JPH10248574A - 新規な乳酸酸化酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 乳酸の定量に用いることのできる乳酸酸化酵
素活性を有する新規な酵素、ならびに該酵素をコードす
る遺伝子および遺伝子工学的技術による該酵素の製造法
およびその用途の提供。 【解決手段】 熱安定性約５０℃以下（ｐＨ７．５、１
０分間処理）、ｐＨ安定性約４．０〜９．０（２５℃、
１６時間処理）、至適温度約３５℃、至適ｐＨ約６．５
〜７．５、であるラクトコッカス属細菌由来の乳酸酸化
酵素および該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含有
する組換えベクター、該ベクターで形質転換した形質転
換体、ならびに該形質転換体を培養し、乳酸酸化酵素を
生成させ、該酵素を採取する製造法ならびに乳酸測定用
試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は乳酸の定量に用いる
ことのできる乳酸酸化酵素活性を有する新規な酵素、な
らびに該酵素をコードする遺伝子および遺伝子工学的技
術による該酵素の製造法ならびに該酵素の用途に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来から、酸素の存在下に乳酸に作用し
てピルビン酸および過酸化水素を生成する反応を触媒す
る乳酸酸化酵素は、乳酸測定用酵素として、他の酵素、
例えばペルオキシダーゼあるいはカタラーゼと共に使用
されている。体液中の乳酸値は循環不全、肝障害などの
種々の病態に対する指標となる。また、食品中の乳酸値
は品質管理等の指標となる。本発明の酵素単独でもっ
て、酵素センサーに用いて、乳酸の測定などに使用され
る。

【０００３】このような乳酸酸化酵素は、アエロコッカ
ス・ビリダンス(Aerococcus viridans)(Biochemical an
d Biophysical Research Communications, Vol.164, 91
9-926 (1989)) 、ストレプトコッカス・フェカリス(Str
eptococcus faecalis) (米国特許第 4,116,763号明細
書) 或いはペディオコッカス属細菌（Analytical Chemi
stry, Vol.55, 35-38 (1983)) が生産することが知られ
ているにすぎない。このうち、エアロコッカス・ビリダ
ンス（Aerococcus viridans)ＩＦＯ１２２１９が産生す
る乳酸酸化酵素の性質は調べられており（特公昭59-101
90号公報）、エアロコッカス・ビリダンス（Aerococcus
viridans)ＩＦＯ１２２１９が産生する乳酸酸化酵素を
コードする遺伝子は既に分離され、アミノ酸配列が公開
されている（特開平2-177886号公報）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、今ま
でに生産していない新しい細菌から、新規な乳酸酸化酵
素を単離し、そして、該酵素をコードする遺伝子をクロ
ーニングし、遺伝子工学的に該酵素を多量に製造する方
法を提供することにある。また、本発明の別な目的は、
該酵素を改変することにより、理化学的性質の改良され
た新規な乳酸酸化酵素を製造する方法を導き出すことに
ある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成するために種々検討した結果、乳酸酸化酵素生産菌
として、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lac
tis (subsp. cremoris)) ＩＦＯ３４２７を選び、該菌
体から新規な乳酸酸化酵素を単離し、さらに、該菌体よ
り抽出した染色体ＤＮＡから乳酸酸化酵素をコードする
遺伝子を分離することに成功し、該遺伝子より発現され
る新規な乳酸酸化酵素を単離した。さらに、該遺伝子の
全塩基配列を決定し、該酵素を遺伝子工学的技術により
高価な誘導物質を培地に添加する必要なく、高生産させ
ることに成功し、高純度な該酵素を安価に大量供給する
ことを可能にした。

【０００６】すなわち、本発明は下記理化学的性質を有
する、ラクトコッカス属由来の新規な乳酸酸化酵素であ
る。 作用：酸素の存在下に乳酸に作用して、ピルビン酸およ
び過酸化水素を生成する。 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、１０分間処理） ｐＨ安定性：約４．０〜９．０（２５℃、１６時間処
理）

【０００７】本発明の一実施態様は下記理化学的性質を
有する新規な乳酸酸化酵素である。 作用：酸素の存在下に乳酸に作用して、ピルビン酸およ
び過酸化水素を生成する。 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、１０分間処理） ｐＨ安定性：約４．０〜９．０（２５℃、１６時間処
理） 至適温度：約３５℃ 至適ｐＨ：約６．５〜７．５ 分子量： 約４０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 約４０，０００（アミノ酸組成から求めた計算値） 約１６０，０００（ゲル濾過） 等電点：約４．３±０．１

【０００８】さらに、本発明は以下の（ａ）又は（ｂ）
のタンパク質である乳酸酸化酵素である。 （ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列か
らなるタンパク質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数の
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ、乳酸酸化酵素活性を有するタンパク質

【０００９】本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタン
パク質である乳酸酸化酵素をコードする遺伝子である。 （ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列か
らなるタンパク質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数の
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ、乳酸酸化酵素活性を有するタンパク質

【００１０】また、本発明は以下の（ｃ）、（ｄ）又は
（ｅ）のＤＮＡからなる乳酸酸化酵素をコードする遺伝
子である。 （ｃ）配列表の配列番号２に記載される塩基配列からな
るＤＮＡ （ｄ）上記（ｃ）の塩基配列において、１もしくは複数
の塩基が付加、欠失または置換されており、かつ、乳酸
酸化酵素活性を有するアミノ酸配列をコードしているＤ
ＮＡ （ｅ）上記（ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、乳酸酸化
酵素活性を有するタンパク質をコードする細菌由来のＤ
ＮＡ

【００１１】本発明は上記乳酸酸化酵素をコードする遺
伝子を含有する組換えベクターである。

【００１２】また、本発明は上記組換えベクターにより
形質転換された形質転換体である。

【００１３】さらに、本発明は上記形質転換体を培地で
培養し、乳酸酸化酵素を生成させ、該乳酸酸化酵素を採
取することを特徴とする乳酸酸化酵素の製造法である。

【００１４】また、本発明はラクトコッカス・ラクティ
ス(Lactococcus lactis (subsp. cremoris)) ＩＦＯ３
４２７を培養し、乳酸酸化酵素を生成させ、該乳酸酸化
酵素を採取することを特徴とする乳酸酸化酵素の製造法
である。

【００１５】本発明は上記乳酸酸化酵素およびペルオキ
シダーゼまたはカタラーゼおよび過酸化水素検出試薬を
含有する乳酸測定用試薬である。

【００１６】

【発明の実施態様】本発明の乳酸酸化酵素は、乳酸酸化
酵素生産微生物、例えばラクトコッカス・ラクティス(L
actococcus lactis (subsp. cremoris))ＩＦＯ３４２７
から入手し得る。しかしながら、乳酸酸化酵素をコード
する遺伝子を分離し、これより発現される乳酸酸化酵素
を単離することにより、本発明の乳酸酸化酵素を簡便、
かつ効率的に入手することもできる。

【００１７】本発明の乳酸酸化酵素は、ｐＨ７．５、１
０分間処理で約５０℃以下の熱安定性を有し、かつ、ｐ
Ｈ４．０〜９．０で安定であることが特徴である。

【００１８】本発明の別な実施態様としては、（ａ）配
列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質または（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１
もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加され
たアミノ酸配列からなり、かつ、乳酸酸化酵素活性を有
するタンパク質がある。アミノ酸の欠失、置換、付加の
程度については、基本的な特性を変化させることなく、
あるいはその特性を改善するようにしたものを含む。こ
れらの変異体を製造する方法は、従来から公知である方
法に従う。

【００１９】本発明の乳酸酸化酵素をコードする遺伝子
は、例えばラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus l
actis (subsp. cremoris)) ＩＦＯ３４２７から抽出し
ても良く、また化学的に合成することもできる。ポリメ
ラーゼチェーンリアクション法（PCR)の利用により、乳
酸酸化酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能で
ある。

【００２０】上記遺伝子としては、例えば（ａ）配列表
の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質をコードするＤＮＡ、または（ｂ）アミノ酸配列
（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置
換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、乳
酸酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
がある。ＤＮＡの欠失、置換、付加の程度については、
基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性
を改善するようにしたものを含む。これらの変異体を製
造する方法は、従来から公知である方法に従う。

【００２１】また、（ｃ）配列表の配列番号２に記載さ
れる塩基配列からなるＤＮＡ、（ｄ）上記（ｃ）の塩基
配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失また
は置換されており、かつ、乳酸酸化酵素活性を有するア
ミノ酸配列をコードしているＤＮＡまたは（ｅ）上記
（ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな
条件下でハイブリダイズし、かつ、乳酸酸化酵素活性を
有するタンパク質をコードする細菌由来のＤＮＡがあ
る。ここで、ストリンジェントな条件とは、×２ＳＳＣ
（３００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ クエン酸）、６５
℃、１６時間である。

【００２２】本発明の遺伝子を得る方法としては、例え
ばラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis (s
ubsp. cremoris)) ＩＦＯ３４２７の染色体ＤＮＡを分
離、精製した後、超音波破砕、制限酵素処理等を用いて
ＤＮＡを切断したものと、リニヤーな発現ベクターとを
両ＤＮＡの平滑末端または接着末端においてＤＮＡリガ
ーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築す
る。こうして得られた組換えベクターは複製可能な宿主
微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の
発現を指標としてスクリーニングして、乳酸酸化酵素を
コードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する
微生物を得る。次いで該微生物を培養し、該培養菌体か
ら該組換えベクターを分離・精製し、該組換えベクター
から乳酸酸化酵素遺伝子を採取すれば良い。

【００２３】遺伝子供与体であるラクトコッカス・ラク
ティス(Lactococcus lactis (subsp. cremoris)) ＩＦ
Ｏ３４２７の染色体ＤＮＡは、具体的には、以下のよう
に採取される。すなわち、供与微生物を例えば１〜３日
間撹拌培養して得られた培養物を遠心分離にて集菌し、
次いでこれを溶菌させることにより乳酸酸化酵素遺伝子
の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法とし
ては、例えばリゾチームやβ−グルカナーゼ等の溶菌酵
素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他
の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（SDS)等の界面活性剤
が併用され、さらに凍結融解やフレンチプレス処理のよ
うな物理的破砕方法と組み合わせても良い。

【００２４】このようにして得られた溶菌物からＤＮＡ
を分離・精製するには、常法に従って、例えばフェノー
ル処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌ
クレアーゼ処理、アルコール沈澱処理などの方法を適宜
組み合わせることにより行うことができる。微生物から
分離・精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音
波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好
ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するII型制限酵
素が適している。

【００２５】ベクターとしては、宿主微生物内で自律的
に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換
え用として構築されたものが適している。ファージとし
ては、例えばエシェリヒア・コリー（Escherichia col
i）を宿主微生物とする場合には、Lambda-gt10 、Lambd
a-gt11 などが使用できる。またプラスミドとしては、
例えばエシェリヒア・コリー（Escherichia coli）を宿
主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１９、
pBluescript 、ｐＬＥＤ−Ｍ１(Journal of Fermentati
on and Bioenzineering, Vol.76, 265-269 (1993))など
が使用できる。

【００２６】このようなベクターを、上述した乳酸酸化
酵素遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した
制限酵素で切断してベクター断片を得ることができる
が、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素
と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断
片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知の
ＤＮＡリガーゼを用いる方法であれば良く、例えば微生
物ＤＮＡ断片の接着末端とベクター断片の接着末端との
アニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により
微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベク
ターを作成する。必要なら、アニーリングの後、宿主微
生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換え
ベクターを作成することもできる。

【００２７】宿主微生物としては、組換えベクターが安
定、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できる
ものであれば良く、一般的にはエシェリヒア・コリーW3
110、エシェリヒア・コリーC600、エシェリヒア・コリ
ーHB101 、エシェリヒア・コリーJM109 などを用いるこ
とができる。

【００２８】宿主微生物に組換えベクターを移入する方
法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリー
の場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法
やエレクトロポレーション法などが用いることができ
る。

【００２９】このようにして得られた形質転換体である
微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の乳
酸酸化酵素を安定に生産し得る。宿主微生物への目的組
換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とす
るＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーと乳酸
酸化酵素活性を同時に発現する微生物を検索すれば良
く、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育
し、かつ、乳酸酸化酵素を生成する微生物を選択すれば
良い。

【００３０】上記の方法により得られた乳酸酸化酵素遺
伝子の塩基配列はサイエンス（Science, Vol.214, 1205
-1210 (1981)）に記載されたジデオキシ法により解読
し、また乳酸酸化酵素のアミノ酸配列は決定した塩基配
列より推定した。このようにして一度選択された乳酸酸
化酵素遺伝子を保有する組換えベクターは、形質転換微
生物から取り出され、他の微生物に移入することも容易
に実施することができる。また、乳酸酸化酵素遺伝子を
保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲにより乳
酸酸化酵素遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター
断片と結合させ、宿主微生物に移入することも容易に実
施できる。

【００３１】形質転換体である宿主微生物の培養形態
は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択す
ればよく、通常、多くの場合は液体培養で行うが、工業
的には通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養
源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く
使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物で
あればよく、例えばグルコ−ス、シュークロース、ラク
トース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸
などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合
物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが
使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグ
ネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛
などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必
要に応じて使用される。培養温度は菌が発育し、乳酸酸
化酵素を生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒ
ア・コリーの場合、好ましくは20〜42℃程度である。培
養時間は条件によって多少異なるが、乳酸酸化酵素が最
高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了
すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨ
は菌が発育し乳酸酸化酵素を生産する範囲で適宜変更し
得るが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度であ
る。

【００３２】培養物中の乳酸酸化酵素を生産する菌体を
含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、
一般には、常法に従って乳酸酸化酵素が培養液中に存在
する場合は濾過、遠心分離などにより、乳酸酸化酵素含
有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。乳酸
酸化酵素が菌体内に存在する場合には、得られた培養物
から濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取
し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなど
の酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等の
キレート剤及びまたは界面活性剤を添加して乳酸酸化酵
素を可溶化し、水溶液として分離採取する。

【００３３】このようにして得られた乳酸酸化酵素含有
溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウ
ム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機
溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどに
よる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱
処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸
着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィーを行うことにより、精製さ
れた乳酸酸化酵素を得ることができる。

【００３４】例えば、セファデックス(Sephadex) G-25
（ファルマシア バイオテク）などによるゲルろ過、DE
AEセファロースCL-6B(ファルマシア バイオテク）、オ
クチルセファロースCL6-B(ファルマシア バイオテク）
カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵
素標品を得ることができる。この精製酵素標品は、電気
泳動(SDS-PAGE)的に、ほぼ単一のバンドを示す程度に純
化されている。

【００３５】本発明の乳酸酸化酵素の一例は、以下に示
す理化学的性質を有する。 作用：酸素の存在下に乳酸に作用して、ピルビン酸およ
び過酸化水素を生成する。 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、１０分間処理）
（図１参照) ｐＨ安定性：約４．０〜９．０（２５℃、１６時間処
理）（図２参照） 至適温度：約３５℃（図３参照） 至適ｐＨ：約６．５〜７．５（図４参照） 分子量： 約４０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 約４０，０００（アミノ酸組成から求めた計算値） 約１６０，０００（ゲル濾過） 等電点：約４．３±０．１

【００３６】本発明の乳酸酸化酵素と性質が公知である
エアロコッカス・ビリダンス（Aerococcus viridans)Ｉ
ＦＯ１２２１９が産生する乳酸酸化酵素との性質の比較
を表１に示す。また、本発明の乳酸酸化酵素のアミノ酸
配列と唯一、公知であるエアロコッカス・ビリダンス
（Aerococcus viridans)ＩＦＯ１２２１９が産生する乳
酸酸化酵素のアミノ酸配列との相同性は51.8％であり、
両者の比較は図５に示す。本発明の乳酸酸化酵素は、同
一反応を触媒する公知の酵素とは性質の異なる新規な酵
素である。

【００３７】

【表１】

【００３８】本発明の乳酸測定用試薬は、上記乳酸酸化
酵素、ペルオキシダーゼまたはカタラーゼおよび過酸化
水素検出試薬を含む。ペルオキシダーゼまたはカタラー
ゼは従来公知のものを使用することができる。また、過
酸化水素検出試薬とは乳酸酸化酵素により生成した過酸
化水素を、ペルオキシダーゼまたはカタラーゼにより検
出する試薬であって、例えば４−アミノアンチピリンと
フェーノル誘導体またはアニリン誘導体がある。本発明
ではこれらの過酸化水素検出試薬に限定されない。

【００３９】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。実施例中、乳酸酸化酵素活性の測定は以下の試薬お
よび測定条件で行った。 ＜試薬＞５０ｍＭ ＤＬ−乳酸、５０ｍＭ ３−ジメチ
ルグルタル酸、１．５ｍＭ ４−アミノアンチピリン、
３．１ｍＭ Ｎ−ジメチルアニリン、２．５Ｕ／ｍｌペ
ルオキシダーゼ、０．２μＭ フラビンアデニンジヌク
レオチドを含む水溶液（ｐＨ６．５）

【００４０】＜測定条件＞試薬１ｍｌを３７℃で約５分
予備加温後、０．０２ｍｌの酵素溶液を加え、３７℃で
反応を開始し、１０分間反応させた後、０．２５％ ド
デシル硫酸ナトリウム水溶液を２ｍｌ加えて反応を停止
させ、５６５ｎｍにおける吸光度変化を分光光度計にて
測定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬に加
えて、以下同様に吸光度変化を測定する。上記条件で１
分間に１マイクロモルの乳酸を分解する酵素量を１単位
（Ｕ）とする。

【００４１】実施例１ 染色体ＤＮＡの分離 ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis (sub
sp. cremoris)) ＩＦＯ３４２７の染色体ＤＮＡを次の
方法で分離した。同菌株をブレインハートインヒュージ
ョン培地（ディフコ社製）で３７℃一晩振盪培養した
後、遠心分離（8,000rpm、10分間）により集菌した。１
５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム
を含んだ溶液で菌体を洗浄した後、２０％シュークロー
ス、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含んだ溶液５ｍｌに懸濁し、１ｍｌのリゾチーム
溶液（100mg/ml）を加えて、３７℃、３０分間保温し、
次いで１１ｍｌの１％ラウロイルサルコシン酸、０．１
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ９．６）を含む溶液を加えた。この
懸濁液に臭化エチジウム溶液を０．５％塩化セシウムを
約１００％加え、攪拌混合し、55,000rpm 、２０時間の
超遠心分離でＤＮＡを分取した。分取したＤＮＡは１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含んだ１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０
溶液（以下，ＴＥと略記）で透析し、精製ＤＮＡ標品と
した。これを等量のクロロホルム・フェノール溶液で処
理後遠心分離により水層を分取し、２倍量のエタノール
を加えて上記方法で、もう一度ＤＮＡを分離し、２ｍｌ
のＴＥで溶解した。

【００４２】実施例２ 乳酸酸化酵素をコードする遺伝
子を含有するＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を有する組換
えベクターの調製 実施例１で得たＤＮＡ５μｇを制限酵素 Sau3AI （東洋
紡製）で部分分解し、２ｋｂｐ以上の断片に分解した
後、制限酵素 BamHI（東洋紡製）で切断した pBluescri
pt １μｇとをＴ４−ＤＮＡリガーゼ（東洋紡製）１単
位で、１６℃、１２時間反応させ、ＤＮＡを連結した。
連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリーJM109 のコンピ
テントセル（東洋紡製）を用いて形質転換し、乳酸酸化
酵素活性検出用寒天培地［1.0%ポリペプトン、0.5%酵母
エキス、0.5% NaCl 、0.1%乳酸、5U/ml ペルオキシダー
ゼ（東洋紡製）、0.01% ο−ジアニシジン、50μg/mlア
ンピシリン、1.5%寒天］に塗布した。乳酸酸化酵素活性
の検出は、上記培地に生育し、且つ茶色に染色されるコ
ロニーを指標に行った。

【００４３】使用したＤＮＡ１μｇ当たり、約10,000個
の形質転換体のコロニーが得られ、上記スクリーニング
の結果、茶色に染色されるコロニーを１株見いだした。
この株をＬＢ液体培地（1%ポリペプトン、0.5%酵母エキ
ス、0.5% NaCl (pH7.2) 、50μg/mlアンピシリン）で培
養し、乳酸酸化酵素活性を測定したところ、該活性が検
出された。この株の保有するプラスミドには約３ｋｂｐ
の挿入ＤＮＡ断片が存在しており、このプラスミドをｐ
ＬＣＯ３とした。ｐＬＣＯ３の制限酵素地図を図６に示
す。

【００４４】実施例３ 塩基配列の決定 ｐＬＣＯ３の約３ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片について種々
の制限酵素にてサブクローンを調製した。種々のサブク
ローンは常法に従い、シーケンシング・キット（Radioa
ctive Sequencing Kit）（東洋紡製）を用いて、塩基配
列を決定した。決定した塩基配列およびアミノ酸配列を
配列表に示した。アミノ酸配列から求められる蛋白質の
分子量は、約40,000であり、ラクトコッカス・ラクティ
ス(Lactococcus lactis (subsp. cremoris)) ＩＦＯ３
４２７の乳酸酸化酵素の分子量とほぼ一致した。

【００４５】実施例４ 形質転換体の作成 エシェリヒア・コリーJM109 のコンピテントセル（東洋
紡製）をｐＬＣＯ３で形質転換し、形質転換体エシェリ
ヒア・コリーJM109 (pＬＣＯ３）を得た。

【００４６】実施例５ エシェリヒア・コリーJM109 (p
ＬＣＯ３）からの乳酸酸化酵素の製造 ＬＢ培地５００ｍｌを２Ｌフラスコに分注し、１２１
℃、１５分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌ろ
過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク
製）０．５ｍｌを添加した。この培地にＬＢ培地であら
かじめ，３０℃、７時間振盪培養したエシェリヒア・コ
リーJM109 (pLCO3) の培養液５ｍｌを接種し、３７℃で
１８時間通気撹拌培養した。培養終了時の乳酸活性は約
１０Ｕ／ｍｌであった。

【００４７】上記菌体を遠心分離にて集菌し、２０ｍＭ
リン酸緩衝液、ｐＨ７．０に懸濁した。上記菌体懸濁液
をフレンチプレスで破砕し、遠心分離を行い上清液を得
た。得られた粗酵素液をポリエチレンイミンによる除核
酸処理および硫安分画処理を行った後、セファデックス
(Sephadex) G-25 （ファルマシア バイオテク）による
ゲルろ過により脱塩し、DEAEセファロースCL-6B （ファ
ルマシア バイオテク）カラムクロマトグラフィー、オ
クチルセファロースCL6-B(ファルマシア バイオテク）
カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵
素表品を得た。本方法により得られた乳酸酸化酵素標品
は、電気泳動(SDS-PAGE)的にほぼ単一なバンドを示し、
この時の比活性は約１５０Ｕ／ｍｇ−タンパク質であっ
た。

【００４８】以下に、上記方法により得られた乳酸酸化
酵素の性質を示す。 作用：酸素の存在下に乳酸に作用して、ピルビン酸およ
び過酸化水素を生成する。 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、１０分間処理） ｐＨ安定性：約４．０〜９．０（２５℃、１６時間処
理） 至適温度：約３５℃ 至適ｐＨ：約６．５〜７．５ 分子量： 約４０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 約４０，０００（アミノ酸組成から求めた計算値） 約１６０，０００（ゲル濾過） 等電点：約４．３±０．１

【００４９】実施例７ ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis (sub
sp. cremoris)) ＩＦＯ３４２７をブレインハートイン
ヒュージョン培地にて、３７℃、約１〜３日間培養し、
培養液を遠心分離して集菌し、次いで、これを溶菌させ
ることによって、乳酸酸化酵素を生成させ、該乳酸酸化
酵素を採取した。

【００５０】

【発明の効果】本発明により、ラクトコッカス属細菌か
ら新規な乳酸酸化酵素遺伝子が単離され、遺伝子工学的
技術による該酵素の製造法が確立され、高純度な該酵素
の大量供給と乳酸の定量への利用が可能となった。ま
た、該遺伝子を改変することにより、理化学的性質の改
良された新規な乳酸酸化酵素を製造する方法を導き出す
ことができる。

【００５１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：366 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 生物名：ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lac
tis(subsp. cremoris)) 株名：IFO 3427 配列 Glu Lys Thr Tyr Gln Ala Gly Thr Asn Glu Gly Ile Val Asp Phe Ile 1 5 10 15 Asn Met Glu Asp Leu Glu Ile Ala Ala Ser Gln Val Ile Pro Ala Gly 20 25 30 Gly Tyr Gly Tyr Ile Ser Ser Gly Ala Gly Asp Leu Phe Thr Tyr Gln 35 40 45 Glu Asn Glu Arg Ala Phe Asn His Gln Leu Ile Ile Pro His Val Leu 50 55 60 Arg Asp Val Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr His Phe Asp Glu Glu Thr 65 70 75 80 Leu Thr Ala Pro Ile Ile Met Ala Pro Val Ala Ala His Gly Leu Ala 85 90 95 His Val Lys Ala Glu Lys Ala Ser Ala Lys Gly Val Ala Asp Phe Gly 100 105 110 Thr Ile Tyr Thr Ala Ser Ser Tyr Ala Ser Cys Thr Leu Glu Glu Ile 115 120 125 Arg Glu Ala Gly Gly Glu Lys Ala Pro Gln Trp Phe Gln Phe Tyr Met 130 135 140 Ser Lys Asp Asn Glu Ile Asn Leu Asp Ile Leu Glu Val Ala Lys Arg 145 150 155 160 Asn Gly Ala Lys Ala Ile Val Leu Thr Ala Asp Ala Thr Val Gly Gly 165 170 175 Asn Arg Glu Thr Asp Arg Arg Asn Gly Phe Thr Phe Pro Leu Pro Met 180 185 190 Pro Ile Val Gln Ala Tyr Gln Ser Gly Val Gly Gln Thr Met Asp Ala 195 200 205 Val Tyr Lys Ser Ser Lys Gln Lys Leu Ser Pro Lys Asp Val Glu Phe 210 215 220 Ile Ala Ala His Ser Asp Leu Pro Val Tyr Val Lys Gly Val Gln Ser 225 230 235 240 Glu Glu Asp Val Tyr Arg Ser Leu Glu Ser Gly Ala Gly Gly Ile Trp 245 250 255 Val Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp Gly Gly Pro Ala Ala Phe 260 265 270 Asp Ser Leu Gln Tyr Val Ala Asp Ala Val Asp Lys Arg Val Pro Ile 275 280 285 Val Phe Asp Ser Gly Val Arg Arg Gly Gln His Val Phe Lys Ala Ile 290 295 300 Ala Ser Gly Ala Asp Leu Val Ala Ile Gly Arg Pro Val Ile Tyr Gly 305 310 315 320 Leu Ser Leu Gly Gly Ser Thr Gly Val Arg Gln Val Phe Asp Phe Phe 325 330 335 Lys Thr Glu Leu Glu Met Val Met Gln Leu Ala Gly Thr Gln Thr Val 340 345 350 Glu Asp Ile Lys Lys Ile Lys Leu Arg Glu Asn Arg Phe Ile 355 360 365 366

【００５２】配列番号：２ 配列の長さ：1098 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムDNA 起源 生物名：ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lac
tis(subsp. cremoris)) 株名：IFO 3427 配列 GAA AAA ACG TAT CAA GCA GGT ACA AAT GAA GGA ATA GTG GAT TTT ATC 48 Glu Lys Thr Tyr Gln Ala Gly Thr Asn Glu Gly Ile Val Asp Phe Ile 1 5 10 15 AAT ATG GAA GAT TTA GAA ATA GCC GCT TCA CAA GTG ATT CCA GCT GGT 96 Asn Met Glu Asp Leu Glu Ile Ala Ala Ser Gln Val Ile Pro Ala Gly 20 25 30 GGT TAT GGT TAC ATC AGC AGT GGT GCT GGC GAC TTA TTT ACT TAT CAA 144 Gly Tyr Gly Tyr Ile Ser Ser Gly Ala Gly Asp Leu Phe Thr Tyr Gln 35 40 45 GAA AAT GAA CGG GCA TTC AAT CAT CAA CTG ATT ATT CCT CAT GTA TTA 192 Glu Asn Glu Arg Ala Phe Asn His Gln Leu Ile Ile Pro His Val Leu 50 55 60 AGA GAT GTA GAA TTA CCC GAT ACA ACT ACA CAT TTT GAC GAA GAA ACG 240 Arg Asp Val Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr His Phe Asp Glu Glu Thr 65 70 75 80 CTG ACT GCA CCA ATC ATC ATG GCA CCA GTT GCT GCT CAT GGC TTA GCT 288 Leu Thr Ala Pro Ile Ile Met Ala Pro Val Ala Ala His Gly Leu Ala 85 90 95 CAT GTG AAG GCG GAG AAA GCT TCT GCA AAA GGT GTA GCA GAT TTT GGG 336 His Val Lys Ala Glu Lys Ala Ser Ala Lys Gly Val Ala Asp Phe Gly 100 105 110 ACG ATC TAT ACA GCA AGT TCT TAT GCT TCT TGT ACT TTA GAA GAG ATA 384 Thr Ile Tyr Thr Ala Ser Ser Tyr Ala Ser Cys Thr Leu Glu Glu Ile 115 120 125 AGA GAA GCA GGA GGG GAG AAA GCA CCG CAA TGG TTT CAA TTT TAT ATG 432 Arg Glu Ala Gly Gly Glu Lys Ala Pro Gln Trp Phe Gln Phe Tyr Met 130 135 140 AGC AAA GAT AAT GAA ATC AAT TTG GAT ATT CTT GAA GTG GCC AAG CGT 480 Ser Lys Asp Asn Glu Ile Asn Leu Asp Ile Leu Glu Val Ala Lys Arg 145 150 155 160 AAT GGA GCA AAA GCA ATC GTA TTG ACA GCG GAT GCA ACA GTT GGA GGA 528 Asn Gly Ala Lys Ala Ile Val Leu Thr Ala Asp Ala Thr Val Gly Gly 165 170 175 AAC CGT GAA ACA GAC CGC AGA AAT GGG TTT ACC TTC CCA CTG CCA ATG 576 Asn Arg Glu Thr Asp Arg Arg Asn Gly Phe Thr Phe Pro Leu Pro Met 180 185 190 CCA ATC GTT CAG GCT TAT CAA TCA GGA GTA GGC CAA ACG ATG GAT GCT 624 Pro Ile Val Gln Ala Tyr Gln Ser Gly Val Gly Gln Thr Met Asp Ala 195 200 205 GTG TAC AAA TCT TCC AAA CAG AAG CTT AGT CCA AAA GAT GTA GAA TTT 672 Val Tyr Lys Ser Ser Lys Gln Lys Leu Ser Pro Lys Asp Val Glu Phe 210 215 220 ATT GCT GCT CAT TCT GAT TTG CCA GTT TAT GTG AAA GGT GTC CAG TCA 720 Ile Ala Ala His Ser Asp Leu Pro Val Tyr Val Lys Gly Val Gln Ser 225 230 235 240 GAA GAA GAT GTC TAT CGT TCA TTA GAA TCG GGT GCT GGC GGA ATC TGG 768 Glu Glu Asp Val Tyr Arg Ser Leu Glu Ser Gly Ala Gly Gly Ile Trp 245 250 255 GTA TCT AAT CAT GGC GGC CGT CAA CTA GAT GGT GGT CCT GCA GCG TTT 816 Val Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp Gly Gly Pro Ala Ala Phe 260 265 270 GAT TCG TTG CAA TAT GTG GCA GAT GCA GTA GAT AAA CGT GTA CCA ATC 864 Asp Ser Leu Gln Tyr Val Ala Asp Ala Val Asp Lys Arg Val Pro Ile 275 280 285 GTG TTT GAC AGC GGT GTA CGA CGC GGA CAG CAT GTT TTC AAA GCA ATC 912 Val Phe Asp Ser Gly Val Arg Arg Gly Gln His Val Phe Lys Ala Ile 290 295 300 GCA TCA GGT GCA GAT CTA GTT GCT ATT GGC AGA CCC GTT ATT TAT GGA 960 Ala Ser Gly Ala Asp Leu Val Ala Ile Gly Arg Pro Val Ile Tyr Gly 305 310 315 320 TTG TCT TTA GGA GGA AGC ACA GGA GTC CGT CAA GTG TTT GAT TTC TTT 1008 Leu Ser Leu Gly Gly Ser Thr Gly Val Arg Gln Val Phe Asp Phe Phe 325 330 335 AAA ACA GAA TTG GAA ATG GTC ATG CAA TTA GCT GGA ACA CAA ACA GTA 1056 Lys Thr Glu Leu Glu Met Val Met Gln Leu Ala Gly Thr Gln Thr Val 340 345 350 GAA GAT ATC AAA AAA ATA AAA TTG CGT GAG AAT CGT TTT ATT 1098 Glu Asp Ile Lys Lys Ile Lys Leu Arg Glu Asn Arg Phe Ile 355 360 365 366

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の乳酸酸化酵素の熱安定性を示す図であ
る。

【図２】本発明の乳酸酸化酵素のｐＨ安定性を示す図で
ある。

【図３】本発明の乳酸酸化酵素の至適温度を示す図であ
る。

【図４】本発明の乳酸酸化酵素の至適ｐＨを示す図であ
る。

【図５】本発明の乳酸酸化酵素のアミノ酸配列とエアロ
コッカス・ビリダンス（Aerococcus viridans)ＩＦＯ１
２２１９が産生する乳酸酸化酵素のアミノ酸配列との比
較を示す図である。

【図６】ｐＬＣＯ３の制限酵素地図を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記理化学的性質を有する、ラクトコッ
   カス属由来の新規な乳酸酸化酵素。 作用：酸素の存在下に乳酸に作用して、ピルビン酸およ
   び過酸化水素を生成する。 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、１０分間処理） ｐＨ安定性：約４．０〜９．０（２５℃、１６時間処
   理）
2. 【請求項２】 下記理化学的性質を有する新規な乳酸酸
   化酵素。 作用：酸素の存在下に乳酸に作用して、ピルビン酸およ
   び過酸化水素を生成する。 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、１０分間処理） ｐＨ安定性：約４．０〜９．０（２５℃、１６時間処
   理） 至適温度：約３５℃ 至適ｐＨ：約６．５〜７．５ 分子量： 約４０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 約４０，０００（アミノ酸組成から求めた計算値） 約１６０，０００（ゲル濾過） 等電点：約４．３±０．１
3. 【請求項３】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質で
   ある乳酸酸化酵素。 （ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列か
   らなるタンパク質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数の
   アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
   からなり、かつ、乳酸酸化酵素活性を有するタンパク質
4. 【請求項４】 配列表の配列番号１に記載されるアミノ
   酸配列を有する請求項１または２記載の乳酸酸化酵素。
5. 【請求項５】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質で
   ある乳酸酸化酵素をコードする遺伝子。 （ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列か
   らなるタンパク質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数の
   アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
   からなり、かつ、乳酸酸化酵素活性を有するタンパク質
6. 【請求項６】 配列表の配列番号１に記載されるアミノ
   酸配列からなるタンパク質である乳酸酸化酵素をコード
   する遺伝子。
7. 【請求項７】 以下の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のＤＮ
   Ａからなる乳酸酸化酵素をコードする遺伝子。 （ｃ）配列表の配列番号２に記載される塩基配列からな
   るＤＮＡ （ｄ）上記（ｃ）の塩基配列において、１もしくは複数
   の塩基が付加、欠失または置換されており、かつ、乳酸
   酸化酵素活性を有するアミノ酸配列をコードしているＤ
   ＮＡ （ｅ）上記（ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリン
   ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、乳酸酸化
   酵素活性を有するタンパク質をコードする細菌由来のＤ
   ＮＡ
8. 【請求項８】 配列表の配列番号２に記載される塩基配
   列からなるＤＮＡを含有する乳酸酸化酵素をコードする
   遺伝子。
9. 【請求項９】 請求項５、６、７または８記載の乳酸酸
   化酵素をコードする遺伝子を含有する組換えベクター。
10. 【請求項１０】 請求項９記載の組換えベクターで宿主
    細胞を形質転換した形質転換体。
11. 【請求項１１】 請求項１０記載の形質転換体を培養
    し、乳酸酸化酵素を生成させ、該乳酸酸化酵素を採取す
    ることを特徴とする乳酸酸化酵素の製造法。
12. 【請求項１２】 ラクトコッカス・ラクティス(Lactoco
    ccus lactis (subsp.cremoris)) ＩＦＯ３４２７を培
    養し、乳酸酸化酵素を生成させ、該乳酸酸化酵素を採取
    することを特徴とする乳酸酸化酵素の製造法。
13. 【請求項１３】 請求項１〜４のいずれか１項記載の乳
    酸酸化酵素およびペルオキシダーゼまたはカタラーゼお
    よび過酸化水素検出試薬を含有する乳酸測定用試薬。