JPH02195830A - 人工種子発芽促進剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、人工種子発芽促進剤に関する。

（従来の技術） 植物組織培養とは、植物細胞の分化全能性による細胞の
脱分化（カルス化）、再分化に基づくものである。

近年の植物バイオテクノロジーの進歩にともない、植物
組織培養技術を用いて植物体再生組織（将来植物体へと
発達しうる培養体や組織片、器官等）を培養し、植物体
再分化を行わせることは、数多くの植物種に於いて可能
であることが示されている。また、植物組織培養を利用
したクローン植物大量増殖法の一つとして、人工種子の
開発が着目され、野菜やイネなど多くの植物種で実用化
に向けての試みがなされている。

人工種子は、植物体の１部から植物組織培養技術によっ
て作成した不定芽、不定胚（体細胞胚）等の植物体再生
組織をアルギン酸カルシウムのような吸水性ゲルや各種
の高分子膜で包んだものである。人工種子に用いる不定
芽、不定胚を得るには外植体から直接発生させる方法と
培養細胞（カルス）を経由して発生させる二つの方法が
あるが、人工種子の開発には大量の均一な不定胚を得る
必要があるため、培養細胞経由の方が有利であると言わ
れている。

人工種子中に包埋される植物体再生組織については、遺
伝的変異の問題において、不定胚を経て植物体再分化を
行った方が、不定芽を経て植物体再分化をさせるよりも
遺伝的変異が少ないと考えられているため不定胚を包埋
することが有利であると言われている。

また、不定胚は受精胚と形態的に類似しているため受精
胚のように乾燥に耐え、長期間貯蔵が可能であるという
性質を有することが期待されている。さらに不定芽と比
較して不定胚は、起源となる細胞が少なく培養細胞から
誘導できる植物種に於いては１つの細胞塊から１つの胚
を経て、１つの固体が形成できるため、クローニングの
方法としてはきはめて効率がよく大量増殖を行う上で有
効である。従って人工種子の開発においては不定胚を包
理するのが主流となっている。

人工種子は、植物体再生組織を人工的な胚乳と人工膜に
よって包埋しているが、これらの組成、素材、製法など
についても種々検討されている。

人工的な胚乳は１人工種子に於て植物体再生組織に栄養
を与えたり発芽を制御する物質を含む部分である。現在
、植物ホルモンの一種であるアブシジン酸の添加が人工
種子の発芽率を高めるとの報告などもあるが、アブシジ
ン酸の場合は、播種後。

水に溶解拡散して除去されるのであるが、そのために時
間を要し発芽が良好でない場合がある。−般的には不定
胚の生長を促進し１人工種子の発芽率を高めたというよ
うな特殊な効果を示す植物調節物質の存在は知られてい
ない、また、高濃度の糖等を添加する方法なども提案さ
れているが、雑菌の繁殖を促し、生育に支障をきたす場
合がある。

人工膜については、現在人エイクラに用いられているア
ルギン酸カルシウムが最適とされているが。

その他の高分子ゲル化剤についても種々検討されている
。

（発明が解決しようとする課題） 現在知られている植物組織培養技術を用いて得られた植
物体再生組織を人工種子として用いた場合、発芽率が低
く乾燥に弱いなどの問題点がある。

特に、植物ホルモン処理して育成した不定胚を用いた場
合、理由は定かではないが１発芽率が低いことが報告さ
れている。前記したとおり、不定胚は通常培養細胞から
誘導される。しかしながら、培養細胞の培養には植物ホ
ルモンの添加は不可欠である。培養細胞は組織培養技術
によって大量、迅速に培養することが可能で、その産業
的利用価値は高い、そこで、最近植物ホルモンを用いて
培養された培養細胞から発生した不定胚であってもアブ
シジン酸を添加することで優良な不定胚へと生長させる
方法や、植物ホルモンを用いず外植片から直接高濃度の
糖を添加することで得られた不定胚を人工種子中に包埋
して用いる方法などが提案されているが、それぞれにま
た新たな問題を生じているのが現状である。このように
近年植物バイオテクノロジーの進歩とともに研究が盛ん
に行われている優良クローン植物大量増殖法の１つとし
ての人工種子開発は、植物体再生組織の生理学的な部分
、植物組織培養技術のテクノロジーとしての部分に未だ
不明な点が多く解決できない幾多の問題点がある。

（課題を解決するための手段） 本発明は、上述せる問題点に鑑みなされたもので、植物
体再生組織を人工的に作成した膜で包埋したものを人工
種子として用いる際１人工種子発芽促進剤として微細藻
類培養濾液及び／又は微細藻類抽出物を用いることを特
徴とする人工種子発芽促進剤を要旨とするものである。

本発明で利用できる微ｍ藻類としては、紅藻類。

緑藻類、黄緑藻類、珪藻類、黄色鞭毛藻類、渦鞭毛藻類
などがある。緑藻類としては、ブラキオモナス（Ｂｒａ
ｃｈｉｏｍｏｎａｓ　）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａ
ｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌ
ａ）属、ロボモナス（Ｌｏｂｏ＋ｗｏｎａｓ）属、ネフ
ェロクラミス（Ｎｅｐｈｒ。

ｃｈｌａｍｙｓ）属、ネフェロデエラ（Ｎｅｐｈｒｏｄ
ｉｅｌｌａ）属、プロトシフオン（Ｐｒｏｔｏｓｉｐｈ
ｏｎ）属、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）属、セ
ネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓａ＋ｕｓ）ｉ；４．セレ
ナストウルム（Ｓａｌａｎａｓｔｒｕｏ＋）属などがあ
り、具体例としては、ブラキオモナス・スブマリナ（Ｂ
ｒａｃｈｉｏｍｏｎａｓ　ｓｕｂｍａｒｉｎａ）　Ａ　
Ｔ　ＣＣ３０５９７、クラミドモナス・トルソベントラ
リス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍ。

ｎａｓ　ｄｏｒｓｏｖｅｎｔｒａｌｉｓ）　Ａ　Ｔ　Ｃ
Ｃ３０５９４、クラミドモナス・オウガメトス（Ｃｈｌ
ａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｅｕｇａｗ＋ｅｔｏｓ）ＡＴＣ
Ｃ３０４０１，クラミドモナス・モノイカ（Ｃｈｌａｍ
ｙｄｏｍｏｎａｓ　ｍｏｎｏｉｃａ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３
０６２９、クラミドモナス・プソウダグロエ（Ｃｈｌａ
ｍｙｄｏｓｉｏｎａｓ　ｐｓｅｕｄａｇｌｏｅ）Ａ　Ｔ
　ＣＣｌ　２２３５、クロレラ・エリツブソイデア（Ｃ
ｈｌｏｒｅｌｌａ　ａｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）ＡＴＣＣ
ｌ　１４６６、クロレラ・ルテオヴイリディス（Ｃｈｌ
ｏｒｅｌｌａ　１ｕｔａｏｖｉｒｉｄｉｓ）　Ａ　Ｔ　
ＣＣ３０４０６、クロレラ・ミニアタ（Ｃｈｌｏｒｅｌ
ｌａ　ａ＋１ｎｉａｔａ）ＡＴＣＣ３０５４６，クロレ
ラ・サツ力ロフイラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　５ａｃｃｈ
ａｒｏｐｈｉｌａ　ｖａｒ、５ａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌ
ａ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３０４０８、クロレラ属（Ｃｈｌｏ
ｒｅｌｌａ　ｓｐ、）Ａ　Ｔ　ＣＣ１１４６９、クロレ
ラ・バリエガタ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖａｒｉｅｇａ
ｔａ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３０４０９、クロレラ・ブルガリ
ス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｖｕｌｇａｒｉｓ）ＡＴＣＣ１
１４６８，クロレラ・キサンセラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ
　ｘａｎｔｈｅｌｌａ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３０４１１、ロ
ボモナス・ビリフォーミス（Ｌｏｂｏｍｏｎａｓ　ｐｉ
ｒｉｆｏｒｍｉｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３０４０３、ネフェ
ロクラミス・スブソリタリア（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌａｍ
ｙｓ　５ｕｂｓｏ１ｉｔａｒｉａ）ＡＴＣＣ３０４３３
、ネフェロデエラ・プレビス（Ｎｅｐｈｒｏｄｉｅｌｌ
ａ　ｂｒｓｖｉｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３０４４０、プロト
シフオン・ボテリオイデス（Ｐｒｏｔｏｓｉｐｈｏｎ　
ｂｏｔｒｙｏｉｄｅｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３０４３６。

プロトチ力・スタッグノラ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ　ｓ
ｔａｇｎｏｒａ）ＡＴＣＣ１６５２８、セネデスムス・
ビジュガトウス（Ｓｃａｎｅｄｅｓｍｕｓ　ｂｉｊｕｇ
ａｔｕｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ１１４６２、セネデスムス・
クウアドリ力ウド（Ｓｃｅｎｅｄｅｓ＋＋ｕｓ　ｑｕａ
ｄｒｉｃａｕｄａ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３０４２８などが挙
げられる。黄緑藻類としては、ボティリデウム（Ｂｏｔ
ｒｙｄｉｕｍ）属、ミショコッカス（Ｍｉｓｃｈｏｃｏ
ｃｃｕＳ）属、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）属、オフィ
オシティウム（Ｏｐｈｉｏｃｙｔｉｕｎ＋）属などがあ
り、具体例としては。

ボティリデウム・ペケリアニウム（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ
　ｂｅｃｈｅｒｉａｎｕｍ）ＡＴＣＣ３０６０２、ボテ
ィリデウム・シストスム（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｎ＋　ｃｙ
ｓｔｏｓｕｍ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３０５８９、ミショコッ
カス・スフ７エロセフアラス（Ｍｉｓｃｈｏｃｏｃｃｕ
ｓ　５ｐｈａｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ
３０５９２、モノダスーセブテラネウス（Ｍｏｎｏｄｕ
ｓ　５ｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３０５
９３、オフィオシテイウム・マジュス（Ｏｐｈｉｏｅｙ
ｔｉｕｍ　ｍａｊｕｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３０６０１など
が挙げられる。黄色鞭毛藻類としては、オクロモナス（
Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ　）属などがあり、具体例として
は、オクロモナス・ダニ力（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ　ｄ
ａｎｉｃａ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３０００４、オクロモナス
・マルバメンシス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｈａ
＋ｍｅｎｓｉｓ）ＡＴＣＣ１１５３２などが挙げられる
。また、微細藻類は、上記した微生物あるいはその変種
や変異株に限ることなく、天然から分離した海洋性、淡
水性の微細藻類も含まれる。

微１ｍ藻類の培養は５通常、無機塩類等を含む培地を用
い、タンク培養あるいは太陽光を利用した屋外開放培養
で行い得るが、本発明においては、目的とする微細藻類
が天然にある程度豊富に存在するならば、その微生物の
生育存在する海水あるいは淡水を培養液とすることがで
きる。

微細藻類培養濾液は上述した培養法で得られる培養液を
遠心分離あるいは濾過などを行って取得されるが、目的
とする培養濾液の生物活性が弱い場合は、前記濾液を減
圧濃縮などにより濃縮して用いてもかまわないにの際、
濃縮倍率が大きくなり塩濃度が高くなると植物組織に悪
影響を与えることがあるので、電気透析などで植物組織
に悪影響がなくなるまで脱塩して使用するのが望ましい
。

また、微細藻類の抽出物は、前記のようにして得られた
菌体または適度に破砕した菌体を常温または加熱した適
当な溶媒と接触させて行い得たものであるが、ここで用
いる溶媒としては、菌体によって種々の溶媒を単独また
は複数併用してかまわないが、一般的には水性溶媒が好
ましい。例えば水性溶媒としては、水単独あるいは酸、
塩基、塩類、もしくは有機溶媒を溶解した溶液などがあ
る。また、メタノール、エタノール、酢酸エチルエステ
ル、エーテル等の有機溶媒で抽出後、有機溶媒を除去後
水に溶解させてもよい。このようにして得られた微細藻
類培養濾液あるいは微細藻類抽出物を添加する形態とし
ては、上述した溶液の形態で添加してもよいし、これら
を適宜濃縮あるいは希釈して使用できる。さらに、これ
らの培養濾液あるいは抽出液または塩基性物質を含む分
画液を減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥等により乾燥し粉
末としても使用できる。さらに活性の強い画分を得るに
は透析、ゲル濾過、限外濾過等を行い、分子量の大きさ
で分画し各々の活性画分を用いてもよい。

微細藻類培養濾液及び／又は微細藻類抽出物の培地への
添加量は、０．０００１〜５０％で使用目的、使用方法
によって適宜選択できるが、望ましくは０．００１〜１
０％である。

以上述べた。微細藻類培養濾液及び／又は微細藻類抽出
物や微細藻類培養濾液を人工種子発芽促進剤として培地
に添加し、その培地と植物体再生組織を人工種子として
アルギン酸カルシウム、寒天、ゼラチン、カラギーナン
、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース
等の吸水性ゲルで包埋するが、培地としては、ムラシゲ
（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）　＆スクーグ（Ｓ　ｋｏｏｇ）
培地が代表的なものとして挙げられるが、その他の植物
組織培養に適した種々の培地、あるいはそれらの改変培
地を適宜選択して使用できる６更に、通常の培養に使用
される植物ホルモン、ココナツツミルク、カゼイン分解
物や酵母抽出物等を目的に応じて併せて添加してもよい
。

本発明において培養の対象となる植物としては、特に制
限はなく、全ての植物に適用可能である。

また、植物は分化全能性を有していることが知られてい
るので植物体再生組織（将来植物体へと発達しうる培養
物）、外植体（植物体又はそれらの一部）または、外植
体の初代培養体あるいは継代培養体も包埋され人工種子
として使用可能である。

特に、−外植体としては不定胚、不定芽、実生等が好ま
しい。

（実施例） 以下、実施例によってさらに詳しく説明するが、これに
より限定されるものではない。

（１）微細藻類培養濾液、微細藻類抽出物、及び微細藻
類抽出物中からの高分子画分及び低分子画分の調整 タラミドモナス・トルソベントラリス（Ｃｈｌａｍｙｄ
ｏｍｏｎａｓ　ｄｏｒｓｏｖｅｎｔｒａｌｉｓ）　Ａ　
Ｔ　ＣＣ３０５９４、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏ
ｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）　Ａ　ＴＣＣ１１４６
８、セネデスムス・ビジュガトウス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓ
ｍｕｓ　ｂｉｊｕｇａｔｕｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣｌ　１４
６２、ボティリデウム・ペケリアニウム（Ｂｏｔｒｙｄ
ｉｕｍｂｅｃｈｅｒｉａｎｕ＋ｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３０
６０２、オクロモナス・ダニ力（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ
　ｄａｎｉｃａ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３ｏ００４を用いて調
製した。

前記微細藻類をＡＴＣＣ指定の培養条件にて培養後、培
養液を遠心濾過し濾液を得、エバポレイターで１００倍
に濃縮した。′この濃縮液をモザイク荷電膜脱塩器（デ
ザルトン　ＤＳ−１０３：東ソー株式会社）で脱塩し、
０．４５μｍのメンンブランンフィルターを用いて濾過
し、得られた濾液を微細藻類培養濾液とした。微細藻類
抽出物は菌体を集菌後凍結乾燥し、水に対して３％にな
るように菌体を懸濁させ、１００℃で６０分間熱水抽出
し、遠心分離して上澄液を０．４５μｍメンブランフィ
ルタ−にで濾過して得た。

（２）ニンジン培養細胞からの不定胚の作製ニンジンの
無菌種子の芽生えにおいて胚軸が１０ｃｍ位に生長した
ものを約１０ｗ位に切断し、下記培地中で２５℃、暗条
件下で培養した。培地は、基本培地としてＭＳ培地を使
用し、これに植物ホルモンのオーキシン類である２、４
−Ｄを１　ｍ　ｇ／ｌの濃度で添加しｐＨ５，５〜５．
７に調整したものである。得られたカルスを液体培養に
て継代培養し、不定胚の形成に用いた。

不定胚は植物ホルモンである２、４−Ｄを含まない前記
基本培地を用いて１４日間、２５℃、暗条件下で液体振
盪培養することで誘導された。以下の実験では、１４８
μｍのナイロンメツシュを用いて１４８μｍ以上に生長
した不定胚のみを選別し使用した。得られた不定胚のほ
とんどは、球状から初期の心臓型胚であった。

（３）人工種子の調製及び人工種子発芽促進剤の効果確
認 ニンジン培養細胞から誘導された不定胚を用いた人工種
子に対する微細藻類培養濾液及び微細藻類抽出物発芽促
進効果の検討を行った。

ＭＳ培地２５　ｍ　ｌ中に（２）で得られた不定胚を懸
濁し、包埋剤として３％（Ｗ／Ｖ）アルギン酸ナトリウ
ムを含む７５ｎ＋ｌのＭＳ培地と混ぜ合わせ、得られた
混液１００　ｍ　１を得た。この時、（１）で調整した
各種人工種子発芽促進剤を各々最終混液１００ｍ１に対
して１０％（ＩＮ／Ｖ）の濃度で添加した。その後、最
終混液を５０　ｍ　Ｍ塩化カルシウム溶液中に滴下し、
得られた球状体を人工種子とした。

次いで人工種子の培養は、無菌的に２５℃明条件下（２
０００ルツクス、１２時間照明で１ケ月間培養した結果
を表に示す。

（以下余白） （発明の効果） 植物体再生組織（将来植物体）を人工的に作成した膜で
包埋した人工種子を産業的に利用する際人工種子発芽促
進剤として微細藻類培養濾液及び／又は微細藻類抽出物
を用いることで人工種子からの発芽を効率よく行わせる
ことができる。

従って、組織培養による優良株の大量繁殖を効率よく行
うことができ、真に実用的な技術とすることができる。

あわせて、農業生産に大きな変革をもたらすことができ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 植物体再生組織を人工的に作成した膜で包埋したものを
   人工種子として用いる際、人工種子発芽促進剤として微
   細藻類培養濾液及び／又は微細藻類抽出物を用いること
   を特徴とする人工種子発芽促進剤。