JPH06500698A

JPH06500698A - Ｃ型肝炎ウィルス単離物のヌクレオチド及びペプチド、診断及び治療用途

Info

Publication number: JPH06500698A
Application number: JP4510772A
Authority: JP
Inventors: ブレショ，クリスティアン; クレムドルフ，ディナ; ポルション，コレット
Original assignee: Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur
Priority date: 1991-06-06
Filing date: 1992-06-04
Publication date: 1994-01-27
Also published as: US5879904A; FR2677372A1; WO1992021759A1; EP0542970A1; US5919454A; US6210962B1; CA2088666A1; FR2677372B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ｃ型肝炎つィルス単履物のヌクレオチド及びペプチド、診断及び治療用途本発明は、ヨーロッパ人、特にフランス人のＣ型肝炎ウィルス株のヌクレオチド及びペプチド、及びそれらの配列の診断及び治療的用途に関する。

Ｃ型肝炎ウィルスは、これまで“非−Ａ非−Ｂ“ウィルスと呼ばれるウィルスによる感染の主な原因物質である。実際、Ｃ型ウィルスによる感染は、急性肝炎及び慢性非−Ａ非−Ｂ肝炎の最っとも頻繁な形を表わす（Ａ　１　ｔｅｒなど、　（１）、　；Ｃｈｏｏなど１、　（３）　；　［Ｉｏｐｆなど。、（５）；Ｋｕｏなど６、　（８）　；　Ｍｉｙａｓｕｒａなど、　、　（１１））　、さらに、抗−ＨＣＶ抗体の存在と主な肝癌の進行との間に関連が存在する（その有意性はまだ十分に理解されていない）、Ｃ型肝炎ウィルスは、血液生成物又は散在性起原の輸血に関連する慢性又は急性非−Ａ非−Ｂ肝炎に関与することがまた示された。

Ｃ型肝炎ウィルスのゲノムがクローン化され、そしてアメリカ人の単１Ｉｌｌ物のヌクレオチド配列がＥＰ−Ａ−０３１８２１６、ＨＰ−Ａ−０３６３０２５゜ＥＰ　−Ａ　−０３８８２３２及び−〇−Ａ−９０／１４４３６に記載されている。さらに、データは、ウィルスの非構造的領域及び構造的領域の両者に関係するいく人かの日本人の単離物のヌクレオチド配列に基づいて現在入手できる（Ｏｋａｓｏｔｏなど、　、（１２）、Ｅｎｏｓｏｔｏなど１、　（４）、　Ｋａｔ。

なと１、（６）　ｉ　Ｔａｋｅｕｃｈｉなど８、（１５及び１６））、ウィルスは、ワラビウィルス及びベスチウィルスを含んで成る群といくつかの１！像性を示し；しかしながら、現在まで知られているウィルスとは異なる明確な種類を形成すると思われる　（Ｍｉｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｐｕｒｃｅｌｌ　（１０））ｅＨＣｖのクローニングが表わす解決法にもかかわらず、いくつかの問題が残存するニー実質的な遺伝的変異性が、２種のグループのウィルスの存在の説明を可能にしたウィルスの一定領域に存在し、−ウィルス感染の診断が患者の血清における抗 −ＵＣＶ抗体の検出の可能性にもかかわらず困難のままである。これは、誤った陽性結果の存在及び急性感染に続く遅延された血清転換による。最後に、ウィルスＲＮＡの検出がｆｌｃＶｉ染の検出を単に可能にし、そして血清学が陰性のままである場合が明白に存在する。

これらの問題は、ウィルスに対する診断及び保護に関して重要な示唆を有する。

本発明者は、クローニングを実施し、そして受容体に活性慢性肝炎を伝達した血液ドナーからの［ＩＣＶ　（この後、ｆｌｃＶ　Ｅｌと称される）のフランス人単離体の一部のヌクレオチド配列を得た。アメリカ人及び日本人単離体のそれぞれの配列により得られたヌクレオチド配列及びペプチド配列の比較は、次ものの存在を示したニー〇ＣＶ　Ｅｌの非コード領域における核酸の高い保存性、−Ｅｌ及びＥ　２　／ＮＳ　１と呼ばれる構造領域における高い遺伝的変異性、一非構造領域における小さな遺伝的変異性。

本発明は、技術の前記状態に記載されていないＣ型肝炎ウィルスの新規ヌクレオチド及びポリペプチド配列に基づかれる。

本発明の目的は、次のヌクレオチド（ｎ）：配列番号２に示される　ｒ１＋＋ａ　〜ｎｒｓａ　；　ｎ　自ｔｔ　〜ｎｚ＊ｚ　；　ｎｔｓ３〜ｎｚａｔ　；　ｎｔｓａ　〜ｎ　ｚｔｚ及びｎ　ｚｔｔ　−ｎ　ｔ＊＊及び配列番号３に示されるｆｌ　１５４〜ｎ　ｒｔｏ＋１’ｌ＋ｙｏ　′ｎｚ＋ｔ　ｉ　ｎｔｂｔ−ｎｔｓａ及びｎ３＋・〜ｎ３３４間の少な（とも１０個のヌクレオチドのヌクレオチド配列並びに遺伝子コードの宿主に起因する相同ヌクレオチド配列から選択されたＤＮＡ配列を含んで成るＨＣＶ　ＥｌのＤＮＡ配列である。

本発明の目的は特に、次のヌクレオチド配列に関する：配列番号２、配列番号３及び配列番号４゜オリゴヌクレオチド配列は、Ａｐｐｌｉｅｄ　８ｉｏ　５ｙｓｔｅ＋＊技術により都合良く合成され得る。

本発明の目的はまた、次のアミノ酸（ａａ）　：ペプチド配列番号２に示されるａａｓＩ〜ａａ＆４　；　ａａ？４〜ａａｌｌ１１　＋ペプチド配列番号３に示されるａａａｌ””ａａ？ｌ　ｉ　ａａ雫ｓ〜ａａ口１　；ａａｌ！！　””ａａ１３３　；ａａ＋４＠　〜ａａ１４９間の少なくとも７個のアミノ酸配列；並びに生物学的及び免疫学的性質の変性を誘発しない相同ペプチド配列から選択されたペプチド配列を含んで成るＨＣＶ　Ｅｌのペプチド配列にも関する。

好ましくは、ペプチド配列は次のアミノ酸配列から選択される：ペプチド配列番号２で示されるａａｓｌ〜ａａ＆６　；　ａａ？６””ａａｌ＠ｌ　、及びペプチド配列番号３で示されるａａａｑ〜ａａｔ＠　ｉ　ａａｇ口〜ａａ＋＋ｔ　；　ａａ＋ｚｙ　〜ａａ＋３ｆｆ及びａａＩａ＠　〜ａａＩｎ？　ｅさらに、ペプチド配列はペプチド配列番号２，３及び４から都合良く選択される。

本発明の目的はまた、上記に定義されるようなペプチド配列をコードするヌクレオチド配列でもある。

さらに、本発明の目的は、上記に定義されるようなりＮＡ配列を含んで成るポリヌクレオチドプローブである。

本発明の目的は、上記に定義されるようなペプチド配列を含んで成る免疫学的ペプチドでもある。

本発明のペプチド配列は、発現ベクター、たとえばプラスミド中に、本発明のペプチド配列をコードするＤＮＡ配列の挿入及びこの発現ベクターを用いてのａｔ胞の形質転換及びそれらの細胞の培養を含んで成る遺伝子工学技法の通用により又は従来の合成方法により得られる。

本発明の目的はまた、上記に定義されたようなペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を含んで成るプラスミド又は発現ベクター並びにこのベクターを用いて形質転換された宿主である。

好ましいプラスミドは、番号１−１１０５．　ｌ−１１０６及びｌ−１１０７として１９９１年６月５日にＣＮＣＭに寄託されたものである。

本発明の目的は、本発明のペプチド配列又はそのようなポリペプチドの免疫原性配列に対して向けられたモノクローナル抗体でもある。

本発明のモノクローナル抗体は、従来技法に従って調製され得る。

この目的のためには、ポリペプチドは、必要なら、免疫原性物質、たとえば破傷風アナトキシンに、カップリング剤、たとえばグルタルアルデヒド、カルボジイミド又はビスジアゾ化されたベンジジンを用いて結合され得る。

本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体のフラグメント又は誘導体を包含する。これらのフラグメントは、特に、ペプシンによる抗体分子の酵素的切断により得られるＦ（ａｂ’　）ｚフラグメント、Ｆ（ａｂ’　）！フラグメントのジスルフィド橋を還元することによって得られるＦａｂ　’フラグメント及び還元剤の存在下でペプシンにより抗体分子を酵素的切断することによって得られるＦａｂフラグメントである。これらのフラグメント及びＦｃフラグメントはまた、遺伝子工学により得られる。

モノクローナル抗体の誘導体は、マーカー、たとえば放射性同位体が結合される抗体又はそれらの抗体のフラグメントである。モノクローナル抗体の誘導体はまた、治療的に活性な分子が結合される抗体又はそれらの抗体のフラグメントである。

本発明の目的はまた、上記のように１又は複数のプローブを含んで成る、ＨＣＶ　ＥＩ株に対して特異的なヌクレオチド配列の検出のための分析用キットでもある。

本発明の目的はまた、前記抗原をたぶん含む生物学的サンプル（ここでその生物学的サンプルは抗体又は抗体フラグメントに暴露される）におけるＨＣＶ　Ｅｌに対して特異的な抗原の検出を包含するインビトロ診断方法；及びその方法を実施するための診断キットにも関する。

本発明の目的はまた、前記抗体をたぶん含む生物学的サンプル（ここでその生物学的サンプルはペプチド配列に対応するエピ＋−−ブを含む抗原に暴露される）におけるＨＣＶ　Ｅｌに対して特異的な抗体の検出を包含するインビトロ診断方法、並びに上記に定義されるようなペプチドに対応するエピトープを含む抗原を含んで成る、特異的抗体の検出のための診断キットにも関する。

これらの方法は、ＲＩＡ、　ＲＩＰＡ又はＩＲＭＡタイプの放射性免疫学的方法又はストリップ上で実施されるウェスターンプロットタイプ又はＥＬＩＳＡタイプの免疫酵素的方法に基づかれる。

本発明の目的はまた、上記に定義されるようなモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体のフラグメント又はモノクローナル抗体の誘導体を含んで成る治療用組成物でもある。

好都合には、モノクローナル抗体誘導体は、治原的に活性な分子に結合されるモノクローナル抗体又はそれらの抗体のフラグメントである。

本発明の目的はまた、キャリヤータンパク質に任意に結合される、上記に定義されたような免疫原性配列を含む免疫原性組成物に関し、ここで前記免疫原性配列は保護抗体又は細胞毒性Ｔリンパ球を誘発することができる。アナトキシン、たとえば破傷風アナトキシンがキャリヤータンパク質として使用され得る。他方、ＭＡＰ　（ＭｕｌｔｔｐｌｅＡｎｔｉｇｅｎｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅ）技法に従って生成される免疫原がまた、使用され得る。

免疫原性ペプチド配列の他に、免疫原性組成物は免疫刺激性質を有するアジュバントを含むことができる。

次のものが、使用され得るアジュバントである：無機塩、たとえば水酸化アルミニウム、疎水性化合物又は界面活性剤、たとえば不完全フロイントアジュバント、スクアレン又はリポソーム、合成ポリヌクレオチド、微生物又は微生物成分、たとえばムラブチド、合成人工分子、たとえばイムチオール又はレバミゾール、又は他のサイドキン、たとえばインターフェロンα、β、Ｔ又はインターロイキン。

本発明の目的はまた、上記に定義されたようなペプチド配列に対して向けられたモノクローナル抗体の使用を含んで成るそのペプチド配列のアッセイ方法にも関する。

本発明の目的はまた、発現ベクター中への、ペプチド配列をコードするＤＮＡ配列の挿入、この発現ベクターを用いての細胞の形質転換及び前記細胞の培養を含んで成る、上記に定義されたようなペプチド配列を調製するための方法にも関する。

１’ｒｃＶ　ＥＩ株の配列のＤＮＡの生成は、添付図面により詳細に記載され、ここでニー図１は、増幅され、そして配列決定されたＨＣＶ　［！ＬＳＩ域の位置を表わし；一図２は、非コード領域における、［ＩＣＶ　Ｅｌのヌクレオチド配列（１）とアメリカ人単離体の配列（２）及び−〇−Ａ−９０／１４４３６及びＯｋａｍｏｔｏなど、　（１２）にそれぞれ記載される２つの日本人単離体：ＨＣＪＩ　（３）及びＨＣｌ２　（４）の配列との比較を表わし；−図３は、領域Ｅ１における、ＨＣＶ　Ｅｌのヌクレオチド配列（１）とＮｏ　９０／１４４３６　ニ記載されるアメリカ人単離体（ＨＣＶｐｔ）　（７）配列（２）及びＴａｋｅｕｃｈｉなど、　（１５）、Ｏｋａｍｏ　ｔｏなど、　（１２）に記載される３つの日本人単離体：ＨＣＶＪ−１（３）、ＩＩｃＪＩ　（４）及びＨＣｌ２　（５）の配列との比較を表わし；一図４は、領域Ｅｌにおける、ＨＣＶ　Ｅｌのアミノ酸配列（１）とアメリカ人単離体１’ｆＣＶｐｔ　（２）及び日本人単離体：　ＨＣＶＪＬ　（３）、　ＩｆＣＪｌ　（４）及びＨＣｌ２　（５）の配列との比較を表わし；可変領域は四角で囲まれており；一図５は、領域Ｅ　２　／ＮＳ　１における、ＨＣＶ　Ｅｌのヌクレオチド配列（１）と−〇−Ａ　−９０／１４４３６　ニ記載されるアメリカ人単離体ＨＣＶｐｔ（２）及びＯｋａｍｏｔｏなど、　（１２）＋　Ｔａｋｅｕｃｈｉなど、　（１５）により記載される日本人単離体：　ＩｆＣＪｌ　（３）、　Ｉ（ＣＪ４　（４）及びＨＣＶＪＩ　（５）（７）配列トノ比較を表わし；一図６は、８Ｎ域Ｅ　２／ＮＳＩ　ニＡケル、ＢＣｖＥ１ノアミノ酸配列（１）とアメリカ人単離体ＨＣＶｐｔ　（２）及び日本人単離体）ＩＣＪＩ　（３）、　ＨＣｌ２（４）及びｆｌｃＶＪｌ　（５）の配列との比較を表わし：可変領域は四角で囲まれており；一図８は、領域ＮＳ　３　／ＮＳ　４における、ＨＣＶ　Ｅｌのヌクレオチド配列（１）と−〇−Ａ−９０／１４４３６　ニ記載されるアメリカ人単離体１１ｃＶｐ　ｔ（２）及びＫｕｂｏなと、（７）に記載される日本人単離体）ＩＣＶＪＩ　（３）の配列との比較を表わし；一図９は、領域ＮＳ３／ＮＳ４における、ＨＣＶ　ｌ１ｔｌ（７）アミノ酸配列（１）とアメリカ人単離体ＨＣＶｐｔ　（２）及び日本人単離体１（ＣＶＪＩ　（３）の配列との比較を表わす。

Ｉ−ヌクレオチド　１の量 ■）肛り牡」■Ω１盟ＨＣＶ　ＥＩ　ＲＮＡを、抗−ＨＣＶ陽性（抗−〇１００）の慢性肝炎を有するフランス人血液ドナーの血清から、ＥＰ　−Ａ　−０，３１８，２１６に記載されるようにして調製した（にｕｂｏなと、（７））　。

血清１００μｍを、次の抽出謹衡液に希釈し、１ａ＋１の最終体積にしり：５０ −Ｍ（Ｄトリス−［ＩＣ１，ｐＨ８，ＬｍＨ）ＥＤＴＡ、１００ｓＮ＜７）ＮａＣ１，Ｉｗｇ／　ｍ　１のブロティナーゼＫ、及び０．５％のＳＯ５，３７℃で１時間プロテイナーゼＫにより消化した後、タンパク質を１体積のＴＥ−飽和フエ／−ル（１０ｓＭ（７）　ト’）　ス−ＨＣｌ、ｐＨ８、１ｍＭ（７）ＥＤＴＡ）　ニより抽出した。

次に水性相を１体積のフェノール／クロロホルム（１：　１）により２度及び１体積のクロロホルムにより１度抽出した０次に水性相を０．２Ｍの酢酸ナトリウムの最終濃度に調整し、そして核酸を２体積のエタノールの添加により沈殿せしめた。遠心分離の後、核酸を１）ＥＰＣ処理された滅Ｉ蒸留水３０ＩＩｌに懸濁した。

２）ｌ未３逼しυ１畷相補的（ＩＮＡ　（ｃＤＮＡ）を、下記表Ｉに示されるＩｆＣＶに対して特異的なオリゴヌクレオチド、又はａＣＶに対して特異的ではないヘキサヌクレオチド及びネズミ逆転写酵素の混合物のいづれかをプライマーとして使用して合成した。ＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）を、このようにして得られたｃＤＮＡに対して、ａＣＶに対して特異的な１対のプライマー（下記表■）を用いて、次の温度：９４℃（１分）、５５℃（１分）。

７２°Ｃ（１分）で４０サイクル以上行なった０種々のＨｃｖプライマーを、慢性的に感染されたチンパンジーから単離されたＨｃｖ表現型（ＨＣＶｐｔ）の配列から製造した（Ｂｒａｄｌｅｙなど、（２）　；　Ａｌｔｅｒなど５（１）、ＢＰ−Ａ−０，３１８，２１６）。Ｅ　２　／ＮＳ　１遺伝子の５′領域のヌクレオチド配列を、Ｒｅｙｅ５など、　（１３）により記載される配列−非依存性単一１ライマー増幅技法（ＳＩＳＰＡ）からの手段を用いて得た。それは、１ｔｃｖｐ　を配列の５′に位１するＢＣＶ−特異的プライマー（表ＩにおけるプライマーＮ５ＩＡ）を用いて合成されたＤＮＡの末端に二重鎖アダプターを連結することから成る０次に、半時異的増幅を、ＨＣＶ−特異的プライマー及びアダプターに対応するプライ７−を用いて行なった。このアプローチは、ｃＤＮＡの合成のために使用されるプライマーの５′領域を拡張する増幅生成物の獲得を可能にする。

■、プライマー　びプローブの配　− ａ）プライマー＋１：ＮＳ３　（＋）　５’　ＡＣＡＡｔＡＣＧｒＧＴＧＴＣＡＣ（：　（３０１３− ３０２９）ＮＨ４（−）５’　ＡＡＧＴ丁ＣＣＡＣＡＴＡＴＧＣＴｒＣＧＣ（３９５５−３９３５）ＮＳＩＡ　（−）５’　ＴＣＣＧＴｒＧＧＣＡＴＡＡＣＴＣＡＴＡＧ　（１１３−６４）ＨｎＢ　（＋）５’　１ｉＡＴｃＡＧＴｒＡＴＧ（：ＣＡＡＣＧＧＡ　（６４−８３）ＮＳＩＣ（−）５’　ＧＴ丁ＧＣＣＣＧＣＣＣＣＴＣＣＧｋＴＧＴ　（３８０−３６１）ＮＳＩＤ　（＋）　５’　ＣＣＣＡＧＣＣＣＣ（：ＴＧＧＴＧｃＴＧ４１：Ｇ　（１８３−２０２）ＮＳＩＫ　（− ）　５’　（：ＣＡＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＡＣに（：　（８６０−８４１）ＮＣＡ　（＋）　５’　ＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧ’ｒ　（−２５９−−２３９）ＮＣＲ（−）　５’　ＧＣｈＧＧＴＣ：ｒＡｃｃ；ｋＧＡｃｃｒｃ　（−４−−２３）ＥＩＡ　（＋）５’　ＴＴＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＧＣにＴＧＡＡＣ（４７０−４１１９）Ｅｌ！ｌ　（−）　５’　ＴＣａＴＣＡＴＡＴＣ（：ＣＡＴＧ（：ＣＡＴＧ　（９７３−９５４）ｂ）プローブａ：ＮＳ：ｌ／ＮＳ４　（＋）５’ＣＣＴｒＣＡＣＣＡＴＴにＡＧＡＣＡＡ丁ＣＡＣＧＣＴＣＣＣＣＣＡＧＧＡＴＧ（：ＴＧ？（３０５１１−３O９７）ＮＳＬ　（＋）　５’ＣＴＧＴＣ（ｍ；Ａ（：ＡＧＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＴＧＣＣＧＡ（：Ｃ（：ＣＴｒＡＣＣＣＡ丁　（５−４７４）ＮＳＩＢ／Ｃ（＋）　５ ’Ａ１６ＣＧＣＧＣＧＣＧＣＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＴＣＧＧＧＴＧＡＡＡＡτ ＧＡＴＡ　（２１０−２４８）ＮＧ　（＋）　ｓ’ｃＴｃｃＡｃ；ｃｃｒｃｃＡｃｃＡｃｃｃｃｃ　（４３５−−２１６）Ｅｌ　（−）　５’ＣＴＣにＴＡＣＡＣＡＡＴＡＣＴＣＣＡＧＴ　（６４６−６２７）ａ：ヌクレオチド配列及びそれらの位置はＨＣＶＣ視表（ＨＣＶｐｔ）に対応する（ＥＰ−Ａ−０，３１８，２１６及び−〇　−Ａ　−９０／１４４３６）。

３）クローニング　び　１゛− 増幅生成物を、Ｔｈ　１ｅｒｓなど、　（１７）により記載されているようにしてＭ１３ｍｐ１９又はバタテリオファージλｇｔｌｏ中にクローン化した。

ＤＮＡ配列とスクリーニングするためのプローブは上記表■に示される。挿入体のヌクレオチド配列を、Ｓａｎｇｅｒなど、、（１４）により記載されるジデオキシヌクレオチド基材の方法により決定した。

■−ス立ｌス入　（ＨＣＶ　Ｅｌ）のヌクレオチド配　の　力非構造及び構造領域及びウィルスの非コード領域におけるＨＣＶ　Ｅｌ単離体のヌクレオチド配列の獲得を可能にする種々の増幅生成物の位置は、図１に図的に示される。

１）ｌｌ−ユニ上エニ１　にお番るＨＣＶ　Ｅｌのヌクレオチド配マＨＣＶ　Ｅｌの増幅され、そして配列決定された非コード５′領域と配列番号１と称する。

それは、ｎｏ　−Ａ　−９０／　１４４３６に記載されるようニＨＣＶｐｔニおける位置−２５９〜−４ニ位置する２５６塩基対（ｂｐ）　（７）フラグメントに対応する。　ＨＣＶ　Ｅｌ配列と前に公開された配列との比較は、ひじょうに高い核酸転換を示す（図２）。

２）ｔＬｉ　におけるＨＣＶ　Ｅｌのヌクレオチド　びペプチド　１ヌクレオチド配列はたぶん、ウィルスエンベロープタンパク質をコードする２つの領域（現在、Ｅｌ及びＥ　２　／ＮＳ　１　Ｈ域と称される）に対応する。

Ｅｌｆｌ域のためには、ＢＣＶ　Ｅｌのために得られた配列は遺伝子の３′成分に対応する。それは、配列番号２と呼ばれた。この５０１−　ｂｐの配列は、ＷＯ−Ａ　−９０／１４４３６　ニ記載されるようニＨＣＶｐｔ配列の位置４７０〜９７３に位！する。この配列と前記に記載される配列との比較は、高い遺伝的変異性を示す（図３）、事実、研究された単離体に依存して、核酸比較において１０〜２７％及びアミノ酸比較において７〜２０％の差異が、下記表■に示されるように観察され得る。さらに、ペプチド配列の比較は、図４に四角で囲まれる２つの超可変領域の存在を示す。

Ｅ　２　／ＮＳ　１　ｊＩ域のために、ＨＣＶ　Ｅｌ配列データが３つのオーバーラツプする増幅生成物から得られた（図１）。このようにして得られたコンセンサス配列（１２１０ｂｐ）は、完全なＥ　２　／ＮＳ　！遺伝子を含み、そして配列番号３と呼ばれた。　１（ＣＶ　ＥｌのＥ　２　／ＮＳ　１８！域の配列は、Ｎｏ−Ａ−９０／１４４３６　ニ記載されるＨＣＶｐ　を配列と比較して、位置９９９〜２２０９に位置する。　ＩＩｃＶ　Ｅｌ配列と前記記載された単離体との比較は、核酸の場合１３〜３３％及びアミノ酸の場合１１〜３０％の差異を示す（図５及び６、表■）、最高の変異性は、Ｅ　２　／ＮＳ　１遺伝子の５ ′に観察される（図５）、アミノ酸の比較は、図６において四角で囲まれる４つの超可変領域の存在を示す、Ｅ２／ＮＳ１′Ｍ域の親木性プロフィール（Ｋｙｔｅ　ａｎｄ　Ｄｏｌｉｔｔｌｅ、　（９））は、図７に与えられる。２つの疎水性領域を端にをする親水性領域が観察される９両疎水性領域はたぶん、シグナル配列及びトランスメンプランセグメントに対応する。最後に、中央領域は、種々の単離体に保存される、１０個の可能性あるグリコジル化（ｓｔｃ〕部位（Ｎ− Ｘ−Ｔ／Ｓ）を有する（図６）。

３）　°　におけるＩＩｃＶ　Ｅｌのヌクレオチド　びペプチド非構造領域における［ＩＣＶ　Ｅｌについての配列データは、それぞれＮＳ３及びＮ５４（７）３’及び５′末端部分に対応する（図１　）　、　ＩＩｃＶ　Ｅｌ（７）りａｌ１５ニｌうａり配列（９４３ｂｐ）　ハ、ＨＣＶｐｔ配列の位置４３６１〜５３０３に位置し、そして配列番号４と呼ばれた。配列の相同性は、ＨＣＶｐｔ単離体に関して９５％及び日本人単離体に関して７８．６％である（図８、下記表■ ）、アミノ酸の比較の場合、９８％及び９３％の相同性が、ＨＣＶｐｔ及び日本人単離体に関してそれぞれ観察された（図８、下記表■）。

従って、ＨＣＶ　Ｅｌ単離体のヌクレオチド配列とアメリカ人及び日本人単離体の配列との比較は、上記単離体とは異なる。それは、エンベロープタンパク質において高い可変領域の存在を示す、研究された非構造領域の特異性は低い、最後に、非コード５′領域は、高い保存性を示す。

これらの結果は、）ＩＶＣの診断及び予防のための関連を示す。

診断が考えられる場合、超可変領域及び保存された領域の定義は、次のものを導びくニ一種々のＨＣＶグループに対して特異的なエピトープの発現を可能にする合成ペプチドの定義。

エンベロープタンパク質Ｅ１のためには、型特異的エピトープの決定のためのペプチドが、アミノ酸７５〜１００の間の領域に都合良く低される（図４）、同様に、タンパク質Ｅ　２　／ＮＳ　１のためには、特異的エピトープの特徴化を可能にするペプチド（５ｉｃ）が、アミノ酸５０〜１４９の間の好ましい領域に合成される（図６）。

クローンされた配列のすべて又は一部の発現、特にウィルスのエンベロープ領域に対応するクローンは、診断試薬の開発及び免疫原性組成物の生成のための新規抗原の獲得を可能にする。最後に、この単離体のヌクレオチド配列の実質的な部分の調製は、ウィルス感染の機構の良好な理解のために、及びまた、診断及び予防目的のために使用され得る相補的ＤＮＡの全体の長さの生成を可能にする。

日本人（ＨＣＶＪｌ、　ＨＣＪｌ、１ＩｃＪ４）単離体との間の核酸（ｎ、ａ、）及びアミノ酸（ａ、ａ、）の差異。

参考文献Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　３２１．１４９４−１５００゜Ｍｓｄｉｃａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　３．２５３−２６９゜ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　ｇｅｎｏｍｅ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４．３５９−３６２゜ｔｉｏｎｇ　１７０．１０２１−１０２５゜８７．９５２４−９５２８゜２４４．３６２−３６４゜Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｑｙ　１５７．　１０５−１３２゜７４．５４６３−５４６７゜Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１Ｂ、４６２Ｌ１７、　Ｔｈ１ｅｒｓ、Ｖ、、Ｎａｋａｊｉｍａ、Ｅ、Ｎ、、Ｋｒｅｍｓｄｏｒｆ、Ｄ、、Ｍａｃｋ、Ｄ、。

５ｃｈｅｌｌａｋｅｎｓ、Ｈ，、Ｄｒｉｓｓ、Ｆ、、Ｇｏｕｄｅ、Ａ、、Ｗａｎｄｓ、Ｊ、。

５ｎｉｎｓｋｙ、Ｊ、、Ｔｉｏｌｌａｉｓ、Ｐ、＆　Ｂｒｅｃｈｏｔ、Ｃ，（１９８８１゜Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈａｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｆｒｏｍ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｓｓｕｂｊ＠ｃｔｓ、　Ｌａｎｃｅｔ　ｉｉ、　１２７：１−１２７６アミノ　のか　のＤ　Ａｓｐ　アスパラギン酸Ｅ　Ｇｌｕ　グルタミン酸ＷＴｒｐトリプトファンＹ　Ｔｙｒ　チロシン Σ１図？Ｊｌ蔓 ■−一般的情報（１）出願者：　ｌＮ５ＴＩＴＵＴ　ＰＡＳＴ［！［１９診断及び治療用途（３）配列の数：４ ■−配列番号１についての情報配列の特徴型　；ヌクレオチド配列長　さ　：２５６鎖の数　ニ一本領形　Ｉ！：直鎖状配列の種！１１：ウィルスＲＮＡのためのｃＤＮＡ起源生物名：Ｃ型肝炎ウィルス特徴ＤＮＡの位置：非コード５′領域ＧＴＣＴＣＧＴＡＧＡＣ工πＣ２５６長　さ　：　５０１個の塩基対１６６個のアミノ酸配列 ■−配列番号３についての情報型　：ヌクレオチド配列及びその対応するタンパク質長　さ　：　１２１０個の塩基対４０３個のアミノ酸鎖の数　ニ一本領特　徴　：タンパク質Ｅ　２　／ＮＳＩをコードするＤＮＡ　（全Ｅ２Ａ　ＡＴＧ　ＧＣＴ　ＣＡＡ　ＣＴＧ　ＣＴＣＡＧＧ　ＧＴＣＣＣＧ　ＣＡＡ　ＧＣＣＡＴＣＴＴＧ　３７ｓａｔ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　ｋｒｑ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｌａ工１４！！　Ｌａｕ　１２ＡＴＡ　ＧＣＧ　ＴＡＴ　’ ＩＴＣＴＣＣＡＴＧ　ＧＴＧ　ＧＧＧ　ＡＡＣＴＧＧ　にＣＧ　ＡＡＧ　ＧＴＣ１１５工ｌａ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｓａｒ　Ｍａｔ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　入３−ａ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　コ８ＣＴＧ　ＣＩ’Ａ　ＧＴＧ　ＣＴＧ　ＴＴＧ　ＣＩ’Ｇ　ＴＴＣＧＣＣＧＧＣＧＴＣＧＡＴ　ＧＣＧ　ＧＭ　１５４Ｌｅｕ　Ｌ＠ｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅ＋ｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　ｊｕａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　５１ＡＣＣＴＡＣＡＣＣＡＣＣＧＧＧ　ＧＧＧ　ＡＧ、Ｔ　ＡＣＴ　ＧＣＣＡＧＧ　ＡＣＣＡＣＧ　ＣＡＡ　１９］Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　５ｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　、Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　６４ＡＴＣＣＡＧ　ＣＴＧ　ＡＴＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＧＣＡＧＣＴＧＧ　ＣＡＣＡＴＴＡＡＴ　２７１工ｌａＧユｎ　Ｌａｕ　Ｉｌａ　Ａｓｎ　ＴｈＸ：　Ａｓｎ　ＧＩＹ　Ｓｉｒ　Ｔｒｐ　Ｈｉｓ　ｌ１＠　Ａｓｎ　９０Ｖ−配列番号４についての情報型　；ヌクレオチド配列及びその対応するタンパク質長　さ　：９４３個の塩基対３１３個のアミノ酸鎖の数　ニー末鎖特　徴　：非構造領域の配列をコードするＤＮＡ（それぞれＮＳ３及びＮＳ４遺伝子の３′及び５′末端部分）配列ＦＩＧ、Ｓ　（続き）国際調査報告フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，Ｓ　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ３３１５７６　Ｚ　９０１５−２Ｊ３３１５７７　Ｂ　９０１５−２Ｊ９２８１−４ＢＩＣ１２Ｎ　５１００　Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】

１．次のヌクレオチド（ｎ）：配列番号２に示されるｎ１１■〜ｎ１３８；ｎ１７７〜ｎ２０２；ｎ２３３〜ｎ２４７；ｎ２５４〜ｎ２７２及びｎ２７２〜ｎ２ ■■及び配列番号３に示されるｎ１５４〜ｎ１７０；ｎ１７０〜ｎ２１７；ｎ２６７〜ｎ２８３及びｎ３１０〜ｎ３３４間の少なくとも１０個のヌクレオチドのヌクレオチド配列並びに遺伝子コードの宿重に起因する相同ヌクレオチド配列から選択されたＤＮＡ配列を含んで成るＨＣＶＥ１のＤＮＡ配列。
２．配列番号２、配列番号３及び配列番号４；及び遺伝子コードの分解に起因する相同配列から選択されたＤＮＡ配列を含んで成るＨＣＶＥ１のＤＮＡ配列。
３．次のアミノ酸（ａａ）：ペプチド配列番号２で示されるａａ５■〜ａａ６４；ａａ７４〜ａａ１０１；ペプチド配列番号３に示されるａａ４９〜ａａ７８；ａａ９■〜ａａ１１１；ａａ１２３〜ａａ１３３；ａａ１４０〜ａａ１４■間の少なくとも７個のアミノ酸配列；並びに生物学的及び免疫学的性質の変性を誘発しない相同ペプチド配列から選択されたペプチド配列を含んで成るＨＣＶＥ１のペプチド配列。
４．次のアミノ酸配列：ペプチド配列番号２に示されるａａ５８〜ａａ６６；ａａ７６〜ａａ１０１；ペプチド配列番号３に示されるａａ４９〜ａａ７８；ａａ９８〜ａａ１１１；ａａ１２３〜ａａ１３３及びａａ１４０〜ａａ１４９；及び生物学的及び免疫学的性質の変性を誘発しない相同配列から選択されたペプチド配列を含んで成るＨＣＶＥ１のペプチド配列。
５．ペプチド配列番号２，３及び４；並びに生物学的及び免疫学的性質の変性を誘発しない相同配列から選択されたペプチド配列を含んで成るＨＣＶＥ１のペプチド配列。
６．請求の範囲第３又は４項記載のペプチド配列をコードするヌクレオチド配列。
７．請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチドプローブ。
８．請求の範囲第３又は４項記載のペプチド配列を含んで成る免疫原性ペプチド配列。
９．請求の範囲第３，４及び５のいづれか１項記載のペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクター。
１０．１−１１０５，１−１１０６及び１−１１０７として１９９１年６月５日にＣＮＣＭに寄託されたプラスミドから選択された、請求の範囲第５項記載のペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を含んで成るプラスミド。
１１．請求の範囲第９項記載のベクターにより形質転換された宿主。
１２．請求の範囲第３，４又は５のいづれか１項記載のペプチド配列に対して向けられたヒト又はネズミモノクローナル抗体。
１３．請求の範囲第１２項記載のモノクローナル抗体のフラグメントＦａｂ，Ｆａｂ′，Ｆ（ａｂ′）２又はＦｃ。
１４．マーカー又は治療的に活性な分子が結合される、請求の範囲第１２項記載のモノクローナル抗体又は請求の範囲第１３項記載のフラグメントを含んで成るモノクローナル抗体の誘導体。
１５．請求の範囲第１２項記載のモノクローナル抗体を生成するハイプリドーマ。
１６．請求の範囲第７項記載の１又は複数のポリヌクレオチドプローブを含んで成るＣ型肝炎ウィルスのヌクレオチド配列の検出のための分析用キット。
１７．ＨＣＶＥ１に対して特異的な抗原をたぶん含む生物学的サンプルにおける前記抗原の検出を包含するインビトロ診断方法であって、ここで前記生物学的サンプルが請求の範囲第１２又は１３項記載の抗体又は抗体フラグメントに暴露されることを特徴とする方法。
１８．ＨＣＶ抗原との免疫学的反応を生成する請求の範囲第１２又は１３項記載の抗体又は抗体フラグメントを含んで成るＨＣＶＥ１に対して特異的な抗原の検出のための診断キット。
１９．ＨＣＶＥ１に対して特異的な抗体をたぶん含む生物学的サンプルにおける前記抗体の検出を包含するインビトロ診断方法であって、ここで前記生物学的サンプルが請求の範囲第３，４又は５項記載のペプチド配列に対応するエピトープを含む抗原に暴露されることを特徴とする方法。
２０．請求の範囲第３，４又は５項記載のペプチド配列に対応するエピトープを含む抗原を含んで成るＨＣＶＥ１に対して特異的な抗体の検出のための診断キット。
２１．請求の範囲第１２項記載のモノクローナル抗体、請求の範囲第１３項記載のモノクローナル抗体のフラグメント又は請求の範囲第１４項記載のモノクローナル抗体の誘導体を含んで成る治療用組成物。
２２．前記モノクローナル抗体の誘導体が、治療的に活性な分子に結合されるモノクローナル抗体又はそれらの抗体のフラグメントである請求の範囲第２１項記載の治療用組成物。
２３．キャリヤータンパク質に結合される請求の範囲第８項記載の免疫原性配列を含む免疫原性組成物であって、前記免疫原性配列が保護抗体を誘発でき、又は細胞毒性Ｔリンパ球を誘発できる免疫原性組成物。
２４．請求の範囲第３，４又は５項記載のポリペプチド又はそのようなポリペプチドの免疫原性配列に対して向けられたモノクローナル抗体の使用を含んで成る、請求の範囲第３，４又は５項記載のポリペプチドをアッセイするための方法。
２５．請求の範囲第３〜５のいづれか１項記載のポリペプチドの調製方法であって、発現ベクター中への、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の挿入、この発現ベクターを用いての細胞の形質転換及びそれらの細胞の培養を含んで成る方法。