JPH0219768A - ヒトアデノシンデアミナーゼの免疫学的測定方法 - Google Patents
ヒトアデノシンデアミナーゼの免疫学的測定方法Info
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- JPH0219768A JPH0219768A JP16879888A JP16879888A JPH0219768A JP H0219768 A JPH0219768 A JP H0219768A JP 16879888 A JP16879888 A JP 16879888A JP 16879888 A JP16879888 A JP 16879888A JP H0219768 A JPH0219768 A JP H0219768A
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- adenosine deaminase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、ヒトアデノシンデアミナーゼ（以下、ＡＤＡ
とする）の各アイソザイムに特異的なモノクローナル抗
体を利用した試料中のＡＤＡアイソザイムの分別定量方
法に関するものである。
とする）の各アイソザイムに特異的なモノクローナル抗
体を利用した試料中のＡＤＡアイソザイムの分別定量方
法に関するものである。
（従来の技術）
アデノシンデアミナーゼは、アデノシンをイノシンとア
ンモニアとに分解する酵素である。本酵素は、肺臓、肝
臓、赤血球などに高濃度に存在しており、基質としての
アデノシンのほかデオキシアデノシン、アデニンアラビ
ノシドなどの各種アデノシンアナログをも分解する作用
を持つ。このアデノシンデアミナーゼは遺伝的にはＡＤ
Ａアイソザイム１（以下ＡＤＡ１とする）とＡＤＡアイ
ソザ・イム２（以下ＡＤＡ２とする）の二種のアイソザ
イムに区別できる。このうち前者のＡＤＡ １は、ＡＤ
Ａ結合蛋白質と結合して、等電点４〜５．５で分子ｆｉ
１４４０ｋＤａ、 ２８０ｋＤａ、 ３５ ｋＤａの種
々の分子状態を取り、血清中では血球中に存在する分子
９３５ｋＤａの分子種はほとんど見られないとされてい
る。
ンモニアとに分解する酵素である。本酵素は、肺臓、肝
臓、赤血球などに高濃度に存在しており、基質としての
アデノシンのほかデオキシアデノシン、アデニンアラビ
ノシドなどの各種アデノシンアナログをも分解する作用
を持つ。このアデノシンデアミナーゼは遺伝的にはＡＤ
Ａアイソザイム１（以下ＡＤＡ１とする）とＡＤＡアイ
ソザ・イム２（以下ＡＤＡ２とする）の二種のアイソザ
イムに区別できる。このうち前者のＡＤＡ １は、ＡＤ
Ａ結合蛋白質と結合して、等電点４〜５．５で分子ｆｉ
１４４０ｋＤａ、 ２８０ｋＤａ、 ３５ ｋＤａの種
々の分子状態を取り、血清中では血球中に存在する分子
９３５ｋＤａの分子種はほとんど見られないとされてい
る。
アデノシンデアミナーゼをアイソザイムのレベルで精査
すると、個々のアイソザイムレベルの高低と各種疾患と
の関連を示唆する報告がみられることが注目される。例
えば、肝疾患の急性期には血清中にＡＤＡ２が増加し、
悪性腫瘍組織ではＡＤＡＩが多くなることが示されてい
る。また、白血病患者血清においてもＡＤＡアイソザイ
ムのパターンが特異的であるとされている。
すると、個々のアイソザイムレベルの高低と各種疾患と
の関連を示唆する報告がみられることが注目される。例
えば、肝疾患の急性期には血清中にＡＤＡ２が増加し、
悪性腫瘍組織ではＡＤＡＩが多くなることが示されてい
る。また、白血病患者血清においてもＡＤＡアイソザイ
ムのパターンが特異的であるとされている。
以上のようなこれまでの知見から、まだ報告例数は少な
いとしても、ＡＤＡアイソザイムのパターンを１１１１
定することによって、ある種の腫瘍マーカーになるので
はないかとも想像されており、またリンパ球中のアイソ
ザイムが生体内の免疫の状態を反映しているのではない
かとも考えられている。
いとしても、ＡＤＡアイソザイムのパターンを１１１１
定することによって、ある種の腫瘍マーカーになるので
はないかとも想像されており、またリンパ球中のアイソ
ザイムが生体内の免疫の状態を反映しているのではない
かとも考えられている。
以上の状況から、ＡＤＡアイソザイムを簡単に分別定量
することは、医療関係者から強く望まれていることであ
る。
することは、医療関係者から強く望まれていることであ
る。
従来用いられているＡＤＡアイソザイムの分別定量法は
、ＡＤＡＩとＡＤＡ２の物理的性質の差、例えば分子量
の差を利用したゲル濾過法、および等電点の差を利用し
た電気泳動法などの方法が知られている。しかし、これ
らの方法ではいずれも予めＡＤＡｌとＡＤＡ２を分離す
ることが必要であり、これは本ＪＩＪ定を臨床的に実用
化する場合の条件である簡便性、迅速性に欠ける。
、ＡＤＡＩとＡＤＡ２の物理的性質の差、例えば分子量
の差を利用したゲル濾過法、および等電点の差を利用し
た電気泳動法などの方法が知られている。しかし、これ
らの方法ではいずれも予めＡＤＡｌとＡＤＡ２を分離す
ることが必要であり、これは本ＪＩＪ定を臨床的に実用
化する場合の条件である簡便性、迅速性に欠ける。
またＫｍ値の異なる二種の基質を用いてそれぞれの基質
によるＡＤＡ総活性を測定して、このａ−ｊ定値を各基
質に対するＡＤＡＩとＡＤＡ２の各活性比を既知項とす
る連立方程式に代入し各アイソザイムの活性値を求める
方法もある（公開特許公報 昭０２−２５９６００）。
によるＡＤＡ総活性を測定して、このａ−ｊ定値を各基
質に対するＡＤＡＩとＡＤＡ２の各活性比を既知項とす
る連立方程式に代入し各アイソザイムの活性値を求める
方法もある（公開特許公報 昭０２−２５９６００）。
この方法はＡＤＡｌとＡＤＡ２を分離すること無く定量
することができる。
することができる。
しかし、上記したいずれの方法においても、ＡＤＡの量
は活性値として表すことになる。活性測定はアデノシン
あるいはデオキシアデノシンを基質として酵素反応を行
ない、■アデノシンの吸収（２０５ｎｍ ）の減少を７
１１定、■生成するアンモニアを定量、あるいは■生成
するイノシンをプリンヌクレオサイドホスホリラーゼ（
ＥＣ２，４，２，１，）とキサンチンオギシダーゼ（Ｅ
Ｃ１，２，３，２，）で尿酸に導いて７？３定すること
により行われている。
は活性値として表すことになる。活性測定はアデノシン
あるいはデオキシアデノシンを基質として酵素反応を行
ない、■アデノシンの吸収（２０５ｎｍ ）の減少を７
１１定、■生成するアンモニアを定量、あるいは■生成
するイノシンをプリンヌクレオサイドホスホリラーゼ（
ＥＣ２，４，２，１，）とキサンチンオギシダーゼ（Ｅ
Ｃ１，２，３，２，）で尿酸に導いて７？３定すること
により行われている。
活性測定による定量はＡＤＡの絶対的な蛋白質量を求め
ることが不可能である。また、活性測定系に阻害剤など
の活性値に影響を与えるものが存在する場合には、さら
に定量に疑問が生じる。
ることが不可能である。また、活性測定系に阻害剤など
の活性値に影響を与えるものが存在する場合には、さら
に定量に疑問が生じる。
（発明が解決しようとする課題）
本発明の目的は、ＡＤＡの各アイソザイムに特異的なモ
ノクローナル抗体を用いることによって、従来の方法よ
りもより簡便な操作でかつ安全に短時間に、加えて高感
度にＡＤＡアイソザイムを免疫学的に分別ａ＞＋定する
方法を提供することにある。
ノクローナル抗体を用いることによって、従来の方法よ
りもより簡便な操作でかつ安全に短時間に、加えて高感
度にＡＤＡアイソザイムを免疫学的に分別ａ＞＋定する
方法を提供することにある。
（課題を解決するための手段）
本発明者らは、上記課題に関し鋭意検討した結果、本発
明に到達した。即ち本発明は、試料中のＡＤＡを測定す
る方法において、ＡＤＡｌとＡＤＡ２のそれぞれを特異
的に認識し、かつ互いに交差反応を示さないモノクロー
ナル抗体を用いることを特徴とする試料中のＡＤＡアイ
ソザイムの分別定量方法にある。
明に到達した。即ち本発明は、試料中のＡＤＡを測定す
る方法において、ＡＤＡｌとＡＤＡ２のそれぞれを特異
的に認識し、かつ互いに交差反応を示さないモノクロー
ナル抗体を用いることを特徴とする試料中のＡＤＡアイ
ソザイムの分別定量方法にある。
以下その詳細について説明する。
モノクローナル抗体は、ＡＤＡｌとＡＤＡ２のそれぞれ
について、特異的でかつ交差反応を示さないものが必要
であり、それを用いてそれぞれの免疫学的７１？１定法
を行なう。本発明方法において、用いられるモノクロー
ナル抗体は、方法自体は公知であるケーラーとミルスタ
インの方法（Ｇ、 Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｃ，Ｍｉｌｓ
ｔｅｉｎ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２５Ｇ 。
について、特異的でかつ交差反応を示さないものが必要
であり、それを用いてそれぞれの免疫学的７１？１定法
を行なう。本発明方法において、用いられるモノクロー
ナル抗体は、方法自体は公知であるケーラーとミルスタ
インの方法（Ｇ、 Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｃ，Ｍｉｌｓ
ｔｅｉｎ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２５Ｇ 。
４９５ 、 （１９７５） ）に準じて行なうことに
より、得ることかできる。
より、得ることかできる。
以上の方法により、ＡＤＡの各アイソザイムを特異的に
認識する複数種のモノクローナル抗体を得た。これらの
抗体の結合定数は、ｌＯ〜ｌｏ１１Ｍ−１の範囲内であ
った。これらのモノクローナル抗体を使って、ＡＤＡの
各アイソザイムを定量的に測定できるサンドイッチ法、
競合法などの免疫学的ｉｌｌｌｌ法が可能となった。
認識する複数種のモノクローナル抗体を得た。これらの
抗体の結合定数は、ｌＯ〜ｌｏ１１Ｍ−１の範囲内であ
った。これらのモノクローナル抗体を使って、ＡＤＡの
各アイソザイムを定量的に測定できるサンドイッチ法、
競合法などの免疫学的ｉｌｌｌｌ法が可能となった。
例えば、サンドイツチ法による免疫学的方法では、一方
の抗体を固相に固定化するのが好ましいが、その方法は
、公知の方法を採用でき、固相としては例えば、ポリス
チレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネ
ート、セファロース粒子、ラテックス、アガロース、セ
ルロース、ポリメタアクリレート、ガラスなどが使用さ
れる。
の抗体を固相に固定化するのが好ましいが、その方法は
、公知の方法を採用でき、固相としては例えば、ポリス
チレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネ
ート、セファロース粒子、ラテックス、アガロース、セ
ルロース、ポリメタアクリレート、ガラスなどが使用さ
れる。
また他方の抗体の標識化の方法とその検出方法もなんら
限定されるものでなく、公知の方法により標識化および
検出することができる。標識として酵素を用いる場合、
標識物質としては例えば、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ウレアー
ゼ、カタラーゼ。
限定されるものでなく、公知の方法により標識化および
検出することができる。標識として酵素を用いる場合、
標識物質としては例えば、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ウレアー
ゼ、カタラーゼ。
β−グルクロニダーゼなどの酵素が使われる。放射性物
質としては、 Ｈ，Ｉ、または Ｉ等が、蛍光物質を
使用する方法としては、例えば、フルオレスカミン、フ
ルオレッセンチオシアネート、テトラローダミンイソチ
オシアネート等が常法によりモノクローナル抗体に結合
される。しかしながら、標識物質は上記物質に何ら限定
されるべきものではない。
質としては、 Ｈ，Ｉ、または Ｉ等が、蛍光物質を
使用する方法としては、例えば、フルオレスカミン、フ
ルオレッセンチオシアネート、テトラローダミンイソチ
オシアネート等が常法によりモノクローナル抗体に結合
される。しかしながら、標識物質は上記物質に何ら限定
されるべきものではない。
また、試料、抗体の反応系への添加順序にも特に限定は
なく、さらに１ステップ法、２ステツプ法のどちらを採
用してもよい。
なく、さらに１ステップ法、２ステツプ法のどちらを採
用してもよい。
測定に使用される試薬は、上記物質以外にも、基質５溶
解剤、緩衝剤、洗浄剤１反応停止剤等の公知の試薬が用
いられる。
解剤、緩衝剤、洗浄剤１反応停止剤等の公知の試薬が用
いられる。
（発明の効果）
以上の説明から明らかなように本発明によれば、（１）
試料中のＡＤＡ各アイソザイム濃度は、１．２５〜３２
０ ｎ ｇ ／ ｍｌの範囲内で測定することができ、
（２）従来法に比べて極めて簡便な操作で短時間に、か
つ感度よく多数の検体の測定が可能である。
試料中のＡＤＡ各アイソザイム濃度は、１．２５〜３２
０ ｎ ｇ ／ ｍｌの範囲内で測定することができ、
（２）従来法に比べて極めて簡便な操作で短時間に、か
つ感度よく多数の検体の測定が可能である。
（実施例）
以下、本発明を実施例にてさらに詳細に説明するが、本
発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
（実施例１）
（イ）抗原感作動物細胞の調製
Ｂａ１ｂ／ｃｖウス（♀）をＡＤＡｌで免疫した。
免疫は、マウスの腹腔にフロイントの完全アジュバント
とＡＤＡＩ ５０μｇ／匹とを乳化させた試料１００
μｌを投与した。２週間後に追加免疫としてＡＤＡｌ
５０μｇ／匹をフロイントの不完全アジュバントと乳
化させたちの１００μｌをマウス腹腔に投与した。１週
間後最終免疫としてＡＤＡ １５０μｇ／匹をリン酸緩
衝化生理食塩水（０，８５％ＮａＣ１含有０．０１％リ
ン酸′ａ！衝液、ｐ１１７．２ 二以下ＰＢＳ ）に溶
解したちの１００μｌを腹腔内に投与した。３日後この
処置マウスの肺臓を無菌的に取出した。１５％子牛脂児
血清（以下１５％ＦＣ８と省略する）を含むＤＨＥＭＩ
Ｏｍｌを注射器で吸い取り２７ゲージの注射針をつけた
。肺臓を氷冷しておいたデイツシュに入れ、注射針で数
か所穴をあけた。注射針を差し込み還流し肺臓細胞をデ
イツシュに流出させた。流出液をナイロンメツシュで濾
過し遠心チューブに入れ、１１０００ｒｐで１０分間遠
心分離して上澄をすてた。細胞ペレット中の赤血球を０
．１５Ｍ塩化アンモニウム溶液（１ｍＭエチレンジアミ
ン４酢酸−２ナトリウム塩（以下ＥＤＴＡと省略する）
を含む０．０１Ｍ炭酸緩衝液、ｐｌ＋７．２ ）で溶血
させ遠心分離し、さらに細胞ペレットをＤＭＥＭで２回
同様に遠心洗浄して肺細胞とした。
とＡＤＡＩ ５０μｇ／匹とを乳化させた試料１００
μｌを投与した。２週間後に追加免疫としてＡＤＡｌ
５０μｇ／匹をフロイントの不完全アジュバントと乳
化させたちの１００μｌをマウス腹腔に投与した。１週
間後最終免疫としてＡＤＡ １５０μｇ／匹をリン酸緩
衝化生理食塩水（０，８５％ＮａＣ１含有０．０１％リ
ン酸′ａ！衝液、ｐ１１７．２ 二以下ＰＢＳ ）に溶
解したちの１００μｌを腹腔内に投与した。３日後この
処置マウスの肺臓を無菌的に取出した。１５％子牛脂児
血清（以下１５％ＦＣ８と省略する）を含むＤＨＥＭＩ
Ｏｍｌを注射器で吸い取り２７ゲージの注射針をつけた
。肺臓を氷冷しておいたデイツシュに入れ、注射針で数
か所穴をあけた。注射針を差し込み還流し肺臓細胞をデ
イツシュに流出させた。流出液をナイロンメツシュで濾
過し遠心チューブに入れ、１１０００ｒｐで１０分間遠
心分離して上澄をすてた。細胞ペレット中の赤血球を０
．１５Ｍ塩化アンモニウム溶液（１ｍＭエチレンジアミ
ン４酢酸−２ナトリウム塩（以下ＥＤＴＡと省略する）
を含む０．０１Ｍ炭酸緩衝液、ｐｌ＋７．２ ）で溶血
させ遠心分離し、さらに細胞ペレットをＤＭＥＭで２回
同様に遠心洗浄して肺細胞とした。
（ロ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としてはＢａ１ｂ／ｃマウス由来の８−アザ
グアニン耐性株として、５Ｐ２１０− Ａｇ１４ （以
下５ｐ２１０と省略する）を使用した。細胞融合を行う
１週間前まで２０μｇ ／ ｍｌの８−アザグアニン、
■５％ＦＣ３を含むＤＭＥＭで培養し、その後細胞融合
日まで１５％ＦＣ８を含むＤＭＩＥＭを使用した。細胞
融合直前に、５Ｐ２１０を無菌的にＤＭＥＭでｌｏｏｏ
ｒｐｍで１０分間遠心洗浄を２回繰り返し、調製した。
グアニン耐性株として、５Ｐ２１０− Ａｇ１４ （以
下５ｐ２１０と省略する）を使用した。細胞融合を行う
１週間前まで２０μｇ ／ ｍｌの８−アザグアニン、
■５％ＦＣ３を含むＤＭＥＭで培養し、その後細胞融合
日まで１５％ＦＣ８を含むＤＭＩＥＭを使用した。細胞
融合直前に、５Ｐ２１０を無菌的にＤＭＥＭでｌｏｏｏ
ｒｐｍで１０分間遠心洗浄を２回繰り返し、調製した。
（ハ）細胞融合
上記（イ）項で調製した肺臓細胞と上記（ロ）項で調製
した骨髄腫細胞を５＝１の割合で混合遠心（１０００ｒ
ｐ ｍ、 １０分）し、細胞ペレットを集めた。遠心
チューブを軽くたたいて細胞ペレットを壁面にうずく広
げた。その中に３７℃に暖めておいた５０％ポリエチレ
ングリコール（ＭＥＲＫ社製ポリエチレングリコール４
０００）を含むＤＨＰＭ溶液０．５ｍｌを遠心チューブ
を回しながら少しずつ滴下した。
した骨髄腫細胞を５＝１の割合で混合遠心（１０００ｒ
ｐ ｍ、 １０分）し、細胞ペレットを集めた。遠心
チューブを軽くたたいて細胞ペレットを壁面にうずく広
げた。その中に３７℃に暖めておいた５０％ポリエチレ
ングリコール（ＭＥＲＫ社製ポリエチレングリコール４
０００）を含むＤＨＰＭ溶液０．５ｍｌを遠心チューブ
を回しながら少しずつ滴下した。
１分間ゆっくりと遠心チューブを回転させ混合した後、
３０秒に１ ｍｌの割合で、遠心チューブを回転しなが
ら３７℃に加温しておいたＤＭＥＭを１０回加えた。つ
ぎにＦｅ２を２ ｍｌゆっくりと入れ、１０００ｒ ｐ
ｍ、 １０分間遠心した。細胞ペレットを１５９δＰ
Ｃ３とＩ Ｘ １０−’Ｍヒボキサンチン、４Ｘ１０−
７Ｍアミノプテリン、 １．Ｇ Ｘｌ０−５Ｍチミジン
を含むＤＭ膣（以下ＨＡＴ培地と省略する）で２回遠心
洗浄（］０００ｒ ｐ ｍ、 １０分間）する。この培
養液を９６ウエルプレート（Ｆａ １ｃｏｎ＃３０４２
）に５×１０５細胞個／ウェルになるように２００μｌ
ずつ分注した。３８目ごとにＨＡＴ培地を１００μｌ／
ウエル交換した。３週間後からは、Ｉ Ｘ １０−’Ｍ
ヒポキサンチン、 Ｌ、６ Ｘ１０−５Ｍチミジンと１
５％ｐｃｓを含むＤＭＥＭ （以下１１Ｔ培地と省略す
る）を培地交換に用いた。
３０秒に１ ｍｌの割合で、遠心チューブを回転しなが
ら３７℃に加温しておいたＤＭＥＭを１０回加えた。つ
ぎにＦｅ２を２ ｍｌゆっくりと入れ、１０００ｒ ｐ
ｍ、 １０分間遠心した。細胞ペレットを１５９δＰ
Ｃ３とＩ Ｘ １０−’Ｍヒボキサンチン、４Ｘ１０−
７Ｍアミノプテリン、 １．Ｇ Ｘｌ０−５Ｍチミジン
を含むＤＭ膣（以下ＨＡＴ培地と省略する）で２回遠心
洗浄（］０００ｒ ｐ ｍ、 １０分間）する。この培
養液を９６ウエルプレート（Ｆａ １ｃｏｎ＃３０４２
）に５×１０５細胞個／ウェルになるように２００μｌ
ずつ分注した。３８目ごとにＨＡＴ培地を１００μｌ／
ウエル交換した。３週間後からは、Ｉ Ｘ １０−’Ｍ
ヒポキサンチン、 Ｌ、６ Ｘ１０−５Ｍチミジンと１
５％ｐｃｓを含むＤＭＥＭ （以下１１Ｔ培地と省略す
る）を培地交換に用いた。
（ニ）ハイブリドーマの選択
９６ウエルプレートに細胞コロニーが認められる１０口
目前後から固相酵索免疫潤定法を行い、培養上清に抗Ａ
ＤＡＩ抗体が存在するかどうか調べた。
目前後から固相酵索免疫潤定法を行い、培養上清に抗Ａ
ＤＡＩ抗体が存在するかどうか調べた。
９６ウエルイムノプレート平底（インターメッド社製）
に、Ａ Ｄ Ａ １ ２ ｕ ｇ ／ ｍｌを５０μｌ
／ウェル分注し、３７℃で１，５時間静置した。ウェル
に残っている溶液を除去し、ＰＢＳに０．０４％ツイー
ン（ｔｗｅｅｎ ）−２０を含んだ溶液（以下ＰＢＳ−
Ｔ）で３回洗浄した後、０，１％ウシ血清アルブミン（
以下ＢＳＡ ）を溶解したＰＢＳ−Ｔ溶液３００μｌを
各ウェルに加えて、３７℃で１．５時間ブロッキング処
理した。つぎに各ウェルに上記培養上清を１００μｌず
つ分注し３７℃で１．５時間静置した。これらのウェル
をＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ
標識ラビット抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン社製）
４０００倍希釈を５０μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃
で１．５時間静置した。ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した
のち、基質溶液（ｌ、２％ ２，２−アジノジー（３−
エチルベンズチアゾリン硫酸）−ジアンモニウム塩（Ａ
ＢＴＳ）及び０．０１％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含有
する０、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，ｌ ） ）を各
ウェルに１００μｌ添加した。３０分間室温で放置し、
２．００ｍＭシュウ酸溶液を１００μｌを加えて酵素反
応を停止させた。４１５ｎｍでの吸光度をΔＩ１１定し
、酵素活性が認められたつ再ルに抗ＡＤＡ１抗体を産生
ずるハイブリドーマが存在することがわかる。以上のよ
うにして、抗体価の強い抗体産生ハイブリドーマを取得
した。
に、Ａ Ｄ Ａ １ ２ ｕ ｇ ／ ｍｌを５０μｌ
／ウェル分注し、３７℃で１，５時間静置した。ウェル
に残っている溶液を除去し、ＰＢＳに０．０４％ツイー
ン（ｔｗｅｅｎ ）−２０を含んだ溶液（以下ＰＢＳ−
Ｔ）で３回洗浄した後、０，１％ウシ血清アルブミン（
以下ＢＳＡ ）を溶解したＰＢＳ−Ｔ溶液３００μｌを
各ウェルに加えて、３７℃で１．５時間ブロッキング処
理した。つぎに各ウェルに上記培養上清を１００μｌず
つ分注し３７℃で１．５時間静置した。これらのウェル
をＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ
標識ラビット抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン社製）
４０００倍希釈を５０μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃
で１．５時間静置した。ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した
のち、基質溶液（ｌ、２％ ２，２−アジノジー（３−
エチルベンズチアゾリン硫酸）−ジアンモニウム塩（Ａ
ＢＴＳ）及び０．０１％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含有
する０、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，ｌ ） ）を各
ウェルに１００μｌ添加した。３０分間室温で放置し、
２．００ｍＭシュウ酸溶液を１００μｌを加えて酵素反
応を停止させた。４１５ｎｍでの吸光度をΔＩ１１定し
、酵素活性が認められたつ再ルに抗ＡＤＡ１抗体を産生
ずるハイブリドーマが存在することがわかる。以上のよ
うにして、抗体価の強い抗体産生ハイブリドーマを取得
した。
（ホ）コンデショニングメデウムの調製２６ゲージの注
射針をつけた注射器に１０ｍ１の冷蔵しておいたＯＪ４
Ｍサッカロース溶液を吸い取る。
射針をつけた注射器に１０ｍ１の冷蔵しておいたＯＪ４
Ｍサッカロース溶液を吸い取る。
１３ａｉｂ／ｃマウス（♂）をを椎脱臼させ、無菌的に
股腔内に上記溶液を注入する。注入後５分以内に左側腹
部に１８ゲージの注射針をつけ水冷しておいた注射器に
て腹腔内溶液を回収する。水冷しておいた遠心チューブ
に上記回収液を流し込み、１１０００ｒｐで５分間遠心
分離する。遠心後上清を廃棄し、細胞ベレットに１５％
ＰＣ８−ＤＭＩＥＭを加え攪拌しデイツシュに入れた。
股腔内に上記溶液を注入する。注入後５分以内に左側腹
部に１８ゲージの注射針をつけ水冷しておいた注射器に
て腹腔内溶液を回収する。水冷しておいた遠心チューブ
に上記回収液を流し込み、１１０００ｒｐで５分間遠心
分離する。遠心後上清を廃棄し、細胞ベレットに１５％
ＰＣ８−ＤＭＩＥＭを加え攪拌しデイツシュに入れた。
３７℃、５％炭酸ガス濃度。
９５％湿度で一晩培養する。培養上清を集め、０．２２
μｍのメンブレンフィルターで濾過し、これをコンデシ
ョニングメデウムとした。
μｍのメンブレンフィルターで濾過し、これをコンデシ
ョニングメデウムとした。
（へ）クローニング
抗体産生を認めるハイブリドーマについて限界希釈法を
用いて単一クローンにした。上記（ホ）項で作製したコ
ンデショニングメデウムを１ ｍｌ含むＨＡＴ培地２０
ｍ１を用意した。クローニングしたいハイブリドーマ細
胞を各ウェルに１個になるように上記培養液中に調製し
、２００μｌ／ウエルずつ９６ウエルプレー） （Ｆａ
ｌｃｏｎ＃ ３０４２）に分注した。
用いて単一クローンにした。上記（ホ）項で作製したコ
ンデショニングメデウムを１ ｍｌ含むＨＡＴ培地２０
ｍ１を用意した。クローニングしたいハイブリドーマ細
胞を各ウェルに１個になるように上記培養液中に調製し
、２００μｌ／ウエルずつ９６ウエルプレー） （Ｆａ
ｌｃｏｎ＃ ３０４２）に分注した。
培養１０日目前後から細胞コロニーが認められるウェル
について、上記（ニ）項に記載した固相酵素免疫１１１
１１定法に準じて抗ＡＤＡ１抗体産生ハイブリドーマを
選択し、さらに再度クローニングを繰り返し単一ハイブ
リドーマを樹立した。最終的に２７クローンのハイブリ
ドーマを確立した。
について、上記（ニ）項に記載した固相酵素免疫１１１
１１定法に準じて抗ＡＤＡ１抗体産生ハイブリドーマを
選択し、さらに再度クローニングを繰り返し単一ハイブ
リドーマを樹立した。最終的に２７クローンのハイブリ
ドーマを確立した。
（ト）抗ＡＤＡ１モノクローナル抗体の精製Ｂａ１ｂ／
ｃｖウス（♂）６〜１０週令の腹腔に２゜６、１０．１
４−テトラメチルペンタデカンを０．５ｍｌ／匹投与す
る。２週間後上記（へ）項で得られた抗ＡＤＡ１抗体産
生ハイブリドーマ株をマウス腹腔内に各クローンについ
て２ Ｘ １０６細胞個／匹移植した。ｌＯ日目前後に
生成した腹水を、１８ゲージの注射針を腹腔に差し込み
、１／２０ｆｆｉの０．２Ｍ・ＥＤＴＡをいれた遠心チ
ューブに滴下させる。遠心チューブを４０００ｒｐ１１
で１０分間遠心し、上清を集める。
ｃｖウス（♂）６〜１０週令の腹腔に２゜６、１０．１
４−テトラメチルペンタデカンを０．５ｍｌ／匹投与す
る。２週間後上記（へ）項で得られた抗ＡＤＡ１抗体産
生ハイブリドーマ株をマウス腹腔内に各クローンについ
て２ Ｘ １０６細胞個／匹移植した。ｌＯ日目前後に
生成した腹水を、１８ゲージの注射針を腹腔に差し込み
、１／２０ｆｆｉの０．２Ｍ・ＥＤＴＡをいれた遠心チ
ューブに滴下させる。遠心チューブを４０００ｒｐ１１
で１０分間遠心し、上清を集める。
採取した上清を５０％硫酸アンモニウム沈殿分画法にし
たがって粗精製し、０．０５％アジ化ナトリウムを含む
ＰＢＳ溶液に透析後、イオン交換クロマトグラフィー、
ゲル濾過をおこない精製した。メルカプトエタノール還
元下での１２％５Ｏ９−ポリアクリルアミド電気泳動で
１本の重鎮と１本の軽鎖の２本のバンドになったことで
抗体の純度を確認した。
たがって粗精製し、０．０５％アジ化ナトリウムを含む
ＰＢＳ溶液に透析後、イオン交換クロマトグラフィー、
ゲル濾過をおこない精製した。メルカプトエタノール還
元下での１２％５Ｏ９−ポリアクリルアミド電気泳動で
１本の重鎮と１本の軽鎖の２本のバンドになったことで
抗体の純度を確認した。
（チ）抗ＡＤＡ １抗体の固定化
未処理マイクロタイタープレート（９６ウエル・ヌンク
プレート、インターメッド社製）の各ウェルに０．１
Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐｌ＋９．６ ）に溶解した
３μｇ ／ ｍｌのマウス由来の抗ＡＤＡ １モノクロ
一ナル抗体（名称Ａとする）の溶液２００μｌを加えて
、４℃−夜インキユベートした。次に、各ウェルの溶液
を除去し、リン酸緩衝化生理食塩水（０，８５％ＮａＣ
１含有０．０１％リン酸緩衝液、ｐＨ７，２：以下ＰＢ
ｓ ）に０．０４％ツイーン（ｔｗｅｅｎ ）−２０を
含んだ溶液（以下ＰＢＳ−Ｔ ）で３回洗浄り、 ｌユ
後、０．１％ウシ血清アルブミン（以下１３ＳＡ ）を
溶解したＰＩ３５−Ｔ溶液３００μｌを各ウェルに加え
て、４℃でブロッキング処理しそのまま保存した。
プレート、インターメッド社製）の各ウェルに０．１
Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐｌ＋９．６ ）に溶解した
３μｇ ／ ｍｌのマウス由来の抗ＡＤＡ １モノクロ
一ナル抗体（名称Ａとする）の溶液２００μｌを加えて
、４℃−夜インキユベートした。次に、各ウェルの溶液
を除去し、リン酸緩衝化生理食塩水（０，８５％ＮａＣ
１含有０．０１％リン酸緩衝液、ｐＨ７，２：以下ＰＢ
ｓ ）に０．０４％ツイーン（ｔｗｅｅｎ ）−２０を
含んだ溶液（以下ＰＢＳ−Ｔ ）で３回洗浄り、 ｌユ
後、０．１％ウシ血清アルブミン（以下１３ＳＡ ）を
溶解したＰＩ３５−Ｔ溶液３００μｌを各ウェルに加え
て、４℃でブロッキング処理しそのまま保存した。
（す）西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下１１ＲＰ ）
標識抗体の調製 ０．３Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ！１８．１ ）に
溶解したＩ（ＲＰ溶液（５ｍｇ／ｍりに１％ １−フル
オロ−２，４−ジニトロベンゼンのエタノール溶液０．
１ｍｌを加え、室温にて１時間反応させた。
標識抗体の調製 ０．３Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ！１８．１ ）に
溶解したＩ（ＲＰ溶液（５ｍｇ／ｍりに１％ １−フル
オロ−２，４−ジニトロベンゼンのエタノール溶液０．
１ｍｌを加え、室温にて１時間反応させた。
その溶液に０．０６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１．０ｍｌ
を添加し３０分反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナトリ
ウムを０．１６Ｍのエチレングリコール１．０ｍｌを加
えて除去した後、０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９，５）で透析した。次に、マウス由来抗ＡＤＡ１モ
ノクローナル抗体（名称Ｂとする。モ／′クローナル抗
体Ａとは異なる部位を認識するもの）５ｍｇを加えて５
〜６時間反応させた。水素化ホウ素ナトリウム５ ｍｇ
を添加して４℃中で一夜放置した。この後、未反応の水
素化ホウ素ナトリウムを除去するため、０，８５％塩化
ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，１）に対して４℃で一夜攪拌しながら透析した。
を添加し３０分反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナトリ
ウムを０．１６Ｍのエチレングリコール１．０ｍｌを加
えて除去した後、０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９，５）で透析した。次に、マウス由来抗ＡＤＡ１モ
ノクローナル抗体（名称Ｂとする。モ／′クローナル抗
体Ａとは異なる部位を認識するもの）５ｍｇを加えて５
〜６時間反応させた。水素化ホウ素ナトリウム５ ｍｇ
を添加して４℃中で一夜放置した。この後、未反応の水
素化ホウ素ナトリウムを除去するため、０，８５％塩化
ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，１）に対して４℃で一夜攪拌しながら透析した。
上記反応物をＴＳＫ−ゲルＧ−３０００ＳＷ （東ソー
株式会社製、商品名）を用いて高速液体クロマトグラフ
ィーにて精製し、＋１１？ Ｐ標識抗体とした。
株式会社製、商品名）を用いて高速液体クロマトグラフ
ィーにて精製し、＋１１？ Ｐ標識抗体とした。
（ヌ）試料中のＡＤＡｌの定量
本実施例中の（チ）で記述した方法で作製したマイクロ
タイタープレートを室温にもどし、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗
浄した後、ＡＤＡｌを含む標準試料を各ウェルにそれぞ
れ２０μｌ加えた。つぎに本実施例（す）で得たＩＩ
ＲＰ標識抗体をＰ １３８− Ｔ溶液で希釈し、各ウェ
ルに２００μｌずつ添加した。そのまま室温で３時間イ
ンキュベートした後、溶液を除去しＰＢＳ−Ｔ溶液で３
回洗浄した。それに、１．２％２．２−アジノジー（３
−エチルベンズチアゾリン硫酸）−ジアンモニウム塩及
び０，０１％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含有する０、１
Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ１４，１）から成る基質溶液を
各ウェルに２００μｌ添加し、室温で３０分間酵素反応
させた後、２００ｍＭシュウ酸溶液を１００μｌ加えて
酵素反応を停止させた。上記マイクロタイタープレート
を各ウェルについて、波長４１５ｎｍ 、対照波長４９
２ｎｍの吸光強度を自動マイクロタイタープレートリー
ダー（東ソー株式会社製、ＭＰＲ−Ａ４、商品名）で測
定した。結果を表１に示す。表１から明らかなように、
試料中のＡＤＡｌは１．２５〜３２０ ｎ ｇ／ｍｌの
範囲で定量できることが確認された。
タイタープレートを室温にもどし、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗
浄した後、ＡＤＡｌを含む標準試料を各ウェルにそれぞ
れ２０μｌ加えた。つぎに本実施例（す）で得たＩＩ
ＲＰ標識抗体をＰ １３８− Ｔ溶液で希釈し、各ウェ
ルに２００μｌずつ添加した。そのまま室温で３時間イ
ンキュベートした後、溶液を除去しＰＢＳ−Ｔ溶液で３
回洗浄した。それに、１．２％２．２−アジノジー（３
−エチルベンズチアゾリン硫酸）−ジアンモニウム塩及
び０，０１％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含有する０、１
Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ１４，１）から成る基質溶液を
各ウェルに２００μｌ添加し、室温で３０分間酵素反応
させた後、２００ｍＭシュウ酸溶液を１００μｌ加えて
酵素反応を停止させた。上記マイクロタイタープレート
を各ウェルについて、波長４１５ｎｍ 、対照波長４９
２ｎｍの吸光強度を自動マイクロタイタープレートリー
ダー（東ソー株式会社製、ＭＰＲ−Ａ４、商品名）で測
定した。結果を表１に示す。表１から明らかなように、
試料中のＡＤＡｌは１．２５〜３２０ ｎ ｇ／ｍｌの
範囲で定量できることが確認された。
また同様の方法で、ただしＡＤＡ２ ３２０ｎｇ／ｍ１
の試料を用いて、モノクロルナル抗体Ａ、ＢのＡＤＡ２
への交差反応性を検討した結果を表２に示す。表２から
明らかなように、これらは、ＡＤＡ２への交差反応性は
見られなかった。
の試料を用いて、モノクロルナル抗体Ａ、ＢのＡＤＡ２
への交差反応性を検討した結果を表２に示す。表２から
明らかなように、これらは、ＡＤＡ２への交差反応性は
見られなかった。
表１
表２
（実施例２）
実施例１と同様にして、但ＡＤＡ１のかわりにＡＤＡ２
を用いて免疫し、２種の抗ＡＤＡ２モノクローナル抗体
（相異なる抗原部位を認識するもの、名称Ｃ，Ｄとする
）を得、試料中のＡＤＡ２濃度を７Ｉｌ１１定した。結
果を表３に示す。表３から明らかなように、試料中のＡ
ＤＡ２は１．２５〜３２０ｎ ｇ ／ ｍｌの範囲で定
量できることが確認された。
を用いて免疫し、２種の抗ＡＤＡ２モノクローナル抗体
（相異なる抗原部位を認識するもの、名称Ｃ，Ｄとする
）を得、試料中のＡＤＡ２濃度を７Ｉｌ１１定した。結
果を表３に示す。表３から明らかなように、試料中のＡ
ＤＡ２は１．２５〜３２０ｎ ｇ ／ ｍｌの範囲で定
量できることが確認された。
また同様の方法で、ただしＡＤＡＩ ａ２０ｎｇ／ｍ
ｌの試料を用いて、モノクローナル抗体Ｃ，ＤのＡＤＡ
１への交差反応性を検討した結果を表４に示す。表４
から明らかなように、これらは、ＡＤＡｌへの交差反応
性は見られなかった。
ｌの試料を用いて、モノクローナル抗体Ｃ，ＤのＡＤＡ
１への交差反応性を検討した結果を表４に示す。表４
から明らかなように、これらは、ＡＤＡｌへの交差反応
性は見られなかった。
Claims (3)
- （１）試料中のヒトアデノシンデアミナーゼを測定する
方法において、ヒトアデノシンデアミナーゼアイソザイ
ム１とヒトアデノシンデアミナーゼアイソザイム２のそ
れぞれを特異的に認識し、かつ互いに交差反応を示さな
いモノクローナル抗体を用いることを特徴とする試料中
のヒトアデノシンデアミナーゼアイソザイムの分別定量
方法。 - （２）サンドイッチ免疫測定法を行う特許請求の範囲第
１項記載の方法。 - （３）試料中のヒトアデノシンデアミナーゼアイソザイ
ム１又はヒトアデノシンデアミナーゼアイソザイム２の
濃度が１．２５〜３２０ｎｇ／ｍｌである特許請求の範
囲第１項又は第２項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16879888A JPH0219768A (ja) | 1988-07-08 | 1988-07-08 | ヒトアデノシンデアミナーゼの免疫学的測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16879888A JPH0219768A (ja) | 1988-07-08 | 1988-07-08 | ヒトアデノシンデアミナーゼの免疫学的測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0219768A true JPH0219768A (ja) | 1990-01-23 |
Family
ID=15874673
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16879888A Pending JPH0219768A (ja) | 1988-07-08 | 1988-07-08 | ヒトアデノシンデアミナーゼの免疫学的測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0219768A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5160391A (en) * | 1991-04-15 | 1992-11-03 | James River Ii, Inc. | Method for the formation of a clamped wave seal structure |
-
1988
- 1988-07-08 JP JP16879888A patent/JPH0219768A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5160391A (en) * | 1991-04-15 | 1992-11-03 | James River Ii, Inc. | Method for the formation of a clamped wave seal structure |
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