JPH02182155A - ホエイ蛋白質の部分加水分解物、同加水分解物を製造するための酵素的方法および同加水分解物を含有する低アレルギー性滋養特別食用乳製品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ホエイ蛋白質の部分加水分解物、同加水分解
物を製造するための酵素的方法および同加水分解物を含
有する低アレルギー性の滋養特別食用乳製品（ｄｉｅｔ
ｅｔｉｃ　ｍ１ｌｋ　ｆｏｏｄ）に関する。

［従来技術とその問題点］ 乳幼児用滋養特別食用乳製品は牛乳から抽出された蛋白
質を用いて作られることが多い。この場合には、その組
成を人乳に近付けるために牛乳とは異なる成分を特に処
方することが必要である。

蛋白質に限って言えば各種アミノ酸成分の重量（特に、
トレオニン、トリプトファン、リジン等の必須アミノ酸
の供給量）を人乳のそれにできるだけ近付けるような配
慮が必要である。

このため、特に、乳清蛋白質／牛乳カゼインの比を乳清
蛋白質が優勢になるように再調整する必要がある。この
ようにして得られた滋養特別食用乳製品はホエイ蛋白質
を高い割合で含有している。

しかしこのために、以下のような問題が生じる。

すなわち、ヒトとウシとではそのホエイ中の蛋白質組成
が同一ではなく、特に、ヒトーホエイがβ−ラクトグロ
ブリンを全く含まないのに対して、ウシーホエイはその
蛋白質成分の約半分がβ−ラクトグロブリンであるため
、乳幼児によっては、ウシ起源の乳清蛋白質に基づいた
組成を有するミルクを与えた場合に、この組成の違いが
、アレルギー現象の原因となるのである。このアレルギ
は、特に消化の際の障害（腹痛、下痢、嘔吐）となって
現われる。

また、アレルギー誘起力ではβ−ラクトグロブリンが最
大であるものの（主要抗原）、こればかりが原因物質と
なるわけではな（、α−ラクトグロブリンもまたアレル
ギー現象の原因物質になることがある。

ホエイ蛋白質に基づく乳製品の消化性を改善するために
、たとえば、加熱により蛋白質を変性させたり、ラクト
グロブリンの量を減少させるなど過去において様々な解
決策が提案されてきた。最近では、乳清蛋白質を酵素的
方法で加水分解することが提案されている。

フランス方法公開公報ＦＲ−Ａ−２，４５０，８４２号
には、蛋白質やマクロペプチドを含まない純粋な蛋白質
加水分解物の製造方法が記載されている。ここでは、蛋
白質の水溶液が、たとえばパンクレアチンを用いて加水
分解され、加水分解生成物はさらに熱処理を施されて残
留蛋白質が変性され、該蛋白質は限外濾過により除かれ
る。限外濾過透過物は純粋な蛋白質加水分解物である。

蛋白質は様々な起源のものであってよく、特にホエイ蛋
白質である。この方法出願明細書においては、得られた
加水分解物の正確なペプチド組成は示されていない。

ヨーロッパ方法公開公報ＥＰ−Ａ−２２，０１９号には
、ホエイ蛋白質の酵素による全加水分解物およびその製
造法が記載されている。この加水分解物は、はとんど残
留蛋白質を含んでおらず、少なくともその５０％が２な
いし５個のアミノ酸を含むペプチド（分子量約７００以
下）からなり、遊離アミノ酸の割合は１５％未満である
。ここでは、加水分解物は極めて広汎な加水分解を経て
おり、病人に対する消化器経由の栄養補給を目的として
いる。しかし、滋養特別食用乳製品の製造にはこれほど
までの加水分解は必要ではない。この全加水分解物の製
造法では、たとえばバンクレアチンのような蛋自分解酵
素を用いてホエイ蛋白質を酵素で加水分解する方法をと
っており、加水分解に先立っておよび／またはその後に
限外濾過を行なってもよい。

［発明の構成］ 本発明は、乳幼児および牛乳にアレルギーを示す音に与
えるのに適した低アレルギー性滋養特別食用乳製品の製
造に供しつる、新規な、ホエイ蛋白質部分加水分解物な
らびにその製法を提供することを目的とする。

より特定すれば、本発明は、残留全蛋白質を含有しない
ホエイ蛋白質部分加水分解物であって、分子量ｆｍｏｉ
ａξｍａｓｓ）で次の分布に亙るベブヂド二分子量　　
　　　重量比（全ペプチド１００ｇ（ｇ１モル）　　　
　中のペプチドのｇ数）＞５０００　　　　　　　　　
　　　　　０　〜５５０００〜３５００　　　　　　１
５〜２５３５００〜１５００　　　　　　２０〜３０■
５００〜５００　　　　　　３５〜４５５００＜　　　
　　　　　　　　　　　　　　５　〜　ＩＯならびに加
水分解物中の含有量が（全窒素１００ｇあたりの窒素ｇ
数で計算して）　１０％未満の遊離アミノ酸を含むこと
を特徴とするものに関する。

また本発明は、上記部分加水分解物を含有する低アレル
ギー性滋養特別食用乳製品に関する。

さらに本発明は、 ａ）酵素キモトリプシン／トリプシンの活性比が１．５
ないし３．０であるキモトリプシン／トリプシンの混合
物を、ホエイ、脱脂および／または脱ミネラル化したホ
エイ、濃縮ホエイ、脱脂および／または脱ミネラル化し
た濃縮ホエイ、および上記のホエイから抽出された蛋白
質の水溶液から選択される基質に対し、キモトリプシン
／全基質蛋白質の比が、全蛋白質１００ｇあたり２０、
０００から３００　、０００ＡＴＨＥ単位の間となるよ
うな量を、ｐＨ７，５ないし９．０　、４０℃ないし６
０℃の温度で、上に規定したペプチド分布が得られるよ
うな時間をかけて用いた酵素的加水分解；およびｂ）酵
素および加水分解されずに残った残留蛋白質の分離；の
各段階からなる上記部分加水分解物の酵素的製造方法に
関する。

本発明の一態様によれば、可溶性酵素の混合物が用いら
れ、段階ｂ）は限外濾過および／または１０．０００以
下の閾値を有する少なくとも−の膜を用いた透過濾過（
ｄｉａ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により遂行される。

また本発明の別の態様によれば、固定化酵素の混合物が
用いられ、段階ｂ）は、最初に行なわれるデカンテーシ
ョン、遠心分離および／または濾過による固定化酵素の
分離、次いで、加水分解物を得るために行なわれる、限
外濾過および／または１０，０００以下の閾値を有する
少なくとも−の膜を用いた透過濾過による、加水分解さ
れずに残った残留蛋白質の分離からなる。

また本願発明の別の態様によれば、固定化酵素の混合物
が用いられ、段階ｂ）は、最初に、デカンテーション、
遠心分離および／または濾過による固定化酵素の分離、
次いで、得られた生成物を酸性媒体中６０ないし７０°
Ｃに加熱して加水分解されずに残った残留蛋白質を沈殿
させ、生じた沈殿を遠心分離または精密濾過により加水
分解物からなる生成物の残りの部分から分離することか
らなる。

本発明の生成物は、ホエイ蛋白質の部分加水分解物であ
って、滋養特別食用乳製品、特に乳幼児用組成のミルク
中に含有した際に、アレルギー反応を起こすことが少な
い（低アレルギー性幼児用滋養特別食用乳製品である）
という特徴を有する。

これは以下の特徴を有するニ ー全蛋白（未加水分解蛋白質）を含まない。

遊離アミノ酸濃度が少ない（全窒素１００ｇあたりアミ
ノ酸のかたちでの窒素が最大で１０ｇ）。

この特徴のため、アミノ酸をより高濃度に含むものと比
べ、生体内での浸透圧が減少緩和されて、含窒素物質の
速やかな吸収が容易になるという利点がある。

一中程度の大きさのペプチド（分子量が３，５００〜１
，５００　〕を含む。この特徴は乳製品の処方という観
点から重要である。実際、最終製品の組成には脂肪が含
まれており（固形分のおよそ２０％前後）、水を添加し
てミルクに戻すときにこの脂肪が第二相を形成すること
がないよう、脂肪は容易に分散するようにしなければな
らないが、このためには、処方物中に分散剤となる化合
物が存在しなければならない。ホエイ蛋白質由来の中程
度の大きさのペプチドは良好な乳化力を有しているが、
この特徴は、ペプチド鎖が短くなるにつれ消失する。し
たがって、加水分解物中に中程度の大きさのペプチド分
を保持する必要がある。

本発明の加水分解物は以下のようなペプチド分布を有す
る： 分子量　　　　　重量比（全ペプチド１００ｇ（ｇ１モ
ル）　　　　中のペプチドのｇ数〕〉５０００　　　　
　　　　　　　　　０〜５５０００〜３５０（１１５〜
　２５ ３５００〜１５００　　　　　　２０〜３０１５００〜
５００　　　　　　３５〜４５５００＜　　　　　　　
　　　　　　　　　　５　〜　ｌＯ本発明の方法はホエ
イ蛋白質の部分加水分解に基づいている。部分加水分解
は、最適な割合としたトリプシンとキモトリプシンの混
合物を用い、α−ラクトアルブミンが完全に消失するま
で行なう。その後、酵素と残留蛋白質すなわち加水分解
の不十分な蛋白質の分離ならびに収集しようとするペプ
チドの分離を行なう。

操作条件は可能な限り最大の生成物濃度を得るために最
適化されている。

本　明に　用できる出発原料 加水分解は、様々な起源のホエイに対して直接行なうこ
とができる。酸味物（ａｃｉｄ：新鮮なチズ、カゼイン
の製造によるもの）、甘味物（ｓｗｅｅｔ　：圧縮チー
ズ）のいずれでもよい。これらのものは、そのままでも
、またはあらかじめ脱脂しておよび／または脱ミネラル
化して使用することができる。

濃縮された（固形分で約２０％まで）ホエイも加水分解
の出発物質として使用できる。

加水分解は上記の様々なホエイから抽出した蛋白質を用
いても行なうことができる。これらの蛋白質は、イオン
交換クロマトグラフ法、ゲル濾過法、沈殿法あるいは限
外濾過法等、様々な方法により多かれ少なかれ精製した
状態で得ることができる。これらの技術のうち、最も経
済的であるという点で最適な方法は限外濾過法であり、
商業的にも、この方法が最も多く用いられている。（固
形分中に）約７５ないし８５％の蛋白質を含む非変性蛋
白質はこのようにして得られる。１リツトルあたり１０
０ないし１５０ｇの蛋白質を含む溶液はこうした精製蛋
白質（乾燥物または水和物）で調製される。

ホエイまたは再生蛋白質製造物はそのままでもまたは遠
心分離もしくは精密濾過によりあらかじめ純化しても用
いることができる。

出発原料は微生物特質の確認が必要であろう。

実際に、酵素的加水分解のある種の操作条件（ｐＨや温
度）は、最終製品の品質に望ましくない影響を与える微
生物の成育を促進する。したがって、加水分解に先立ち
、出発原料の加熱殺菌または滅菌操作を行なう必要があ
る。

仇皿工Ａ屏１ 本発明の目的には、トリプシンとキモトリプシンとを、
その混合物として用いる。これらの酵素は、その作用特
性が相補的である。実際、このニ種の蛋白分解酵素を個
々に用いた場合には、加水分解物を所望の特徴を有する
ものとすることができない。

醪慮濯Ｉ誌λ蔗孜 トリプシン活性：これは合成基質ＢＡＥＥ　（Ｎ−ベン
ゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル）加水分解系に
より表わす。トリプシンはＢＡＥＥを加水分解してプロ
トンを遊離する。ｐＨ８，０の５０ｍＭのＴＲｌ５／塩
酸緩衝液を用いて、１００ｍＭのＢＡＥＥと２０ｍＭの
塩化カルシウムを含む溶液を調製する。

−キモトリプシン活性：これは、合成基質ＡＴＥＥ（Ｎ
−アセチル−Ｌチロシンエチルエステル）の加水分解系
により表わす。キモトリプシンはＡＴＥＥを加水分解し
てプロトンを遊離する。調製は次のようにして行なう：
　１３５　ｍｇのＡＴＥＥを１ｍＪのメタノールに溶解
し、次いでｐＨ８，０、５０ｍＭのＴＲｌ５／塩酸緩衝
液９ｍｌを添加する（ＡＴＥＥ：５０ｍＭ）。

調製された合成基質（トリプシンに対するＢＡＥＥ、キ
モトリプシンに対するＡＴＥＥ）溶液は、３０℃のｐＨ
スタットに装入し、酵素を添加した後でｐＨを８．０に
維持するために用いた塩基（たとえばソーダやボタッシ
ュ）の量を計る。

トリプシン活性の単位は、上記の測定条件で、１マイク
ロモルのＢＡＥＥの１分間あたりの加水分解を触媒する
トリプシンの量である。

キモトリプシン活性の単位は、上記の測定条件で、１マ
イクロモルのＡＴＥＥの１分間あたりの加水分解を触媒
するキモトリプシンの量である。

二　の　白　　　素の活性比 ホエイ蛋白質の加水分解蛋白分解酵素混合物中のキモト
リプシン／トリプシン活性の比を任意とすることは、本
発明の目的には適当でない。実際、速度論的な見地から
最良の加水分解の結果を得るためにも、また、所望の加
水分解物を得るためにも、キモトリプシン／トリプシン
活性比が上記のＡＴＥＥ／ＢＡＥＥ系で表わして１．Ｓ
ないし３．０の間であるトリプシンとキモトリプシンの
混合物を用いることが必要であることが見出されている
。

基 この比は得られる加水分解物のペプチドの様相および遊
離アミノ酸び含有量に影響を及ばず。したがって、本発
明の目的のためには非常に重要である。

蛋白分解酵素／蛋白質比は、所望の加水分解物が得られ
る程度に低く、かつ、商業的な実施に適する反応速度と
なる程度に高くする。

キモトリプシン／全蛋白質比は、全蛋白質１００ｇあた
り２０，０００ＡＴＥＥ単位ないし３００，０００ＡＴ
ＥＥ単位の間とする。

トリプシン／全蛋白質比は先に選択したキモトリプシン
／トリプシン比に応じて導出される。たとえば、キモト
リプシン／トリプシン比を２．０とし、キモトリプシン
／全蛋白質比を、１００ｇあたり１００　、０００ＡＴ
ＥＥ単位とすると、１−リプシン／全蛋白質比は１００
ｇあたり５０　、０００ＢＡＥＥ単位となる。

皓許ｑ使■方恭 二種の蛋白分解酵素は加水分解をするべき調製物（ホエ
イまたは精製蛋白質の溶液）に溶液として溶解し、また
は不溶性担体上に固定化して用いることができる。

後者の場合、酵素を（吸着によってであれ、共有結合に
よってであれ）固定化するすべての方法が使用でき、ま
たどのような担体も、それが予定する実施態様に適合す
るものであるかぎりは、使用することができる。

しかし、選択したキモトリプシン／トリプシン比を酵素
の固定化の後も保つ方法および担体でなければならない
。したがって、酵素を担体に共有結合で結合させるよう
な方法を選択することが好ましい。また、その方が複合
体の安定性がより良（なる。

例を挙げれば、シリカまたはアルミナの多孔性ビーズの
ような担体が使用できる。挽いて選粒された穀物細粒で
も用いることができる。担体には最初に、たとえば、 ａ）シリカまたはアルミナをベースにした担体の場合に
はシラン化合物を用いて； ｂ）穀物軸茎の場合には、（たとえば、ソディウムメタ
ペリオダートを用いる等して）酸化処理した後、エチレ
ンジアミン調製物を用いて；−級アミン官能基が付加さ
れる。

次いで、付加された官能基は、たとえば、グルタルアル
デヒドを用いて活性化される。

その後、蛋白分解酵素混合物が担体（穀物細粒、シリカ
あるいはアルミナ）に添加され、望ましい架橋が行なわ
れ、これにより、選択したキモトリプシン／トリプシン
比に近い比を有する、安定な複合体が得られる。

加　　　の　法および　　制御 選択した出発原料（ホエイまたは精製した蛋白質溶液）
のｐＨ値は、二種の蛋白分解酵素が同時に良好な機能を
果たすような値に調整される。これらの二種の酵素は最
適活性のためのｐｉ（値がわずかながら異なり、キモト
リプシンでは８ないし８．５であり、トリプシンでは８
．５ないし９．０である。

したがって、ｐＨ値は、７，５ないし９．０、好ましく
は８．０ないし８．５と調整する。

ｐＨは、想定する実施態様に適合する塩基を用いて調整
される。一般的には、ソーダ（水酸化ナトリウム）、ボ
タッシュ（水酸化カリウム）、アンモニアまたはこれら
の混合物が、カチオンとして水素イオン濃度を調節する
のに使用できる。

加水分解反応は、ｐＨおよび温度が調節された系におい
て行なう。

ｐＨは、塩基の添加により出発値に維持する。

温度は、高い酵素活性が得られるような（そして、それ
により、加水分解時間と酵素の量を減少できるような）
値とし、適度な安定性を保つ。

比較的高い温度は、また、微生物の成長を抑えたり阻止
する。

温度は４０ないし６０℃とし、好ましくは４５ないし５
０℃とする。

処理すべき出発物質は、 ａ）可溶性蛋白分解調製物の場合には、反応器内におい
て撹拌した溶液中で： ｂ）固定化された蛋白分解酵素の場合には、穏やかに撹
拌した床中で、または固定床に再循環させることにより
： 酵素と接触させることができる。

加水分解を行なう方法は不連続である。各ペプチドの分
子量分布が目的生成物に一致したらすぐに加水分解を停
止するのが原則である。

反応速度は、本質的に温度および酵素／基質比の関数で
あり、これらほどではないが、ｐＨおよびキモトリプシ
ン／トリプシン比（１，５ないし３．０）にも依存する
。

確定した操作条件の下で最適な加水分解時間を見出し、
処理終了時の加水分解生成物を制御するためには、何よ
りも、ペプチドの様相（ｐｒｏｆｉｌｅ）をゲル浸透ク
ロマトグラフ法により分析する必要がある。

この分析は、異なるまたは適当なりロマトグラフ用ゲル
を用い、同様な原則にしたがって実施する（その大きさ
、すなわち分子量の区分により各種を分離する）。たと
えば、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ１５■ゲルは、分子量が１
５００未満のペプチド種を区別し分離する。５ｅｐｈａ
ｄｅｘ　Ｇ２５（′（：′ゲルは、分子量が１５００か
ら５、０００のペプチド種を区別し分離する。

本発明の生成物は、大部分のペプチド分子量が５００な
いし５，０００であることが特徴であり、二種の相補的
クロマトグラフ系を使用する必要がある。

すなわち、一方には５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ１５を士他方
には５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５を使用する。

５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ１５および５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ
２５をイ吏用するためには比較的長い時間が必要になる
。たとえば、５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２クロマトグラフカ
ラムを用いたＦ、　Ｐ。

Ｌ−Ｃ，（高速蛋白液クロマトグラフ法：　Ｆａｓｔ　
Ｐｒ。

ｔｅｉｎ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙ）によれば結果はより迅速に得られる。

こうしたクロマトグラフ系（Ｇ１５　、　Ｇ２５および
ＦＰＬＣ）は酸性媒体中（クエン酸緩衝液または酢酸も
しくはギ酸の存在下）で行なわなければならない。中性
媒体中ではペプチドの凝集が起こり、ペプチドの大きさ
を誤って評価する原因となる。この現象をさけるためで
ある。最大でｐＨ３，０が必要である。

溶出分画の分析は、溶出液に応じて、　２８０ｎｍ、２
３７ｎｍまたは２１５ｎｍでの光学濃度を測定すること
により行なう。ニンヒドリンを用いて遊離アミノ基を測
定することもできる。

こうして、十分に確定し制御された操作条件のために、
一連のペプチド連続分析により、所望の加水分鮮度を実
現するのに必要な加水分解時間を知ることができる。こ
の加水分鮮度は消費された塩基の量に対応しており、結
果として、次の操作では塩基消費量がこの値に達するま
で加水分解を行なえば良いことになり、便利であり実際
的である。

この場合には、クロマトグラフ法は、加水分解の終了時
で加水分解物のペプチドの様相を監視するためにのみ意
味を持つ。

所望の加水分鮮度が達成されたら、反応は停止させなけ
ればならない。このためには、媒体を酸性化（ｐＨ４，
０以下）し、温度を２０℃未満の値にすればよい。

残留蛋白質および酵素の除去 加水分解が終了した段階では、得られた生成物は、目的
とするペプチドおよびアミノ酸を含む一方、残留蛋白質
および蛋白分解酵素をも含んでいる。

この残留蛋白質は、使用される酵素系では加水分解が極
めて困難な構造を有するものがほとんどである。たとえ
ば、乳清アルブミンやイムノグロブリンが主に含まれる
。

これに対しては、加水分解が可溶性酵素を使用して行な
われたか固定化酵素を使用したかにより次の二つの解決
策を用いることができる。

ａ）可溶性酵素を用いた場合：残留蛋白質と二種の蛋白
分解酵素の不溶度が異なるため、これら二種の蛋白質を
共沈させることは容易ではない。

方、蛋白質構造はいずれも限外濾過によって容易に除去
できる。このためには、販売されているあらゆる種類の
膜および限外濾過系が適するが、膜の閾値は１０，００
０以下でなければならない。限外濾過はこの種の操作に
は既知のものである方法により行なう１、 限外濾過／透過濾過は、含窒素物質を最大限に回収する
ためにも用いることができる。

本発明の加水分解物を構成するのは、限外濾過透過物（
すなわち、膜を透過した生成物）である。

ｂ）固定化酵素を用いた場合：固定化酵素の複合体はま
ず加水分解生成物と分離する。

固定床を用いた場合には、分離は容易である。

撹拌床法の場合、分離法は担体の種類によって決まる。

一般的には、単純なデカンテーション、濾過あるいは遠
心分離が行なわれる。

固定化酵素を用いた場合には、牛乳起源の含窒素物質（
残留蛋白質、ペプチドおよびアミノ酸）は液相に含まれ
る。したがって、蛋白質は以下の二つの方法で抽出され
る。

一限外濾過または限外濾過／透過濾過。

−低温加熱（ｔｈｅｒｍｉｓａｔｊｏｎ）　：ペプチド
およびアミノ酸は蛋白質よりも大きな溶解度を有する。

したがって、蛋白質は媒体により選択的に沈殿させるこ
とができる。次いで、これらは遠心分離または精密濾過
によってペプチドから分離する。

蛋白質の沈殿は、熱とｐＨの組合わせ効果により行なう
。加水分解物は少な（とも６０℃、最高７０℃の温度に
さらす。ｐＨは４．０に調整する。この目的のためには
想定する実施態様に適合するものであればどのような酸
を用いても良い（塩酸、乳酸、クエン酸、酢酸またはリ
ン酸）。たとえば、生成物を、６０℃で１時間または７
０℃で３０分間維持し、次いで、沈殿した蛋白質を分離
する。

得られる上澄み液が本発明の加水分解物を含んでいる。

限外濾過または低温加熱により得られた本発明の加水分
解物は、次いで、微生物に対する安定性を良くするため
に、乾燥または濃縮される。

［発明の具体的開示コ 以下、本発明を例解するために実施例を示すがこれらは
本発明を限定するものではない。

実施例１から４は、実測の反応速度が異なる酵素／基質
比によって変化することを示すものである。

実ＪＵ江よ 限外濾過により蛋白質純度を７５％まで高めたホエイ蛋
白質粉末から、固形分ｌＯ％（蛋白質７．５％）を含む
水溶液を調製する。

溶液のｐＨはソーダを用いて８．０に調整する。

溶液を、ｐｆｒ調節手段を備えた反応容器中で５０℃に
加熱する。

使用する蛋白質のダラムあたりトリプシンを１．３５０
ＢＡＥＥ単位、キモトリプシンを２，７５０ＡＴＨＥ単
位含むようなキモトリプシンとトリプシンの混合物を調
製する。

蛋白分解酵素混合物を溶液に添加し、そのｐＨをソーダ
の添加により８．０に維持する。

１時間の加水分解の後、塩酸を用いてｐＨを６．０に調
整し、温度を２０°Ｃまで下げ、閾値５，０００（ＭＭ
）の膜を用いて限外濾過を行なう。

限外濾過の透過物は所望の加水分解物からなっている。

Ｋ施舅２ 限外濾過により蛋白質純度を７５％まで高めたホエイ蛋
白質粉末から、固形分１０％を含む水溶液を調製する。

溶液のｐＨはソーダを用いて８．０に調整する。

溶液を、ｐＨ調節手段を備えた反応容器中で５０°Ｃに
加熱する。

使用する蛋白質のダラムあたりトリプシンを７００８Ａ
ＥＥ単位、キモトリプシンを１，４００ＡＴＨＥ単位含
むようなキモトリプシンとトリプシンの混合物を調製す
る。

蛋白分解酵素混合物を溶液に添加し、そのｐＨをソーダ
の添加により８．０に維持する。

２．５時間の加水分解の後、塩酸を用いて、ｐＨを６．
０に調整し、温度を２０℃まで下げ、閾値５，０００（
ＭＭ）の膜を用いて限外濾過を行なう。

限外濾過の透過物は所望の加水分解物からなっている。

実」「例３ 限外濾過により蛋白質純度を７５％まで高めたホエイ蛋
白質粉末から、固形分ｌＯ％を含む水溶液を調製する。

溶液のｐＨはソーダを用いて８．０に調整する。

溶液を、ｐＨ調節手段を備えた反応容器中で５０℃に加
熱する。

使用する蛋白質のダラムあたりトリプシンを３００８Ａ
ＥＥ単位、キモトリプシンを６００ＡＴＨＥ単位含むよ
うなキモトリプシンとトリプシンの混合物を調製する。

蛋白分解酵素混合物を溶液に添加し、そのｐＨをソーダ
の添加により８．０に維持する。

８時間の加水分解の後、塩酸を用いてｐＨを６．０に調
整し、温度を２０℃まで下げ、閾値５．０００　（ＭＭ
）の膜を用いて限外濾過を行なう。

限外濾過の透過物は所望の加水分解物からなっている。

夾施舅４ 限外濾過により蛋白質純度を７５％まで高めたホエイ蛋
白質粉末から、固形分ｌＯ％を含む水溶液を調製する。

溶液のｐＨはソーダを用いて８．０に調整する。

溶液を、ｐＨ調節手段を備えた反応容器中で５０℃に加
熱する。

使用する蛋白質のダラムあたりトリプシンを１５０８Ａ
ＥＥ単位、キモトリプシンを３００ＡＴＨＥ単位含むよ
うなキモトリプシンとトリプシンの混合物を調製する。

蛋白分解酵素混合物を溶液に添加し、そのｐＨをソーダ
の添加により８．０に維持する。

１５時間の加水分解の後、塩酸を用いてｐＨを６．０に
調整し、温度を２０℃まで下げ、閾値５，０００（ＭＭ
）の膜を用いて限外濾過を行なう。

限外濾過の透過物は所望の加水分解物からなっている。

実施例５から７は、異なる種類のホエイについての処理
方法の例を示すものである。

衷胤然ｊ 加水分解のための出発物質は圧縮チーズ由来のホエイで
あり、逆浸透により、固形分２２．６％まで濃縮したも
のである。当初のｐ）ｌは６．３であり、含窒素物質の
全量は、固形分の１４．６％である。

ホエイのｐＨはソーダを用いて８．０に調整し、これを
ｐＨ調節手段を備えた反応容器中に、５０℃で装入する
。

使用する蛋白質ダラムあたりトリプシンを１．３５０Ｂ
ＡＥＥ単位、キモトリプシンを２．７５０ＡＴＨＥ単位
含むようなキモトリプシンとトリプシンの混合物を調製
する。これは使用する濃縮ホエイ１００グラムあたりで
は、−トリプシンを４．５００ＢＡＥＥ単位、キモトリ
プシンを９，１００ＡＴＨＥ単位含む。

蛋白分解酵素混合物を溶液に添加し、そのｐＨをソーダ
の添加により８．０に維持する。

１時間の加水分解の後、塩酸を用いてｐＨを６．０に調
整し、温度を２０℃まで下げ、加水分解したホエイの限
外濾過を行なう。

得られる透過物のペプチドの様相は所望の加水分解物の
種類に対応する。

火監冊ｌ 加水分解のための出発物質は圧縮チーズ由来のホエイで
あり、電解透析により脱ミネラル化し、逆浸透により濃
縮したものである。

その主な特徴は以下のようになっている：固形分２１．
３％ 一含窒素物質の全量：固形分の１５．４％−灰分：固形
分の０．９％ 当初のｐＨ：５．０ ｐｉ（はソーダを用いて８．０に調整し、次いで、濃縮
ホエイをｐｉ＋調節手段を備えた反応容器中に、５０℃
で装入する。

使用する蛋白質ダラムあたりトリプシンを１，３５０Ｂ
ＡＥＥ単位、キモトリプシンを２．７５０ＡＴＨＥ単位
含むようなキモ］・リプシンとトリプシンの混合物を調
製する。これは使用する濃縮ホエイ１００グラムあたり
では、トリプシンを４，５００ＢＡＥＥ　１位、キモト
リプシンを９．１００ＡＴＨＥ単位含む。

蛋白分解酵素混合物を溶液に添加し、そのｐＨをソーダ
の添加により８．０に維持する。

１時間の加水分解の後、塩酸を用いてｐＨを６．０に調
整し、温度を２０°Ｃまで下げ、加水分解したホエイの
限外濾過を行なう。

得られる透過物のペプチドの様相は所望の加水分解物の
種類に対応する。

火血奥ｌ 加水分解のための出発物質は圧縮チーズ由来のホエイで
あり、６％の固形分を有する。当初のｐＨは６．５であ
り、含窒素物質の全量は、固形分の１４％である。

ｐＨはソーダを用いて８，０に調整し、このホエイをｐ
Ｈ調節手段を備えた反応容器中に、５０°Ｃで装入オる
。

使用する蛋白質ダラムあたりトリプシンを７００ＢＡＥ
Ｅ単位、キモトリプシンを１．４００ＡＴＨＥ単位含む
ようなキモトリプシンとトリプシンの混合物を調製する
。これは使用するホエイ１００グラムあたりでは、トリ
プシンを６０．０ＢＡＥＥ単位、キモトリプシンを１，
２００ＡＴＨＥ単位含む。

蛋白分解酵素混合物を溶液に添加し、そのｐＨをソーダ
の添加により８０に維持する。

２．５時間の加水分解の後、塩酸を用いて、ｐＨを６．
５に調整し、温度を２０℃まで下げ、限外濾過を行なう
。

得られる透過物のペプチドの様相は所望の加水分解物の
種類に対応する。

支廐拠溢 この例では、固定化酵素を用いた方法について例解する
。

共有結合によって無機担体に固定化された酵素複合体を
以下の方法により調製する。

★担体：粒径が４５０ミクロンの多孔性シリカでできた
ビーズであり、細孔の平均孔径は３５０オングストロー
ム、平均比表面積は３５　ｍ　２／ｇ　ａ“−級アミン
官能基を以下の方法でこの担体に付加（ｇｒａｆｔ）す
るニ ー乾燥担体１ｇをγ−アミノプロピルトリエトキシシラ
ンの０．５％溶液１００ｍ１に接触させる。そのｐＨは
酢酸の添加により４．５に調整しておく。

−７０℃で１時間撹拌する。

一水ですすぐ。

★担体（１グラム）を、次いで、グルタルアルデヒド２
．５％水溶液１００ｍ１を用いて２０℃、２時間で活性
化し、次いですすぐ。

★３，５００ＢＡＥＥ単位のトリプシンと７　、０００
ＡＴＨＥ単位のキモトリプシンとからなる混合物を５０
ｍＭのリン酸緩衝液１００ｍ１中でｐＨ７，０に調製し
、活性化担体１グラムと４℃で１６時間接触させる。

”担体を洗浄した後、担体１グラムあたり　１００ｍ１
のグルタルアルデヒド２．５％水溶液を用いて、２０°
Ｃで２時間かけて蛋白分解酵素の架橋を行なう。

”吸着されただけの蛋白分解酵素は、塩化ナトリウムの
１モル溶液を用いて１５分づつ３回洗浄することにより
（担体１グラムあたり１００ｍ１゜合計３００ｍ１　）
除去する。この操作は２０℃で行ない、その後、自由洗
浄する。

加水分解反応は次のようにして行なう：”出発原料：圧
縮チーズ由来のホエイであり、逆浸透により固形分２２
．６％に濃縮したもの。当初のｐＨは６．３であり、含
窒素物質の全量は、固形分の１４，６％である。

”加水分解： ポエイのｐｉｌはソーダを用いて８．０に調整し、次い
で、固定化蛋白分解酵素複合体１５０ｇを４０℃でホエ
イ５００ｇと接触させる。この際、穏やかに撹拌して複
合体をホエイ中に懸濁させる。

ｐｏはソーダの添加により８．０に調節する。

加水分解を２０時間行なった後、酵素複合体はデカンテ
ーションによってホエイから分離する。

ボエイのｐＨを塩酸を用いて４．０に調整し、生成物を
６０℃に１時間保つ。次いで、遠心分離する。

上澄み液が所望の加水分解物である。

以上の実施例は例示のためのものであり、その一部を同
等な技術で置換すること等により、本発明の範囲内で変
更できることは明らかである。

代 理 人 メールーエグリズ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、残留全蛋白質を含まないホエイ蛋白質部分加水分解
   物であって、次の分布に亙るペプチド： 分子量（ｇ／モル）　重量比（全ペプチド１００ｇ中の
   ペプチドのｇ数） ＞５０００　０〜５ ５０００〜３５００　１５〜２５ ３５００〜１５００　２０〜３０ １５００〜５００　３５〜４５ ５００＜　５〜１０ ならびに加水分解物中の含有量が（全窒素１００ｇあた
   りの窒素ｇ数で計算して）１０％以下の遊離アミノ酸を
   含むことを特徴とするもの。 ２、請求項第１項に規定する加水分解物を含有すること
   を特徴とする低アレルギー性滋養特別食用乳製品。 ３、以下の各段階からなる請求項第１項に規定された部
   分加水分解物の酵素的製造方法： ａ）酵素キモトリプシン／トリプシンの活性比が１．５
   ないし３．０であるキモトリプシン／トリプシンの混合
   物を、ホエイ、脱脂および／または脱ミネラル化したホ
   エイ、濃縮ホエイ、脱脂および／または脱ミネラル化し
   た濃縮ホエイ、および上記のホエイから抽出された蛋白
   質の水溶液から選択される基質に対し、ｐＨ７．５ない
   し９．０、４０℃ないし６０℃の温度で、上に規定した
   ペプチド分布が得られるような時間用い、キモトリプシ
   ン／全基質蛋白質の比が全蛋白質１００ｇあたり２０，
   ０００から３００，０００ＡＴＥＥ単位の間である酵素
   的加水分解；および ｂ）酵素および残留未加水分解蛋白質の分離。 ４、請求項第３項の方法であって、可溶性酵素の混合物
   が使用され、段階ｂが、閾値１０，０００未満の膜を用
   いて限外濾過および／または透過濾過により行なわれる
   ことを特徴とする方法。 ５、請求項第３項の方法であって、固定化酵素の混合物
   が使用され、段階ｂが、最初に固定化酵素をデカンテー
   ション、遠心分離および／または濾過により分離し、次
   いで、加水分解物を得るために未加水分解残留蛋白質を
   閾値１０，０００未満の膜を用いて限外濾過および／ま
   たは透過濾過により分離することからなることを特徴と
   する方法。 ６、請求項第３項の方法であって、固定化酵素の混合物
   が使用され、段階ｂが、最初に固定化酵素をデカンテー
   ション、遠心分離および／または濾過により分離し、次
   いで、生成物を酸性媒体中、６０ないし７０℃の温度に
   加熱して、加水分解されずに残った残留蛋白質を沈殿さ
   せ、生じた沈殿を遠心分離または精密濾過により加水分
   解物を含む生成物の残りの部分から分離することからな
   ることを特徴とする方法。