JPH02182191A - 発現エンハンサーおよび組換え遺伝子発現時の収量を増大させる方法 - Google Patents
発現エンハンサーおよび組換え遺伝子発現時の収量を増大させる方法Info
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- JPH02182191A JPH02182191A JP1292538A JP29253889A JPH02182191A JP H02182191 A JPH02182191 A JP H02182191A JP 1292538 A JP1292538 A JP 1292538A JP 29253889 A JP29253889 A JP 29253889A JP H02182191 A JPH02182191 A JP H02182191A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、発現エンハンサ−および組換え遺伝子を有す
る発現ベクターを含む適当な宿主細胞の形質転換によっ
て組換え遺伝子の発現時の収量を増大させる方法に関す
る。
る発現ベクターを含む適当な宿主細胞の形質転換によっ
て組換え遺伝子の発現時の収量を増大させる方法に関す
る。
従来の技術
組換え遺伝子、就中Ｅ、ｃｏｌｉ中の真核遺伝子の発現
時には、しばしば、所望の遺伝子生成物の発現が不十分
である、という難点が生じる。こｆ′Ｌは、当該分野に
おいて従事する研究者によって種々の原因に帰せら扛て
いるが、就中特定の組換え遺伝子で形質転換さ【たＥ、
ｃｏｌｉ細胞の極めて小さい発酵速度に原因があるとさ
牡ている。
時には、しばしば、所望の遺伝子生成物の発現が不十分
である、という難点が生じる。こｆ′Ｌは、当該分野に
おいて従事する研究者によって種々の原因に帰せら扛て
いるが、就中特定の組換え遺伝子で形質転換さ【たＥ、
ｃｏｌｉ細胞の極めて小さい発酵速度に原因があるとさ
牡ている。
成程Ｅ、ｃｏｌｌ細胞は部分的には組換え遺伝子の極め
て良好な発現を示すが、細胞成長は不良であって、その
ためにバイオマスが僅かしか得られず、その結果また所
望の遺伝子生成物の収量も極めて少なくなる。
て良好な発現を示すが、細胞成長は不良であって、その
ためにバイオマスが僅かしか得られず、その結果また所
望の遺伝子生成物の収量も極めて少なくなる。
発明が解決しようとする課題
したがって本発明は、Ｅ、ｃｏｌｉにおける発現時の所
望の遺伝子生成物の収量全増大させる方法および手段を
提供するという課題を基礎にしている。
望の遺伝子生成物の収量全増大させる方法および手段を
提供するという課題を基礎にしている。
課題を解決するための手段
前記課題は本発明により、発現エンハンサ−が、転写後
にｔ ＲＮＡのクローバ−葉構造を形成する能力のある
ＤＮＡ配列を有しかつ転写後にクロバー葉構造において
アンチコドンループを形成するＤＮＡ＠域で、配列５’
−ＧＡＣＴＴＡＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴ−３’またはこの
配列と相、補的な配列 ５’−ＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＴＣ−３’、好１
しくは５’ −ＣＡＣＧＡＣＴＴＡＧＡＡＧＧＴＣＧＴ
ＴＧ −３’または同配列と相補的なオリゴＳ５’−Ｃ
ＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＴＣＧＴＧ−３’とノ１
イブリッドを形成していることによって解決さＧる。
にｔ ＲＮＡのクローバ−葉構造を形成する能力のある
ＤＮＡ配列を有しかつ転写後にクロバー葉構造において
アンチコドンループを形成するＤＮＡ＠域で、配列５’
−ＧＡＣＴＴＡＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴ−３’またはこの
配列と相、補的な配列 ５’−ＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＴＣ−３’、好１
しくは５’ −ＣＡＣＧＡＣＴＴＡＧＡＡＧＧＴＣＧＴ
ＴＧ −３’または同配列と相補的なオリゴＳ５’−Ｃ
ＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＴＣＧＴＧ−３’とノ１
イブリッドを形成していることによって解決さＧる。
ｔＲＮＡ分子のクローバ−葉構造は、−本領ＲＮＡ分子
の特定領域の塩基対によって形成さね、すべてのｔＲＮ
Ａ分子において特定の規則性が生じる。
の特定領域の塩基対によって形成さね、すべてのｔＲＮ
Ａ分子において特定の規則性が生じる。
クローバ−葉構造のそｎぞｎには、左のループ、すなわ
ち所謂ジヒドロウリジンルーツ；第２番目のループ、す
なわち相補的なトリジレットを有するｔ ＲＮＡ分子の
場合にはｍＲＮＡの塩基対ヲ弓受けることができ、七Ｃ
によってｔ ＲＮＡの特異性を決める所謂アンチコドン
ループおよび右に配置されたループ、すなわち所謂プソ
イドウリジンループが存在し、アンチコドンループとプ
ソイドウリジンループとの間にはしばしば可変のエキス
トラルーツがある。
ち所謂ジヒドロウリジンルーツ；第２番目のループ、す
なわち相補的なトリジレットを有するｔ ＲＮＡ分子の
場合にはｍＲＮＡの塩基対ヲ弓受けることができ、七Ｃ
によってｔ ＲＮＡの特異性を決める所謂アンチコドン
ループおよび右に配置されたループ、すなわち所謂プソ
イドウリジンループが存在し、アンチコドンループとプ
ソイドウリジンループとの間にはしばしば可変のエキス
トラルーツがある。
本発明による発現エンノ・ンサーは、転写後にこのよう
なりローパー葉構造を形成することができるＲＮＡ ’
ｉ与えるＤＮＡ構造を有する。従って本発明は、クロー
バ−葉構造を形成する能力のある天然および合成遺伝子
を包含しており、本発明の範囲内にはまた、クローバ−
葉構造を形成する能力のあるＤＮＡ配列の他に別の配列
を有しかつクローバ−葉構造を有するＲＮＡの形成下に
プロセッシングさｎうるＤＮＡ配列も入る。しかし本発
明による発現エンハンサ−は、アンチコドンループで前
記オリゴヌクレオチドとハイブリットを形成すること全
特徴としている。本発明の好ましい実施態様においては
、発現エンハンサは配列５’−ＣＡＣＧＡＣＴＴＡＧＡ
ＡＧＧＴＣＧＴＴＧ−３’またばこｎと相補的な配列５
’−ＣＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＴＣＧＴＧ−３’
のオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成する。
なりローパー葉構造を形成することができるＲＮＡ ’
ｉ与えるＤＮＡ構造を有する。従って本発明は、クロー
バ−葉構造を形成する能力のある天然および合成遺伝子
を包含しており、本発明の範囲内にはまた、クローバ−
葉構造を形成する能力のあるＤＮＡ配列の他に別の配列
を有しかつクローバ−葉構造を有するＲＮＡの形成下に
プロセッシングさｎうるＤＮＡ配列も入る。しかし本発
明による発現エンハンサ−は、アンチコドンループで前
記オリゴヌクレオチドとハイブリットを形成すること全
特徴としている。本発明の好ましい実施態様においては
、発現エンハンサは配列５’−ＣＡＣＧＡＣＴＴＡＧＡ
ＡＧＧＴＣＧＴＴＧ−３’またばこｎと相補的な配列５
’−ＣＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＴＣＧＴＧ−３’
のオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成する。
このような発現エンハンサ−は合成することもできるし
、また例えばＥ、ｃｏｌｉ細胞から分離することもでき
る。本発明の好ましい実施態様においては、発現エンハ
ンサ−を製造するために、Ｐｓｔｌで部分的に消化さ扛
た染色体Ｅ、ｃｏｌｉ ＤＮＡから成る遺伝子パンク（
Ｇｅｎｔ）ａｎｋ）を適当なベクターに導入し、この遺
伝子パンクベクターおよびその発現時にＥ、ｃｏｌｉ細
胞の成長を不良にする組換え遺伝子を有する発現シラス
ミド（ここで６成長を不良にする′″という表現は本発
明の範囲では、細胞の成長全組換え遺伝子のみの発現の
場合には、発現エンノーンサーの付加的発現の場合より
も不良にすること全意味する）を含むＥ、ｃｏｌｉ細胞
が共同形質転換さｎ、選択され、誘導さｎ、培養さ扛、
増殖して大きなコロニーになったクローンを分離し、こ
ｎらのクローンから遺伝子パンクベクターを分離する。
、また例えばＥ、ｃｏｌｉ細胞から分離することもでき
る。本発明の好ましい実施態様においては、発現エンハ
ンサ−を製造するために、Ｐｓｔｌで部分的に消化さ扛
た染色体Ｅ、ｃｏｌｉ ＤＮＡから成る遺伝子パンク（
Ｇｅｎｔ）ａｎｋ）を適当なベクターに導入し、この遺
伝子パンクベクターおよびその発現時にＥ、ｃｏｌｉ細
胞の成長を不良にする組換え遺伝子を有する発現シラス
ミド（ここで６成長を不良にする′″という表現は本発
明の範囲では、細胞の成長全組換え遺伝子のみの発現の
場合には、発現エンノーンサーの付加的発現の場合より
も不良にすること全意味する）を含むＥ、ｃｏｌｉ細胞
が共同形質転換さｎ、選択され、誘導さｎ、培養さ扛、
増殖して大きなコロニーになったクローンを分離し、こ
ｎらのクローンから遺伝子パンクベクターを分離する。
配列５’−ＧＡＣＴＴＡＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴ−３’ま
たはこ【と相補的な配列５’−ＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＴ
ＡＡＧＴＣ−３’のオリゴヌクレオチドとのハイブリッ
ド形成によって、発現エンハンサ−の存在を検ぺること
かできる。本発明の特に好ましい実施態様においては配
列５’ −ＣＡＣＧＡＣＴＴＡＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＧ
−３’のオリゴヌクレオチドまたはこれと相補的なオリ
ゴヌクレオチド５’−ＣＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧ
ＴＣＧＴＧ−３’を使用する。
たはこ【と相補的な配列５’−ＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＴ
ＡＡＧＴＣ−３’のオリゴヌクレオチドとのハイブリッ
ド形成によって、発現エンハンサ−の存在を検ぺること
かできる。本発明の特に好ましい実施態様においては配
列５’ −ＣＡＣＧＡＣＴＴＡＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＧ
−３’のオリゴヌクレオチドまたはこれと相補的なオリ
ゴヌクレオチド５’−ＣＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧ
ＴＣＧＴＧ−３’を使用する。
本発明による好ましい製造方法は、Ｅ、ｃｏｌｉでその
遺伝子が発現する際同細胞の成長を極めて不良にする組
換え遺伝子を有する発現シラスミドを用いて行なうこと
ができる。このために好ましくは藺導可能な発現シラス
ミドを使用すると、誘導までＥ、ｃｏｌｉ細胞の通常の
発酵が起こりうる。誘導後に、再び本発明による発現エ
ンハンサ−を有する遺伝子パンクベクターを含むような
りローンが増殖して大きなコロニーになる。これは、前
記配列のオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によ
って検べることかできる。次に、発現エンハンサ−を有
する遺伝子バンクベクターを含むクローンから、遺伝子
パンクの製造のために使用した制限酵素による消化によ
って該エンハンサ−を分離することができる。
遺伝子が発現する際同細胞の成長を極めて不良にする組
換え遺伝子を有する発現シラスミドを用いて行なうこと
ができる。このために好ましくは藺導可能な発現シラス
ミドを使用すると、誘導までＥ、ｃｏｌｉ細胞の通常の
発酵が起こりうる。誘導後に、再び本発明による発現エ
ンハンサ−を有する遺伝子パンクベクターを含むような
りローンが増殖して大きなコロニーになる。これは、前
記配列のオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によ
って検べることかできる。次に、発現エンハンサ−を有
する遺伝子バンクベクターを含むクローンから、遺伝子
パンクの製造のために使用した制限酵素による消化によ
って該エンハンサ−を分離することができる。
本発明の好ましい実施態様においては、発現プラスミド
としてはｔ−ＰＡ発現プラスミドを使用し、特に好まし
くはプラスミドｐＵＢＳ ９８．ｓｔを使用する（例３
参照）。
としてはｔ−ＰＡ発現プラスミドを使用し、特に好まし
くはプラスミドｐＵＢＳ ９８．ｓｔを使用する（例３
参照）。
本発明により使用さｎる誘導可能の発現プラスミドは、
好ましくはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ
シドによって、極めて好ましくは５〜２０ ｍｍｏｌ／
７の量で誘導さ扛る。
好ましくはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ
シドによって、極めて好ましくは５〜２０ ｍｍｏｌ／
７の量で誘導さ扛る。
遺伝子パンクを製造するためには、本発明により好まし
くはベクターｐＡＣＹＣ１７７（ＤＳＭ３６９３Ｐ）を
使用する。
くはベクターｐＡＣＹＣ１７７（ＤＳＭ３６９３Ｐ）を
使用する。
本発明の他の対象は、組換え遺伝子の発現時の収量を、
四組換え遺伝子を有する発現ベクターを含むＥ、ｃｏｌ
ｉ細胞の形質転換によって増大させる方法であり、この
際本発明による発現エンハンサ−を発現可能な形で同様
に宿主細胞に導入し、同エンハンサ−の発現を前記発現
ベクターの発現前にまたはこの発現と同時に生起させる
。
四組換え遺伝子を有する発現ベクターを含むＥ、ｃｏｌ
ｉ細胞の形質転換によって増大させる方法であり、この
際本発明による発現エンハンサ−を発現可能な形で同様
に宿主細胞に導入し、同エンハンサ−の発現を前記発現
ベクターの発現前にまたはこの発現と同時に生起させる
。
本発明による好ましい実施態様では、該発現エンハンサ
−を組換え遺伝子を有する発現ベクター中に導入する。
−を組換え遺伝子を有する発現ベクター中に導入する。
これは、本発明によｎば、発現エンハンサ−が特有の別
個のプロモーターに制御ざｎるか、または組換え遺伝子
と一緒に同プロモーターに制御さするように行なわれる
。
個のプロモーターに制御ざｎるか、または組換え遺伝子
と一緒に同プロモーターに制御さするように行なわれる
。
本発明の他の好ましい実施態様においては、発現ベクタ
ーを組換え遺伝子を有する発現ベクターに適合するベク
ターに導入する。適合するベクターとは、本発明の範囲
では、発現ベクターとは異なる複製源を有するベクター
のことである。こ扛によって両プラスミドの細胞におけ
る同時的複製および転写が可能になる。
ーを組換え遺伝子を有する発現ベクターに適合するベク
ターに導入する。適合するベクターとは、本発明の範囲
では、発現ベクターとは異なる複製源を有するベクター
のことである。こ扛によって両プラスミドの細胞におけ
る同時的複製および転写が可能になる。
好ましくは、発現エンハンサ−金有するベクターとして
は、シラスミドｐＵＢｓ １００を使用し、組換え遺伝
子を有する発現ベクターとしてはこ扛に適合するベクタ
ー、例えばｔ−ＰＡ発現シラスミドｐＵＢ８９８．ｓＡ
ｋ使用する。本発明の好ましい実施態様においては、
組換え遺伝子として、ｔ−ＰＡまたはｔ−ＦＡ誘導体、
ウロキナーゼまたはＨＩＶタンパク質の遺伝子もしくは
ｅＤＮＡｆ：使用する。
は、シラスミドｐＵＢｓ １００を使用し、組換え遺伝
子を有する発現ベクターとしてはこ扛に適合するベクタ
ー、例えばｔ−ＰＡ発現シラスミドｐＵＢ８９８．ｓＡ
ｋ使用する。本発明の好ましい実施態様においては、
組換え遺伝子として、ｔ−ＰＡまたはｔ−ＦＡ誘導体、
ウロキナーゼまたはＨＩＶタンパク質の遺伝子もしくは
ｅＤＮＡｆ：使用する。
発現エンハンサ−の発現は本発明によ牡ば、組換え遺伝
子を有する発現ベクターの発現前にまたはその発現と同
時に行なってよい。しかしこの発現エンハンサ−の発現
は、発現ベクターの発現前に発現エンハンサ−の遺伝子
生成物が宿主細胞でヌクレアーゼによって著しく分解さ
扛るように長時間で起ってはならない。従って本発明に
よ扛ば該発現を発現ベクターの発現と同時に、極めて好
ましくは構成性発現または誘導によって行なうのが有利
である。このために発現エン−・ンザ−は本発明によれ
ば誘導性プロモーター、好ましくは７ａｃプロモーター
に制御さｔでもよい。
子を有する発現ベクターの発現前にまたはその発現と同
時に行なってよい。しかしこの発現エンハンサ−の発現
は、発現ベクターの発現前に発現エンハンサ−の遺伝子
生成物が宿主細胞でヌクレアーゼによって著しく分解さ
扛るように長時間で起ってはならない。従って本発明に
よ扛ば該発現を発現ベクターの発現と同時に、極めて好
ましくは構成性発現または誘導によって行なうのが有利
である。このために発現エン−・ンザ−は本発明によれ
ば誘導性プロモーター、好ましくは７ａｃプロモーター
に制御さｔでもよい。
次に本発明を実施例によシ詳述する。
例１
発現エンハンサ−のクローニングおよび選択：制限酵素
Ｐ＠ｔｌで部分的に消化さｎ ｆｔ−Ｅ、 ｃｏｌ １
ＤＮＡの遺伝子パンクを、周知の分子生物学的手段（特
にＷｉｎｎａｃｋｅｖ Ｅ、Ｌ、、Ｇｅｎｅ ｕｎｄ
Ｋｌｏｎｐ。
Ｐ＠ｔｌで部分的に消化さｎ ｆｔ−Ｅ、 ｃｏｌ １
ＤＮＡの遺伝子パンクを、周知の分子生物学的手段（特
にＷｉｎｎａｃｋｅｖ Ｅ、Ｌ、、Ｇｅｎｅ ｕｎｄ
Ｋｌｏｎｐ。
ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇ １９８５） ’！ｃ”用いて、
ｐＡＣＹＣ１７７゜ＤＳＭ ３６９３ｐ （Ｃｈａｎｑ
ｕｎｄ Ｃｏｈｅｎ、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
ｐＡＣＹＣ１７７゜ＤＳＭ ３６９３ｐ （Ｃｈａｎｑ
ｕｎｄ Ｃｏｈｅｎ、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
１３４（１９７８）、１１４１〜１１５６） 中に導
入した。
入した。
このためにＰｓｔｌ テ切断さｆｌ’ｃ ｐＡＣＹＣ１
７７プラスミドＤＮＡ ｉ、部分的にＰｓｔｉで消化さ
れた染色体Ｅ、ｃｏｌｉ ＤＮＡと結合した。ｐＡＣＹ
Ｃ’ １７７のＰｓｔ１位置に挿入断片を含むクローン
を、アンピシリン感受性によって、および挿入断片の長
さだけ増大された分子量によって固定することができる
。このようなりローンのプラスミドＤＮＡは、ゲル電気
泳動法／ｒル溶離によって挿入断片を含まないプラスミ
ドＤＮＡから分離し、単離することができる。この遺伝
子パンクから、遺伝子バンクプラスミドとｔ−ＰＡ発現
プラスミドｐＵＢｓ９８．ｓｔ（この製造は例３に記載
する）との共同形質転換およびＩＰＴＧ（イソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド） １０ ｍｍｏｌ
／ｌを含有するＬＢ−カナマイシン／アンビシリン培地
での選択によって、シラスミドｐＵＢｓ １００を分離
した。
７７プラスミドＤＮＡ ｉ、部分的にＰｓｔｉで消化さ
れた染色体Ｅ、ｃｏｌｉ ＤＮＡと結合した。ｐＡＣＹ
Ｃ’ １７７のＰｓｔ１位置に挿入断片を含むクローン
を、アンピシリン感受性によって、および挿入断片の長
さだけ増大された分子量によって固定することができる
。このようなりローンのプラスミドＤＮＡは、ゲル電気
泳動法／ｒル溶離によって挿入断片を含まないプラスミ
ドＤＮＡから分離し、単離することができる。この遺伝
子パンクから、遺伝子バンクプラスミドとｔ−ＰＡ発現
プラスミドｐＵＢｓ９８．ｓｔ（この製造は例３に記載
する）との共同形質転換およびＩＰＴＧ（イソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド） １０ ｍｍｏｌ
／ｌを含有するＬＢ−カナマイシン／アンビシリン培地
での選択によって、シラスミドｐＵＢｓ １００を分離
した。
このシラスミドｐＵＢｓ １００は、約３０００塩基の
長さを有する染色体Ｅ、ｃｏｌｉ ＤＮＡの部分を含む
。
長さを有する染色体Ｅ、ｃｏｌｉ ＤＮＡの部分を含む
。
該シラスミドｐＵＢｓ １００は、同プラスミドｐＵＢ
５１００および発現グラスミドｐＵＢＳ ９８． ｓ
ｔｋ有しかつＩＰＴＧの藺導によってｔ−ＰＡを産生す
るＬ ｃｏ １１細胞（ＤＳＭ ３６８Ｑ ）が、ｐＵ
Ｂｓ ９３．ｓｔおよびＴＩＡＣＹＣ１７７を有するＥ
、ｃｏｌｉ細胞とは対照的に、藺導後に大きなコロニー
に増殖しうるという効果をもたらす。
５１００および発現グラスミドｐＵＢＳ ９８． ｓ
ｔｋ有しかつＩＰＴＧの藺導によってｔ−ＰＡを産生す
るＬ ｃｏ １１細胞（ＤＳＭ ３６８Ｑ ）が、ｐＵ
Ｂｓ ９３．ｓｔおよびＴＩＡＣＹＣ１７７を有するＥ
、ｃｏｌｉ細胞とは対照的に、藺導後に大きなコロニー
に増殖しうるという効果をもたらす。
例２
発現エンハンサ−を含むシラスミドを用いる共同形質転
換によるＥ、ｃｏｌｉにおけるｔ−ＰＡの発現： この例では、発現エンハンサ−を含むプラスミドとして
シラスミドｐＵＢｓ １００ ｅ使用した。
換によるＥ、ｃｏｌｉにおけるｔ−ＰＡの発現： この例では、発現エンハンサ−を含むプラスミドとして
シラスミドｐＵＢｓ １００ ｅ使用した。
ｐＵＢｓ １００およびｔ−ＰＡ発現シラスミドを含む
Ｅ、ｃｏｌｉ （ＤＳＭ ３６８９ ）の共同形質転換
を、プラスミドｐＵＢｓ ９Ｂ、ｓｔのみによる形質転
換の際の宿主細胞における発現率と比較した。さらにこ
の発現率を同一菌株におけるプラスミドｐｅ Ｐａ９８
．１ （ＤＥ ３６１３４０１）の発現率と比較した。
Ｅ、ｃｏｌｉ （ＤＳＭ ３６８９ ）の共同形質転換
を、プラスミドｐＵＢｓ ９Ｂ、ｓｔのみによる形質転
換の際の宿主細胞における発現率と比較した。さらにこ
の発現率を同一菌株におけるプラスミドｐｅ Ｐａ９８
．１ （ＤＥ ３６１３４０１）の発現率と比較した。
この比較の結果を表１に記載する。さらに、発現エンハ
ンサ−およびｔ−ＰＡ遺伝子を含むプラスミド、つまり
プラスミドｐＵＢ８９８． ｓｋｙ （ＤＡＭ ４８９
８）を使用したｔ−ＰＡの発現も実験した。こ扛に関す
る結果も表１に記載する。
ンサ−およびｔ−ＰＡ遺伝子を含むプラスミド、つまり
プラスミドｐＵＢ８９８． ｓｋｙ （ＤＡＭ ４８９
８）を使用したｔ−ＰＡの発現も実験した。こ扛に関す
る結果も表１に記載する。
表 １
Ｅ、ｃｏｌｉ、ＤＳＭ ３６８９ 完全ｔ−ｐＡ／全
タンノ４り質％ 生存能力 ＋ｐｅＰａ ９８．１ ３％ 制限さ
牡ている＋ｐＵＢＳ ９８．ｓｌ １
０％ 極めて不良＋ｐＵＢＳ ９８．ｓｌ＋ｐＵＢ８１
００３０％ 極めて良好＋ｐＵＢＳ ９８． ａｋｙ
３０％ 極めて良好表１で示した結果か
ら、発現エンハンサ−を含むＦ、ｅｏｌｌ細胞で発現さ
ｎるｔ−ＰＡの発現率は、発現エンハンサ−を含まない
細胞の場合と比べると明らかに高くなったことがわかる
。これは得らｔ−Ｌｆｃ、クローンの生存能力と相関し
ている。
タンノ４り質％ 生存能力 ＋ｐｅＰａ ９８．１ ３％ 制限さ
牡ている＋ｐＵＢＳ ９８．ｓｌ １
０％ 極めて不良＋ｐＵＢＳ ９８．ｓｌ＋ｐＵＢ８１
００３０％ 極めて良好＋ｐＵＢＳ ９８． ａｋｙ
３０％ 極めて良好表１で示した結果か
ら、発現エンハンサ−を含むＦ、ｅｏｌｌ細胞で発現さ
ｎるｔ−ＰＡの発現率は、発現エンハンサ−を含まない
細胞の場合と比べると明らかに高くなったことがわかる
。これは得らｔ−Ｌｆｃ、クローンの生存能力と相関し
ている。
例３
シラスミドｐｔＪＢ８９８．ｉ＋Ａを構成するための出
発グラスミドとしてグラスミドｐａＰａ ９８．１（ヨ
ーロツノ臂特許出願公開第２４２８３６号）ｔ−使用し
た。このプラスミドにおけるｔ−ＰＡのｃＤＮＡの、約
４００塩基対の長さの３′−未翻訳領域を、３６１塩基
対の長さのＸｈｏ［断片の欠失によって約４０塩基対に
短縮した。この結果生じるシラスミドはｐｅＰａ １２
６−１命名した。
発グラスミドとしてグラスミドｐａＰａ ９８．１（ヨ
ーロツノ臂特許出願公開第２４２８３６号）ｔ−使用し
た。このプラスミドにおけるｔ−ＰＡのｃＤＮＡの、約
４００塩基対の長さの３′−未翻訳領域を、３６１塩基
対の長さのＸｈｏ［断片の欠失によって約４０塩基対に
短縮した。この結果生じるシラスミドはｐｅＰａ １２
６−１命名した。
このプラスミドは、例えば、プラス、ミドｐｅＰａ９８
．１の場合には同プラスミドを制限エンドヌクレアーゼ
Ｂ ａｍＨＩおよびＨｌｎｄ Ｉで二重消化する際、２
２３４塩基対および４３７２塩基対の長さの２個の断片
を検出することができるが、プラスミドｐｅＰａ １２
６．１の場合には１８７３塩基対お（］３） よび４３７２塩基対の長さを有する２個の断片が得らｎ
ることによって区別されうる。
．１の場合には同プラスミドを制限エンドヌクレアーゼ
Ｂ ａｍＨＩおよびＨｌｎｄ Ｉで二重消化する際、２
２３４塩基対および４３７２塩基対の長さの２個の断片
を検出することができるが、プラスミドｐｅＰａ １２
６．１の場合には１８７３塩基対お（］３） よび４３７２塩基対の長さを有する２個の断片が得らｎ
ることによって区別されうる。
該グラスミドｒｅＰｉ １２６．１ ｋ単一のＨｉｎｄ
ｕ切断位置で線状化し、残っている両末端をフレノウ酵
素およびｄＮＴＰで充填する。また同様にプラスミドｐ
ｅＰａ １２６．１から、４７２塩基対の長さのＦＪｅ
ｏＲＩ断片を分離し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理した。プ
ラスミドｐｅＰａ １２６−１から得らｎた２つの断片
を結合することによってプラスミドｐＵＢ８９８、ｓｔ
が得らｎた。
ｕ切断位置で線状化し、残っている両末端をフレノウ酵
素およびｄＮＴＰで充填する。また同様にプラスミドｐ
ｅＰａ １２６．１から、４７２塩基対の長さのＦＪｅ
ｏＲＩ断片を分離し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理した。プ
ラスミドｐｅＰａ １２６−１から得らｎた２つの断片
を結合することによってプラスミドｐＵＢ８９８、ｓｔ
が得らｎた。
ｐＵＢｓ ９８．ｇｔは制限解析によってｐｅＰｉ １
２６．１から区別さｎうる：Ｂａｎ１消化ｐｅＰａ １
２６．１ ＤＮＡは、１１７５塩基対、３９３塩基対、
１６５塩基対および４５６０塩基対の長さの断片によっ
て定義さ扛る： ｐＵＢｓ ９８．５ＬＤＮＡは、Ｂａ
ｎ１ｌ断片が約１１７５塩基対、３９３塩基対、１４塩
基対、１６５塩基対、４７０塩基対および４５４０塩基
対の長さを有することを特徴としている。
２６．１から区別さｎうる：Ｂａｎ１消化ｐｅＰａ １
２６．１ ＤＮＡは、１１７５塩基対、３９３塩基対、
１６５塩基対および４５６０塩基対の長さの断片によっ
て定義さ扛る： ｐＵＢｓ ９８．５ＬＤＮＡは、Ｂａ
ｎ１ｌ断片が約１１７５塩基対、３９３塩基対、１４塩
基対、１６５塩基対、４７０塩基対および４５４０塩基
対の長さを有することを特徴としている。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、発現エンハンサーが、転写後にｔ−ＲＮＡのクロー
バー葉構造を形成する能力のあるＤＮＡ配列を有しかつ
転写後にクローバー葉構造においてアンチコドンループ
を形成するＤＮＡの領域で、配列５′−ＧＡＣＴＴＡＧ
ＡＡＧＧＴＣＧＴＴ−３′またはこの配列と相補的な配
列５′−ＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＴＣ−３′を有
するオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成している
ことを特徴とする発現エンハンサー。 ２、組換え遺伝子の発現時に同組換え遺伝子を有する発
現ベクターを含む適当な宿主細胞の形質転換によつて収
量を増大させるに当り、請求項１記載の発現エンハンサ
ーを発現可能な形で宿主細胞に導入して発現させること
を特徴とする組換え遺伝子の発現時の収量を増大させる
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3838377A DE3838377A1 (de) | 1988-11-11 | 1988-11-11 | Expressions-enhancer und dessen verwendung zur erhoehung der ausbeute bei der expression von rekombinanten genen |
| DE3838377.2 | 1988-11-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02182191A true JPH02182191A (ja) | 1990-07-16 |
| JP2667261B2 JP2667261B2 (ja) | 1997-10-27 |
Family
ID=6367027
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1292538A Expired - Lifetime JP2667261B2 (ja) | 1988-11-11 | 1989-11-13 | 発現エンハンサーおよび組換え遺伝子発現時の収量を増大させる方法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5336602A (ja) |
| EP (1) | EP0368342B1 (ja) |
| JP (1) | JP2667261B2 (ja) |
| AT (1) | ATE111527T1 (ja) |
| AU (1) | AU608180B2 (ja) |
| CA (1) | CA2002515C (ja) |
| DE (2) | DE3838377A1 (ja) |
| DK (1) | DK175757B1 (ja) |
| ES (1) | ES2060725T3 (ja) |
| IL (1) | IL92265A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2660397A (en) * | 1996-04-05 | 1997-10-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells |
| US6083715A (en) * | 1997-06-09 | 2000-07-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells |
| CN100480848C (zh) * | 2003-07-11 | 2009-04-22 | 株式会社可乐丽 | 叠层片和其设计方法以及背面投影型屏幕及其制造方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4654307A (en) * | 1983-02-17 | 1987-03-31 | The Research Foundation Of State University Of New York | Novel bacteria containing a plasmid having a tRNA code |
| AU618640B2 (en) * | 1988-11-11 | 1992-01-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process for the expression of a recombinant gene |
-
1988
- 1988-11-11 DE DE3838377A patent/DE3838377A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-11-06 AU AU44445/89A patent/AU608180B2/en not_active Ceased
- 1989-11-08 CA CA002002515A patent/CA2002515C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-09 DK DK198905618A patent/DK175757B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-11-09 IL IL9226589A patent/IL92265A/en unknown
- 1989-11-10 EP EP89120894A patent/EP0368342B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-10 AT AT89120894T patent/ATE111527T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-11-10 ES ES89120894T patent/ES2060725T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-10 DE DE58908358T patent/DE58908358D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-13 JP JP1292538A patent/JP2667261B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-01-22 US US08/007,405 patent/US5336602A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK561889D0 (da) | 1989-11-09 |
| AU4444589A (en) | 1990-05-17 |
| US5336602A (en) | 1994-08-09 |
| IL92265A0 (en) | 1990-07-26 |
| EP0368342A2 (de) | 1990-05-16 |
| DK561889A (da) | 1990-05-12 |
| CA2002515C (en) | 1996-03-19 |
| JP2667261B2 (ja) | 1997-10-27 |
| DE58908358D1 (de) | 1994-10-20 |
| EP0368342B1 (de) | 1994-09-14 |
| ATE111527T1 (de) | 1994-09-15 |
| DK175757B1 (da) | 2005-02-14 |
| EP0368342A3 (de) | 1991-10-16 |
| ES2060725T3 (es) | 1994-12-01 |
| CA2002515A1 (en) | 1990-05-11 |
| AU608180B2 (en) | 1991-03-21 |
| IL92265A (en) | 1995-08-31 |
| DE3838377A1 (de) | 1990-05-23 |
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