。１０％サッカロース、５０ｒｎＭトリス塩酸（
ｐＨ８，０）５０ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ溶液５ｍＡ
のリゾチーム溶液（１０ｍｇ／１ｎｌ）を加えて３７℃
、１５分間保温し、次いで１ｍβの１０％ＳＤＳ （ド
デシル硫酸ナトリウム）溶液ヲ加えた。この懸濁液に等
量のクロロホルムフェノール混液（１，：１）を加え、
攪拌混合し、１００００ ｒ ｐ ｍ ３分の遠心で水
層と溶媒層に分け、水層を分取した。この水層に２倍量
のエタノールを静かに重層し、ガラス棒でゆっくり攪拌
しながらＤＮＡをガラス棒にまきつかせて分離した。こ
れを１０ｍρの１０ｍＭ＋−リス塩酸（ｐＨ８０） 、
１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ溶液（以下７゛Ｅと略す）
で溶解した。これを等量のクロロホルム−フェノール混
液で処理後、遠心により水層を分取し、２倍量のエタノ
ールを加えて上記の方法でもう一度ＤＮＡを分離し、２
ｍ１ｌのＴＥで溶解した。
実施例２ １：ｐＡｃＹｃ］８４プラスミドＤＮＡの
分離〕 ｐＡｃＹｃ１８４を保有するエシェリヒア・コリｐ Ｍ
１９１ （Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １３４．１４
４Ｈ９８１） ； ＡＴＣＣ３７０３３）を１７！のＢ
ＨＩ培地（Ｄ ｉ ｆＣＯ社製）で振盪培養した。濁
度がＯＤ ｂ ｔ、。−１０に増殖したとき、スペクチ
ノマイシン（最終濃度３００μｇ／ｍ＃）を加え、さら
に３７℃で１６時間以上振盪を続けた。３０００ｒｐｍ
ＩＯ分間の遠心により集菌し、リゾチーム−３ＤＳ法と
セシウムクロライド−エチジウムブロマイド法（Ｍａｎ
ｉｏｒｔｉｓ ら： Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ ｐｐ８６−９４ Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ １
ｌａｒｂｏｒ （１９８２） ）に従いプラスミドＤＮ
Ａを８周製した。
分離〕 ｐＡｃＹｃ１８４を保有するエシェリヒア・コリｐ Ｍ
１９１ （Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １３４．１４
４Ｈ９８１） ； ＡＴＣＣ３７０３３）を１７！のＢ
ＨＩ培地（Ｄ ｉ ｆＣＯ社製）で振盪培養した。濁
度がＯＤ ｂ ｔ、。−１０に増殖したとき、スペクチ
ノマイシン（最終濃度３００μｇ／ｍ＃）を加え、さら
に３７℃で１６時間以上振盪を続けた。３０００ｒｐｍ
ＩＯ分間の遠心により集菌し、リゾチーム−３ＤＳ法と
セシウムクロライド−エチジウムブロマイド法（Ｍａｎ
ｉｏｒｔｉｓ ら： Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ ｐｐ８６−９４ Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ １
ｌａｒｂｏｒ （１９８２） ）に従いプラスミドＤＮ
Ａを８周製した。
実施例３ （Ｇ６ＰＤＨ遺伝子を有するプラスミドｐ
Ｇ６ＰＤＨ１の作成〕 （１〕実施例１で調製したＢａｃｉｌｌｌｕｓ ｓｐ、
Ｔ１１−３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１７２）の染色
体ＤＮＡ２μｌ（約０．５μｇ）と１００倍量の切断用
バッフｙ−（１００ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，０＞、７
０ ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃｊ！ ２．１．０Ｍ ＫＣ
Ｉ、７０ｍＭメルカプトエタノール）１μ１．、ＭｂＯ
■（宝酒造製、８ｕｎｉｔ／ ＩＩ Ｉｌ） １ 、
＋７β、水６μ、Ｃを混合し、３７℃１時間切断した。
Ｇ６ＰＤＨ１の作成〕 （１〕実施例１で調製したＢａｃｉｌｌｌｕｓ ｓｐ、
Ｔ１１−３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１７２）の染色
体ＤＮＡ２μｌ（約０．５μｇ）と１００倍量の切断用
バッフｙ−（１００ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，０＞、７
０ ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃｊ！ ２．１．０Ｍ ＫＣ
Ｉ、７０ｍＭメルカプトエタノール）１μ１．、ＭｂＯ
■（宝酒造製、８ｕｎｉｔ／ ＩＩ Ｉｌ） １ 、
＋７β、水６μ、Ｃを混合し、３７℃１時間切断した。
別に調製したプラスミドｐＡｃＹｃ１８４ＤＮＡ約０．
３μｇを同様の方法を用いて３ｄｍＨ＋で切断し、さら
にアルカリ製フォスファターゼ（以下ＢＡＰと略すこと
がある。宝酒造製） ９． ５ｕｎｉｔを加え、６５’
Ｃ１時間処理した。これらの切断した２種のＤＮＡ溶液
を混合し、その１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え
、さらに全体量と等量のクロロホルム−フェノール混液
で処理し、遠心分離により水層を分取した。この水層に
２倍容のエタノールを加え、遠心でＤＮＡを沈殿させた
のち減圧乾燥した。水８９μｌで溶解後、１００倍量の
ライゲーションバッファ （０，５Ｍ）リス塩酸（ｐＨ
７゜６） 、０．１Ｍ ＭｇＣｊ２２．１．０Ｍジチ
オスレイトール、１０ｍＭスペルミジン、１０ｍＭＡＴ
Ｐ）］ ＯｐＨとＴ４ＤＮＡリガーゼ１μｌ（宝酒造製
、１７５ｕｎｉｔ）を加え混合し４ ’ｃで一晩放置し
た。このＤＮＡ？容液をクロロホルム−フェノール処理
し、エタノール沈殿を集め減圧乾燥した後、１０μｌの
ＴＥで溶解した。
３μｇを同様の方法を用いて３ｄｍＨ＋で切断し、さら
にアルカリ製フォスファターゼ（以下ＢＡＰと略すこと
がある。宝酒造製） ９． ５ｕｎｉｔを加え、６５’
Ｃ１時間処理した。これらの切断した２種のＤＮＡ溶液
を混合し、その１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え
、さらに全体量と等量のクロロホルム−フェノール混液
で処理し、遠心分離により水層を分取した。この水層に
２倍容のエタノールを加え、遠心でＤＮＡを沈殿させた
のち減圧乾燥した。水８９μｌで溶解後、１００倍量の
ライゲーションバッファ （０，５Ｍ）リス塩酸（ｐＨ
７゜６） 、０．１Ｍ ＭｇＣｊ２２．１．０Ｍジチ
オスレイトール、１０ｍＭスペルミジン、１０ｍＭＡＴ
Ｐ）］ ＯｐＨとＴ４ＤＮＡリガーゼ１μｌ（宝酒造製
、１７５ｕｎｉｔ）を加え混合し４ ’ｃで一晩放置し
た。このＤＮＡ？容液をクロロホルム−フェノール処理
し、エタノール沈殿を集め減圧乾燥した後、１０μｌの
ＴＥで溶解した。
（ｉｉ）１００ｍｆｆのＢＨＩ培地（Ｂｒａｉｎ Ｈｅ
ａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ、、Ｄ ｉ ｒ ｃ ｏ社製）
で培養した対数増殖期のエシェリヒア・コリＤＨ１株〔
国立遺伝学研究所より分与を受けた、ストック番号ＭＥ
８５６９〕を遠心分離により集菌しく１１００００ｒｐ
、２分間）４０ｍ１ｆの氷冷した３０ｍＭ酢酸カリウム
、１００ｍＭ Ｒｂ（１！、１０ｍＭ ＣａＣｌ２
．５０ｍＭ ＭｎＣｊ！２１５％グリセリンを含んだ
溶液（ｐＨ５，８）で懸濁した。０℃で５分間放置後、
遠心し上清をすて、さらに４ｍｌの１０ｍＭ ＭＯＰ
Ｓ緩衝液（ドータイト社製）、７５ｍＭ ＣａＣＮｚ
、１０ｍＭ Ｒｂ（１！および１５％グリセリンを含
んだ溶液（ｐＨ６，５）で懸濁し、０℃で１５分間放置
してコンピテント細胞とした。
ａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ、、Ｄ ｉ ｒ ｃ ｏ社製）
で培養した対数増殖期のエシェリヒア・コリＤＨ１株〔
国立遺伝学研究所より分与を受けた、ストック番号ＭＥ
８５６９〕を遠心分離により集菌しく１１００００ｒｐ
、２分間）４０ｍ１ｆの氷冷した３０ｍＭ酢酸カリウム
、１００ｍＭ Ｒｂ（１！、１０ｍＭ ＣａＣｌ２
．５０ｍＭ ＭｎＣｊ！２１５％グリセリンを含んだ
溶液（ｐＨ５，８）で懸濁した。０℃で５分間放置後、
遠心し上清をすて、さらに４ｍｌの１０ｍＭ ＭＯＰ
Ｓ緩衝液（ドータイト社製）、７５ｍＭ ＣａＣＮｚ
、１０ｍＭ Ｒｂ（１！および１５％グリセリンを含
んだ溶液（ｐＨ６，５）で懸濁し、０℃で１５分間放置
してコンピテント細胞とした。
（ｉｉｉ ）この大腸菌懸濁液２００μｐに（ｉ）で調
製したＤＮＡ溶？＆１０μβを加え、３０分間０℃で放
置した。ＢＨＩ培地１ ｍρを加え、３７℃で９０分間
保’／１４ ？！、この１００μρをクロラムフェニコ
ール（２５μｇ／ｍρ）を含んだＢＨＩ寒天プレートに
まき、３７℃で一晩培養し形質転換体を得た。この形質
転換体をアッセイ用寒天（組成は、ＩＭリン酸ハソフｙ
−（ｐＨ６，５）４ｍｆｆ、１０％トリトンＸ−１０
０１ｍｊ！、１００ｍＭ ＮＡＤＰ１ｍｊ！、５００
ｕ／ｒｒ＋ｊ！ジアホラ一ゼ１ｍｆｆ、１％ＮＢＴ２．
５ｍＡ、ＩＭ グルコース６リン酸２ｍＡ、寒天１．５
ｇ、ｉ留水８８．５ｍβ）のプレートにレプリカし、そ
のまま室温で色の変化を観察した。
製したＤＮＡ溶？＆１０μβを加え、３０分間０℃で放
置した。ＢＨＩ培地１ ｍρを加え、３７℃で９０分間
保’／１４ ？！、この１００μρをクロラムフェニコ
ール（２５μｇ／ｍρ）を含んだＢＨＩ寒天プレートに
まき、３７℃で一晩培養し形質転換体を得た。この形質
転換体をアッセイ用寒天（組成は、ＩＭリン酸ハソフｙ
−（ｐＨ６，５）４ｍｆｆ、１０％トリトンＸ−１０
０１ｍｊ！、１００ｍＭ ＮＡＤＰ１ｍｊ！、５００
ｕ／ｒｒ＋ｊ！ジアホラ一ゼ１ｍｆｆ、１％ＮＢＴ２．
５ｍＡ、ＩＭ グルコース６リン酸２ｍＡ、寒天１．５
ｇ、ｉ留水８８．５ｍβ）のプレートにレプリカし、そ
のまま室温で色の変化を観察した。
約４５００コロニーの形質転換体を調べたところ、他の
コロニーよりも青変したコロニー１つを得、この株をエ
シェリヒア・コリＤＨＩ・ｐＧ６ＰＤＨＩ株「微工研条
寄第２１７４号」と命名した。この菌を純粋分離後、Ｂ
ＨＩ培地で３７℃−晩培養し、Ｇ６ＰＤ）Ｔの生産性を
調べたところ、１８Ｕ／ｍｆｆのＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈ活
性を有していた。
コロニーよりも青変したコロニー１つを得、この株をエ
シェリヒア・コリＤＨＩ・ｐＧ６ＰＤＨＩ株「微工研条
寄第２１７４号」と命名した。この菌を純粋分離後、Ｂ
ＨＩ培地で３７℃−晩培養し、Ｇ６ＰＤ）Ｔの生産性を
調べたところ、１８Ｕ／ｍｆｆのＧ ６ Ｐ Ｄ Ｈ活
性を有していた。
この菌株の保有していたプラスミドを実施例２と同様に
して分離し、０６ＰＤＨ遺伝子を含みｐＡＣＹＣ１８４
遺伝子を含むプラスミドをｐＧ６Ｐ Ｄ Ｈ１と命名し
た。
して分離し、０６ＰＤＨ遺伝子を含みｐＡＣＹＣ１８４
遺伝子を含むプラスミドをｐＧ６Ｐ Ｄ Ｈ１と命名し
た。
実施例４ （ｐＧ６ＰＤＨ１のマツピングおよび０６
Ｐ Ｄ Ｈ遺伝子の塩基配列の決定〕エシェリヒア・
コリＤＨＩ・ｐＧ６ＰＤＨ１株からｐＡｃＹｃｌ ８４
と同様の方法でｐ０６ＰＤＨ１プラスミドＤＮＡを調製
した。
Ｐ Ｄ Ｈ遺伝子の塩基配列の決定〕エシェリヒア・
コリＤＨＩ・ｐＧ６ＰＤＨ１株からｐＡｃＹｃｌ ８４
と同様の方法でｐ０６ＰＤＨ１プラスミドＤＮＡを調製
した。
ｐＧ６ＰＤ、Ｈ１プラスミドＤＮＡについて制限酵素Ｅ
ｃｏＲ１，Ｃ１ａ ＩＸＥｃｏＲＶ、Ｈ４ｎｄｌｌ［、
ＢｇｌｌＩ、ＢａｍＨｌ、、５ｐｈｌ、Ｎｒｕｌ、、Ｈ
ｐａｌ、、ＭｌｕｌＸＮｃｏｌ、、ＡｐａＬＩ、Ｘｂａ
■ （いずれも宝酒造製）による切断地図を作成した。
ｃｏＲ１，Ｃ１ａ ＩＸＥｃｏＲＶ、Ｈ４ｎｄｌｌ［、
ＢｇｌｌＩ、ＢａｍＨｌ、、５ｐｈｌ、Ｎｒｕｌ、、Ｈ
ｐａｌ、、ＭｌｕｌＸＮｃｏｌ、、ＡｐａＬＩ、Ｘｂａ
■ （いずれも宝酒造製）による切断地図を作成した。
その結果を第３図に示した。Ｇ６ＰＤ Ｈ遺伝子を含ん
だＤＮＡの塩基配列をＭ１３フプージを用いたジデオキ
シ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１４．１２０５−１２１０
（１９８１） ）を用いて決定した。Ｇ ６ Ｐ Ｄ
Ｈの構造遺伝子の塩基配列（第２図）並びにアミノ酸配
列（第１図）をそれぞれ示した。
だＤＮＡの塩基配列をＭ１３フプージを用いたジデオキ
シ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１４．１２０５−１２１０
（１９８１） ）を用いて決定した。Ｇ ６ Ｐ Ｄ
Ｈの構造遺伝子の塩基配列（第２図）並びにアミノ酸配
列（第１図）をそれぞれ示した。
実施例５ （Ｇ６ＰＤＨの製造〕
エシェリヒア・コリＤＨＩ・ｐＧ６ＰＤＨ１株をクロラ
ムフェニコール（三共株式会社製、３０μｇ／ｍｊりを
含む４７！のＢＨＪ培地（ＤｉｆｃＯ社製）で３７℃１
１８時間ジャーファーメンタ−により培養し、５０００
ｒｐｍ１５分間の遠心で集菌した。
ムフェニコール（三共株式会社製、３０μｇ／ｍｊりを
含む４７！のＢＨＪ培地（ＤｉｆｃＯ社製）で３７℃１
１８時間ジャーファーメンタ−により培養し、５０００
ｒｐｍ１５分間の遠心で集菌した。
集菌した菌体を２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７，０
）ｌｆｉで洗浄後、５００ｍ７！の２０ｍＭリン酸バッ
ファ＝（ｐＨ７，０）に懸濁した。リゾチームをｌ ｍ
ｇ ／ ｍ ｊ！、ＥＤＴＡ−２Ｎａを２ｍＭ、トリ
トンＸ−１００を０．１％となるように加えて、３７℃
３０分間保温した後に、ｐＨを７．０になるように調整
し、６０℃６時間加熱処理を行い５０００ｒｐｍ１５分
間の遠心により上清液４．２０ ｍ Ａを分離した（Ｇ
６ＰＤＨの活性は、１６２ｕ／ｍｊ！であった）。この
上清液にアセトン８４０ｍＡを添加し５０００ｒｐｍ１
５分間の遠心により沈殿を分離し、再度、該沈殿物を５
００ｍｌ１の２０ｍＭリン酸八ソフへ−（ｐＨ７０）に
懸濁し、５０００ｒｐｍ１５分間の遠心により上清液４
８０ｍＡを分離した（Ｇ６ＰＤＨの活性は、１１４ｕ／
ｍｎであった）、２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７，
０）で緩衝化したＤＥＡＥ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃ
Ｌ−６Ｂを用いてイオン交換クロマトグラフィー（ファ
ルマシア社製）を行い、活性画分を分取し、透析膜を用
いて脱塩し、酵素標品を得た（３００ｍρ、０６ＰＤＨ
の活性は、１４８ｕ／ｍｆｆ１であった）。
）ｌｆｉで洗浄後、５００ｍ７！の２０ｍＭリン酸バッ
ファ＝（ｐＨ７，０）に懸濁した。リゾチームをｌ ｍ
ｇ ／ ｍ ｊ！、ＥＤＴＡ−２Ｎａを２ｍＭ、トリ
トンＸ−１００を０．１％となるように加えて、３７℃
３０分間保温した後に、ｐＨを７．０になるように調整
し、６０℃６時間加熱処理を行い５０００ｒｐｍ１５分
間の遠心により上清液４．２０ ｍ Ａを分離した（Ｇ
６ＰＤＨの活性は、１６２ｕ／ｍｊ！であった）。この
上清液にアセトン８４０ｍＡを添加し５０００ｒｐｍ１
５分間の遠心により沈殿を分離し、再度、該沈殿物を５
００ｍｌ１の２０ｍＭリン酸八ソフへ−（ｐＨ７０）に
懸濁し、５０００ｒｐｍ１５分間の遠心により上清液４
８０ｍＡを分離した（Ｇ６ＰＤＨの活性は、１１４ｕ／
ｍｎであった）、２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７，
０）で緩衝化したＤＥＡＥ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃ
Ｌ−６Ｂを用いてイオン交換クロマトグラフィー（ファ
ルマシア社製）を行い、活性画分を分取し、透析膜を用
いて脱塩し、酵素標品を得た（３００ｍρ、０６ＰＤＨ
の活性は、１４８ｕ／ｍｆｆ１であった）。
比較例１ 〔従来例〕
バチルス エスピー ＨＴ−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−２
１７２）を４７！のＢＨＩ培地（Ｄｉｆｃ。
１７２）を４７！のＢＨＩ培地（Ｄｉｆｃ。
社製）で５５℃２１８時間ジャーファーメンクーにより
培養し、５０００ｒｐｍ１５分間の遠心で集菌した。
培養し、５０００ｒｐｍ１５分間の遠心で集菌した。
集菌した菌体を２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７，０
）ｉｆｆで洗浄後、５０ ＱｍＡの２０ｍＭリン酸バッ
ファー（ｐＨ７，０）に懸濁した。リヅチームを１ｍｇ
／ｍｆｆ、ＥＤＴＡ−２Ｎａを２ｍＭ、ｌ−リドンＸ−
１００を０．１％となるように加えて、３７°ｃ３０分
間保温した後に、ｐＨを７．０になるように調整し、６
０℃６時間加熱処理を行い５０００ｒｐｍ１５分間の遠
心により」二清液４２０ｍ６を分離した。この上清液に
アセトン８４ ＱｍＡを添加し５０００ ｒ ｐ ｍ
１５分間の遠心により沈殿を分離し、再度、該沈殿物を
５００ｍｐの２０ｍＭリン酸バッファー（ｐ１４７．０
）に懸濁し、５０００ｒｐｍ１５分間の遠心により上清
液４８０ｍβを分離した。２０ｍＭリン酸バッファー（
ｐＨ（７，０）で緩衝化したＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓ
ｅ ＣＬ−６Ｂを用いてイオン交換クロマトグラフィ
ー（ファルマシア社製）を行い、活性画分を分取し、透
析膜を用いて脱塩し、３０％飽和硫安で緩衝化した（＋
ｃｔｙｌ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ （ファ
ルマシア社製）を用いてクロマトグラフィーを行い、活
性画分を分取し、透析膜を用いて脱塩した。次いで、ｈ
ｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅ （ＫＯＫＥＮ社製）を
用いてクロマトグラフィーを行い、活性画分を分取し、
透析膜を用いて脱塩し、ｂｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ
（ファルマシア社製）を用いてクロマトグラフィーを
行い、活性画分を分取し、透析膜を用いて脱塩し酵素標
品を得た。
）ｉｆｆで洗浄後、５０ ＱｍＡの２０ｍＭリン酸バッ
ファー（ｐＨ７，０）に懸濁した。リヅチームを１ｍｇ
／ｍｆｆ、ＥＤＴＡ−２Ｎａを２ｍＭ、ｌ−リドンＸ−
１００を０．１％となるように加えて、３７°ｃ３０分
間保温した後に、ｐＨを７．０になるように調整し、６
０℃６時間加熱処理を行い５０００ｒｐｍ１５分間の遠
心により」二清液４２０ｍ６を分離した。この上清液に
アセトン８４ ＱｍＡを添加し５０００ ｒ ｐ ｍ
１５分間の遠心により沈殿を分離し、再度、該沈殿物を
５００ｍｐの２０ｍＭリン酸バッファー（ｐ１４７．０
）に懸濁し、５０００ｒｐｍ１５分間の遠心により上清
液４８０ｍβを分離した。２０ｍＭリン酸バッファー（
ｐＨ（７，０）で緩衝化したＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓ
ｅ ＣＬ−６Ｂを用いてイオン交換クロマトグラフィ
ー（ファルマシア社製）を行い、活性画分を分取し、透
析膜を用いて脱塩し、３０％飽和硫安で緩衝化した（＋
ｃｔｙｌ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ （ファ
ルマシア社製）を用いてクロマトグラフィーを行い、活
性画分を分取し、透析膜を用いて脱塩した。次いで、ｈ
ｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅ （ＫＯＫＥＮ社製）を
用いてクロマトグラフィーを行い、活性画分を分取し、
透析膜を用いて脱塩し、ｂｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ
（ファルマシア社製）を用いてクロマトグラフィーを
行い、活性画分を分取し、透析膜を用いて脱塩し酵素標
品を得た。
実施例５の酵素標品と、比較例１の酵素標品にそれぞれ
ＢＳＡ （シグマ社製、ＲＩＡ Ｂｒａｄｅ）を少量
添加して常法に基づき凍結乾燥し、それぞれの凍結乾燥
品のＧ ６ Ｐ Ｄ ＨｌＮＡＤ （Ｐ）■］オキシダ
ーゼ（ＮＡＤ （Ｐ）Ｈｏ ｘ）とラクテートデヒドロ
ゲナーゼ（ＬＤＨ）の比活性を測定し下記の結果を得た
。
ＢＳＡ （シグマ社製、ＲＩＡ Ｂｒａｄｅ）を少量
添加して常法に基づき凍結乾燥し、それぞれの凍結乾燥
品のＧ ６ Ｐ Ｄ ＨｌＮＡＤ （Ｐ）■］オキシダ
ーゼ（ＮＡＤ （Ｐ）Ｈｏ ｘ）とラクテートデヒドロ
ゲナーゼ（ＬＤＨ）の比活性を測定し下記の結果を得た
。
Ｇ ６ Ｐ Ｄ Ｈ１，ＯＯＵに対して０．０００１Ｕ
以下 〔発明の効果〕 本発明の第１図に示されたアミノ酸配列をコドするＤＮ
Ａまたは第２図に示されたＤＮＡおよび該ＤＮＡを保持
する形質転換体は、該形質転換体を培養することを特徴
とするＧ６ＰＤＨの製造法に用いられるものであり、０
６ＰＤＨを安定的に大量に提供することを可能ならしめ
るとともに、さらに臨床診断等に用いるときに問題とな
る夾雑酵素を含有せず、長期安定性および熱安定性に極
めて優れた０ ６ Ｐ Ｄ Ｈを得ることができるもの
である。
以下 〔発明の効果〕 本発明の第１図に示されたアミノ酸配列をコドするＤＮ
Ａまたは第２図に示されたＤＮＡおよび該ＤＮＡを保持
する形質転換体は、該形質転換体を培養することを特徴
とするＧ６ＰＤＨの製造法に用いられるものであり、０
６ＰＤＨを安定的に大量に提供することを可能ならしめ
るとともに、さらに臨床診断等に用いるときに問題とな
る夾雑酵素を含有せず、長期安定性および熱安定性に極
めて優れた０ ６ Ｐ Ｄ Ｈを得ることができるもの
である。
第１図は、Ｇ ６ Ｐ Ｄ Ｈを構成するポリペプチド
のアミノ酸配列を示す。第２図は、Ｇ６ＰＤＨを構成す
るポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを示
す。第３図は、プラスミ）” ｐ ０６ ＰＤＨｌの制
限酵素開裂地図である。 特許出願人 東洋醸造株式会社 ＬｙｓＬｅｕＴｈｒＴｈｒＡｓｐＡｓｐＩｌｅＡｒｇＳ
ｅｒＧ１ｕＬｙｓＶａＩＬｙｓＶａＩＬｅｕＡｒｇＡ１
ａＬｅｕＡｒｇＰｒｏＭｅｔＴｈｒＨｉｓＡｓｐＡｓｐ
ＶａＩＧＩｕＴｈｒＴｙｒＰｈｅＶａｌＡｒｇＧｌｙＧ
ｌｎＴｙｒＧ１ｙＡｒｇＧ１ｙ１１ｅＶａｌＡｒｇＧ１
ｙＧｌｎＧ１ｎＶａＩＶａＩＧＩｙＴｙｒＡｒｇＧ１ｕ
Ｇ１ｕＨｉｓＡｓｎＶａＩＡｓｐＰｒｏＡｓｎＳｅｒＡ
ｓｎＴｈｒＧｌｕＴｈｒＰｈｅｒａＩＡＩａＧｌｙＬｙ
ｓＬｅｕＭｅｔＩｌｅＡｓｐＡｓｎＰｈｅＡｒｇＴｒｐ
ＡｌａＧｌｙＶａＩＰｒｏＰｈｅＴｙｒＩｌｅＡｒｇＴ
ｈｒＧｌｙＬｙｓＡｒｇＭｅｔＴｈｒＧ１ｕＬｙｓＳｅ
ｒＴｈｒＬｙｓ１１ｅＶａＩＶａｌＧ１ｎＰｈｅＬｙｓ
ＡｓｐｅａｌＰｒｏＭｅｔＡｓｎＬｅｕＴｙｒＴｙｒＡ
ｒｇＴｈｒＳｅｒＧｌｕＨｉｓｅａｌＨｉｓＰｒｏＡｓ
ｎＬｅｕＬｅｕＶａＩＩｌｅＨｉｓ 工１ｅＧ１ｎＰｒ
ｏＡｓｐＧｌｕＧｌｙＩｌｅＴｈｒＬｅｕＨｉｓＬｅｕ
ＡｓｎＡｌａＬｙｓＬｙｓＳｅｒＧ１ｙＧ１ｕＡｓｎＭ
ｅｔＬｙｓＴｈｒＴｈｒＡｌａＩｌｅＬｙｓＬｅｕＡｓ
ｐＴｙｒＣｙｓＡｓｎＡｓｎＣｙｓＩｌｅＡｓｐＧ１ｙ
１１ｅＡｓｎＴｈｒＰｒｏＧｌｕＡｌａＴｙｒＧｌｕＬ
ｙｓＬｅｕＬｅｕＴｙｒＡｓｐＣｙｓＭｅｔＡｒｇＧｌ
ｙＡｓｐＡ１ａＴｈｒＡｓｎＰｈｅＴｈｒＨｉｓＴｒｐ
ＡｓｐＧｌｕＶａＩＡＩａＡ１ａＳｅｒＴｒｐｓｅｒＰ
ｈｅＶａＩＡｓｐＰｒ。 ＩｌｅＳｅｒＧｌｕＶａｌＴｒｐＡｌａＡｓｎＴｈｒＬ
ｙｓＡ１ａＶａＩＡｓｐＰｈｅＰｒｏＡｓｎＴｙｒＧｌ
ｕＡ１ａＧｌｙＳｅｒＭｅｔＧ１ｙＰｒｏＬｙｓＬｙｓ
Ａ１ａＡｓｐＧｌｕＬｅｕＬｅｕＧｌｎＬｙｓＡｓｐＧ
ｌｙＰｈｅＨｉｓＴｒｐＴｒｐＰｒｏＬｅｕＡｓｎＧｌ
ｙＴｈｒＩｌｅ手続主甫正書（自発） 平成元年７７月７Ｚ日 昭和６３年特許願第３３４６２９号 ２、発明の名称 グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 静岡県田方郡大仁町三福６３２−１５、補正によ
り増加する請求項の数 ６、補正の対象 （１）明細書の特許請求の範囲の欄 ７、補正の内容 （１）明細書の特許請求の範囲の欄 明細書の特許請求の範囲を別紙の通り訂正する。 （２）明細書の発明の詳細な説明の欄 明細書第５頁第１０行〜第１１行の 「酵素ハンドブック、６０２頁、」を「酵素ハンドブッ
ク、２０〜２１頁、」と訂正する。 明細書第７頁第９行の 「アミノ酸配列をＪの後に「コードするＤＮＡを」を挿
入する。 同頁第１２行および第１５行の 「外来性であるＤＮＡ、の後に「を有するヘクター」を
挿入する。 明細書第１８頁第１行の ’５ｕｂｔｉｌｌｉｓ 」をｒ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｊ
と訂正する。 明細書第３６頁第１８行の ’Ｍａｎｉｏｒｔｉｓ ＪをｒＭａｎｉａｒｔｉｓ 」
と訂正する。 明細書第３７頁第９行の 「宝酒造製、８ ｕｎｉｔ／ ｕ ｌ Ｊを「宝酒造製
、３ｕｎｉｔ／μ乏」と訂正する。 明細書第３８頁第１３行〜第１４行の ｒＭＥ８５６９」の後に「、ＡＴＣＣ３３８４９」を挿
入する。 刊」」４隘特肩」［丸Δ範■ ｒ（］） Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ０ （２） ＤＮＡ塩基配列が、５゛末端側より第２図で
表される特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。 （３）Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡを保持することを特徴とするヘクター。 （４）Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列をコ
ードする宿主にとって外来性であるＤＮＡ吏宜を五二又
又二を保持することを特徴とする形質転換体。 （５） 宿主が、エシェリヒア属に属する微生物であ
る特許請求の範囲第４項記載の形質転換体。 （６） エシェリヒア属に属する微生物が、エシェリ
ヒア・コリに属する微生物である特許請求の範囲第５項
記載の形質転換体。 （７）形質転換体が、エシェリヒア コリ ＤＨｌ・ｐ
Ｇ６ＰＤＨ１’微工研条寄第２１７４号、ＦＥＲＭ
ＢＰ−２１７４」である特許請求の範囲第６項記載の形
質転換体。 （８）Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列をコ
ートする宿主にとって外来性であるＤＮＡ炎宜１４二又
ｔニを保持する形質転換体を培養して、該ＤＮＡの遺伝
情報を発現せしめ、該培養物からグルコース−６−リン
酸デヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするグルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの製造法。 （９）５’ 末端側より第２図で表されるＤＮＡ−’ｔ
Ｍ！６丘久叉二を保持する形質転換体を培養して、該Ｄ
ＮＡの遺伝情報を発現せしめ、該培養物からグルコース
−６−リン酸デヒドロゲナーゼを採取することを特徴と
する特許請求の範囲第８項記載の製造法。 ００） グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが
、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性１００
単位に対し、夾雑酵素であるＮＡＤ （Ｐ）Ｈオキシダ
ーゼとラクテートデヒドロゲナーゼの活性が０．０００
１単位以下であり、少なくとも下記の理化学的性状を有
するグルコース−６リン酸デヒドロゲナーゼであること
を特徴とする特許請求の範囲第８項記載の製造法、 （８）酵素作用；グルコース−６−リン酸とＮＡＤ （
Ｐ）からグルコノラクトン−６−リン酸とＮＡＤ （Ｐ
）Ｈを生成する酵素反応を触媒する（ｂ） 基質特異
性；少なくともグルコース−６リン酸に基質特異性を有
する、 （Ｃ） 至適ｐＨ；８〜９、 （ｄ） 等電点；６１土０． ６、 （ｅ）熱安定性：約６５℃で１５分間の処理に安定、 （ｆ）ｐＨ安定性；ｐＨ６〜８（７０’Ｃ１１５分間）
において安定。 （Ｉｌｌ Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配
列からなるポリペプチド６Ｊ 以上
のアミノ酸配列を示す。第２図は、Ｇ６ＰＤＨを構成す
るポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを示
す。第３図は、プラスミ）” ｐ ０６ ＰＤＨｌの制
限酵素開裂地図である。 特許出願人 東洋醸造株式会社 ＬｙｓＬｅｕＴｈｒＴｈｒＡｓｐＡｓｐＩｌｅＡｒｇＳ
ｅｒＧ１ｕＬｙｓＶａＩＬｙｓＶａＩＬｅｕＡｒｇＡ１
ａＬｅｕＡｒｇＰｒｏＭｅｔＴｈｒＨｉｓＡｓｐＡｓｐ
ＶａＩＧＩｕＴｈｒＴｙｒＰｈｅＶａｌＡｒｇＧｌｙＧ
ｌｎＴｙｒＧ１ｙＡｒｇＧ１ｙ１１ｅＶａｌＡｒｇＧ１
ｙＧｌｎＧ１ｎＶａＩＶａＩＧＩｙＴｙｒＡｒｇＧ１ｕ
Ｇ１ｕＨｉｓＡｓｎＶａＩＡｓｐＰｒｏＡｓｎＳｅｒＡ
ｓｎＴｈｒＧｌｕＴｈｒＰｈｅｒａＩＡＩａＧｌｙＬｙ
ｓＬｅｕＭｅｔＩｌｅＡｓｐＡｓｎＰｈｅＡｒｇＴｒｐ
ＡｌａＧｌｙＶａＩＰｒｏＰｈｅＴｙｒＩｌｅＡｒｇＴ
ｈｒＧｌｙＬｙｓＡｒｇＭｅｔＴｈｒＧ１ｕＬｙｓＳｅ
ｒＴｈｒＬｙｓ１１ｅＶａＩＶａｌＧ１ｎＰｈｅＬｙｓ
ＡｓｐｅａｌＰｒｏＭｅｔＡｓｎＬｅｕＴｙｒＴｙｒＡ
ｒｇＴｈｒＳｅｒＧｌｕＨｉｓｅａｌＨｉｓＰｒｏＡｓ
ｎＬｅｕＬｅｕＶａＩＩｌｅＨｉｓ 工１ｅＧ１ｎＰｒ
ｏＡｓｐＧｌｕＧｌｙＩｌｅＴｈｒＬｅｕＨｉｓＬｅｕ
ＡｓｎＡｌａＬｙｓＬｙｓＳｅｒＧ１ｙＧ１ｕＡｓｎＭ
ｅｔＬｙｓＴｈｒＴｈｒＡｌａＩｌｅＬｙｓＬｅｕＡｓ
ｐＴｙｒＣｙｓＡｓｎＡｓｎＣｙｓＩｌｅＡｓｐＧ１ｙ
１１ｅＡｓｎＴｈｒＰｒｏＧｌｕＡｌａＴｙｒＧｌｕＬ
ｙｓＬｅｕＬｅｕＴｙｒＡｓｐＣｙｓＭｅｔＡｒｇＧｌ
ｙＡｓｐＡ１ａＴｈｒＡｓｎＰｈｅＴｈｒＨｉｓＴｒｐ
ＡｓｐＧｌｕＶａＩＡＩａＡ１ａＳｅｒＴｒｐｓｅｒＰ
ｈｅＶａＩＡｓｐＰｒ。 ＩｌｅＳｅｒＧｌｕＶａｌＴｒｐＡｌａＡｓｎＴｈｒＬ
ｙｓＡ１ａＶａＩＡｓｐＰｈｅＰｒｏＡｓｎＴｙｒＧｌ
ｕＡ１ａＧｌｙＳｅｒＭｅｔＧ１ｙＰｒｏＬｙｓＬｙｓ
Ａ１ａＡｓｐＧｌｕＬｅｕＬｅｕＧｌｎＬｙｓＡｓｐＧ
ｌｙＰｈｅＨｉｓＴｒｐＴｒｐＰｒｏＬｅｕＡｓｎＧｌ
ｙＴｈｒＩｌｅ手続主甫正書（自発） 平成元年７７月７Ｚ日 昭和６３年特許願第３３４６２９号 ２、発明の名称 グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 静岡県田方郡大仁町三福６３２−１５、補正によ
り増加する請求項の数 ６、補正の対象 （１）明細書の特許請求の範囲の欄 ７、補正の内容 （１）明細書の特許請求の範囲の欄 明細書の特許請求の範囲を別紙の通り訂正する。 （２）明細書の発明の詳細な説明の欄 明細書第５頁第１０行〜第１１行の 「酵素ハンドブック、６０２頁、」を「酵素ハンドブッ
ク、２０〜２１頁、」と訂正する。 明細書第７頁第９行の 「アミノ酸配列をＪの後に「コードするＤＮＡを」を挿
入する。 同頁第１２行および第１５行の 「外来性であるＤＮＡ、の後に「を有するヘクター」を
挿入する。 明細書第１８頁第１行の ’５ｕｂｔｉｌｌｉｓ 」をｒ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｊ
と訂正する。 明細書第３６頁第１８行の ’Ｍａｎｉｏｒｔｉｓ ＪをｒＭａｎｉａｒｔｉｓ 」
と訂正する。 明細書第３７頁第９行の 「宝酒造製、８ ｕｎｉｔ／ ｕ ｌ Ｊを「宝酒造製
、３ｕｎｉｔ／μ乏」と訂正する。 明細書第３８頁第１３行〜第１４行の ｒＭＥ８５６９」の後に「、ＡＴＣＣ３３８４９」を挿
入する。 刊」」４隘特肩」［丸Δ範■ ｒ（］） Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ０ （２） ＤＮＡ塩基配列が、５゛末端側より第２図で
表される特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。 （３）Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡを保持することを特徴とするヘクター。 （４）Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列をコ
ードする宿主にとって外来性であるＤＮＡ吏宜を五二又
又二を保持することを特徴とする形質転換体。 （５） 宿主が、エシェリヒア属に属する微生物であ
る特許請求の範囲第４項記載の形質転換体。 （６） エシェリヒア属に属する微生物が、エシェリ
ヒア・コリに属する微生物である特許請求の範囲第５項
記載の形質転換体。 （７）形質転換体が、エシェリヒア コリ ＤＨｌ・ｐ
Ｇ６ＰＤＨ１’微工研条寄第２１７４号、ＦＥＲＭ
ＢＰ−２１７４」である特許請求の範囲第６項記載の形
質転換体。 （８）Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列をコ
ートする宿主にとって外来性であるＤＮＡ炎宜１４二又
ｔニを保持する形質転換体を培養して、該ＤＮＡの遺伝
情報を発現せしめ、該培養物からグルコース−６−リン
酸デヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするグルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの製造法。 （９）５’ 末端側より第２図で表されるＤＮＡ−’ｔ
Ｍ！６丘久叉二を保持する形質転換体を培養して、該Ｄ
ＮＡの遺伝情報を発現せしめ、該培養物からグルコース
−６−リン酸デヒドロゲナーゼを採取することを特徴と
する特許請求の範囲第８項記載の製造法。 ００） グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが
、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性１００
単位に対し、夾雑酵素であるＮＡＤ （Ｐ）Ｈオキシダ
ーゼとラクテートデヒドロゲナーゼの活性が０．０００
１単位以下であり、少なくとも下記の理化学的性状を有
するグルコース−６リン酸デヒドロゲナーゼであること
を特徴とする特許請求の範囲第８項記載の製造法、 （８）酵素作用；グルコース−６−リン酸とＮＡＤ （
Ｐ）からグルコノラクトン−６−リン酸とＮＡＤ （Ｐ
）Ｈを生成する酵素反応を触媒する（ｂ） 基質特異
性；少なくともグルコース−６リン酸に基質特異性を有
する、 （Ｃ） 至適ｐＨ；８〜９、 （ｄ） 等電点；６１土０． ６、 （ｅ）熱安定性：約６５℃で１５分間の処理に安定、 （ｆ）ｐＨ安定性；ｐＨ６〜８（７０’Ｃ１１５分間）
において安定。 （Ｉｌｌ Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配
列からなるポリペプチド６Ｊ 以上
Claims (11)
- （１）Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡ。 - （２）ＤＮＡ塩基配列が、５’末端側より第２図で表さ
れる特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。 - （３）Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡを保持することを特徴とするベクター。 - （４）Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列をコ
ードする宿主にとって外来性であるＤＮＡを保持するこ
とを特徴とする形質転換体。 - （５）宿主が、エシェリヒア属に属する微生物である特
許請求の範囲第４項記載の形質転換体。 - （６）エシェリヒア属に属する微生物が、エシェリヒア
・コリに属する微生物である特許請求の範囲第５項記載
の形質転換体。 - （７）形質転換体が、エシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＧ
６ＰＤＨ１「微工研条寄第２１７４号、ＦＥＲＭＢＰ−
２１７４」である特許請求の範囲第６項記載の形質転換
体。 - （８）Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列をコ
ードする宿主にとって外来性であるＤＮＡを保持する形
質転換体を培養して、該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめ
、該培養物からグルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼを採取することを特徴とするグルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼの製造法。 - （９）５’末端側より第２図で表されるＤＮＡを保持す
る形質転換体を培養して、該ＤＮＡの遺伝情報を発現せ
しめ、該培養物からグルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼを採取することを特徴とする特許請求の範囲第８
項記載の製造法。 - （１０）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが、
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性１００単
位に対し、夾雑酵素であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ
とラクテートデヒドロゲナーゼの活性が０．０００１単
位以下であり、少なくとも下記の理化学的性状を有する
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼであることを
特徴とする特許請求の範囲第８項記載の製造法、 （ａ）酵素作用；グルコース−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ
）からグルコノラクトン−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
を生成する酵素反応を触媒する （ｂ）基質特異性；少なくともグルコース−６−リン酸
に基質特異性を有する、 （ｃ）至適ｐＨ；８〜９、 （ｄ）等電点；６．１±０．６、 （ｅ）熱安定性；約６５℃で１５分間の処理に安定、 （ｆ）ｐＨ安定性；ｐＨ６〜８（７０℃、１５分間）に
おいて安定。 - （１１）Ｎ末端側より第１図で表されるアミノ酸配列か
らなるポリペプチド。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63334629A JP2742281B2 (ja) | 1988-12-29 | 1988-12-29 | グルコース―６―リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 |
| US07/450,588 US5137821A (en) | 1988-12-29 | 1989-12-13 | Gene and process of making glucose-6-phosphate dehydrogenase |
| DE3942129A DE3942129C2 (de) | 1988-12-29 | 1989-12-20 | Glucose-6-phosphat-dehydrogenase-Gen |
| FR898916970A FR2641285B1 (fr) | 1988-12-29 | 1989-12-21 | Gene de la glucose-6-phosphate deshydrogenase, plasmide et microorganisme le contenant et procede de preparation de la glucose-6-phosphate deshydrogenase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63334629A JP2742281B2 (ja) | 1988-12-29 | 1988-12-29 | グルコース―６―リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02177887A true JPH02177887A (ja) | 1990-07-10 |
| JP2742281B2 JP2742281B2 (ja) | 1998-04-22 |
Family
ID=18279517
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63334629A Expired - Lifetime JP2742281B2 (ja) | 1988-12-29 | 1988-12-29 | グルコース―６―リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
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