JPH02194360A - カルボキシル基含有重合体を含む免疫化学試験用剤 - Google Patents

カルボキシル基含有重合体を含む免疫化学試験用剤

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JPH02194360A
JPH02194360A JP1310822A JP31082289A JPH02194360A JP H02194360 A JPH02194360 A JP H02194360A JP 1310822 A JP1310822 A JP 1310822A JP 31082289 A JP31082289 A JP 31082289A JP H02194360 A JPH02194360 A JP H02194360A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物学的材料中の分析物質の免疫化学検出お
よび定量用の試剤に関し、この試剤はカルボキシル基含
有水溶性重合体である。
公知の免疫化学試験系では、タンパク質、多糖および／
または界面活性剤の添加物が使用される。これらは免疫
化学反応にはあずからないが、このような反応の結果に
有利な影響を与えるのに適している。
イムノアッセイたとえばＥＬＩＳＡでは、使用されるイ
ンキュベーション培地（緩衝溶液、インキュベーション
培地、接合緩衝液）の組成は、サンプル中の夾雑物質の
非特異的結合および／または同相への接合を防止するも
のでなければならない。タンパク質たとえばアルブミン
、ＩｇＧ、カゼイン、加水分解ゼラチンおよびそれらの
誘導体、タンパク質混合物、またはヒトもしくは動物血
清、ならびに界面活性剤のような既知の添加物は、この
ようなわけでインキュベ＝３＝ ＝４ −ション培地中に用いられる。
ラクトフェリン、ウシ胎仔血清、ポリオキシエチレン２
０−ソルビタンモノオレエート（Ｔｖｅｅｎ■２０）お
よび緩衝塩類を含有する、固相免疫化学試験用のインキ
ュベーション培地がドイツ特許第３，６３８，７６７号
に記載されている。
ポロキサマー類からの界面活性剤たとえばＰｌｕｒｏｎ
ｉｃ■Ｆ６８、ならびにボロキザミン類からの界面活性
剤たとえばＴｅｔｒｏｎｉｃ■７０７および１１０７が
またヨーロッパ特許Ａ−２１５．４５７号に記載されて
いる。上述の３種の化合物はＴｗｅｅｎＯ２０に比べて
有利であることが明らかにされている。
しかしながら、これらの添加物を加えたインキュベーシ
ョン培地では、たとえば、至適感度を得るために大ザン
ブル容量を高い接合体濃度で、しかし低い接合体容量で
使用する一工程サンドイツチ法で生じる誤まった測定値
を防止することはできない。
したがって、サンプルとのインキュベーションによって
誤まった測定値を防止できる試剤の発見は重要な課題で
あった。
驚くべきことに、カルボキシル基含有水溶性重合体は、
誤まった測定値を防止し、生物学的材料（サンプルとも
呼ぶ）中に含まれる分析物質の検出および定量に高感度
の効果を示す免疫化学反応に有利に影響する添加剤とし
て、従来の添加剤よりもさらに適していることが明らか
にされた。
このような試剤の成分としてのこれらの重合体は、試験
用サンプルの調製時にすでに添加することができる。
したがって、本発明は、免疫化学反応体を含有する生物
学的材料中の分析物質の検出または定量用の試料であっ
て少なくとも１種の免疫化学反応体が分析物質と反応す
るものである試剤がさらにカルボキシル基含有水溶性重
合体を含有する免疫化学試験用剤に関する。
適当なカルボキシル基含有水溶性重合体は、エステルま
たは無水物質をもつ水不溶性合成重合体からアルカリ加
水分解によって製造することができる。これらの例には
、七ツマ−として、アクリル酸およびアルキルアクリル
酸のエステルもしくは無水マレイン酸のみを単独で、ま
たはカルボキシル基を含まないモノマー（たとえばメチ
ルビニルエーテル、スチレン、エチレン、プロピレンま
たはオクタデセン）と混合して用いて製造される重合体
がある。ホモポリマーまたはヘテロポリマーと呼ばれる
これらの重合体は一般的に遊離ラジカル重合によって得
られる。
すなわち、遊離基重合開始剤の添加、たとえばクマリル
ヒドロペルオキシドまたはジベンゾイルペルオキシドに
よって行われ、重合体の鎖長はペルオキシドの添加量、
または温度、テロゲンたとえば四塩化炭素もしくは遊離
ラジカルを捕集する試剤たとえばアセチルシスティンや
他のチオールの添加によって調節される。
分子量が２，０００を越える反応生成物は一般に重合体
（ポリマー）と呼ばれ、分子量２，０００未満の反応生
成物はスリゴマ−またはテロマーと呼ばれる。
カルボキシル基を含有する水溶性合成ヘテロポリマーは
、カルボキシル基をもつモノマーとカルボキシル基を含
まない七ツマ−の割合を、生成したポリマー、オリゴマ
ーまたはテロマーがアルカリ加水分解後に水溶性になる
ように選択するだけで、有利に製造される。この比は各
ヘテロポリマーについて経験的に決定できる。
たとえば、スチレンと無水マレイン酸のモノマーから製
造されるヘテロポリマーではモル比２〜２．５：１では
アルカリ加水分解後にまだ水溶性を示すが、比が３＝１
以上になるとアルカリ加水分解後も水不溶性のままであ
る。カルボキシル基を含む水溶性ポリペプチド、たとえ
ばアスパラギン酸、グルタミン酸、また必要に応じて中
性アミノ酸も含有し、市販されているかまたは既知のペ
プチド合成法で製造できるポリペプチドもまた適当であ
る。
天然生成物から得られ、糖酸たとえばペクチン酸および
ガラクツロン酸を含有する多糖はさらに適当である。
以下に挙げる重合体：ポリアクリル酸、ポリマレイン酸
、無水マレイン酸とメチルビニルエーテル、エチレン、
プロピレンまたはオクタデセンとのポリマーまたはテロ
マーであってその無水物環を加水分解によって開裂した
重合体、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸および
ポリガラクツロン酸が好ましい。
無水マレイン酸とメチルビニルエーテルまたはプロピレ
ンのテロマーを水酸化ナトリウム溶液で処理して水溶性
のカルボキシル基含有重合体に変換した重合体がとくに
好ましい。
免疫化学反応体および／または生物学的親和性を有する
結合パートナ−を含む試剤については多くのものが知ら
れている。
これらの試剤は一般に、それらが使用される免疫化学過
程によって命名される。
本発明における試剤とは、それによって分散系としても
しくはゲルの沈殿または粒子の凝集を生じるかあるいは
それらの不存在がわかる試剤、または免疫化学反応によ
って発色シグナルもしくは放射線の生成もしくは妨害を
生じる試剤である。
最後に挙げた種類の好ましい試剤は、発色もしくは放射
線が酵素基質から生じる場合はＥＬＩＳＡ（酵素連結免
疫吸着検定）もしくはシンチレーション検定、放射能で
標識された同位元素によって放射線を生じる場合は固相
放射免疫検定、蛍光原によって蛍光を生じる場合は固相
蛍光検定と呼ばれる固相免疫化学試験に用いられる試剤
である。
診断用試剤は、反応体として抗原、抗体または同時にそ
の両者、および反応体に対するまたは分析物質に生物学
的親和性を有する他の結合パートナ−例えばレクチン、
補体、プロティンＡもしくはＧならびにビオチンおよび
アビジンの誘導体を含有し、反応体の少なくとも１種を
標識することができる。さらに必要に応じて標識の検出
用試薬を含有する。またさらに、反応体の１種は固相と
して存在させることもできる。
本発明において固相とは、１種または２種以上の反応体
が結合した水不溶性担体である。
担体の例としては、ラテックス粒子、顆粒状の膨潤性ま
たは非膨潤性材料、ビーズ、試験管の内壁、試験管構造
の特殊な態様としてのマイクロテストプレー］・、なら
びに吸着マトリックスとして記載されている多孔性材料
を挙げることができる。
本発明の試剤は一構成態様として、サンプルを収容する
デバイス、たとえばサンプルを収容する容器または、い
わゆる「乾燥試薬」試験システムのサンプル吸収域たと
えば吸着マトリックスとすることができる。また構成態
様を水溶液とすることもできる。この溶液にはまた緩衝
剤および必要に応じ安定化添加剤たとえば、分析物質も
同様に安定化する物質としてタンパク質または多糖を含
有させる。重合体は０．０１〜５０ｇ／Ｑｚ好ましくは
０，１〜２０ｇ／ρ、とくに好ましくは０．２〜２ｇ／
Ｑの濃度で存在させる。
重合体はまたその中で免疫化学反応が起こる診断用試剤
の構成成分としてデバイス中に含有させることもできる
。
分析物質を含有し、サンプルとも呼ばれる生物学的材料
は、たとえば生検もしくは剖検で得られた組織、血液、
血球、血清もしくは血漿、分泌物炎症もしくは非炎症組
織からの液体、組織の崩壊、生成物および代謝排泄物で
ある。
本発明はまた、生物学的材料中に含まれる分析物質を免
疫化学的に定量する方法において、分析物質を重合体と
混合し、混合物を必要に応じて水溶液中でインキユベー
トシ、こうして得られた混合物について免疫化学的定量
を実施する方法に関する。
本発明はまたさらに、このような重合体の免疫化学試験
における使用に関する。
生物学的材料を重合体と混合すると長期間にわたって保
存することが可能で、その中に含まれる分析物質の免疫
化学的性質は変化することかない。
反応体の１種が固相中に存在する免疫化学的方法では、
上述の処理材料を固相と混合し、ま−１ま た必要に応じて固相の反応体および分析物質の検出試薬
のほかに他の免疫化学反応体を混合し、ついで同相を液
相から分離し、分析物質を固相または液相のいずれかに
ついて定量するのが好ましい。
実施例 １、水溶性カルボキシル基含有重合体の製造１．１．　
　ｍ水マレイン酸−プロピレンテロマーのカルボキシレ
ート（ＭＰＴカルボキシレート） Ｓｔｉｃｋｓｔｏｆｆｖｅｒｋｅ　Ｌｉｎｚの市販製品
であるＭＰＴ　１５５（５ｇ）を脱イオン水５００ｍＱ
に懸濁した。
５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を、ついで、撹拌下に１時間
かけて滴下した。この混合物をさらに３時間、ＩＮ水酸
化ナトリウム溶液を加えてｐｌ（を８に維持しながら撹
拌した。こうして得られた溶液を２０〜２５℃にさらに
１５時間放置してから使用した。
１．２．　　ｍ水マレイン酸−メチルビニルエーテルテ
ロマーのカルボキシレート（ＭＭＶＴカルボキシレート
） Ｓｅｒｖａ　Ｈｅｉｄｅｌｂｓｒｇから入手できるｃａ
ｎｔｒｅｚＡＮ　１７９の商品名の無水マレイン酸−メ
チルビニルエーテルテロマー５ｇを例１．１に記載した
と同様に処理した。
２、固相二側免疫化学法（サンドイッチＥＬＩＳＡ）に
よるＢ型肝炎表面抗［（ＨＢｓ）定量用試験キットの構
成成分の製造 ２．１．　　ＨＢｓに体する抗体で被覆したマイクロテ
ストプレート マイクロプレート、すなわち大型のイムノプレートＩＦ
　９６Ｆ　（Ｎｕｎｃ、　Ｒｏｓｋｔｌｄｅ、　Ｄｅｎ
ｍａｒｋ。
商品番号２６２１６２）をマウスからのモノクローナル
抗−ＨＢｓ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）で被覆した。こ
のためには、ＩｇＧをｐＨ９，６の１００ｍｒｎｏＱ／
　Ｄ。
炭酸水素ナトリウムで２１１９／１２に希釈した。
マイクロテストプレートの各凹部（ウェル）にこの希釈
液ｌＯＯμＱを加えた。このように充填したテストプレ
ートを２０°Ｃで１８時間放置し、ついでリン酸緩衝生
理食塩溶液、ｐＨ７，４中１ｇ／ＱのＴｗｅｅｎ■２０
溶液２００μＱを３〜４回充填、吸引して洗浄し、次に
シリカゲル上２０℃でテストプレートを乾燥した。
２．２．抗−ＨＢｓ　ｒｇＧペルオキシダーゼ接合体Ｈ
Ｂｓに対するモノクローナルマウスＩｇＧをＴａｎａｍ
ｏｒｉら：Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ１．Ｍｅｔｈ、、６２：１
２３〜１３１（１９８３）に記載されているようにして
Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミド（Ｇ
ＭＢＳ）と反応させた。２−イミノチオラン塩酸塩（Ｓ
ｉｇ＋＋＋ａ、　　カタログ番号Ｉ　６２５６）をＢｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　から入手した西
洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ、　　カタログ番号
４１３４７０）と、Ｋｉｎｇら：　Ｂｉｏｃｂｅｍ、　
、　　１７　：　１４９９〜１５０６　（１９７８）に
記載されているようにして反応させた。ＩｇＧ−ＰＯＤ
接合体はＣＭＢＳ　−１ｇｃ接合体とイムノチオラン−
ＰＯＤ接合体から、Ｔａｎａｍｏｒ　ｉの記載に従って
調製した。得られたＩｇＧ−ＰＯＤ接合体の溶液のタン
パク含量は１．２ｍｇ／ｒｒｒＱであった。ＰＯＤとＩ
ｇＧの比率は２．５と測定された。次にこの溶液を、加
熱により脱繊維素および脱脂処理したウシ血清２００ｗ
ＩＱ／Ｑ１ポリゲリン＠　ｌ　ｇ／　Ｑ、　ｔｒｉｓ　
５０＋ｉｍｏＱ／　Ｑ、クエン酸三ナトリウム１５０ａ
ｍｏＱ１０およびＮａ（４０，５１＋１ｏ（１／Ｑを含
有しＨＣｆｉでｐＨ７，４に調整した溶液で２ＩｇＧ−
ＰＯＤ２４および６μｇ／ｍ（ｌに希釈し、得られた溶
液を２４ｕＱ／ｒｓ（ｌおよび６１１９／ｍＱ抗−ＨＢ
ｓ　−ＰＯＤと呼称した。
２．３．　　ＴＭＢ基質プレバレージョン抗−）ＩＢｓ
−ＰＯＤの検出には、２種の保存溶液から調製した過酸
化水素およびテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）含有基
質系または基質プレバレージョンを使用した。
保存溶液１：ＴＭＢ二塩酸塩酸塩回蒸留精製水に撹拌し
ながら、濃度５　ｇ／Ｑすなわち１６ｔａｍｏＱ／Ｑに
なるように溶解し、この溶液のＩＩ）Ｈを５Ｎ塩酸で１
．５にした。この溶液にペニシリンＧを、撹拌しながら
、最終濃度が２００ｍｙ／ａすなわち０．５６ｍ１Ｉｏ
ｆｆｉ／１２になるように加えた。
保存溶液２：氷酢酸１．４＋＋１１２、ｌ　Ｎ　ＮａＯ
Ｈ１，５１１およびＨｚＯｚ　２５０＋ｌ＋ｇすなわち
３　ｍｔｎｏＱを尿素−過酸化水素付加物として９００
ｓ＋Ｑの二回蒸留精製水に加えた。全成分が完全に溶解
したのち、溶液を二回蒸留精製水で全容ＩＱとした。
ＴＭＢ基質プレバレージョン：ｌ容量部の保存溶液１と
１０容量部の保存溶液を互いに混合した。
３、比較定量および結果 ３．１．　−工程サンドイッチＥＬＩＳＡによるＨＢｓ
の定従来技術の方法、すなわち二工程サンドイッチＥＬ
ＩＳＡによってＨＢｓ陰性と定量されたが、カルボキシ
ル基含有重合体を使用しない一工程すンドイツチＥＬＩ
ＳＡでは０．０４を越える吸光を生じたため確定とは評
価されなかった血清も定量に加えた。１（Ｂｓ陰性とし
て分類された参考パネルの全サンプルが二工程サンドイ
ッチＥＬＩＳＡで０．０４０未満の吸光しか生じなかっ
たので、このＥＬ　Ｉ　ＳＡは偽陽性結果の回避に関し
ては信頼できるものとして評価された。陰性および陽性
対照も同時に定量に加えた。２．１に記載したようにし
てＨＢｓに対する抗体で予め被覆したマイクロテストプ
レートの２個の凹部を各対照および各サンプル毎に使用
した。
２個の凹部の群に、抗−ＨＢｓ−ＰＯＤ　２４ｐｙ／ｍ
Ｉ２の溶液２５μＱとこの溶液に１９／１２のＭＭＶＴ
カルボキシレートを添加した溶液２５μａを使用した。
各群の各凹部に陰性対照１００μｇもしくは陽性対照１
００μａまたはサンプル１０（ｌｔｌρを導入した。
このように処理したマイクロテストプレートを３７°Ｃ
で１時間放置した。次に凹部の内容物を吸引によって除
去し、リン酸緩衝生理食塩溶液ｐＨ７，４中１ｇ／Ｑの
Ｔｗｅｅｎ１３２０の溶液を各回２００μ０充填して吸
引する操作を４回反復して凹部を洗浄した。各凹部にＴ
ＭＢ基質プレバレージョン１００μＱを導入し、２０〜
２２℃で３０分間放置し、ついでＩＮ硫酸１００μＱを
添加した。
凹部内の溶液の吸光度を４５０ｎｍにおいて、別の凹部
のリン酸緩衝食塩溶液２００μａのブランク値に対して
測定した。
３．２．従来技術の方法、二工程サンドイッチＥＬＩＳ
ＡによるＨＢｓの定量 一工程サンドインチによっても試験した陰性対照１００
μ９、陽性対照１．００μｇおよびサンプルｌＯＯμｇ
を、実施例２．１に従ってＨＢｓに対する抗体で被覆し
たマイクロテストプレートの凹部に導入した。プレート
を３７°Ｃで１時間放置した。ついで凹部の内容物を実
施例３．１に記載したと同様にして４回洗浄した。抗−
ＨＢｓ〜ＰＯＢの６μｇ／ｍ（ｌ溶液１００μＣを次に
加え、プレートを３７°Ｃで１時間放置した。凹部の内
容物を除去し、上述のようにして凹部を洗浄した。
ＴＢＳｌｉプレバレージョンおよび硫酸の添加ならびに
溶液の吸収塵の測定は実施例３．１に記載したと同様に
実施した。
３．３．　　実施例３．１および３．２にょるＨＢｓ定
量の測定結果 陰性対照および陽性対照ならびに１０個の血清サンプル
について、−工程および二工程すンドイツヂＥＬ　Ｉ　
ＳＡにより得られた吸光度を表に示す。サンプルの吸光
度のカットオフと呼ばれる、ＨＢｓ陰性と分類される上
限値も示す。
カットオフ値は陰性対照の吸光度プラス吸光＝２０ 度０．０２５と特定した。
表から明らかなように５−工程ザンドイッチ検定は陽性
対照については二工程サンドインチＥＬｒＳＡよりも高
い吸光度を与えたが、二工程検定で陰性と判定されたサ
ンプルが、ｔ（Ｂｓ−ＰＯＤ接合体を含む溶液にＭＭＶ
Ｔカルボキシレートが添加されていない一工程検定にお
いて陽性となっている。
ＭＭＶＴカルボキシレートを含有する上述の一工程すン
ドインチＥＬＩＳＡは、サンプルがＨＢｓ陰性として分
類されるべきかの決定に関しては、高感度で、信頼でき
るものである。測定された吸光度はすべて０．０４０の
カントオフ値未満であり、０．０４０の付近の値も示さ
ないからである。
さらに別の実験において、ＭＰＴカルボキシレート、ポ
リアクリル酸、ポリアスパラギン酸および／またはポリ
ガラクツロン酸を含有する−工程サンドイッチＥＬＩＳ
Ａを用いたＨＢｓの検定でも同等の結果が得られた。
サンドインチ ＬＩＳＡ シレート便用　−工程法　二工程法 ４５０ｎｍにおける吸光度 ０．０１５　　　　０．０１４　　　０．０１９０．０
４０　　　　０．０３９　　　０．０４４１．６９２　
　　　１．５１４　　　０．９１８０．０１８ ０．０１１ ｏ、ｏｏｓ Ｏ，００５ ０，００７ ０，０２０ ０，０３０ ０，０３６ ０，０１０ ０，０３６ ０，２８１０，０３８ ０，０７６、Ｏ，０Ｌ８ ０．０７２　　　　０．０２８ ０．０２４　　　　０．０２３ ０．１２８　　　　０．０２８ ０．０１７　　　　０．０２５ ０．０１１　　　　０．０１７ ０．０４９　　　　０．０１５ ０．０５６　　　　０．０２９ ０．０１５　　　　０．０２６

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）免疫化学反応体を含有する生物学的材料中の分析物
    質の検出または定量用の試剤であって、少なくとも１種
    の免疫化学反応体が分析物質と反応するものである試剤
    がさらにカルボキシル基含有水溶性重合体を含有する免
    疫化学試験用剤。 ２）カルボキシル基含有重合体はポリアクリル酸である
    請求項１記載の免疫化学試験用剤。 ３）カルボキシル基含有重合体は無水マレイン酸−プロ
    ピレンテロマーまたはそれと同等の重合体のアルカリ加
    水分解によって得られたものである請求項１記載の免疫
    化学試験用 剤。 ４）カルボキシル基含有重合体は無水マレイン酸−メチ
    ルビニルエーテルテロマーまたはそれと同等の重合体の
    アルカリ加水分解によって得られたものである請求項１
    記載の免疫化学試験用剤。 ５）カルボキシル基含有重合体は溶液中に含まれる請求
    項１記載の免疫化学試験用剤。 ６）カルボキシル基含有重合体は乾燥化学試験系に含ま
    れる請求項１記載の免疫化学試験用剤。 ７）生物学的材料中に含まれる分析物質を免疫化学的に
    定量する方法において、分析物質を請求項１記載のカル
    ボキシル基含有重合体と混合し、必要な場合にはこの混
    合物を水性溶液中でインキュベートし、こうして得られ
    た混合物について免疫化学的定量を実施する方法。 ８）生物学的材料中に含まれる分析物質を免疫化学的に
    定量する方法において、請求項１記載のカルボキシル基
    含有重合体を必要に応じて免疫化学反応体を含有する溶
    液として、分析物質および固相として存在する他の免疫
    化学反応体と混合し、ついで液相から固相を分離し、固
    相または液相中いずれかの分析物質を定量する方法。 ９）生物学的材料中に含まれる分析物質を免疫化学的に
    定量する方法において、乾燥形態で存在するカルボキシ
    ル基含有重合体を、必要に応じて分析物質および／また
    は免疫化学反応体を含む水性溶液と、請求項１記載の試
    験用剤中で混合し、生成した溶液を同時にまたはついで
    、固相として存在する他の免疫化学反応体と接触させ、
    固相または液相中いずれかの分析物質を定量する方法。 １０）請求項１記載のカルボキシル基含有重合体の免疫
    化学試験用における使用。
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