JPH02186997A - 酵素選別方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、酵素活性測定用充填剤を充填したカラムを用
いる酵素選別方法に関する。

［従来の技術］ 酵素は、生粕胞により合成されるタンパク質であり、そ
の生体反応に対する触媒作用が生命の維持に重要な役割
を持つことが知られている。自然界には、動、植物また
は微生物起源の数百万種にのぼる酵素が存在しているが
、その中で単離された約２．０００１ｍのうちのあるも
のは、工業用酵素として食品や洗剤関係に、また医療用
酵素として酵素製剤や分析、臨床検査用に、さらに近年
は遺伝子工学用にと幅広く利用されている。従って、各
種の用途に、より適合した酵素を見い出し、単離、精製
した酵素の活性及び特異性を各段階で評価するための筐
便かっ正確な選別技術を確立することが肝要である。酵
素の活性を測定することは、即ち酵素の触媒能を測るこ
とであり、酵素の機能を示す基本的な指標を得ることに
他ならない。従来より酵素活性の測定は、基質の減少量
または生成物の増加量を分析することで行われてきたが
、その方法としては例えば酵素の種類により反応後の基
質の減少量を吸光光度計を用いて吸光度で測定する方法
、基質または生成物を化学試薬で発色させて測定する方
法、生成物をさらに着色性の物質に転換して測定する方
法等がしばしば用いられている。その他基質を放射性の
元素で標識して検出する方法などいろいろあるが、総じ
ていえることは測定する酵素の量が多く試薬が高価とな
ること、使用する試薬の種類が多いこと、測定に長時間
を要すること、測定技術に熟練を要すること、不純物の
影響を受は易く正確な値が得にくいこと、等々の欠点を
有することであった。これらの欠点に対応した工夫の一
つとして、液体クロマトグラフィーと組み合わせること
により、酵素のカラムによる分離精製を行い、カラム溶
出後、基質溶液と接触させて基質の減少量を測定するこ
とがなされた［エッチ、ニー　チエイス：　ジャーナル
・オブ・ケミカルテクノロジー・アンド・バイオテクノ
ロジー、　３６　巻、　３５１頁、　１９８６年、　（
Ｈ，Ａ、　　Ｃｈａｓｅ：Ｊ、　　Ｃｈｅｌｌ、　　Ｔ
ｅｃｈ、Ｂｉｏｔ、ｅｃｈｎｏｌ、３６．　３５１（１
９８６）　　）　　　および伊藤尚史ら：　ジャーナル
・オブ・クロマトグラフィー　４００　巻、　１６３　
頁、　１９８７　年、（Ｎ、Ｉｊ。

ｅｔ　ａｌ：　　Ｊ、　　Ｃｈｒｏｉａｔｏｇｒ、、　
　４００．　１８３（１９８７）　　）　　コ。

しかし、この方法も高価な試薬を連続して流し続ける必
要があること及びそのためにポンプなど新たな装置が必
要となるなどの点で必ずしも調足すべきものではない。

［発明が解決しようとするｎ題］ 本発明の目的は、前記従来の酵素活性測定方法の欠点を
克服して、簡便、迅速でしかも精度の高い酵素活性の測
定が可能な酵素選別方法を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明によって上記目的を達成し得る酵素選別方法が提
供される。

即ち、本発明は、同一用途に用いられる活性測定対象酵
素類を、酵素によって認識される基質を水に不溶性の支
持体に固定化してなる酵素活性測定用充填剤を中空管に
充填せしめてなるカラムに導入し、得られる基質分解物
を定量することにより、活性測定対象酵素類の活性比較
を行うことを特徴とする、酵素選別方法に関する。

以下、本発明における酵素活性測定用充填剤。

それを充填したカラム及びそれを用いる酵素選別方法に
ついて説明する。

本発明の酵素活性測定用充填剤は、酵素によって認識さ
れる基質を水に不溶性の支持体に固定化させることによ
ってＩｉｌ製される。

用いられる水に不溶性の支持体としては、ポーラスまた
はノンポーラスのいずれであってもよく、従来しばしば
用いられてきたセルロース、アガロース、デキストラン
等の多糖体及びポリアクリルアミドのようないわゆるソ
フトビーズ；　シリカゲル；スチレン系重合体、ビニル
アルコール系重合体及びメタクリレート系重合体などの
ような合成高分子ビーズ等があげられるが、高速液体ク
ロマトグラフィー（）ＩＰＬＣ）として用いるためには
シリカゲル及び合成高分子ビーズのような硬質ビーズが
望ましい。粒径は特に制限はないが３〜１００μ口の範
囲が望ましい。

支持体に酵素によって認識される基質を結合させるに際
しては、まず上記支持体が有する結合基導入基、例えば
水酸基に基質が共有結合可能な官能基を有する結合基を
結合させることが必要である。

官能基としてはエポキシ基、アミノ基、ヒドラジノ基、
カルボキシル基、ホルミル基等が例示される。これらの
官能基を有する結合基の支持体の導入は、公知の方法で
適当な溶媒の存在下で容易に行うことができる。例えば
エポキシ基を有する結合基としては、エビクロロヒドリ
ンのようなエピハロヒドリン類、１，４−ブタンジオー
ルジグリシジルエーテルのようなジグリシジルエーテル
類、１．７−オクタジニンジエボキシドにようなジエボ
キシド類等があげられるが、これらは支持体上の水酸基
とアルカリ条件下で速やかに反応しエポキシ変性支持体
を与える。また、得られたエポキシ変性支持体は、アン
モニア、ヒドラジン、あるいはプロパンジアミンのよう
なジアミノアルカン類等と反応させることによりアミノ
基を有するアミン変性支持体を、またアミノ酪酸によう
なアミノカルボン酸類と反応させることでカルボキシル
変性支持体を、また、エポキシ基を加水分解し過ヨウ素
酸酸化を行うことでホルミル変性支持体を与える。また
、アミン変性支持体は、無水コハク酸のような酸無水物
と反応させることによりカルボキシル変性支持体とする
こともできる。これらの官能基を有する支持体に酵素に
よって認識される基質を結合させるに際しては、結合基
が有する官能基に応じて必要であれば、適宜触媒や反応
試薬等を用いて適当な溶媒下で行うことができる。例え
ば触媒としては、塩酸や炭酸ナトリウムまたは炭酸水素
ナトリウムなどの酸、アルカリが主として官能基がエポ
キシ基の場合に用いられ、また、例えば反応試薬として
は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、ジシクロへキシル
カルボジイミド、１−エチル　−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミドまたはカルボニルジイミ
ダゾールのような縮合剤が官能基がカルボキシル基また
はアミノ基の場合に、また水素化シアノホウ素ナトリウ
ムのような還元剤が官能基がホルミル基の場合に用いら
れる等々を例示することができる。また、溶媒としては
、通常水が用いられるが必要に応じてリン酸や酢酸緩衝
液として用いることもでき、また塩化ナトリウムなどの
無機塩類を添加して用いることも可能である。

なお、結合基の長さとしては、特に制限はないが、原子
数６〜３０が望ましい。

官能基を有する支持体に固定化させる酵素によって認識
される基質は、対応する活性測定対象酵素との接触によ
り基質分解物を生じるものであればよく、特に制限され
ない。基質の代表例としては、グルコース、コレステロ
ール、コリン、尿酸。

ベンジルアミン、ヒスタミンなどのアミン類、キサンチ
ン、アセチルコリン、グルタチオン、チミジン−５−リ
ン酸、　コンドロイチン硫酸、　（デオキシ）リボ核酸
、コレステロールエステル、ビスパラニトロフェニルリ
ン酸などのリン酸モノエステル、アルギニン、リジン、
チロシンなどのアミノ酸、フェニルアラニルセリルアル
ギニンのようにＣ末端に特異的なアミノ酸を有するオリ
ゴペプチドのＣ末端にパラニトロフェニル基などの標識
化合物が結合したもの、グリシルグルタミン酸のような
オリゴペプチドがエステル縮合したもの、ベンゾイルア
ルギニンエチルエステルなどのような合成基質、α−（
β−）グルコース、　α−（β−）ガラクトース、　α
−（β−）マンノース、　β−フルクトース、　α、α
　−トレハロース、　β−グルクロン酸、α−Ｌ−フコ
ースがグルコースなどの他の糖とあるいはメチルウンベ
リフェロンなどのような標識化合物とグリコシド結合し
ているもの、セルロース、キチン、デキストラン、デン
プン、ヘパリン、フルクトース　−１，６−ビスリン酸
などがあげられる。

上記のようにして得られた酵素によって認識される基質
を水に不溶性の支持体に固定化してなる酵素活性測定用
充填剤は、通常は常法に従って中空管に充填され、酵素
活性の測定用カラムとして使用される。

酵素活性測定用充填剤を充填する中空管の材質は、−殻
内にはガラス製、ステンレス製、テフロン製、ステンレ
スの内壁をテフロンで被覆したもの等が用いられる。中
空管のサイズは、目的に応じて適宜法めればよく、特に
制限はない。

酵素活性測定用充填剤の中空管への充填方法は、常法に
従って行われ特に制限はない。また、充填率は適宜選択
すればよい。

本発明によって得られた酵素活性測定用カラムを用いて
、酵素活性を測定し、酵素選別を行うには、同一用途に
用いられる活性測定対象酵素類をカラムに注入し、得ら
れる基質分解物を定量することによって行われる。即ち
、同一用途に用いられる酵素活性測定対像酵素類が該カ
ラムを通過するに伴い、対象酵素の活性に対応した量の
基質分解物を生成し、生成した基質分解物を紫外吸収、
蛍光吸収、屈折率などの検出器または電気化学検出器等
を用いて検出することができる。測定品度は、特に制限
はないが、通常は４〜６０℃の範囲が望ましい。　活性
測定対象酵素類は、特に制限はなく、すべての酵素が適
用できる。

本発明に係る酵素類及び支持体に固定化された基質は１
両者の接触により基質分解物を生じるものであればよい
。例えば活性測定対象酵素類としてオキシドリダクター
ゼ、　トランスフェラーゼ、ヒドラーゼ、リアーゼ等を
適用した場合、これらの活性測定対象酵素類と基質の好
ましい組み合わせ及びそれらを組み合わせた系から生じ
る基質分屑物の検出方法について例示する。

まず、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシ
ダーゼ、コリンオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、アミ
ンオキシダーゼ、及びキサンチンオキシダーゼなどのよ
うなオキシダーゼに対応する基質としては、それぞれグ
ルコース、コレステロール、コリン、尿酸、ベンジルア
ミン、ヒスタミンなどのアミン類、及びキサンチンなど
をあげることができる。これらの系で生じる基質分解物
は、主として過酸化水素であり、例えば電気化学的に容
易に検出測定することができる。

また、ヒドロラーゼとしては、エステラーゼ、プロテア
ーゼ、グリコシダーゼなどがある。エステラーゼについ
ては、特に種類は問わないが、アセチルコリンエステラ
ーゼ、グルタチオンチオールエステルヒドラーゼ、ホス
ホジェステラーゼＩ、コンドロイチンスルファターゼ、
　（デオキシ）リボヌクレアーゼ■、Ｈのようなヌクレ
アーゼ、コレステロールエステラーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ等においては、それぞれに対応する基質として
アセチルコリン、グルタチオン、　チミジン−５−リン
酸、コンドロイチン硫酸、　（デオキシ）リボ核酸、コ
レステロールエステル、ビスパラニトロフェニルリン酸
などのリン酸モノエステルをあげることができる。これ
らの系で生じる基質分解物は、コリン、グルタチオン、
チミジン、コンドロイチン、ヌクレオチド、コレステロ
ール、パラニトロフェノールなどであり、これらはいず
れも紫外吸収、蛍光吸収あるいは屈折率等の変化により
検出測定することができる。

トリプシン、プラスミン、ウロキナーゼ、ブロメライン
、プロナーゼ、キモパパイン、ペプシン、キモトリプシ
ン、　トロンビンなどのプロテアーゼにおいては、基質
としてはアルギニン、リジン、チロシンなどのような、
対象酵素が特異性を持つアミノ酸またはフェニルアラニ
ルセリルアルギニンのようにＣ末端に特異的なアミノ酸
を有するオリゴペプチドのＣ末端にパラニトロフェニル
基などの標識化合物が結合したもの（以下、　（Ａ）と
いう）、あるいはグリシルグルタミン酸のようなオリゴ
ペプチドがエステル結合したもの（以ド、（Ｂ）という
）、あるいはベンゾイルアルギニンエチルエステルなど
のような合成基質（以下、　（Ｃ）という）があげられ
る、これらプロテアーゼの場合、上記（Ａ）および（Ｂ
）の系では、特異的なアミノ酸に結合していた標識化合
物またはオリゴペプチドが、また（Ｃ）の系では合成基
質の分解生成物が生成してくる。したがって、これらの
生成物の検出は生成化合物の性質に応じて適宜選択する
ことができる。生成物が標識化合物の場合、パラニトロ
フェノール、パラニトロアニリンのような紫外吸収を持
つ化合物は、紫外分光光度計により検出測定する。また
、４−アミンメチルクマリンのような蛍光吸収を持つ化
合物の場合は、蛍光光度計により検出測定する。また、
オリゴペプチドおよびベンゾイル基またはダンシル基な
どを有する合成基質分解生成物が生成してくる場合には
、紫外分光光度計あるいは屈折計を用いて検出測定する
ことができる。

グリコシダーゼにおいては、α−（β−）グルコシダー
ゼ、　α−（β−）ガラクトシダーゼ、　α−（β−）
マンノシダーゼ、　β−フルクトシダーゼ、　α。

α−トレハラーゼ、　β−グルクロニダーゼ、　α−Ｌ
−フコシダーゼなどがあり、それぞれ基質としてはα−
（β−）グルコース、α−（β−）ガラクトース、α−
（β−）マンノース、　β−フルクトース、　α、αト
レハロース、　β−グルクロン酸、　α−Ｌ−フコース
がグルコースなどの他の糖とあるいはメチルウンベリフ
ェロンなどのような標識化合物とグリコシド結合してい
るものをあげることができる。

また、セルラーゼ、キチナーゼ、デキストラナーゼ、ジ
アスターゼ、ヘパリナーゼ、といった多糖に特異性をも
つグリコシダーゼに対する基質としては、セルロース、
キチン、デキストラン、デンプン、ヘパリンをあげるこ
とができる。

これらグリコシダーゼにおいて、分解生成物が糖である
場合には屈折計により、また紫外吸収あるいは蛍光吸収
のある標識化合物である場合には、紫外分光光度計、蛍
光光度計により検出測定することができる。

さらに、リアーゼにおいては、例えばフルクトースビス
リン酸アルドラーゼなどのアルドラーゼがあげられる。

基質としては、　フルクトース−１゜６−ビスリン酸な
どを用い分解生成物であるジヒドロキシアセトンリン酸
またはグリセルアルデヒド−３−リン酸などを紫外分光
光度計あるいは示差屈折計を用いて検出洞室することが
できる。

本発明においては、同一基質固定化カラムを用いて、同
一用途に用いられる活性測定対象酵素類の活性比較を行
って酵素選別を行う。

酵素活性比較に用いる基質固定化カラムには特に制限は
なく、上述の全ての基質固定化カラムを用いることがで
きる。例えば、アルギニンパラニトロアニリド（Ａｒｇ
−ｐＮＡ）、　またはリジンパラニトロアニリド（Ｌｙ
ｓ−ｐＮＡ）を固定化基質として用いた場合、アルギニ
ンまたはリジンに対して特異的な作用を有する酵素は全
て活性測定対象酵素類として例示することができ、測定
対象酵素類の活性は各酵素活性に応じて生成する分解生
成物であるパラニトロアニリンを検出することによって
比較することができる。　　Ａｒｚ−ρＮＡ固定化カラ
ムによる活性比較対象酵素には、スロンビン、　トリプ
シン、　Ｘ　Ｉ　ａ　因子、　ＸＩＩａ因子、　Ｘａ因
子、　カリクレイン、ウロキナーゼなどをあげることが
でき、ＬｙｓｒｐＮ＾固定化カラムを用いた場合には、
　プラスミンや、カリクレイン、エンテロキナーゼなど
の活性を比較することができる。本比較法は、上記アル
ギニン、リジンに特異的な既知のプロテアーゼにとどま
らず、広範囲にわたる未知の、またプロテアーゼ以外の
様々な酵素に対して用い得ることは言うまでもない。

一般に、はとんど同一の基質特異性を有するにも拘らず
、活性が非常に異なっている酵素は数多く知られている
が、本発明の酵素選別方法は、それらの酵素の簡便な識
別同定に用いることができる。即ち、ある特定の基質特
異性を有する酵素を。

多数の酵素群の中から選別するための簡便なスクリーニ
ング方法として、またその基質に対する活性の強弱を判
定するための簡便なスクリーニング方法として用いるこ
とができる。あるいは、同一の酵素に関しては、各精製
段階における活性を検出するために用いることもできる
。さらに、数種類の基質国定化カラムを用いることで特
定の酵素に関する特異性の相違の検討、あるいは逆に特
異性の相違から新規な酵素を同定することも可能である
。従って、上述の活性測定対象酵素類は、精製した単一
標品の他、粗精製標品でもよく、また、生体試料中に存
在している一成分であってもよい。

本選別方法を適用し得る酵素の同一用途としては様々な
ものが考えられるが、食品、洗剤分野に関わる工業用酵
素の他、医療品、臨床分析用酵素、あるいは遺伝子工学
用酵素など多岐にわたって用いることが出来る。特に試
料中に夾雑タンパク質などの他物質が存在しているよう
な場合には、ゲル濾過、イオン交換、疎水性クロマトグ
ラフィーなどの分離カラムと組合せ、酵素活性測定用カ
ラムをポストカラムとして併用することもできる。

こうしたポストカラム法では、酵素活性測定と同時に、
分離カラムによって分離されたピークのどの部分に活性
が存在しているかを直ちに知ることができる。高速液体
クロマトグラフィー装置に組み込むことにより、少量の
試料で感度よく、短時間で容易に酵素活性を測定するこ
とができ、また他の様々の分離カラムとの組合せも有利
となる。

［実施例コ 以下、本発明について代表的な例を示しさらに具体的に
説明する。なお、これらは説明のための単なる例示であ
って本発明はこれらに何ら制限されるものでないことは
いうまでもない。

実施例１ グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタ
クリレートから得られた水酸基変性ビーズに、　　ＩＭ
　ＮａＯＨ水溶液中で１．４−ブタンジオールジグリシ
ジルエーテルを反応させエポキシ基を導入した後、　さ
らにγ−アミノ酪酸でカルボキシル基を導入した。得ら
れたビーズを無水ジオキサンで充分洗浄し、カルボキシ
ル変性ビーズとした。カルボキシル変性ビーズに、無水
ジオキサン中でＮ−ヒドロキシコハク酸イミド及びジシ
クロへキシルカルボジイミドを加え、　室温で１．５時
Ｍ　ｍ盪反応した後ビーズを濾取し、無水ジオキサン、
メタノールで素早く洗浄した。　このビーズＩｇをアル
ギニンパラニトロアニリド（Ａｒに−ｐＮＡ）　３０　
ｍｇの０．０１Ｎ炭酸緩衝液（ｐＨ９，４）の水３　ｍ
ｌに加え、室温で２時間振盪反応後、　４℃で一夜放置
した。

次いでビーズを濾取し、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液及び
水で洗浄した。こうして得られたＡｒｔ−ｐＮＡ固定化
ビーズは乾燥ビーズＩｇあたりＡｒｇ−ｐＮＡを約１０
μｍｏｌｅ担持させていることが確かめられた。

得られたＡｒｇ−ｐＮＡ固定化ビーズを、内径４．６ｍ
ｍ、長さ　１．０　ａｍのステンレス製カラムに充填し
、ＡｒＫ−ＰＮＡ固定化カラムとした。また、カルボキ
シル変性ビーズを内径４．６順、　長さ３．５　ｃｍの
ステンレス製カラムに充填し、ポストカラムとした。高
速液体クロマトグラフ装置に、Ａｒｇ−ｐＮＡ固定化カ
ラム及びポストカラムを組み込んだ。

ｉｎにのトリプシン、ウロキナーゼ、　トロンビン（ヒ
ト、ウシ由来）、カリクレインを含む緩衝液（５０ｍＭ
　トリス塩酸縁ｇＥ液　ｐＨ７，４）　１　ｍｌのうち
それぞれ５μｍを、本装置に注入し、′ｉｔ１離するパ
ラニトロアニリン（ｐＮＡ）　　ピークを検出し比較し
た。

その結果を図１に示した。　Ａｒｚ−ｐＮＡ固定化カラ
ムに対するＰＮＡ分離活性は、　トリプシンが一番高く
、次にウロキナーゼ、ヒトトロンビン、ウシトロンビン
、カリクレインの順であることが判った。

なお、クロマト条件は以下に示した通りである。

ｍ離液：　　５０ｍＭ　）！Ｊス塩酸ｒｉ街液　ｐＨ７
，４＋　０．１５Ｍ　　ＮａＣ１ 流速　　：　　ｌ　１１１／　ｍｉｎ 検出　　：４０５ｒ＋ｍ 試料　　：　トリプシン（ウシ、Ｓｉｇｍａ社製）ウロ
キナーゼ（ヒト、Ｓｉｇｍａ社製）トロンビン　（ヒト
、ウシ ｓｉｇｍａ社製） カリクレイン（カリジノゲナーゼ 標準品、国立衛生試験所） 測定温度：２５℃ 実施例２ 実施例１における固定化用基質Ａｒｇ−ｐＮＡの代わり
にＤ−フェニルアラニルビペコリルアルギニンバラニト
ロアニリド（Ｓ４２３ｇ　　Ｋａｂｉ社〕を用い、以下
同様の操作により　Ｓ−２２３８固定化ビーズを得た。

　得られたＳ−２２３８固定化ビーズは、　乾燥ビーズ
智モｇあたり　Ｓ−２２３８を約１０μｍｏｌｅ担持さ
せていることか確かめられた。Ｓ−２２３８固定化ビー
ズを。

実施例１と同様にしてカラムに充填し、ポストカラムと
共に高速液体クロマトグラフＨａに紐み込んだ。

ヒト、マウス、ラット、ウシ由来のトロンビンを１ｍに
含む緩衝液（５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液ｐｌ＋７−４）
　　１　ｍｌのうちそれぞれ５μｍを本装置に注入し、
′？１離するＰＮＡを検出し比較した。その結果を、図
２に示した。　ＰＮＡビーク面積はヒト：　マウス二　
ラット：　ウシが４：　　２：　　２：　　１であるこ
とが判った。

なお、クロマト条件は以下に示した通りである。

溶離液　：５０ｎＭ）リス塩酸緩衝液　ρ■７．４＋０
．１５　Ｍ　　ＮａＣ１ 流速　　：　ｌ　ｍｌ／　ｗｉｎ 検出　　：　４０５　ｒ＋ｎ 試料　　コ　トロンビン　（ヒト、マウス、ラット。

ウシ、Ｓｉｇｍａ社製） 測定温度：２５℃ 実施例３ 市販のゲル渡過カラムであるＷＳ−８０３Ｆ　（内径８
ｍｍ、長さ３０ｃｍ、昭和電工（株）社製）を２本連結
し、分離カラム４とした。分離カラムの後部に、実施例
１におけるＡｒｇ−ｐＮ＾固定化カラム（内径４．６順
、長さ１　、０ｃｍ）を連結した。　高速液体クロマト
グラフ装置に上記分離カラム及び＾ｒｇ−ｐＮＡ固定化
カラムを組み込み、パンクレアチンを注入した。パンク
レアチン中の物質の分離パターンは２３０ｎｍ、またＡ
ｒ４−ＰＮＡ分解活性は４０５ｎｍの吸収により検出し
た。その結果１図３に示した通り、本装置によりパンク
レアチン中に存在する数種類の物質の分離（図３−■）
とＡｒ４−ｐＮＡ分解活性の検出（図３−■）が同時に
行えることが判った。また、基質固定化カラムを分離カ
ラムに連結したポストカラムとして用いた場合（図３−
■）と、分離カラムのみを用いた場合（図３−■）の分
離パターンを比較すると酵素活性の存在するピークがテ
ーリングしていることが判った。従って、こうしたカラ
ムへの保持時間の変化によっても特異的な酵素活性を検
出できることが判った。

なお、クロマトの条件は以下に示した通りである。

溶離液　　５０ｍＭトリス＠酸ｒｉ債液　ｐｏ　７．４
＋０．１５にＮａＣ１ 流速　　　１ｍｌ／ｍｉｎ 検出　　　２３０　ｎｍ、　　４０５　ｎ　ｍ試料　　
　パンクレアチン（ＩＣＮ社製）測定温度　２５℃ ［発明の効果コ 本発明による酵素選別方法は、前記従来の酵素活性測定
方法の欠点を解決した簡便迅速で精度の高い方法であり
、今後、酵素の分離精製に関わる様々な分野において有
用な手段を提供するものであるが、その中でも特に類似
酵素の選別や酵素活性の強弱の判定等、簡便なスクリー
ニング方法に応用するために有用である。

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明によるＡｒｇ−ｐＮＡ固定化カラムを用
いた酵素活性測定装置により検出した各酵素活性値の結
果である。　図中、横軸は検出したＰＮＡＮ−ピー積を
、またＡ−Ｅは注入した試料を示し、それぞれトリプシ
ン、ウロキナーゼ、ヒトトロンビン、ウシトロンビン、
カリクレインを表す。 図２は、本発明によるＳ−２２３８固定化カラムを用い
た酵素活性測定装置により各種トロンビンを注入した結
果得られたクロマトパターンを示している。検出したト
ロンビン活性値の結果である。図中、横軸は溶出時間（
分）を、縦軸は４０５　ｎｍにおけるＰＮＡの吸収を示
す。また、Ａ−Ｄは注入した試料を示し、それぞれヒト
、マウス、ラット、ウシ由来のトロンビンを表す。 図３は、本発明によるＡｒ４−ｐＮＡ固定化カラムを用
いた酵素活性測定装置によりパンクレアチン中の酵素の
分離と活性検出を行った結果である。図３−■は、分離
カラムにパンクレアチンを注入し、２３０ｎｍで検出し
た結果である。図３−（呟及びｃ塾）は、分離カラムと
基質固定化カラムを連結した本システムに、パンクレア
チンを注入し、それぞれ２３０ｎｍ、　４０５ｎｒｎに
おいて検出した結果である。　図中、横軸は保持時間（
分）、縦軸は吸光度を示す。 図１

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 同一用途に用いられる活性測定対象酵素類を、酵素によ
   って認識される基質を水に不溶性の支持体に固定化して
   なる酵素活性測定用充填剤を中空管に充填せしめてなる
   カラムに導入し、得られる基質分解物を定量することに
   より、活性測定対象酵素類の活性比較を行うことを特徴
   とする、酵素選別方法。