JPH02186990A - 輸血後非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス（ＮＡＮＢ）のｃＤＮＡクローン及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、輸血後非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス（以下ＮＡＮ
Ｂと記載）のｃＤＮＡクローン及びその用途に係る。

本発明によるｃＤＮＡクローンは酵母等に組込む事によ
り、あるいは、塩基配列から推定できるアミノ酸配列を
もったポリペプチドを化学合成する事により、非Ａ非Ｂ
型肝炎ウィルス抗原近似の蛋白質が得られるため、その
反応性を利用し、かつ抗体を製造する事により、非Ａ非
Ｂ型肝炎の診断、治療薬、輸血用血液の浄化剤、ワクチ
ン等として利用できるものである。

（従来技術） ＮＡＮＢは輸血関連肝炎の９（）−９５％を示し治療法
も未だ確立されておらず、非Ａ非Ｂ型肝炎の診断、治療
薬、輸血用血液の浄化剤、ワクチン等の開発が望まれて
いる状況である。

近年、ＮＡＮＢの抗原研究が進み一万塩基程度のＲＮＡ
−本領ウイルスの存在が報告されているものの、非Ａ非
Ｂ型肝炎ウィルスの構造遺伝子である確証は得られてい
ないし、他の原因ウィルスの存在も不明である。

（特開昭６２−２４９９９９号、特開昭６３−９１３２
８号等）（発明が解決しようとする課題及び発明の目的
）本発明はＮＡＮＢｃＤＮＡクローン及びその断片を提
供し、バイオテクノロジー技術を応用して、非Ａ非Ｂ型
肝炎ウィルス抗原、あるいは抗体性物質の工業的生産方
法を確立するものである。

（課題を解決し、目的を達成する手段及び作用）本発明
等は鋭意研究の結果、ＮＡＮＢ　　ＤＮＡのクローン化
に初めて成功し、この構造決定がなされ、これによって
基本的な問題点を解決するに至ったのである。

即ち１本発明によれば、基本的問題点はＮＡＮＢのアミ
ノ酸配列をコードしている約８００個のヌクレオチドを
含むクローン化−本領ＤＮＡ又はこの−本領ＤＮＡと相
補ＤＮＡからなるクローン化二本鎖ＤＮＡにより解決さ
れるのである。

（発明の効果） 本発明による非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス−本領ＤＮＡ又は
その断片は、これをブローベとして用いる事により、遺
伝子レベルでの診断に利用する事も可能である。

本発明による二本鎖ＤＮＡ又はその断片を組込んだプラ
スミドを微生物又は動物細胞に組込ませて培養すれば、
抗原性物質を大量生産する事ができる。又、これを抗原
として、抗体性物質を多量に生産する事もできる。

主な応用範囲は以下の通りである。

１）ｃＤＮＡ配列から得られるアミノ酸配列に基ずく人
口合成ペプチド又はそのｃＤＮＡ配列を組込んだ発現ベ
クターによる大腸菌及び酵母の ｉｎ　ｖｉｖｏ発現系で得られたペプチド及びその修飾
誘導体を用いた免疫原物質、ＮＡＮＢウィルス吸着阻害
剤としての利用。

ａ）ワクチンによるＮＡＮＢ感染予防。

ｂ）抗体価の測定による利用：肝炎、肝癌における病状
、予後の診断、供血試料、のスクリーニング。

ｃ）ＮＡＮＢウィルスの細胞への感染防止を目的とした
肝炎及び肝癌治療剤。

ｄ　）　ｉｎ　ｖｉｖｏ及びｉｎ　Ｖｉｔｒ’Ｏ感染系
を用いた抗ウィルス剤の検定に於ける効果の判定試薬。

２）合成ペプチドまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏ発現系で得た
ペプチドを抗原として作製されたポリクローナルまたは
モノクローナル抗体を用いた利用。

ａ）ウィルス存在の証明による肝炎及び肝患者中のキャ
リヤーの診断、供血試料の検定診断、ウィルス局在等の
免疫生化学試薬。

ｂ）感染事故後の緊急発病防止を目的とした抗体血清の
利用。

ｃ　）　ｉｎ　ｖｉｖｏ及び１ｎｖｉｔｒｏ感染系を用
いた抗ウィルス剤の検定に於ける効果の判定試薬。

（実施例等） 次に、製造例及び構造決定のための試験例に関連して本
発明を更に詳細に説明する。

（１）ウィルスの調製法 ＮＡＮＢ肝炎患者由来の血漿に２０％ポリエヂレングリ
コール（４０００）溶液（ＴＥＮ緩街液：Ｔｒｉ　５−
ＨＣ１ｐＨ８，０，５０ｍＭ、２ｍＭＥＤＴＡ、１５０
ｎＭ　　ＮａＣ１，１ｍＭＰＭＳＦ）を加え、攪拌、約
３０分放置、高速遠心にて沈澱画分を分取する。

沈澱の５倍量のＴＥＮ緩街液により、沈澱の可溶化、高
速遠心により不溶画分を除去する。

１５％、６０％５ｕｃｒｏｓｅ　ｉｎ　　ＴＥＮのｃｕ
ｓｈｉ。

ｎに重層し、ＳＷ２８ローターを用いて、２５０００回
転　１２時間超遠心により、沈澱画分を得てＲＮＡ画分
とする。

ＴＥＮにより希釈し１５％、６０％５ｕｃｒｏｓｅｎ　
　ＴＥＮのｃｕｓｈｉｏｎに重層し、ＳＷ２８ローター
を用いて、２５０００回転　１２時間超遠心により、沈
澱画分を得てＲＮＡ画分とする操作を繰返す。　粒子画
分を１５％５ｕｃｒｏｓｅ　１ｎＴＥＮのｃｕｓｈｉｏ
ｎに重層し、ＳＷ２８ローターを用いて、２５０００回
転　１２時間超遠心により、沈澱画分を得ＴＥＮにより
沈澱を可溶化する。

該試料にＧＩＴ液を加え、ＣｓＣｌ（密度１゜７）ｉｎ
ＴＥＮに重層し、ＳＷ４０ローターを用いて、３５００
０回転　１２時間超遠心により、沈殿部分を得て、ＲＮ
Ａ画分とする。

Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｐｈｅｎｏｌ　、　ツいでＣｈ
ｌｏｒｏｆｏｒｍによる有機溶媒による抽出後、水溶液
層にグリコーゲン（最終濃度：２０μｇ／ｍｌをキャリ
ヤーとして加え、エタノールにより核酸を沈殿し最終製
品とする。（２）ｃＤＮＡクローン作製法上記核酸を鋳
型としてｃＤＮＡを作成しベクター＾ｇｔｌＯに組み込
む方法はＡｍｅｒｓｈａｍ社の！’ｃＤＮＡクローニン
グシステムλｇｔ１０ＪＪに準じた。

【図面の簡単な説明】

第１図はｍＹＳＢ−１の塩基配列を示したもので゛ある
。 第２図はｍＹＳＢ−２の塩基配列を示したもので°ある
。 第３図はｍＹＳＢ−１から翻訳したアミノ酸配列を示し
たものである。 特　許１！）騒人　　株式会社三和化学研究所第３図 Ｌｅｕ（ｒｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｖａ
ｌ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ　−Ｈａ
ｔ−Ｐｒｏ−丁ｙｒ−Ａｒｇ−へ１ａ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒ。 Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｈ
ｌ　５−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−八
１ａ−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−ＰｈｅＬｅｕ−Ｐｈ　ｅ−３ｅ　
ｒ−Ｐｈ　ａ−Ｃｙｓ−Ｖａ　ｌ　−Ｐｈ　ｅ−Ｌｅｕ
　−Ｇ　１　ｎ　−Ｖａ　１−Ｔｒｐ　−Ｐｈ　ｅ−Ｌ
ｅｕ　−Ｔｙ　ｒ−Ｌｙｓ−間ａ　ｔ−Ｃｙｓ−Ｖａ　
ｌ−Ａｒｇ−Ｖａ　１’−５ｅ　ｒ＝ＬｅｕＧｌｙ−Ｐ
ｈｅ−５ｅ　ｒ−Ｌｅｕ−Ａ　１　ａ　−Ｐ　ｒ　ｏ−
５ｓ　ｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅ　ｔ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｐ　ｒ
　ｏ　−Ｌｙ　ｓ−Ｍｅ　ｔ−Ｇ　１　ｙ−Ｐ　ｒ　。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）輸血後非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス（以下ＮＡＮＢと
   略す）のアミノ酸配列をコードしている約５．４Ｋｂの
   ヌクレオチドを含む以下のｃＤＮＡクローン。 （ａ）血清中から単離した粒子画分に含まれる精製ＲＮ
   Ａを鋳型として作製した２重鎖ｃＤＮＡ断片にＥｃｏＲ
   Ｉリンカーを付加し、ラムダｇｔ１０ベクターのＥｃｏ
   ＲＩ部位に置換挿入して作製したファージクローンＹＳ
   １。 （クローンＹＳ１はＮＡＮＢ由来のＥｃｏＲＩ制限酵素
   消化で約１．８Ｋｂ、約１．４Ｋｂ、約１、２Ｋｂ、約
   １．０Ｋｂからなる約５．４ＫｂのｃＤＮＡ断片を含む
   ） （ｂ）血漿中単離した粒子画分に含まれる精製ＲＮＡを
   鋳型として作製した２重鎖ｃＤＮＡ断片にＥｃｏＲＩリ
   ンカーを付加し、ラムダｇｔ１０ベクタ−のＥｃｏＲＩ
   部位に置換挿入して作製したファージクローンＹＳ２。 （クローンＹＳ２はＮＡＮＢ由来のＥｃｏＲＩ制限酵素
   消化で約０．８ＫｂＣのｃＤＮＡ断片を含む）
2. （２）請求項１記載のＹＳ１及びＹＳ２から由来する以
   下のｃＤＮＡサブクローン。 （ａ）ＹＳ１のＮＡＮＢＤＮＡの一部を含む１．８ｋｂ
   ＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８及びｐＵＣ１１９に組込んだ
   プラスミドクローンｐＹＳＡ−１及びｐＹＳＡ−２。 （ｂ）ＹＳ２に含まれるＮＡＮＢＤＮＡ断片をＭ１３ｍ
   ｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９に挿入したｍＹＳＢ−１及び
   ｍＹＳＢ−２。 （ｃ）塩基配列が以下式で示される事を特徴とする請求
   項（２）（ｂ）記載のｃＤＮＡクローン。 ｍＹＳＢ−１ 【遺伝子配列があります】 ｍＹＳＢ−２ 【遺伝子配列があります】 （式中Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴはアデニン、シトシングアニン
   及びチミン塩基を意味し且つ上記の式はアミノ酸に対応
   するコドン毎の配列として示されている）』 （ｄ）アミノ酸配列が以下式で示される事を特徴とする
   請求項（２）（ｂ）記載のｃＤＮＡクローン。 【遺伝子配列があります】
3. （３）下記行程を特徴としたウィルスの調整法。 ［１］ＮＡＮＢ肝炎患者由来血漿に２０％ポリエチレン
   グリコール（４０００）溶液（ＴＥＮ緩衝液：Ｔｒｉｓ
   −ＨＣｌｐＨ８．０、５０ｍＭ、２ｍＭＥＤＴＡ、１５
   ０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＰＭＳＦ）を加え、攪拌、約３
   ０分放置、高速遠心にて沈澱画分を分取する行程。 ［２］沈澱の５倍量のＴＥＮ緩衝液により、沈澱の可溶
   化、高速遠心により不溶画分を除去する行程。 ［３］１５％、６０％ｓｕｃｒｏｓｅｉｎＴＥＮのｃｕ
   ｓｈｉｏｎに重層し、ＳＷ２８ローターを用いて、２５
   ０００回転１２時間超遠心により、沈澱画分を得てＲＮ
   Ａ画分とする行程。 ［４］ＴＥＮにより希釈しｃ）の操作を繰返す行程。 ［５］粒子画分を１５％ｓｕｃｒｏｓｅｉｎＴＥＮのｃ
   ｕｓｈｉｏｎに重層し、ＳＷ２８ローターを用いて、２
   ５０００回転１２時間超遠心により、沈澱画分を得ＴＥ
   Ｎにより沈澱を可溶化する行程。 ［６］該試料にＧＩＴ液を加え、ＣｓＣｌ（密度１．７
   ）ｉｎＴＥＮに重層し、ＳＷ４０ローターを用いて、３
   ５０００回転１２時間超遠心により、沈殿部分を得て、
   ＲＮＡ画分とする工程。 ［７］Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｐｈｅｎｏｌ、ついでＣ
   ｈｌｏｒｏｆｏｒｍによる有機溶媒による抽出後、水溶
   液層にグリコーゲン（最終濃度；２０μｇ／ｍｌをキャ
   リヤーとして加え、エタノールにより核酸を沈殿し最終
   製品とする工程。
4. （４）ヒト血清中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体との反
   応性を測定するための、クローン化ＤＮＡ酵母等組込発
   現性蛋白質性抗原もしくは合成蛋白性抗原を主成分とす
   る、非Ａ非Ｂ肝炎診断用組成物。
5. （５）ヒト血清中の非ＡＢ肝炎ウィルス抗原と反応性を
   測定するための、クローン化ＤＮＡ酵母等組込発現性蛋
   白質もくしは合成蛋白質を抗原とし任意的に得られた抗
   体を主成分とする、非Ａ非Ｂ型肝炎診断用組成物。
6. （６）クローン化ＤＮＡ酵母等組込発現性蛋白質もくし
   は合成蛋白質を抗原とし任意的に得られた抗体を主成分
   とする、ヒト血清中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原除去
   剤。
7. （７）クローン化ＤＮＡ酵母等組込発現性蛋白質もくし
   は合成蛋白質を抗原とし任意的に得られた抗体を主成分
   とする、非Ａ非Ｂ型肝炎の治療剤。
8. （８）クローン化ＤＮＡ酵母等組込発現性蛋白性抗原も
   くしは合成蛋白性抗原からなる非Ａ非Ｂ型肝炎用ワクチ
   ン。