JPH0728756B2

JPH0728756B2 - 酵素活性測定用充填剤、それを充填したカラムおよびそれを用いる酵素活性測定方法

Info

Publication number: JPH0728756B2
Application number: JP63250340A
Authority: JP
Inventors: 珠美小山; 征矢生森口; 廣志鈴木
Original assignee: Showa Denko KK
Current assignee: Resonac Holdings Corp
Priority date: 1988-02-19
Filing date: 1988-10-04
Publication date: 1995-04-05
Anticipated expiration: 2010-04-05
Also published as: JPH01296997A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、酵素活性測定用充填剤、それを充填した酵素
活性測定用カラムおよびそれを用いる酵素活性の測定方
法に関する。

〔従来の技術〕

酵素は、生細胞により合成されるタンパク質であり、そ
の生体反応に対する触媒作用が生命の維持に重要な役割
を持つことが知られている。自然界には、動，植物また
は微生物起源の数百万種にのぼる酵素が存在している
が、その中で単離された約2,000種のうちのあるもの
は、工業用酵素として食品や洗剤関係にまた医薬用酵素
として酵素製剤や分析、臨床検査用に、さらに近年は遺
伝子工学用にと幅広く利用されている。酵素の活性を測
定することは、即ち酵素の触媒能を測ることであり、酵
素の機能を示す基本的な指標を得ることに他ならない。
従来より酵素活性の測定は、基質の減少量または生成物
の増加量を分析することで行われてきたが、その方法と
しては例えば酵素の種類により反応後の基質の減少量を
吸光光度計を用いて測定する方法、基質または生成物を
化学試薬で発色させて測定する方法、生成物をさらに着
色性の物質に転換して測定する方法等がしばしば用いら
れている。その他基質を放射性の元素で標識して検出す
る方法等いろいろあるが、総じて言えることは測定する
酵素の量が多く試薬が高価となること、使用する試薬の
種類が多いこと、測定に長時間を要すること、測定技術
に熟練を要すること、不純物の影響を受け易く正確な値
が得にくいこと、等々の欠点を有することであった。こ
れらの欠点に対応した工夫の一つとして、液体クロマト
グラフィーと組み合せることにより、酵素のカラムによ
る分離精製を行い、カラム溶出後、基質溶液と接触させ
て基質の減少量を測定することがなされた〔エッチ．エ
ー．チェイス：ジャーナル・オブ・ケミカルテクノロジ
ー・アンド・バイオテクノロジー,36巻,351頁,1986年
（H.A.Chase:J.Chem.Tech.Biotechnol,36,351（198
6））および伊藤尚史ら：ジョーナル・オブ・クロマト
グラフィー,400巻,163頁,1987年（N.Ito et al;J.Chrom
atogr.400,163（1987））〕。しかし、この方法も高価
な試薬を連続して流し続ける必要があることおよびその
ためにポンプなど新たな装置が必要となる等の点で必ず
しも満足すべきものではない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、前記従来の酵素活性測定方法の欠点を
克服して、簡便、迅速でしかも精度の高い酵素活性の測
定が可能な、酵素活性測定用充填剤、それを充填したカ
ラムおよびそれを用いる酵素活性の測定方法を提供する
ことにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明によって上記目的を達成し得る酵素活性測定用充
填剤、それを充填したカラムおよびそれを用いる酵素活
性の測定方法が提供される。

すなわち、本発明は、（ａ）高圧ポンプによって溶離液
を送液し、（ｂ）酵素を含有する試料液を該溶離液の流
れに注入し、（ｃ）該試料液が注入された溶離液を、基
質が固定化されてなる充填剤が充填されたカラムに通し
て、酵素と基質との反応により基質を分解せしめ、
（ｄ）該カラムから流出する液中の基質分解生成物を定
量することからなるフロー式酵素活性測定方法において
使用される上記充填剤であって、試料液を含む溶離液中の酵素と接触することによって検
出可能な水溶性基質分解生成物を生じる基質が、原子数
６〜30の長さを有する結合基を介して、粒径３〜100μ
ｍの硬質ビーズ支持体に共有結合によって固定化されて
なることを特徴とする酵素活性測定用の充填剤に関す
る。

また、本発明は、（ａ）高圧ポンプによって溶離液を送
液し、（ｂ）酵素を含有する試料液を該溶離液の流れに
注入し、（ｃ）該試料液が注入された溶離液を、基質が
固定化されてなる充填剤が充填されたカラムに通して、
酵素と基質との反応により基質を分解せしめ、（ｄ）該
カラムから流出する液中の基質分解生成物を定量するこ
とからなるフロー式酵素活性測定方法において使用され
る上記カラムであって、試料液を含む溶離液中の酵素と接触することによって検
出可能な水溶性基質分解生成物を生じる基質が、原子数
６〜30の長さを有する結合基を介して、粒径３〜100μ
ｍの硬質ビーズ支持体に共有結合によって固定化されて
なる充填剤が充填されていることを特徴とする酵素活性
測定用のカラムに関する。

さらに、本発明は、（ａ）高圧ポンプによって溶離液を
送液し、（ｂ）酵素を含有する試料液を該溶離液の流れ
に注入し、（ｃ）該試料液中の酵素と接触することによ
って検出可能な水溶性基質分解生成物を生じる基質が、
原子数６〜30の長さを有する結合基を介して、粒径３〜
100μｍの硬質ビーズ支持体に共有結合によって固定化
されてなる充填剤が充填されたカラムに、上記試料液が
注入された溶離液を通して、基質分解生成物を生ぜし
め、（ｄ）該カラムから流出する液中の基質分解生成物
を定量することを特徴とするフロー式酵素活性測定方
法；ならびに（ａ）高圧ポンプによって溶離液を送液し、（ｂ）酵素
を含有する試料液を該溶離液の流れに注入し、（ｃ）該
試料液が注入された溶離液を分離カラム中を通して液中
の酵素を分離し、（ｄ）該試料液中の酵素と接触するこ
とによって検出可能な水溶性基質分解生成物を生じる基
質が、原子数６〜30の長さを有する結合基を介して、粒
径３〜100μｍの硬質ビーズ支持体に共有結合によって
固定化されてなる充填剤が充填されたカラムに、上記分
離カラムから流出する液を通して、基質分解生成物を生
ぜしめ、（ｅ）該カラムから流出する液中の基質分解生
成物を定量することを特徴とするフロー式酵素活性測定
方法に関する。

以下、本発明の酵素活性測定用充填剤、それを充填した
カラムおよびそれを用いる酵素活性の測定方法について
説明する。

本発明の酵素活性測定用充填剤は、酵素によって認識さ
れる基質を水に不溶性の硬質ビーズからなる支持体に共
有結合によって固定化させることによって調製される。

用いられる水に不溶性の支持体はポーラスまたはノンポ
ーラスのいずれであってもよいが、シリカゲルならびに
スチレン系重合体、ビニルアルコール系重合体およびメ
タクリレート系重合体などの合成高分子の硬質ビーズが
用いられる。従来しばしば用いられてきたセルロース、
アガロース、デキストランなどの多糖体およびポリアク
リルアミドのようないわゆるソフトビーズは好適ではな
い。硬質ビーズとしては、その粒径が３〜100μｍの範
囲であってなるべく一定のものを使用する。硬質ビーズ
の粒径が３μｍ未満では送液に圧力がかかり過ぎ流速を
高めるのが困難となり、且つ均一な粒径とすることも難
しい。逆に粒径が100μｍを超えると細密充填ができ
ず、基質を固定化するために十分な表面積を得ることが
困難となる。いずれの場合も、繰返して短時間に精度の
高い測定を行なうことが難しくなる。

支持体に酵素によって認識される基質を結合させるに際
しては、まず上記支持体が有する結合基導入基、例えば
水酸基に基質が共有結合可能な官能基を有する結合基を
結合させることが必要である。

官能基としてはエポキシ基、アミノ基、ヒドラジノ基、
カルボキシル基、ホルミル基等が例示される。これらの
官能基を有する結合基の支持体への導入は、公知の方法
で適当な溶媒の存在下で容易に行うことができる。例え
ばエポキシ基を有する結合基としてはエピクロロヒドリ
ンのようなエピハロヒドリン類、1,4−ブタンジオール
ジグリシジルエーテルのようなジグリシジルエーテル
類、1,7−オクタジエンジエポキシドのようなエポキシ
シド類などがあげられるが、これらは支持体上の水酸基
とアルカリ条件下ですみやかに反応しエポキシ変性支持
体を与える。また、得られたエポキシ変性支持体は、ア
ンモニア、ヒドラジン、あるいは1,3−プロパンジアミ
ンのようなジアミノアルカン類などと反応させることに
よりアミノ基を有するアミノ変性支持体を、また４−ア
ミノ酪酸のようなアミノカルボン酸類と反応させること
でカルボキシル変性支持体を、また、エポキシ基を加水
分解し過ヨウ素酸酸化を行うことでホルミル変性支持体
を与える。また、アミノ変性支持体は無水コハク酸のよ
うな酸無水物と反応させることによりカルボキシル変性
支持体とすることもできる。これらの官能基を有する支
持体に酵素によって認識される基質を結合させるに際し
ては、結合基が有する官能基に応じて必要であれば、適
宜触媒や反応試薬などを用いて適当な溶媒下で行なうこ
とができる。例えば触媒としては、塩酸や炭酸ナトリウ
ムまたは炭酸水素ナトリウムなどの酸、アルカリが主と
して官能基がエポキシ基の場合に用いられ、また、例え
ば反応試薬としてはＮ−ヒドロキシコハク酸イミド、ジ
シクロヘキシカルボジイミドまたは１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドのよう
な縮合剤が官能基がカルボキシル基の場合に、また水素
化シアノホウ素ナトリウムのような還元剤が官能基がホ
ルミル基の場合に用いられる等々を例示することができ
る。また溶媒としては通常水が用いられる必要に応じて
リン酸や酢酸緩衝液として用いることもでき、また塩化
ナトリウムなどの無機塩類を添加して用いることも可能
である。

結合基としては、その長さが原子数６〜30のものを使用
する。結合基の長さが短か過ぎると酵素自体の立体障害
のために酵素の結合部位に基質が結合できなくなり、所
望の酵素反応が達成できない。逆に、結合基の長さが原
子数30を超えると結合基先端に結合した基質の立体的自
由度が高まり、硬質ビーズ表面の物理化学的相互作用が
強まり、この場合も、酵素の活性部位に対し基質の結合
が困難になる。

官能基を有する支持体に固定化させる酵素によって認識
される基質は、対応する活性測定対象酵素との接触によ
り基質分解物を生じるものであればよく、特に制限され
ない。基質の代表例としては、グルコース、コレステロ
ール、コリン、尿酸、ベンジルアミン、ヒスタミンなど
のアミン類、キサンチン、アセチルコリン、グルタチオ
ン、チミジン−５′−リン酸、コンドロイチン硫酸、
（デオキシ）リボ核酸、コレステロールエステル、ビス
パラニトロフェニルリン酸などのリン酸モノエステル、
アルギニン、リジン、チロシンなどのアミノ酸、フェニ
ルアラニルセリルアルギニンのようにＣ末端に特異的な
アミノ酸を有するオリゴペプチドのＣ末端にパラニトロ
フェニル基などの標識化合物が結合したもの、グリシル
グルタミン酸のようなオリゴペプチドがエステル結合し
たもの、ベンゾイルアルギニンエチルエステルなどのよ
うな合成基質、α−（β−）グルコース、α−（β−）
ガラクトース、α−（β−）マンノース、β−フルクト
ース、α，α−トレハロース、β−グルクロン酸、α−
Ｌ−フコースがグルコースなどの他の糖とあるいはメチ
ルウンベリフェロンなどのような標識化合物とグリコシ
ド結合しているもの、セルロース、キチン、デキストラ
ン、デンプン、ヘパリン、フルクトース−1,6−ビスリ
ン酸などがあげられる。

上記のようにして得られた酵素によって認識される基質
を水に不溶性の支持体に固定化してなる酵素活性測定用
充填剤は、通常は常法にしたがって中空管に充填され、
酵素活性の測定用カラムとして使用される。

酵素活性測定用充填剤を充填する中空管の材質は、一般
的にはガラス製、ステンレス製、テフロン製、ステンレ
スの内壁をテフロンで被覆したもの等が用いられる。中
空管のサイズは、目的に応じて適宜決めればよく、特に
制限はない。

酵素活性測定用充填剤の中空管への充填方法は、常法に
したがって行なわれ、特に制限はない。また、充填率は
適宜選択すればよい。

本発明によって得られた酵素活性測定用カラムを用いて
高速液体クロマトグラフィーによる酵素活性を測定する
には、高圧ポンプによって溶離液を送液し、酵素を含有
する試料液を該溶離液の流れに注入し、必要ならば該試
料液が注入された溶離液を分離カラムに通したうえ、基
質が固定化されてなる充填剤が充填されたカラムに通し
て、酵素と基質との反応により基質を分解せしめ、酵素
と基質との接触によって生じた基質分解物を定量するこ
とによって行なわれる。すなわち、酵素活性測定用カラ
ムに、活性測定対象酵素を注入すると、活性測定対象酵
素が該カラムを通過するに伴い、対象酵素の活性に対応
した量の基質分解物を生成し、生成した基質分解物を紫
外吸収、螢光吸収、屈折率などの検出器または電気化学
検出器等を用いて検出することができる。測定温度は、
特に制限はないが、通常は４〜60℃の範囲が望ましい。
活性測定対象酵素は、特に制限はなく、すべての酵素が
適用できる。活性測定対象酵素は、精製した単一標品の
他、粗精製標品でもよく、また、生体試料中に存在して
いる一成分であってもよい。特に試料中に他の夾雑タン
パク質等の他物質が存在しているような場合には、ゲル
過、イオン交換、疎水クロマトグラフィーなどの分離
カラムと組み合わせ、酵素活性測定用カラムをポストカ
ラムとして併用することができる。こうしたポストカラ
ム法では、酵素活性測定と同時に分離ゲルによって分離
されたピークのどの部分に活性が存在しているかをただ
ちに知ることができる。高速液体クロマトグラフィー装
置に組み込むことにより少量の試料で感度よく、短時間
で容易に酵素活性を測定することができ、また他の様々
の分離カラムとの組み合わせも有利となる。

本発明において使用される、支持体に固定化された基質
は、酵素との接触により水溶性の基質分解物を生じるも
のであればよい。例えば活性測定対象酵素としてオキシ
ダーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼなどを適用した場合、
これらの活性測定対象酵素と基質の好ましい組み合わせ
およびそれらを組み合わせた系から生じる基質分解物の
検出方法について例示する。

まず、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシ
ダーゼ、コリンオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、アミ
ンオキシダーゼ、およびキサンチンオキシダーゼなどの
ようなオキシダーゼに対応する基質としては、それぞれ
グルコース、コレステロール、コリン、尿酸、ベンジル
アミン、ヒスタミンなどのアミン類、およびキサンチン
等をあげることができる。これらの系で生じる基質分解
物は、主として過酸化水素であり、例えば電気化学的に
容易に検出測定することができる。

また、ヒドロラーゼとしてはエステラーゼ、プロテアー
ゼ、グリコシダーゼなどがある。エステラーゼについて
は、特に種類は問わないが、アセチルコリンエステラー
ゼ、グルタチオンチオールエステルヒドラーゼ、ホスホ
ジエステラーゼＩ、コンドロイチンスルファターゼ、
（デオキシ）リボヌクレアーゼI,IIのようなヌクレアー
ゼ、コレステロールエステラーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ等においては、それぞれに対応する基質としてアセ
チルコリン、グルタチオン、チミジン−５′−リン酸、
コンドロイチン硫酸、（デオキシ）リボ核酸、コレステ
ロールエステル、ビスパラニトロフェニルリン酸などの
リン酸モノエステルをあげることができる。これらの系
で生じる基質分解物は、コリングルタチオン、チミジ
ン、コンドロイチン、ヌクレオチド、コレステロール、
パラニトロフェノールなどであり、これらはいずれも紫
外吸収、螢光吸収あるいは屈折率等の変化により検出測
定することができる。

トリプシン、プラスシン、ウロキナーゼ、ブロメライ
ン、プロナーゼ、キモパパインペプシン、キモトリプシ
ンなどのプロテアーゼにおいては、基質としてはアルギ
ニン、リジン、チロシンなどのような、対象酵素が特異
性をもつアミノ酸またはフェニルアラニルセリルアルギ
ニンのようにＣ末端に特異的なアミノ酸を有するオリゴ
ペプチドのＣ末端にパラニトロフェニル基などの標識化
合物が結合したもの（以下、（Ａ）という）、あるいは
グリシルグルタミン酸のようなオリゴペプチドがエステ
ル結合したもの（以下、（Ｂ）という）、あるいはベン
ゾイルアルギニンエチルエステルなどのような合成基質
（以下、（Ｃ）という）があげられる。これらプロテア
ーゼの場合、上記（Ａ）および（Ｂ）の系では、特異的
なアミノ酸に結合していた標識化合物またはオリゴペプ
チドが、また（Ｃ）の系では合成基質の分解生成物が生
成してくる。したがって、これらの生成物の検出は生成
化合物の性質に応じて適宜選択することができる。生成
物が標識化合物の場合、パラニトロフェノール、パラニ
トロアニリンのような紫外吸収をもつ化合物は紫外分光
光度計により検出測定する。また、４−アミノメチルク
マリンのような螢光吸収をもつ化合物の場合は、螢光光
度計により検出測定する。また、オリゴペプチドおよび
ベンゾイル基またはダンシル基等を有する合成基質分解
生成物が生成してくる場合には、紫外分光光度計あるい
は屈折計を用いて検出測定することができる。

グリコシダーゼにおいては、α−（β−）グルコシダー
ゼ、α−（β−）ガラクトシダーゼ、α−（β−）マン
ノシダーゼ、β−フルクトシダーゼ、α，α−トレハラ
ーゼ、β−グルクロニダーゼ、α−（Ｌ−）フコシダー
ゼなどがあり、それぞれ基質としてはα−（β−）グル
コース、α−（β−）ガラクトース、α−（β−）マン
ノース、β−フルクトース、α，α−トレハロース、β
−グルクロン酸、α−Ｌ−フコースがグルコースなどの
他の糖とあるいはメチルウンバリフェロンなどのような
標識化合物とグリコシド結合しているものをあげること
ができる。また、セルラーゼ、キチナーゼ、デキストラ
ナーゼ、ジアスターゼ、ヘパリナーゼといった多糖に特
異性をもつグリコシダーゼに対する基質としては、セル
ロース、キチン、デキストラン、デンプン、ヘパリンを
あげることができる。

これらグリコシダーゼにおいて、分解生成物が糖である
場合には屈折計により、また紫外吸収あるいは螢光吸収
のある標識化合物である場合には、紫外分光光度計、螢
光光度計により検出測定することができる。

さらに、リアーゼにおいては、例えばフルクトースビス
リン酸アルドラーゼなどのアルドラーゼがあげられる。
基質としては、フルクトース−1,6−ビスリン酸などを
用い分解生成物であるジヒドロキシアセトンリン酸また
はグリセルアルデヒド−３−リン酸などを紫外分光光度
計あるいは示差屈折計を用いて検出測定することができ
る。

〔実施例〕

以下、本発明について代表的な例を示しさらに具体的に
説明する。なお、これらは説明のための単なる例示であ
って本発明はこれらに何ら制限されるものではないこと
はいうまでもない。

実施例１グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタ
クリレートから得られた水酸基変性ビーズに、1M NaOH
中で、1,4−ブタンジオールジグリシジルエーテルを反
応させエポキシ基を導入した後、さらにγ−アミノブチ
リックアシドでカルボキシル基を導入した。得られたビ
ーズを無水ジオキサンで充分洗浄し、カルボキシル変性
ビーズとした。カルボキシル変性ビーズに無水ジオキサ
ン中でＮ−ヒドロキシコハク酸イミドおよびジシクロヘ
キシルカルボジイミドを加え、室温で1.5時間振盪反応
した後ゲルを取し、無水ジオキサン、メタノールで素
早く洗浄した。このゲル1gをアルギニンパラニトロアニ
リド（Agr−pNA）30mgの0.01N炭酸緩衝液（pH9.4）の水
3mlに加え、室温で２時間振盪反応後、４℃で一晩放置
した。次いでゲルを取し、1M塩化ナトリウム水溶液お
よび水で洗浄した。こうして得られたAgr−pNA固定化ゲ
ルは乾燥ゲル1gあたりAgr−pNAを約10μmolo担持させて
いることが確められた。

得られたAgr−pNA固定化ビーズを、内径4.6mm、長さ1.0
cmのステンレス製カラムに充填し、Agr−pNA固定化カラ
ムとした。高速液体クロマトグラフ装置にAgr−pNA固定
化カラムを組み込み（図１）、トリプシンの活性測定を
行い本装置における測定の検出限界、直線性、および流
速依存性について検討した。

（１）本装置におけるトリプシン活性の検出限界および
測定値の直線性本装置に注入したトリプシン活性値の上昇に伴い、検出
される測定値は直線的に上昇し、よい相関を示した（図
２）。また、検出限界は0.05nkatであった。なお、クロ
マト条件は以下に示した通りである。

溶離液:50mMトリス−塩酸緩衝液pH7.4＋0.15M NaCl
（溶離液Ａ）流速:1ml/min 検出:405nm 試料：トリプシン（Sigma社製）BAEE（ベンゾイルア
ルギニンエチルエステル）nkat/3μ溶離液Ａ＋0.5mM
CaCl₂ ただし、トリプシンの活性はBAEEに対する加水分解活性
により示し、1BAEE nkatは１秒間に1nmoloのBAEEを分解
する酵素活性の量とした。

測定温度:25℃ （２）測定値の流速依存性一定量のトリプシンを本装置に注入し、流速に対する測
定値の依存性を図３に示した。

クロマトの条件は、流速を除いて（１）に準ずる。

その結果、図３に示した通り、流速の増加に反比例して
値が減少する傾向がみられた。

（３）測定値の温度依存性一定量のトリプシンを本装置に注入し、温度に対する測
定値の依存性を図４に示した。クロマトの条件は、温度
を除いて（１）に準ずる。その結果、図４に示した通
り、カラム温度40℃前後において測定値が最高に達する
ことがわかった。

（４）測定値の塩濃度依存性一定量のトリプシンを本装置に注入し、塩濃度に対する
測定値の依存性を図５に示した。クロマトの条件は、塩
濃度を除いて（１）に準ずる。

その結果、図５に示した通り、塩濃度の上昇に伴い、測
定値が減少する傾向がみられた。

実施例２実施例１で得られたAgr−pNA固定化ビーズを、内径4.6m
m、長さ1.0cmのステンレス製カラムに充填し、Agr−pNA
固定化カラムとした。また内径8.0mm,長さ30cmの市販ゲ
ル過分離カラム（WS−803,昭和電工（株）社製）を２
本連結し分離カラムとした。高速液体クロマトグラフ装
置に、分離カラムおよびAgr−pNA固定化カラムを組み込
み（図６）、４種類のタンパク質（チログロブリン、ト
ランスフェリン、オボアルブミン、トリプシン）の混合
物を本装置に注入した。タンパク質の分離パターンは28
0nm、またはトリプシン活性は405nmの吸収により検出し
た。その結果、図７に示した通り、本装置により、数種
のタンパクの分離（図７−１）とトリプシン活性の検出
（図７−２）が同時に行えることがわかった。

なお、クロマト条件は以下に示した通りである。

溶離液:50mM トリス−塩酸緩衝液 pH7.4＋0.15M NaCl 流速:1ml/min 検出:405nm 試料：チログロブリン（ウシ,type I,Sigma社製）トランスフェリン（ヒト,Sigma社製）オボアルブミン（Sigma社製）トリプシン（ウシ膵臓、type III）測定温度:25℃ 実施例３実施例１におけるアルギニンパラニトロアニリドの代わ
りにＤ−フェニルピペコリルアルギニンパラニトロアニ
リドを用い、またトリプシンの代りにトロンビンを用い
て、その他は実施例１に準じて本装置におけるトロンビ
ン活性測定値の直線性を検討したところ、本装置に注入
したトロンビン活性値の上昇に伴い、検出される測定値
は直線的に上昇し、よい相関を示した（図８）。なお、
クロマト条件は以下に示した通りである。

溶離液:50mMトリス−塩酸緩衝液 pH7.4＋0.15M NaCl 流速:1ml/min 検出:405nm 試料：トロンビン（（Sigma社製、ヒト血漿）NIH uni
t/5μ 50mM クエン酸ナトリウム（pH0.65）＋0.15M
NaCl 測定温度:25℃ 〔発明の効果〕本発明による酵素活性測定方法は、前記従来の酵素活性
測定方法の欠点を克服した簡便，迅速で精度の高い方法
であり、今後、酵素の分離，精製に関わる様々な分野に
おいて有用な手段を提供するものである。

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明による酵素活性測定装置の模式図であ
る。ただし、図中はポンプ、はトリプシン、は恒
温槽、はAgr−pNA固定化カラム、は検出器を示す。図２は、注入したトリプシンの活性値と得られた測定値
の相関を示したものである。図中、縦軸は分解生成物で
あるpNA（パラニトロアニリン）のピーク面積（×10^-3
＝pNAμmole）を、横軸は注入したトリプシンの活性（B
AEEnkat/3μ）を示す。図３は、流速と測定値との関係を示したものである。図
中、縦軸はpNAのピーク面積（×10^-4＝pNAμmole）、横
軸は流速（ml/min）を示す。図４は、温度と測定値との関係を示したものである。図中、縦軸はpNAのピーク面積（×10^-4＝pNAμmole）、
横軸は温度（℃）を示す。図５は、溶離液に含まれる塩化ナトリウム濃度と測定値
との関係を示したものである。図中、縦軸はpNAのピー
ク面積（×10^-4＝pNAμmole）、横軸はモル濃度（Ｍ）
を示す。図６は、分離カラムを基質カラムと連結させて用いた場
合の酵素活性測定装置の模式図である。ただし、図中、
はポンプ、は試料、は恒温槽、は分離カラム、
はAgr−pNA固定化カラム、は検出器を示す。図７は、分離カラムを基質カラムと連結させて用いた場
合のクロマトグラムである。図７−１はタンパク質の分
離パターン（280nmの吸収による）を示し、また図７−
２はトリプシンの活性（405nmの吸収によるpNAのピー
ク）を示す。ただし、図中、はチログロブリン、は
トランスフェリン、はオボアルブミン、はトリプシ
ンのピークを示す。図８は、注入したトロンビンの活性値と得られた測定値
の相関を示したものである。図中、縦軸はpNAのピーク
面積を示し、横軸は注入したトロンビンの活性（NIH un
it）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭62−265998（ＪＰ，Ａ) 特開昭57−18996（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−30698（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−235058（ＪＰ，Ａ) 実開昭60−183555（ＪＰ，Ｕ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）高圧ポンプによって溶離液を送液
し、（ｂ）酵素を含有する試料液を該溶離液の流れに注
入し、（ｃ）該試料液が注入された溶離液を、基質が固
定化されてなる充填剤が充填されたカラムに通して、酵
素と基質との反応により基質を分解せしめ、（ｄ）該カ
ラムから流出する液中の基質分解生成物を定量すること
からなるフロー式酵素活性測定方法において使用される
上記充填剤であって、試料液を含む溶離液中の酵素と接触することによって検
出可能な水溶性基質分解生成物を生じる基質が、原子数
６〜30の長さを有する結合基を介して、粒径３〜100μ
ｍの硬質ビーズ支持体に共有結合によって固定化されて
なることを特徴とする酵素活性測定用の充填剤。
【請求項２】（ａ）高圧ポンプによって溶離液を送液
し、（ｂ）酵素を含有する試料液を該溶離液の流れに注
入し、（ｃ）該試料液が注入された溶離液を、基質が固
定化されてなる充填剤が充填されたカラムに通して、酵
素と基質との反応により基質を分解せしめ、（ｄ）該カ
ラムから流出する液中の基質分解生成物を定量すること
からなるフロー式酵素活性測定方法において使用される
上記カラムであって、試料液を含む溶離液中の酵素と接触することによって検
出可能な水溶性基質分解生成物を生じる基質が、原子数
６〜30の長さを有する結合基を介して、粒径３〜100μ
ｍの硬質ビーズ支持体に共有結合によって固定化されて
なる充填剤が充填されていることを特徴とする酵素活性
測定用のカラム。
【請求項３】（ａ）高圧ポンプによって溶離液を送液
し、（ｂ）酵素を含有する試料液を該溶離液の流れに注
入し、（ｃ）該試料液中の酵素と接触することによって
検出可能な水溶性基質分解生成物を生じる基質が、原子
数６〜30の長さを有する結合基を介して、粒径３〜100
μｍの硬質ビーズ支持体に共有結合によって固定化され
てなる充填剤が充填されたカラムに、上記試料液が注入
された溶離液を通して、基質分解生成物を生ぜしめ、
（ｄ）該カラムから流出する液中の基質分解生成物を定
量することを特徴とするフロー式酵素活性測定方法。
【請求項４】（ａ）高圧ポンプによって溶離液を送液
し、（ｂ）酵素を含有する試料液を該溶離液の流れに注
入し、（ｃ）該試料液が注入された溶離液を分離カラム
中を通して液中の酵素を分離し、（ｄ）該試料液中の酵
素と接触することによって検出可能な水溶性基質分解生
成物を生じる基質が、原子数６〜30の長さを有する結合
基を介して、粒径３〜100μｍの硬質ビーズ支持体に共
有結合によって固定化されてなる充填剤が充填されたカ
ラムに、上記分離カラムから流出する液を通して、基質
分解生成物を生ぜしめ、（ｅ）該カラムから流出する液
中の基質分解生成物を定量することを特徴とするフロー
式酵素活性測定方法。