JPH02188585A - 新規免疫抑制剤 - Google Patents
新規免疫抑制剤Info
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- JPH02188585A JPH02188585A JP1165524A JP16552489A JPH02188585A JP H02188585 A JPH02188585 A JP H02188585A JP 1165524 A JP1165524 A JP 1165524A JP 16552489 A JP16552489 A JP 16552489A JP H02188585 A JPH02188585 A JP H02188585A
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- C07H19/01—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規免疫抑制剤「デメチムノマイシンＪ
（Ｌ−６８３，７４２：又は３１−デスメトキシ−３１
−ヒドロキシ−Ｌ−６８３，５９０）、その製造のため
の微生物アクチノプラナセテ種（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎ
ａｃｅｔｅ ｓｐ、） （ＭＡ ６５５９ ） 、ＡＴ
ＣＣ第５３７７１号を利用した新規醗酵法に関連する。
（Ｌ−６８３，７４２：又は３１−デスメトキシ−３１
−ヒドロキシ−Ｌ−６８３，５９０）、その製造のため
の微生物アクチノプラナセテ種（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎ
ａｃｅｔｅ ｓｐ、） （ＭＡ ６５５９ ） 、ＡＴ
ＣＣ第５３７７１号を利用した新規醗酵法に関連する。
本方法は、Ｌ−６８３，５９０のＣ３１メトキシ基を脱
メチル化する条件下にて、Ｌ−６８３，５９０の存在下
に微生物を培養する事を特徴とする。更に又、自己免疫
病、感染病の治療及び／又は臓器移殖拒否反応の予防の
ためのヒト宿主に対するその使用法についても記述する
。
メチル化する条件下にて、Ｌ−６８３，５９０の存在下
に微生物を培養する事を特徴とする。更に又、自己免疫
病、感染病の治療及び／又は臓器移殖拒否反応の予防の
ためのヒト宿主に対するその使用法についても記述する
。
１９８３年、米国ＦＤＡはシクロスポリンを認可した。
これは非常に効果的な抗拒否反応剤であり、臓器移殖外
科の分野に革命的な変化を与えた。
科の分野に革命的な変化を与えた。
この剤は、体免疫系が移殖による外部タンパク質を拒否
するために、多量に蓄えられた内因性の防御因子が可動
するのを阻害する事により作用する。
するために、多量に蓄えられた内因性の防御因子が可動
するのを阻害する事により作用する。
この剤は、臓器移殖拒否反応を阻害するのに効果的であ
るけれども、多くの場合に非常に重い腎疾患、肝損傷及
び潰瘍を起こす欠点がある。
るけれども、多くの場合に非常に重い腎疾患、肝損傷及
び潰瘍を起こす欠点がある。
ここに引用するフジサワの一旦」−ΩｊΣ浩」１■ユ８
４１６２号には、シクロスポリンよりも１００倍効力が
あると評価される新規マクロライド免疫抑制剤ＦＫ−５
０６が記載されている。このマクロライドは、ス レプ
トマイセス・ツタバエンシス（Ｓｔｒｅ ｔｏｗ ｃｅ
ｓ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）の特定菌株の醗酵培養
により生産される。更に、Ｓ、ヒグロスコピクス亜種ヤ
クシマエンシス（Ｓ。
４１６２号には、シクロスポリンよりも１００倍効力が
あると評価される新規マクロライド免疫抑制剤ＦＫ−５
０６が記載されている。このマクロライドは、ス レプ
トマイセス・ツタバエンシス（Ｓｔｒｅ ｔｏｗ ｃｅ
ｓ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）の特定菌株の醗酵培養
により生産される。更に、Ｓ、ヒグロスコピクス亜種ヤ
クシマエンシス（Ｓ。
ｂ」エリ工５１μリエ５ｕｂｓｐ、−ｕ玉犯ゆ士す旦邸
ユリ−の生産スる、近縁関連マクロライド免疫抑制剤、
ＦＫ−５２０についても記載がある。
ユリ−の生産スる、近縁関連マクロライド免疫抑制剤、
ＦＫ−５２０についても記載がある。
り抗カビ剤「アスコマイシン（ａｓｃｏｍｙｃｉｎ）
Ｊが生産される事が記載されている。
Ｊが生産される事が記載されている。
しかしながら、いずれの免疫抑制剤製造の文献において
も、シクロスポリンの副作用を実質的に無くするという
記述はない。
も、シクロスポリンの副作用を実質的に無くするという
記述はない。
副作用の少ない、新規で、より安全な薬剤が、本分野で
常にさがし求められている。
常にさがし求められている。
微生物アクチップ−セ・−
Ａｃｔｉｎｏ １ａｎａｃｅｔｅ ｓ 、 （ＭＡ６
５５９ ） ＡＴＣＣＮα５３７７１をマクロライド免
疫抑制剤り−６８３，５９０と共に、窒素栄養含有炭水
化物培養液中、好気的深部培養により得る事ができる事
を発見した。この培養条件は、Ｌ−６８３，５９０のＣ
−３１位を選択的に脱メチル化するのに十分なｐＨ約７
で行なう。
５５９ ） ＡＴＣＣＮα５３７７１をマクロライド免
疫抑制剤り−６８３，５９０と共に、窒素栄養含有炭水
化物培養液中、好気的深部培養により得る事ができる事
を発見した。この培養条件は、Ｌ−６８３，５９０のＣ
−３１位を選択的に脱メチル化するのに十分なｐＨ約７
で行なう。
得られた「デメチムノマイシン」は、免疫抑制活性を有
する。すなわちカルシウムイオノホア（イオノマイシン
）とホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）によ
り誘発するＴ−細胞刺激検定（本明細書では「Ｔ−細胞
増殖検定」ということもある。）で示されるＴ−細胞活
性化の阻害が陽性である。
する。すなわちカルシウムイオノホア（イオノマイシン
）とホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）によ
り誘発するＴ−細胞刺激検定（本明細書では「Ｔ−細胞
増殖検定」ということもある。）で示されるＴ−細胞活
性化の阻害が陽性である。
本検定の原理はイオノマイシンとＰＭＡの併用で刺激し
たマウスＴリンパ細胞の増殖を測定するものである０本
検定において陽性の試料は、Ｔ−細胞増殖を阻害するが
、これはトリチウム化したチミジンの取り込み減少で示
される。
たマウスＴリンパ細胞の増殖を測定するものである０本
検定において陽性の試料は、Ｔ−細胞増殖を阻害するが
、これはトリチウム化したチミジンの取り込み減少で示
される。
本発明に従い、窒素栄養含有炭水化物培養液中で、アク
チノプラナセテ種（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎａｃｅｔｅ
ｓｐ、）菌株をＬ−６８３，５９０と共に十分な時間好
気的深部培養する工程から成ることを特徴とする、「デ
メチムノマイシン」と称する免疫抑制剤の製造方法が提
供される。
チノプラナセテ種（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎａｃｅｔｅ
ｓｐ、）菌株をＬ−６８３，５９０と共に十分な時間好
気的深部培養する工程から成ることを特徴とする、「デ
メチムノマイシン」と称する免疫抑制剤の製造方法が提
供される。
更に、Ｔ−細胞増殖検定によるＴ−細胞活性化阻害が陽
性であり、別添の第１図に示すようなプロトン核磁気共
鳴スペクトルを有する新規免疫抑制剤「デメチムノマイ
シン」が提供される。
性であり、別添の第１図に示すようなプロトン核磁気共
鳴スペクトルを有する新規免疫抑制剤「デメチムノマイ
シン」が提供される。
更に又、医薬的に許容される実質的に無毒性の担体又は
賦形剤と併用した、治療に効果的な量の「デメチムノマ
イシンＪを含有する薬剤組成物が提供される。
賦形剤と併用した、治療に効果的な量の「デメチムノマ
イシンＪを含有する薬剤組成物が提供される。
加うるに、治療に効果のある量の「デメチムノマイシン
」を投与する事を特徴とする、移殖拒否予防のためにヒ
ト宿主を治療し、又は自己免疫病もしくは感染病を治療
する方法が提供される。
」を投与する事を特徴とする、移殖拒否予防のためにヒ
ト宿主を治療し、又は自己免疫病もしくは感染病を治療
する方法が提供される。
本発明はＬ−６８３，５９０と共に、アクチノブーナセ
ー Ａｃｔｉｎｏ １ａｎａｃｅｔｅ ｓ 、）ＭＡ
６５５９を醗酵培養し「デメチムノマイシン」を生産
する事を特徴とする。この微生物は現在、Ａｍｅｒｉｃ
ａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
（メリーランド州、ロックビル市パークローンドラ
イブ１２３０１）でＡＴＣＣ第５３７７１号として、ま
たＭｅｒｃｋＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
にュージャージー州、ローウェイ）でＭＡ６５５９とし
て、制限寄託下にある。形態的、培養的、生物学的及び
生理学的特性を含む物理特性及び分類を以下に概説する
。
ー Ａｃｔｉｎｏ １ａｎａｃｅｔｅ ｓ 、）ＭＡ
６５５９を醗酵培養し「デメチムノマイシン」を生産
する事を特徴とする。この微生物は現在、Ａｍｅｒｉｃ
ａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
（メリーランド州、ロックビル市パークローンドラ
イブ１２３０１）でＡＴＣＣ第５３７７１号として、ま
たＭｅｒｃｋＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
にュージャージー州、ローウェイ）でＭＡ６５５９とし
て、制限寄託下にある。形態的、培養的、生物学的及び
生理学的特性を含む物理特性及び分類を以下に概説する
。
今までに行なわれた分類学的分析に基づき、培Ａｃｔｉ
ｎｏ １ａｎａｃｅａ）科に属するものと一時的に同定
された。更なる分類学的特性が属と種の中に本微生物を
位置づけるよう検討されている。
ｎｏ １ａｎａｃｅａ）科に属するものと一時的に同定
された。更なる分類学的特性が属と種の中に本微生物を
位置づけるよう検討されている。
本培養菌は、トリブチカーゼ大豆寒天培地（２８”及び
３７°Ｃ）、イーストモルト抽出物寒天培地、グリセロ
ールアスパラギン寒天培地、無機塩デンプン寒天培地、
オートミール寒天培地、Ｃｚａｐｅｋ Ｄｏｘ、 Ｃｚ
ａｐｅｋ溶液寒天培地、ペプトン寒天培地及びＢｅｎｎ
ｅｔｔ寒天培地（全て２８℃）を含む従来の培地上で良
く増殖する。
３７°Ｃ）、イーストモルト抽出物寒天培地、グリセロ
ールアスパラギン寒天培地、無機塩デンプン寒天培地、
オートミール寒天培地、Ｃｚａｐｅｋ Ｄｏｘ、 Ｃｚ
ａｐｅｋ溶液寒天培地、ペプトン寒天培地及びＢｅｎｎ
ｅｔｔ寒天培地（全て２８℃）を含む従来の培地上で良
く増殖する。
旭旭学−本培養菌は直径０．２〜０．４ ミクロンの分
枝フィラメント状菌糸体として増殖する。コロニーは不
透明で盛り上がり凹凸がある。コロニー構造は、イース
トモルト抽出物寒天培地上では弾力性があるが、菌糸の
有意な分裂が観察される他の培地では牛酪様の傾向にあ
る。コロニー表面は外見上粉状の傾向にある。分散性色
素は観察されない。
枝フィラメント状菌糸体として増殖する。コロニーは不
透明で盛り上がり凹凸がある。コロニー構造は、イース
トモルト抽出物寒天培地上では弾力性があるが、菌糸の
有意な分裂が観察される他の培地では牛酪様の傾向にあ
る。コロニー表面は外見上粉状の傾向にある。分散性色
素は観察されない。
胞ｊシへか一胞子のうば、主として球状で直径４〜２５
ミクロンの範囲にある。胞子のうは一般には２１日まで
に見られ、グリセロールアスパラギン寒天培地上では融
合する傾向にある。胞子は端が鈍な棒状であり（０，７
６Ｘ １．９ ミクロン）、運動性がなく、長くなり、
長さ１５０ミクロンまでは分枝しない。
ミクロンの範囲にある。胞子のうは一般には２１日まで
に見られ、グリセロールアスパラギン寒天培地上では融
合する傾向にある。胞子は端が鈍な棒状であり（０，７
６Ｘ １．９ ミクロン）、運動性がなく、長くなり、
長さ１５０ミクロンまでは分枝しない。
ペプチド−−イースト 寒 ＩＳＰ生長菌糸
は透明〜黄色であり、好気菌糸は２４〜７２時間で進展
し淡黄色〜バラ桃色であり外見上粉状である。反対側は
褐色〜赤褐色である。
は透明〜黄色であり、好気菌糸は２４〜７２時間で進展
し淡黄色〜バラ桃色であり外見上粉状である。反対側は
褐色〜赤褐色である。
オートミール ＩＳＰ ３生長菌糸は透
明〜黄色であり反対側は透明〜褐色である。好気生長菌
糸は白色〜淡バラベージュ色で外見上粉状である。
明〜黄色であり反対側は透明〜褐色である。好気生長菌
糸は白色〜淡バラベージュ色で外見上粉状である。
鉦 −デンプン ＩＳＰ ４光生長、不
完全好気的菌糸、生長菌糸は透明で、分裂が多い。デン
プンの透明化がコロニーの周囲で、７日経過までに顕著
となる。
完全好気的菌糸、生長菌糸は透明で、分裂が多い。デン
プンの透明化がコロニーの周囲で、７日経過までに顕著
となる。
グ１セロ−ルアスパーギン ｌ５Ｐｉ）
生長菌糸は透明〜黄色で、反対側は透明〜黄褐色である
。好気菌糸は粉状で白色〜バラ桃色である。
。好気菌糸は粉状で白色〜バラ桃色である。
生長菌糸は褐色である。好気的な増殖は認められず、メ
ラノイド色素は生産されない。
ラノイド色素は生産されない。
チロシン寒 ＩＳＰ ７
生長菌糸は褐色で培養が進むにつれて深紫色となる。好
気的菌糸はベルベット状〜灰色調バラーベージュ色であ
る。
気的菌糸はベルベット状〜灰色調バラーベージュ色であ
る。
Ｃｚａ ｅｋ−Ｄｏｘ ＩＫ Ｐ！
生長菌糸は、培養が進むにつれて桃色調褐色である。好
気的菌糸は短く、もつれて、分泌物が発現する。
気的菌糸は短く、もつれて、分泌物が発現する。
本発明の方法は多くのアクチップ−セールｃｔｉｎｏ
１ａｎａｃｅｔｅ ｓ 、の「デメチムノマイシン生産
」菌株を用いて実施できる。特にＡＴＣＣ第５３７７１
号株が望ましい。
１ａｎａｃｅｔｅ ｓ 、の「デメチムノマイシン生産
」菌株を用いて実施できる。特にＡＴＣＣ第５３７７１
号株が望ましい。
一般に「デメチムノマイシン」はデメチムノマイシン物
質生産菌株を同化できる炭素及び窒素源を含む栄養培養
液中で培養（醗酵）して製造する事ができるが、好気的
深部培養条件（例えば振とう培養、深部培養等）で行な
うのが望ましい。培養液は培養開始時及び終了時（収穫
時）のｐＨを約７に保つ事が望ましい。ｐＨが高いと実
質的及び／又は全体の生成物が損失する。所望されるｐ
旧よモルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、モルホリ
ノプロパンスルホン酸（ＭＯＰ Ｓ ）の如き緩衝液の
使用又は以下に示す生産培地の如き、固有に緩衝性を持
つ栄養物を選択する事により保つ事ができる。
質生産菌株を同化できる炭素及び窒素源を含む栄養培養
液中で培養（醗酵）して製造する事ができるが、好気的
深部培養条件（例えば振とう培養、深部培養等）で行な
うのが望ましい。培養液は培養開始時及び終了時（収穫
時）のｐＨを約７に保つ事が望ましい。ｐＨが高いと実
質的及び／又は全体の生成物が損失する。所望されるｐ
旧よモルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、モルホリ
ノプロパンスルホン酸（ＭＯＰ Ｓ ）の如き緩衝液の
使用又は以下に示す生産培地の如き、固有に緩衝性を持
つ栄養物を選択する事により保つ事ができる。
栄養培地中で所望される炭素源はグルコース、キシロー
ス、ガラクトース、グリセリン、デンプン、デキストリ
ン等の如き炭水化物である。加える事のできる他の炭素
源はマルトース、ラムノース、ラッフィノース、アラビ
ノース、マンノース、サリチン、コハク酸ナトリウム等
である。
ス、ガラクトース、グリセリン、デンプン、デキストリ
ン等の如き炭水化物である。加える事のできる他の炭素
源はマルトース、ラムノース、ラッフィノース、アラビ
ノース、マンノース、サリチン、コハク酸ナトリウム等
である。
所望される窒素源は、イースト抽出物、牛肉抽出物、ペ
プトン、グルテン粉、綿実粉、大豆粉及び他の野菜粉（
部分的又は全部脱脂）、カゼイン加水分解物、大豆加水
分解物及びイースト加水分解物、トウモロコシ浸出液、
乾燥イースト、小麦胚、羽粉、ビーナツツ粉、ジスチラ
ース・ソリューブルス等のみならず、アンモニウム塩（
例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム等）、尿素、アミノ酸等の如き無機及び有機
窒素化合物である。
プトン、グルテン粉、綿実粉、大豆粉及び他の野菜粉（
部分的又は全部脱脂）、カゼイン加水分解物、大豆加水
分解物及びイースト加水分解物、トウモロコシ浸出液、
乾燥イースト、小麦胚、羽粉、ビーナツツ粉、ジスチラ
ース・ソリューブルス等のみならず、アンモニウム塩（
例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム等）、尿素、アミノ酸等の如き無機及び有機
窒素化合物である。
炭素及び窒素源は利点を持って併用できるが、その純粋
な形で用いる必要がない。これは、完全に純粋でない物
質には、微量の増殖因子、かなりの量の無機栄養が含ま
れており、これを使用するのが望ましいためである。必
要ならば、炭酸ナトリウム又はカルシウム、リン酸ナト
リウム又はカリウム、塩化ナトリウム又はカリウム、ヨ
ウ化ナトリウム又はカリウム、マグネシウム塩、銅塩、
コバルト塩等の如き無機塩を培地に加える事ができる。
な形で用いる必要がない。これは、完全に純粋でない物
質には、微量の増殖因子、かなりの量の無機栄養が含ま
れており、これを使用するのが望ましいためである。必
要ならば、炭酸ナトリウム又はカルシウム、リン酸ナト
リウム又はカリウム、塩化ナトリウム又はカリウム、ヨ
ウ化ナトリウム又はカリウム、マグネシウム塩、銅塩、
コバルト塩等の如き無機塩を培地に加える事ができる。
必要なら特に培養培地がはげしく泡立つ場合、流動パラ
フィン、脂油、植物油、鉱油、又はシリコンの如き消泡
剤を加える事ができる。
フィン、脂油、植物油、鉱油、又はシリコンの如き消泡
剤を加える事ができる。
Ｌ−６８３，５９０の出発物質は、米国特許第３．２４
４，５９２に記載の如く、Ｓ、ヒグロスコピクス
アスコマイセティクス Ｓ。
４，５９２に記載の如く、Ｓ、ヒグロスコピクス
アスコマイセティクス Ｓ。
ｈ ｒｏｓｃｏ １ｃｕｓ ｖａｒ、ａｓｃｏｔ
ｎ ｃｅｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣＮａ１４８９１の醗酵培
養、及びフジサワのＥＰＯ公告番号０１８４１６２ （
本特定の目的のため参考文献としてここに引用）に記載
の如く主−見ｌ旦−６８３，５９０と同定するＦＲ−９
００５２０又はＦＫ−５２０を生産する）の醗酵培養に
より得る事ができる。
ｎ ｃｅｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣＮａ１４８９１の醗酵培
養、及びフジサワのＥＰＯ公告番号０１８４１６２ （
本特定の目的のため参考文献としてここに引用）に記載
の如く主−見ｌ旦−６８３，５９０と同定するＦＲ−９
００５２０又はＦＫ−５２０を生産する）の醗酵培養に
より得る事ができる。
大量にデメチムノマイシンを製造するための条件として
、好気的深部培養条件が望ましい。少量の製造には、フ
ラスコ又はビン中にて、振とう又は表面培養する。更に
、増殖を大型タンク中で行なう場合、デメチムノマイシ
ン製造工程で、増殖の遅延を防ぐため、タンク中に接種
するための微生物の増殖物を用いるのが望ましい。した
がって、最初比較的少量の培養液に、スラント中で生産
した微生物の胞子又は菌糸を接種し、この接種物、いわ
ゆる１種培地」を培養した後、培養増殖物を無菌的に大
量タンクに移すのが望ましい。接種菌を生産する培養培
地はデメチムノマイシンの製造に用いる培地と実質的に
同一か又は異なるものであり、−船釣に接種に先だって
、オートクレーブで培地を殺菌する。培地のｐＨは一般
に、オートクレーブで殺菌する前に酸又は塩基を加えて
約７．０にするが、この場合緩衝液の形が望ましい。
、好気的深部培養条件が望ましい。少量の製造には、フ
ラスコ又はビン中にて、振とう又は表面培養する。更に
、増殖を大型タンク中で行なう場合、デメチムノマイシ
ン製造工程で、増殖の遅延を防ぐため、タンク中に接種
するための微生物の増殖物を用いるのが望ましい。した
がって、最初比較的少量の培養液に、スラント中で生産
した微生物の胞子又は菌糸を接種し、この接種物、いわ
ゆる１種培地」を培養した後、培養増殖物を無菌的に大
量タンクに移すのが望ましい。接種菌を生産する培養培
地はデメチムノマイシンの製造に用いる培地と実質的に
同一か又は異なるものであり、−船釣に接種に先だって
、オートクレーブで培地を殺菌する。培地のｐＨは一般
に、オートクレーブで殺菌する前に酸又は塩基を加えて
約７．０にするが、この場合緩衝液の形が望ましい。
培養混合物の攪拌と通気は種々の方法で行なう事ができ
る。攪拌はプロペラ又は類似の機械的攪拌装置、ファー
メンタ−の回転又は振とう、種々のポンプ装置又は培地
への無菌空気の通風により行なう事ができる０通気は、
醗酵培養混合物に無菌空気を通風すると効果的である。
る。攪拌はプロペラ又は類似の機械的攪拌装置、ファー
メンタ−の回転又は振とう、種々のポンプ装置又は培地
への無菌空気の通風により行なう事ができる０通気は、
醗酵培養混合物に無菌空気を通風すると効果的である。
醗酵培養は一般に約２０℃〜４０℃で行なわれるが、２
５〜３５℃が望ましく、約１０時間〜２０時間行なう、
これは培養条件と培養量により変化する。生産培養物は
回転振とう機で、２２Ｏｒｐｍにて、２７゛Ｃで約１７
時間インキュベートする。この間、培地のｐＨは７．０
に保って収穫する。
５〜３５℃が望ましく、約１０時間〜２０時間行なう、
これは培養条件と培養量により変化する。生産培養物は
回転振とう機で、２２Ｏｒｐｍにて、２７゛Ｃで約１７
時間インキュベートする。この間、培地のｐＨは７．０
に保って収穫する。
醗酵培養を行なうために望ましい培養／生産培地は以下
の培地である。
の培地である。
種１１１Ｎ
デキストロース
デキストリン
牛肉抽出物
アルブミンｐＨ
ＮＺアミンＥ型
Ｍｇ５Ｏａ ・７１１，０
Ｋｚｕｐｏ＜
ｐＨ７，１に調節
ＣａＣ０ｚ ０．５ ｇ／ ｌを加える。
炎撓隻壇旦
グルコース
ハイカーゼＳＦ
牛肉抽出物
トウモロコシ浸出液
ｐｔｔ ｖ、ｏに調節
炎換豊並旦
マンニトール
グリセロール
ハイカーゼＳＦ
１６Ｌ
１．０
１０．０
３．０
５．０
５．０
０．０５
０．３７
牛肉抽出物 １トウモロコシ浸
出液 ３ｐＨ７，０に調節 生産されたデメチムノマイシンは他の既知の生物活性物
質を得るのに一般に用いられている従来の方法で培養培
地から取り出す事ができる。生産されたデメチムノマイ
シンは培養菌体及び濾液中で検出される。したがって菌
体及び濾液から単離精製でき、培養液の濾過又は遠心、
従来の減圧濃縮、凍結乾燥、メタノールの如き従来の溶
媒による抽出、ｐＨ調節、従来の樹脂処理（例えば、ア
ニオン又はカチオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等）
、従来の吸着剤による処理（例えば、活性炭、ケイ酸、
シリカゲル、セルロース、アルミナ等）、結晶化、再結
晶等により得られる。所望される方法は溶媒、特にメタ
ノールを用いた抽出である。
出液 ３ｐＨ７，０に調節 生産されたデメチムノマイシンは他の既知の生物活性物
質を得るのに一般に用いられている従来の方法で培養培
地から取り出す事ができる。生産されたデメチムノマイ
シンは培養菌体及び濾液中で検出される。したがって菌
体及び濾液から単離精製でき、培養液の濾過又は遠心、
従来の減圧濃縮、凍結乾燥、メタノールの如き従来の溶
媒による抽出、ｐＨ調節、従来の樹脂処理（例えば、ア
ニオン又はカチオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等）
、従来の吸着剤による処理（例えば、活性炭、ケイ酸、
シリカゲル、セルロース、アルミナ等）、結晶化、再結
晶等により得られる。所望される方法は溶媒、特にメタ
ノールを用いた抽出である。
醗酵培養により得られるデメチムノマイシン生成物は「
Ｔ−細胞増殖検定」により免疫抑制活性を有し、これに
基づき利用性があり、以下に示す物性を有する。
Ｔ−細胞増殖検定」により免疫抑制活性を有し、これに
基づき利用性があり、以下に示す物性を有する。
１、 白色無定形粉末
２、 メタノールに可溶
３、ＦＡＢマススペクトルにより決定した分子量７７７
（Ｍ＋Ｌｉ＝７８４を観察）は別添の図３の同定構造
と合致し、Ｌ−６８３，５９０から１４マス単位、Ｃｔ
＋Ｚ基の脱離に対応する。
（Ｍ＋Ｌｉ＝７８４を観察）は別添の図３の同定構造
と合致し、Ｌ−６８３，５９０から１４マス単位、Ｃｔ
＋Ｚ基の脱離に対応する。
同定したデメチムノマイシン構造（別添図３）の主要な
ＮＭＲ特性は別添図２から別添図１へのメトキシシグナ
ルの消失である。 ３．１ｐｐ＋ｍ近辺の特徴的化学
シフトでＨ−３１共鳴の消失と関連する。 ＯＨと結合
するＣＨは一般にＣＩ−ＱＣ）ｌ！に比べて０．１〜０
．３ ｐｐｔａ低磁場シフトするので、３１メチルが失
われ、Ｈ−３１が、Ｈ−１３、Ｈ−２１゜Ｈ−３３、残
りのメトキシル基を含む３．３−３．５ｐｐｖａのマル
チブレット中に移行したと考えるのは妥当である。更に
Ｃ−１３又はＣ−１５よりもむしろＣ−３１のメトキシ
ルが消失したものと帰属する根拠は、別添図１のＨ−１
４及びＨ−１５の化学シフトが別添図２における親分子
中のものと一致するという事実である。又、新しい共鳴
が観察されず、Ｈ−２からＨ−２８のすべての認識可能
なプロトンシグナルが、事実上Ｌ−６８３，５９０のも
のと重ね合わせられる事から、Ｃ−３１脱メチル化が唯
一の構造変化と推定する事も妥当である。
ＮＭＲ特性は別添図２から別添図１へのメトキシシグナ
ルの消失である。 ３．１ｐｐ＋ｍ近辺の特徴的化学
シフトでＨ−３１共鳴の消失と関連する。 ＯＨと結合
するＣＨは一般にＣＩ−ＱＣ）ｌ！に比べて０．１〜０
．３ ｐｐｔａ低磁場シフトするので、３１メチルが失
われ、Ｈ−３１が、Ｈ−１３、Ｈ−２１゜Ｈ−３３、残
りのメトキシル基を含む３．３−３．５ｐｐｖａのマル
チブレット中に移行したと考えるのは妥当である。更に
Ｃ−１３又はＣ−１５よりもむしろＣ−３１のメトキシ
ルが消失したものと帰属する根拠は、別添図１のＨ−１
４及びＨ−１５の化学シフトが別添図２における親分子
中のものと一致するという事実である。又、新しい共鳴
が観察されず、Ｈ−２からＨ−２８のすべての認識可能
なプロトンシグナルが、事実上Ｌ−６８３，５９０のも
のと重ね合わせられる事から、Ｃ−３１脱メチル化が唯
一の構造変化と推定する事も妥当である。
上述の醗酵培養に従って得られたデメチムノマイシンは
、例えば、抽出、沈澱、分別結晶化、再結晶、クロマト
グラフィー等の従来の方法により単離精製できる。
、例えば、抽出、沈澱、分別結晶化、再結晶、クロマト
グラフィー等の従来の方法により単離精製できる。
本物質の望ましい塩は、例えばアルカリ金属塩（例えば
、ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩
（例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等）、アンモニ
ウム塩、アミン塩（例えばトリエチルアミン塩、Ｎ−ベ
ンジル−Ｎ−メチルアミン塩等）及び他の従来の有機塩
等の塩基性塩の如き医薬として所望される塩である゛。
、ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩
（例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等）、アンモニ
ウム塩、アミン塩（例えばトリエチルアミン塩、Ｎ−ベ
ンジル−Ｎ−メチルアミン塩等）及び他の従来の有機塩
等の塩基性塩の如き医薬として所望される塩である゛。
前述の醗酵反応及び、そこでの醗酵混合物の後処理の段
階において、デメチムノマイシンの不整炭素又は二重結
合のため、幾何異性体及び／又は立体異性体が、場合に
より、他の幾何異性体及び／又は立体異性体に変換する
事があり、この場合も本発明の態様の範囲内にある事に
注意されたい。
階において、デメチムノマイシンの不整炭素又は二重結
合のため、幾何異性体及び／又は立体異性体が、場合に
より、他の幾何異性体及び／又は立体異性体に変換する
事があり、この場合も本発明の態様の範囲内にある事に
注意されたい。
本発明のデメチムノマイシンは免疫抑制活性、抗菌活性
等の如き薬理学的活性を有する。それ故、心臓、腎臓、
肝臓、骨髄、皮膚等の如き臓器又は組織移殖拒否反応、
骨髄移殖による移殖一対−宿主病、リウマチ関節炎、全
身紅斑性狼疹、ハシモト甲状腺炎、多発性硬化症、重症
性筋無力症、Ｉ型糖尿病、葡萄脱炎等の如き自己免疫病
の予防及び治療に有用である。
等の如き薬理学的活性を有する。それ故、心臓、腎臓、
肝臓、骨髄、皮膚等の如き臓器又は組織移殖拒否反応、
骨髄移殖による移殖一対−宿主病、リウマチ関節炎、全
身紅斑性狼疹、ハシモト甲状腺炎、多発性硬化症、重症
性筋無力症、Ｉ型糖尿病、葡萄脱炎等の如き自己免疫病
の予防及び治療に有用である。
本発明の薬剤組成物は、例えば、固形、半固形、液体の
如き製剤形で用いる事ができ、活性成分としてその中に
本発明のデメチムノマイシンを、内用又は外用薬に望ま
しい有機又は無機担体又は賦形薬と混合して用いる事が
できる。活性成分は例えば、一般に用いられる無毒性薬
剤担体と混合して錠剤、乳剤、カプセル、生薬、溶液、
乳剤、懸濁剤及び他の望ましい形にする事ができる。用
いる事のできる担体は水、グルコース、乳糖、アラビア
ゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンペースト、マ
グネシウムトリシリケート、タルク、トウモロコシデン
プン、ケラチン、コロイド状シリカ、ポテトデンプン、
尿素及び製剤を製造するのに望ましい他の担体の如き、
固形、半固形、又は液体形であり、更に補助剤、安定剤
、濃厚化剤及び着色剤及び香料を用いる事ができる。本
活性化合物は病気の過程又は症状に望ましい効果を得る
のに十分な量を薬剤組成物中に含有せしめる。
如き製剤形で用いる事ができ、活性成分としてその中に
本発明のデメチムノマイシンを、内用又は外用薬に望ま
しい有機又は無機担体又は賦形薬と混合して用いる事が
できる。活性成分は例えば、一般に用いられる無毒性薬
剤担体と混合して錠剤、乳剤、カプセル、生薬、溶液、
乳剤、懸濁剤及び他の望ましい形にする事ができる。用
いる事のできる担体は水、グルコース、乳糖、アラビア
ゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンペースト、マ
グネシウムトリシリケート、タルク、トウモロコシデン
プン、ケラチン、コロイド状シリカ、ポテトデンプン、
尿素及び製剤を製造するのに望ましい他の担体の如き、
固形、半固形、又は液体形であり、更に補助剤、安定剤
、濃厚化剤及び着色剤及び香料を用いる事ができる。本
活性化合物は病気の過程又は症状に望ましい効果を得る
のに十分な量を薬剤組成物中に含有せしめる。
本組成物をヒトに適用するためには、非経口的又は経腸
的に適用するのが望ましい。治療効果のある量のデメチ
ムノマイシンの投与量は、治療する個々の患者の年令、
及び症状に依存して変化するのが、一般に活性成分の１
日投与量は７０ｋｇのヒトに基づいて計算すると、病気
の治療に約０．０１〜１０００■であり、０．１〜５０
０■が望ましく、０．５〜１００■を投与するのが更に
望ましい。
的に適用するのが望ましい。治療効果のある量のデメチ
ムノマイシンの投与量は、治療する個々の患者の年令、
及び症状に依存して変化するのが、一般に活性成分の１
日投与量は７０ｋｇのヒトに基づいて計算すると、病気
の治療に約０．０１〜１０００■であり、０．１〜５０
０■が望ましく、０．５〜１００■を投与するのが更に
望ましい。
般に約０ 、５ ｍｇ 、 １■、５■、１０■、５０
■、１００■、２５０■、及び５００■の平均の単一投
与量で投与する。
■、１００■、２５０■、及び５００■の平均の単一投
与量で投与する。
以下の実施例は本発明を例示する目的で示すものであり
、本発明の態様と精神を限定するものと解釈すべきでは
ない。
、本発明の態様と精神を限定するものと解釈すべきでは
ない。
オートクレーブで滅菌した、デキストリン１０．０％、
デキストロース１．０％、牛肉エキス３．０％、アルダ
ミンｐＨ（イーストプロダクト社）５．０％、Ｎ−Ｚ７
ミ７Ｅ型５．０％、Ｍｇ５Ｏｎ ・７８ｚ０ ０．０
５％、にＨｚＰＯ４０，３７％、及びＣａＣ０：＋ ｏ
、ｓ％（ダラム単位／ｌ）から成る５０−の種培地を入
れた２５０ｄバツフルを付けた振とう用フラスコに、凍
結乾燥した培養菌（ＭＡ ６５５９ ） ＡＴ ＣＣＮ
０．５３７７１を用いて接種した。オートクレーブ前に
種培地のｐｉを７．１に調節した。回転振とう機上、２
２０ ｒｐｍにて、２７℃で４８時間種菌を培養した。
デキストロース１．０％、牛肉エキス３．０％、アルダ
ミンｐＨ（イーストプロダクト社）５．０％、Ｎ−Ｚ７
ミ７Ｅ型５．０％、Ｍｇ５Ｏｎ ・７８ｚ０ ０．０
５％、にＨｚＰＯ４０，３７％、及びＣａＣ０：＋ ｏ
、ｓ％（ダラム単位／ｌ）から成る５０−の種培地を入
れた２５０ｄバツフルを付けた振とう用フラスコに、凍
結乾燥した培養菌（ＭＡ ６５５９ ） ＡＴ ＣＣＮ
０．５３７７１を用いて接種した。オートクレーブ前に
種培地のｐｉを７．１に調節した。回転振とう機上、２
２０ ｒｐｍにて、２７℃で４８時間種菌を培養した。
あるいは又、凍結した成長菌糸又はスラント源を用いる
場合は、培養は２２Ｏｒｐｍにて２７℃で２４時間イン
キュベートする。得られた種培養物を２．５ｄずつ、あ
らかじめオートクレーブで滅菌した変換培地８５０ｄを
入れたバッフルを付けない２５０ｄの振とう用フラスコ
中に接種した。最終濃度を０．１■／ｄになるように、
Ｌ−６８３，５９０をジメチルスルホキサイド溶液とし
て加え入れた。
場合は、培養は２２Ｏｒｐｍにて２７℃で２４時間イン
キュベートする。得られた種培養物を２．５ｄずつ、あ
らかじめオートクレーブで滅菌した変換培地８５０ｄを
入れたバッフルを付けない２５０ｄの振とう用フラスコ
中に接種した。最終濃度を０．１■／ｄになるように、
Ｌ−６８３，５９０をジメチルスルホキサイド溶液とし
て加え入れた。
続いて、振とうフラスコを回転振とう機上２２Ｏｒｐｍ
にて１８時間２７℃でインキュベートした。
にて１８時間２７℃でインキュベートした。
１、変換培地Ｂはグルコース１０．０、ハイカーゼＳＦ
２．０、牛肉抽出物１．Ｑ、トウモロコシ浸出液３．０
（グラム／リットル）から成り、オートクレーブで滅菌
前にｐＨを７．０に調節した。
２．０、牛肉抽出物１．Ｑ、トウモロコシ浸出液３．０
（グラム／リットル）から成り、オートクレーブで滅菌
前にｐＨを７．０に調節した。
■ ″か゛の び ！
変換培地Ｂの培養濾液全体（１００ｄ）をメチレンクロ
ライドで３回抽出した（３Ｘ１００ＩｎＩｌ）。
ライドで３回抽出した（３Ｘ１００ＩｎＩｌ）。
メチレンクロライド抽出液を合併し、硫酸ナトリウムで
乾燥後真空上濃縮して油状残渣を得た。残渣をアセトニ
トリルに溶かし、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）で精製した。−ＨＰＬＣは、Ｗｈａｔａ＋ａｎ Ｐ
ａｒｔｉｓｉｌ １０ ０ Ｄ Ｓ−３，９，４Ｍ
Ｘ ２５ ａａカラムを用い、２０５ｎｍ及び２２５ｎ
ｍで６０℃にてモニターした。カラムは３０分間で０．
１％■、Ｐ０４水−ＣＨ３ＣＮ 、 ４５ ： ５５か
ら０．１％Ｈ３Ｐ０．水−ＣＨ３ＣＮ ２０ ： ８０
まで直線濃度こう配にて展開した。上述抽出物をくり返
し注入して化合物を分取した。保持時間２４分の分画を
集めｐＨ６，５に調節後アセトニトリルを留去した。更
に、Ｃｐｓ ５ｅｐ−Ｐａｋ （Ｗａｔｅｒｓ Ａｓ５
ｏｃｉａｔｉｏｎ）を用い、アセトニトリル−水流出液
にて化合物を精製しＬ−６８３，４２２、「デメチムノ
マイシン」と命名した生成物を１．４ｍｇ得た。変換培
地Ｃを用いても同様の結果を得た。
乾燥後真空上濃縮して油状残渣を得た。残渣をアセトニ
トリルに溶かし、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）で精製した。−ＨＰＬＣは、Ｗｈａｔａ＋ａｎ Ｐ
ａｒｔｉｓｉｌ １０ ０ Ｄ Ｓ−３，９，４Ｍ
Ｘ ２５ ａａカラムを用い、２０５ｎｍ及び２２５ｎ
ｍで６０℃にてモニターした。カラムは３０分間で０．
１％■、Ｐ０４水−ＣＨ３ＣＮ 、 ４５ ： ５５か
ら０．１％Ｈ３Ｐ０．水−ＣＨ３ＣＮ ２０ ： ８０
まで直線濃度こう配にて展開した。上述抽出物をくり返
し注入して化合物を分取した。保持時間２４分の分画を
集めｐＨ６，５に調節後アセトニトリルを留去した。更
に、Ｃｐｓ ５ｅｐ−Ｐａｋ （Ｗａｔｅｒｓ Ａｓ５
ｏｃｉａｔｉｏｎ）を用い、アセトニトリル−水流出液
にて化合物を精製しＬ−６８３，４２２、「デメチムノ
マイシン」と命名した生成物を１．４ｍｇ得た。変換培
地Ｃを用いても同様の結果を得た。
立性上
デメチムノマイシンは、ＮＭＲスペクトロメトリーによ
り、特性化し、別添図１のＮＭＲスペクトルを得た。帰
属分子構造を別添図３に示す。
り、特性化し、別添図１のＮＭＲスペクトルを得た。帰
属分子構造を別添図３に示す。
１、 試圭口」級
上述ＨＰＬＣで製造した精製デメチムノマイシンを１■
／−濃度で無水エタノールに溶かした。
／−濃度で無水エタノールに溶かした。
２、 ｕ
Ｃ５７Ｂ１／６マウスの肺臓を無菌的に取り、１０％熱
処理不活性化生胎児血清（Ｇ Ｉ ＢＧＯ。
処理不活性化生胎児血清（Ｇ Ｉ ＢＧＯ。
Ｇｒａｎｄ ｌ５ｌａｎｄ、 Ｎ、Ｙ、）を加えた氷冷
ＲＰＭ１１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）中に、静かに分散
させた。
ＲＰＭ１１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）中に、静かに分散
させた。
１５００ｒｐ＋ｍにて８分間遠心し細胞をベレット状に
した。ペレットを塩化アンモニウム分解緩衝液（ＧＩＢ
ＣＯ）と４°Ｃ１２分間処理し、混在する赤血球細胞を
除いた。冷却培養液を加え、細胞を再び１５００ｒｐｍ
にて８分間遠心した。次に、以下に示すナイロンウール
カラムにて細胞懸濁液を分離し、Ｔ−リンパ球を単離し
た。ナイロンウールカラムは２０−のプラスチックシリ
ンジ中に約４ｇの洗浄し乾燥したナイロンウールを充て
んして作製した。カラムは２５０”Ｆ、３０分間オート
クレーブにて滅菌した。ナイロンウールカラムを加温し
た（３７℃）培地で湿らせ、同じ培地でゆすいだ、加温
した培地中に再び懸濁させた洗浄肺臓細胞をナイロンウ
ールカラムにゆっクリ乗せ、３７℃で１時間、垂直にし
てインキュベートした。
した。ペレットを塩化アンモニウム分解緩衝液（ＧＩＢ
ＣＯ）と４°Ｃ１２分間処理し、混在する赤血球細胞を
除いた。冷却培養液を加え、細胞を再び１５００ｒｐｍ
にて８分間遠心した。次に、以下に示すナイロンウール
カラムにて細胞懸濁液を分離し、Ｔ−リンパ球を単離し
た。ナイロンウールカラムは２０−のプラスチックシリ
ンジ中に約４ｇの洗浄し乾燥したナイロンウールを充て
んして作製した。カラムは２５０”Ｆ、３０分間オート
クレーブにて滅菌した。ナイロンウールカラムを加温し
た（３７℃）培地で湿らせ、同じ培地でゆすいだ、加温
した培地中に再び懸濁させた洗浄肺臓細胞をナイロンウ
ールカラムにゆっクリ乗せ、３７℃で１時間、垂直にし
てインキュベートした。
非吸着Ｔリンパ球が加温培地によりカラムから流出した
。細胞懸濁液を上述の如く遠心した。
。細胞懸濁液を上述の如く遠心した。
精製したＴリンパ球をｌＯ％熱処理不活性化生胎児血清
、１００ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム
、２Ｘ１０−’Ｍ ２−メルカプトエタノール及び５
ｅｐｇ／ｄゲンタマイシン含有のＲＰＭ１１６４０培地
がら成る完全培地中に２．５Ｘ１０’細胞／Ｍ１で再び
懸濁させた。イオノマイシンを２５０ｎｇ／ｄ、ＰＭＡ
を１０ｎｇ、／ｄ加えた。細胞懸濁液をすぐに９６穴の
平板底マイクロカルチャープレート（Ｃｏｓ ｔａｒ）
に２００μ！／穴ずつ分配した。対照としての検定薬物
のない培養液及び検定すべき以下に示す試料の種々の希
釈物（上述の精製デメチムノマイシン）を２０μｌ／穴
で３穴ずつトリブリケートで加えた。Ｌ−６７９，９３
４を基準として用いた。培養プレートを５％ＣＯ□−９
５％空気の湿潤環境下、３７℃で４４時間インキエベー
トした。Ｔリンパ球の増殖はトリチウム化チミジンの取
り込みの測定で調べた。４４時間培養後、細胞をトリチ
ウム標識チミジン（ＮＥＮ、 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、
ＭＡ）で２ｐｃｉ／穴ずつパルス標識した。さらに４時
間インキュベート後、マルチプル試料収集機を用い、グ
ラスファイバー濾紙上に培養物を集めた０個々の穴に対
応する濾紙ディスクの放射活性を基本的液体シンチレー
シッン測定法により測定した（ベータカウンター）。重
複して検定した穴毎の１分間のカウント数（ｃｐｌｌ）
の平均を計算し、結果は以下の如くトリチウム化チミジ
ン取り込み（増殖）のパーセント阻害として表わした。
、１００ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム
、２Ｘ１０−’Ｍ ２−メルカプトエタノール及び５
ｅｐｇ／ｄゲンタマイシン含有のＲＰＭ１１６４０培地
がら成る完全培地中に２．５Ｘ１０’細胞／Ｍ１で再び
懸濁させた。イオノマイシンを２５０ｎｇ／ｄ、ＰＭＡ
を１０ｎｇ、／ｄ加えた。細胞懸濁液をすぐに９６穴の
平板底マイクロカルチャープレート（Ｃｏｓ ｔａｒ）
に２００μ！／穴ずつ分配した。対照としての検定薬物
のない培養液及び検定すべき以下に示す試料の種々の希
釈物（上述の精製デメチムノマイシン）を２０μｌ／穴
で３穴ずつトリブリケートで加えた。Ｌ−６７９，９３
４を基準として用いた。培養プレートを５％ＣＯ□−９
５％空気の湿潤環境下、３７℃で４４時間インキエベー
トした。Ｔリンパ球の増殖はトリチウム化チミジンの取
り込みの測定で調べた。４４時間培養後、細胞をトリチ
ウム標識チミジン（ＮＥＮ、 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、
ＭＡ）で２ｐｃｉ／穴ずつパルス標識した。さらに４時
間インキュベート後、マルチプル試料収集機を用い、グ
ラスファイバー濾紙上に培養物を集めた０個々の穴に対
応する濾紙ディスクの放射活性を基本的液体シンチレー
シッン測定法により測定した（ベータカウンター）。重
複して検定した穴毎の１分間のカウント数（ｃｐｌｌ）
の平均を計算し、結果は以下の如くトリチウム化チミジ
ン取り込み（増殖）のパーセント阻害として表わした。
デメチムノマイシンの種々の濃度での％阻害の結果を以
下の表に示す。
下の表に示す。
６．６
４．４
１．９
１．３
９８．６
９７．９
９１．９
７２．１
３８．２
０．９
９．０
０．６
注 １．マウスＴ細胞培養物は４８時間後に収集する前
の４時間前に３Ｈ−チミジンでパルス標識した。
の４時間前に３Ｈ−チミジンでパルス標識した。
２、基準のＬ−６７９，９３４（１０ａｇ／ｌｌ１１）
は９９％阻害を示した。
は９９％阻害を示した。
３、 デメチムノマイシン、（Ｌ −６３８７４２）は
Ｉ Ｃ５ａ−１，４ｎｇ／ ｄ＝１．８１ ｎ Ｍ、一
般には１．６〜１．９ Ｘ １０−’モルの範囲である
。
Ｉ Ｃ５ａ−１，４ｎｇ／ ｄ＝１．８１ ｎ Ｍ、一
般には１．６〜１．９ Ｘ １０−’モルの範囲である
。
４、 デメチムノマイシンによるＴ−細胞増殖阻害は培
養開始時に５０μ／ｄのＩＬ−２（遺伝子組換えにより
作製した細胞系により出来たＩＬ−２）を添加すると逆
転する。
養開始時に５０μ／ｄのＩＬ−２（遺伝子組換えにより
作製した細胞系により出来たＩＬ−２）を添加すると逆
転する。
第１図はＣＤ（／！、中４００ＭＨ２で測定した「デメ
チムノマイシン」のＩＨ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクト
ルである。 第２図はＣＤＣｆｊ中４００ＭＨｚで測定したし−６８
３，５９０のＩＨＮＭＲスペクトルである。 第３図は同定した［デメチムノマイシン」の分子構造で
ある。 図面の浄書（内容に変更なし） 手続補正書 （方式） 別紙の通り、 正式図面１通を提出致します。 平成１年１０月２４日
チムノマイシン」のＩＨ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクト
ルである。 第２図はＣＤＣｆｊ中４００ＭＨｚで測定したし−６８
３，５９０のＩＨＮＭＲスペクトルである。 第３図は同定した［デメチムノマイシン」の分子構造で
ある。 図面の浄書（内容に変更なし） 手続補正書 （方式） 別紙の通り、 正式図面１通を提出致します。 平成１年１０月２４日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、窒素栄養含有炭水化物培養液中、好気的深部培養条
件下、Ｌ−６８３、５９０と共に、アクチノプラナセテ
種菌株を十分な時間培養する工程から成ることを特徴と
する、デメチムノマイシンと称する免疫抑制剤の製造方
法。 ２、上記微生物がＡＴＣＣ第５３７７１号である請求項
１記載の方法。 ３、上記培地が、グルコース、ハイカーゼＨＦ、牛肉抽
出物、及びトウモロコシ浸出液を含有する、培地Ｂと称
する醗酵培地である請求項１記載の方法。 ４、上記培地が、マンニトール、グリセロール、ハイカ
ーゼＳｆ、牛肉抽出物、及びトウモロコシ浸出液を含有
する培地Ｃと称する醗酵培地である請求項１記載の方法
。 ５、請求項１記載の方法により得られたデメチムノマイ
シンを含有する醗酵液。 ６、請求項１記載の方法により生産された免疫抑制剤。 ７、Ｔ−細胞増殖検定によるＴ−細胞活性化阻害が陽性
、すなわちＩＣ＿５＿０が約１．６〜１．９×１０＾−
＾９モルであり、別添の第１図に示すようなプロトン核
磁気共鳴スペクトルを有する免疫抑制剤デメチムノマイ
シン。 ８、別添の第３図に示す分子構造を有する免疫抑制剤デ
メチムノマイシン。 ９、医薬的に許容される実質的に無毒性の担体又は賦形
剤と併用した治療に効果的な量のデメチムノマイシンを
含有する薬剤組成物。 １０、治療に効果のある量のデメチムノマイシンを投与
する事を特徴とする移殖拒否予防のためにヒト宿主を治
療し、又は自己免疫病もしくは感染病を治療する方法。
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