JPH02195900A - 糖化蛋白の測定法および測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は糖化蛋白の測定法および測定試薬に関する。さ
らに詳しくは、たとえば糖尿病診断のための長期の平均
的血糖値を反映する指標等とじて有用な糖化蛋白の測定
法及び測定試薬に関する。

［従来の技術］ 従来、糖化蛋白の測定法としてはアルカリ条件下におけ
る糖化蛋白の還元力を利用する方法、アフイニテイクロ
マトグラフイー法、チオバルビッール酸法、高速液体ク
ロマトグラフィー法、ラジオイムノアッセイ法、酵素免
疫測定法などが知られている〔例えば、クリ二カ・シミ
力・アクタ（Ｃ１ｉｎ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ）第１
２７巻、第８７〜９５頁（１９８２年）、糖尿病第２５
巻、第９６３〜９６８頁（１９８２年）、ダイアベトロ
シア（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ）第２１巻、第９４〜
９８頁（１９８１年）、ジャーナル・オブ・クリニカル
・ケミストリー・アンド・クリニカル・バイオケミスト
リー（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　Ｃｌ１ｎ、Ｂｉ
ｏ−ｃｈｅｍ、　）第１９巻、第８１〜８７頁（１９８
１年）、糖尿病第２９巻、第５８１〜５９０頁（１９８
６年）、糖尿病筒２９巻補冊２、第３４０頁（１９８６
年）〕。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら従来の方法には干渉物質の影響を受ける、
操作が複雑で手間がかかるなどの問題点がある。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、干渉物質の影響を受けず、かつ簡便な糖
化蛋白測定法および測定試薬を得るべく鋭意検討した結
果、本発明に到達した。すなわち本発明は、糖化蛋白に
ε−アルキルリジナーゼを作用させ、反応に伴う酸素の
消費量または過酸化水素の発生量を測定する糖化蛋白の
測定法；糖化蛋白の糖結合部位であるリジン残基を遊離
させて得られる混合物にε−アルキルリジナーゼを作用
させ、反応に伴う酸素の消費量または過酸化水素の発生
量を測定する糖化蛋白の測定法；およびε−アルキルリ
ジナーゼを含有してなる糖化蛋白測定試薬である。

ε−アルキルリジナーゼとしてはたとえばラットの腎臓
等からジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）第２３９巻、第
３７９０〜３７９６頁（１９６４年）に記載の方法で抽
出・精製したものを用いることができる。

本発明の測定対象物である糖化蛋白としてはグルコース
等のアルドースが蛋白のりジン残基等のアミノ基に非酵
素的に結合し、さらにアマトリ転移して生じるものがあ
げられる。たとえばフルクトサミン（糖化血清蛋白）、
糖化アルブミン、ヘモグロビンＡ１．などがある。

本発明の測定を行なうためにε−アルキルリジナーゼを
作用させるための反応条件は通常用いられる条件でよい
。たとえばジャーナル・オブ・バイオロジカ／ｌｚ−ケ
ミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）第２３
９巻、第３７９０〜３７９６頁（１９６４年）に記載の
条件を用いることができる。具体的には次の条件が用い
られる。

ε−アルキルリジナーゼの添加量は通常０．０１〜１０
　Ｕ　／ｍＱ、好ましくは０．１〜ＩＵ／Ｔｎ１である
。反応液のｐＨは通常５〜９、好ましくは６．５〜７．
５である。反応温度は通常１０〜６０℃、好ましくは３
０〜４０℃である。反応時間は５〜９０分、好ましくは
１０〜３０分である。反応には通常緩衝液が用いられる
が緩衝液としては酵素反応に通常用いられるものならば
特に制限されず、０．０１〜０．１Ｍのリン酸緩衝液等
を用いることができる。

ε−アルキルリジナーゼは糖化蛋白に直接作用させても
よいが、あらかじめ糖の結合部位であるリジン残基等を
遊離させて得られる混合物に作用させることによりさら
に効率よく反応が進行し好ましい。糖が結合したりジン
残基等を遊離させる方法は通常の方法でよく酵素法、化
学法がある。

酵素法では糖化蛋白に作用してリジン残基等を遊離させ
ることができる酵素ならばいずれでも使用することがで
きる。カルボキシペプチダーゼＢ、パパイン等のエンド
ペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼ等のエキソペプ
チダーゼのいずれも使用することができる。化学法とし
ては塩酸等を用いる加水分解法がある。これらのうち好
ましいのは酵素法である。

酵素法によりリジン残基等を遊離させる際の反応条件は
通常の反応条件でよく、エンドペプチダーゼを用いる場
合は、例えばジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）第２３７
巻、第３０９４〜３０９９頁（１９６２年）、同第２０
７巻、第５１５〜５３１頁（１９５４年）に記載の反応
条件を、またエキソペプチダーゼを用いる場合はたとえ
ばメソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ、　Ｅ
ｎｚ−ｙｍｏｌ、　）第１９巻、第５１４〜５２１頁（
１９７０年）に記載の反応条件をそれぞれ用いることが
できる。

リジン残基等を遊離させる酵素と　ε−アルキルリジナ
ーゼは逐次添加してもよく、同時に添加してもよい。

ε−アルキルリジナーゼによる反応は反応式：％式％（
２０ （式中Ｒは蛋白分子またはリジンの残基を、Ｒ゛はアル
ドースの残基を表す） にしたがって進行し、酸素の消費および過酸化水素の発
生を伴う。酸素の消費量および過酸化水素の発生量は存
在する糖化蛋白の濃度に比例する。

したがって、酸素の消費量または過酸化水素の発生爪を
測定すれば糖化蛋白の濃度を知ることができる。酸素の
消費量および過酸化水素の発生量の測定は通常の方法で
行なうことができる。すなわち酸素の消費量は、たとえ
ば酸素電極によって、また過酸化水素の発生量はたとえ
ばパーオキシダーゼによる発色反応を用いて測定するこ
とができる。

測定の際、通常標準物質が必要であるが標準物質として
はリジンのアミノ基に糖またはアルキル基（炭素数１〜
４）が結合したものならばいずれでも用いることができ
る。好ましいのは糖が結合したものである。

本発明の測定法を糖尿病診断のための臨床検査に利用す
る場合、糖化蛋白を含有する検体は通常臨床検査に用い
られる全血、血しよう、血清のいずれでもよい。これら
はそのまま測定に供してもよいが、あらかじめ透析など
の前処理を行なったのち測定に供してもよい。検体量と
しては通常１〜１，０００μＱ１好ましくは１０〜１０
０μ２を用いる。

本発明の測定法で用いる　ε−アルキルリジナーゼ、パ
ーオキシダーゼ等の酵素は溶液状態で用いてもよいが、
固定化して用いることもできる。固定化したε−アルキ
ルリジナーゼ、パーオキシダーゼ等はカラム型式、バッ
チ型式のいずれの型式でも用いることができる。

本発明の測定法は用手法で実施することもできるが臨床
検査等で通常用いられる自動分析装置で実施すればさら
に効果的である。

測定結果は糖化蛋白の濃度で表現してもよいが検体中に
含まれる全蛋白濃度を測定すれば全蛋白濃度に対する糖
化蛋白濃度の比率で表現することもできる。全蛋白濃度
の測定法としては通常の方法でよ（、たとえば２８０ｎ
ｍにおける吸光度を測定する方法、ロウクー法（Ｌｏｗ
ｒｙ法）をあげることができる。

［実施例コ 次に本発明を実施例により具体的に説明するが本発明は
以下の実施例によって限定されるものではない。

実施例１ （１）糖化蛋白測定試薬 酵素試薬：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）第２３９巻
、第３７９０〜３７９６頁（１９６４年）に記載の方法
で精製したε−アルキルリジナーゼ溶液ＩＴｎ１を凍結
乾燥した。

（２）リジン残基遊離試薬 パパイン溶液（シグマ社製、６００Ｕ／ｍＱ　）　４０
０　μｎカルボキシペブチダーセＢ溶′７ｒｌ（シグマ
社製、２３００Ｕ／ｍＱ）　２００μＱ、システィン２
０ｍｇを０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）１ｍＱ
に溶解し、凍結乾燥した。

（３）標準物質 リジンのアミノ基にグルコースを結合させて得た物質２
６■を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）ｌ蔵に溶
解し、凍結乾燥した。

比較例１ 糖尿病患者および正常者の血清を生理食塩水に対して透
析した。透析後の血清１００１１．Ｑに蒸留水を加え全
量を５００μ２とした。１ｍｏｌｅ／Ｒ濃度の蓚酸５０
０μ２を加え、１００℃で５時間加熱した。次いで６０
０　ｇ　／　Ｑ濃度のトリクロル酢酸を２００μ℃加え
除蛋白した。除蛋白後の上清液に５０ｍｍｏｌ／　Ｑ濃
度のチオバルビッール酸３００μ２を加え、３７℃で１
５分間インキュベーションした。室温に２０分間放置し
たのち４４３ｎｍにおける吸光度を測定した。なお標準
液には５−ハイドロキシメチルフルフラール溶液を用い
、除蛋白後の血清サンプルと同様に操作した。血清中の
糖化蛋白濃度（Ｃ）は次式により算出した。測定結果は
第１図に示す。

Ａ、：サンプルを測定したときの吸光度Ａ１．：標準物
質を測定したときの吸光度Ｃ１，：標準物質濃度（ｎｍ
ｏ　ｌ　／ｍｌ　）実施例２ 糖化蛋白測定試薬、リジン残基遊離試薬、標準物質に蒸
留水を１ｍＱずつ加えて溶液とし、比較例と同じ血清サ
ンプルについて以下の方法で糖化蛋白を測定した。

未透析の血清１００μ℃に０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐ
　Ｈ７，５）　１．２Ｔｎ！ｌおよびリジン残基遊離試
薬１００μＱを加え、３７℃で１５分間インキュベーシ
ョンした。次いで糖化蛋白測定試薬を１００μＱ加え、
３７℃で１５分間インキュベーションし、ε−アルキル
リジナーゼによる反応に伴う酸素消費量を酸素電極で測
定した。標準物質についても同様の操作を行なった。血
清中の糖化蛋白濃度は次式により算出した。測定結果は
第１図に示す。干渉物質を透析により除去して測定した
比較例の測定結果とよく相関している。すなわち、本測
定法はあらかじめ干渉物質を除去しなくてもその影響を
受けることなく正しい糖化蛋白濃度を測定できることを
示している。

ＯＳ：血清サンプルを測定したときの酸素消費量 Ｏｌ、：標準物質を測定したときの酸素消費量Ｃ２，：
標準物質濃度（ｎｍｏｌ／ｄ）［発明の効果］ 本発明の測定法および測定試薬は特異性の高い酵素を用
いるため、従来の測定法では避けられなが−）だ干渉物
質（たとえばアスコルビン酸、尿酸、グルタチオン、Ｅ
ＤＴＡ−２Ｎａなど）の影響を受けない。また、糖化蛋
白を含有する検体からカラムグロマトグラフィー等の方
法によって糖化蛋白を分離するなどの複雑な操作を必要
としないなどの優れた効果を奏する。

糖尿病の診断あるいは糖尿病患者の血糖コントロールの
指標の一つに血糖値があるが、血糖値は食事等の影響で
短期間に激しく変動するためこれだけでは正確な診断あ
るいは血糖コントロールの把握ができない。そこで長期
（１週間〜数ケ月）の平均的血糖値を反映する指標が注
目され診断等に用いられている。本発明はこのような診
断等の目的に有効に利用し得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は比較例１の測定結果と実施例２の測定結果の相
関図である。 （ｎｍｏｌ／ＴｎＩｌ） 図面 第１図 実施例２による測定値

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、糖化蛋白にε−アルキルリジナーゼを作用させ、反
   応に伴う酸素の消費量または過酸化水素の発生量を測定
   する糖化蛋白の測定法。 ２、糖化蛋白の糖結合部位であるリジン残基を遊離させ
   て得られる混合物にε−アルキルリジナーゼを作用させ
   、反応に伴う酸素の消費量または過酸化水素の発生量を
   測定する糖化蛋白の測定法。 ３、ε−アルキルリジナーゼを含有してなる糖化蛋白測
   定試薬。