JPH03200066A - 活性化ヒトプロテインｃの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、活性化ヒトプロティンＣに特異的なモノクロ
ーナル抗体、ヒトプロティンＣインヒビターに特異的な
モノクローナル抗体および、ヒトα１アンチトリプシン
に特異的なモノクローナル抗体を利用した活性化ヒトプ
ロティンＣの測定方法に関するものである。

（従来の技術） 血液凝固の制御反応の重要なものとして、ブロテアーゼ
による凝固因子の分解反応がある。この反応の主たるも
のは、プロティンＣによるものである。

プロティンＣはＧｌａ含有凝固因子（ビタミンに依存性
因子）の一つであり、循環血液中では２本鎖の前駆体と
して存在する。プロティンＣはトロンビンにより高分子
鎖のアミノ末端から１２個のアミノ酸が遊離して活性化
プロティンＣとなる。これが、凝固系のＶａ因子と■ａ
囚子を分解して失活させる。また、活性化プロティンＣ
はブラスミノーゲンアクチベーターインヒビターの活性
を抑制して線溶の凡退を起こす作用もある。

ヒトプロティンＣインヒビターは、血液凝固制御因子の
活性化プロティンＣの生理的阻害因子の１つである。精
製されたプロティンＣインヒビターは、試験管内では、
Ｘａ因子、トロンビン、ＸＩａ因子、血漿カリクレイン
、さらに線溶系プロテアーゼの組織プラスミノーゲンア
クチベーターや尿由来ブラスミノーゲンアクチベーター
（ウロキナーゼ）を阻害する。しかし、通常プロティン
Ｃがほとんど活性化されない状態での血液凝固過程を試
験管内で行うと、プロティンＣインヒビター活性の低下
はほとんど見られない。また、生体内でのプロティンＣ
インヒビターの濃度の変動はプロティンＣ濃度の変動と
良く一致することも知られている。これらのことより、
プロティンＣインヒビターは生体内ではプロティンＣと
最も良く反応するものと考えられる。

また、プロティンＣに対する別のインヒビターとして、
α、アンチトリプシンが作用することが報告されている
（Ｍ、Ｊ、Ｈｅｅｂ＆Ｊ、Ｈ。

Ｇｒｉ　ｆ　ｆ　ｉｎ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２６３．１１６１３．（１９８８））。

以上のことより、活性化プロティンＣをそのインヒビタ
ーとの複合体として測定することにより、血液凝固阻止
活性を検出することになる。また、前血栓状態とされる
糖尿病や、ＤＩＣの病理診断が可能になる。プロティン
Ｃの血中濃度は、健常人では約２〜８　ｍｇ／Ｉである
。

その測定方法としては、プロティンＣに対スるモノクロ
ーナル抗体を用いたＥＩＡが現在行われているが、活性
化されたプロティンＣの測定としては厳格な意味で向い
ていない。

（発明が解決しようとする課題） 本発明の目的は、従来の方法よりも正確に、短時間に、
高感度に活性化ヒトプロティンＣを免疫学的に測定する
方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明
に到達した。

すなわち本発明は、試料中の活性化ヒトプロティンＣを
測定する方法において、 （ａ）　　・活性化ヒトプロティンＣを特異的に認識す
る、固相に固定化されたモノクローナル抗体（１）、 ・試料、 ・ヒトプロテインＣインヒビターを特異的に認識すると
ころの標識されたまたは標識されていないモノクローナ
ル抗体（２） ・および、ヒトα、アンチトリプシンを特異的に認識す
るところの標識されたまたは標識されていないモノクロ
ーナル抗体（３）を接触させ （ｂ）　　（ａ）で標識されていないモノクローナル抗
体（２）　、　（３）を使用した場合には（ａ）で生じ
る免疫反応生成物、またはモノクローナル抗体（２）お
よび（３）を特異的に認識する標識された抗体を接触さ
せ、 （ｅ）遊離の又は固定化された標識化抗体の標識を、直
接的または間接的に検出して免疫反応生成物を定量する ことを特徴とする活性化ヒトプロティンＣの測定方法で
ある。

本発明のヒトプロティンＣインヒビター測定法は、ヒト
プロティンＣに特異的なモノクローナル抗体、ヒトプロ
ティンＣインヒビターに特異的なモノクローナル抗体お
よび、ヒトα、アンチトリプシンに特異的なモノクロー
ナル抗体を利用した血液中のヒトプロティンＣの免疫学
的測定法にあり、以下その詳細について説明する。

本発明方法において、用いられるモノクローナル抗体は
、調製自体公知である方法（Ｇ。

Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｃ，Ｍｉ　１ｓｔｅｉｎ。

Ｎａｔｕｒｅ、２５６，４９５．（１９７５））に準じ
て製造することができる。

以上の方法により、ヒトプロティンＣ１ヒトプロテイン
Ｃインヒビター又はヒトα、アンチトリプシンを特異的
に認識する複数種のモノクローナル抗体を得た。それぞ
れの抗体の結合定数は、］０７〜ＩＯＩＩＭ−１の範囲
内であった。これらのモノクローナル抗体を使って、ヒ
トプロティンＣを定量的に測定できるサンドイツチ法に
よる免疫学的測定方法が可能となった。

本発明方法に用いられる抗活性化ヒトプロティンＣ抗体
を固相に固定化する方法は、公知の方法を採用でき、固
相としては例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ
塩化ビニル、ポリカーボネート、セファロース粒子、ラ
テックス、アガロース、セルロース、ポリメタアクリレ
ートなどが使用される。

また抗ヒトプロティンＣインヒビター抗体および抗ヒト
α、アンチトリプシン抗体を標識する場合、標識化の方
法とその検出方法もなんら限定されるものでなく、公知
の方法により標識化および検出することができる。抗ヒ
トプロティンＣインヒビター抗体および抗ヒトα１アン
チトリプシン抗体が標識されていないものを用いる場合
には、これらの抗体又は免疫反応生成物を特異的に認識
する標識された抗体を用いる。

標識として間接的に検出されるもの、例えば酵素を用い
る場合、標識物質としては例えば、ペルオキシダーゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
ウレアーゼ、カタラーゼ、β−グルクロニダーゼなどの
酵素が使われる。また直接的に検出される標識、例えば
放射性物質としては、Ｊ　　＋２５１．または１３１工
等が、蛍光物質を使用する方法としては、例えば、フル
オレスカミン、フルオレラセンチオシアネート、テトラ
ローダミンイソチオシアネート等が常法によりモノクロ
ーナル抗体に結合される。しかしながら、標識物質は上
記物質に何ら限定されるべきものではない。

測定に使用される試薬は、上記物質以外にも、基質、溶
解剤、緩衝剤、洗浄剤、反応停止剤等の公知の試薬が用
いられる。

試料、抗体の添加順序には特に限定はない。

最終的に生成した免疫反応生成物、すなわち固定化され
た標識化抗体の標識又は遊離の抗体の標識を検出し、定
量すればよい。

（作用） 活性化ヒトプロティンＣは、試料中に共存するヒトプロ
ティンＣインヒビターまたはヒトα１アンチトリプシン
と複合体を形成している。従ってこの複合体を定量する
ことで、活性化ヒトプロティンＣを間接的に定量するこ
とができる。ヒトプロティンＣインヒビターは、ヒトプ
ロティンＣへの結合力は強いが、例えば血中での存在量
が少く、一方、ヒトα、アンチトリプシンはヒトプロテ
ィンＣへの結合力は弱いが、血中では多量に存在する。

そこで、活性化ヒトプロティンＣ−ヒトプロティンＣイ
ンヒビター複合体及び活性化ヒトプロティンＣ−ヒトα
１アンチトリプシン複合体の両方を測定することで、よ
り厳密に活性化ヒトプロティンＣを測定することができ
る。従って本発明方法では、この複合体を抗活性化プロ
ティンＣ抗体及び抗ヒトプロティンＣインヒビター抗体
、又は抗活性化ヒトプロティンＣ抗体及び抗ヒトα１ア
ンチトリプシン抗体でサンドイッチし、測定するのであ
る。

尚、試料中にヒトプロティンＣインヒビターとα、アン
チトリプシンが存在しない場合は、外部から添加して複
合体を形成させてから本発明法により測定すべきである
。しかし、試料がヒト血液であれば、両者ともその中に
含まれているので、外部から添加する必要はなく、そう
いったことからも試料はヒト血液であることが好ましい
。

（発明の効果） 以上の説明から明らかなように本発明によれば、（１）
血液中の活性化ヒトプロティンＣ濃度は、１〜２００ｎ
ｇ／ｍｌの範囲内で測定することができ、 （２）従来法に比べて極めて簡便な操作で短時間に、か
つより厳密な意味での活性化ヒトプロティンＣを感度よ
く多数の検体の測定が可能である。

（実施例） 以下に本発明の詳細な実施例を説明する。しかし、本発
明はこれら実施例にのみに限定されるものではない。

（モノクローナル抗体の調製） （Ａ）抗原感作動物細胞の調製 ヒトプロティンＣ１ヒトプロテインＣインヒビター、又
はヒトα１アンチトリプシンを抗原としてＢ　ａ　１　
ｂ　／　ｃマウス（♀）をそれぞれ免疫した。

免疫は、マウスの腹腔にフロイントの完全アジュバント
と抗原１００μｇ／匹とを乳化させた血液１００μｌを
投与した。２週間後に追加免疫として抗原１００μｇ／
匹をフロイントの不完全アジュバントと乳化させたちの
１００μｌをマウス腹腔に投与した。１週間後最終免疫
として抗原１００μｇ／匹をリン酸ｔ１！衝化生理食塩
水（０，８５％ＮａＣｌ含有０．０１％リン酸緩衝液、
ｐＨ７，２：以下ＰＢＳ）に溶解したちの１００μｌを
腹腔内に投与した。３日後この処置マウスの肺臓を無菌
的に取出した。１５％子牛脂児血清（以下１５％ＦＣＳ
と省略する）を含むＤＭＥＭＩ　Ｏｍ　１を注射器で吸
い取り２７ゲージの注射針をつけた。肺臓を水冷してお
いたデイツシュに入れ、注射針で数か新式をあけた。注
射針を差し込み還流し肺臓細胞をデイツシュに流出させ
た。流出液をナイロンメツシュで濾過し遠心チューブに
入れ、１０００　ｒ　ｐｍで１０分間遠心分離して上澄
をすてた。細胞ペレット中の赤血球を０．１５Ｍ塩化ア
ンモニウム溶液（１ｍＭエチレンジアミン４酢酸−２ナ
トリウム塩（以下ＥＤＴＡと省略する）を含む０．０１
Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ７，２）で溶血させ遠心分離し、さ
らに細胞ペレットをＤＭＥＭで２回同様に遠心洗浄して
肺細胞とした。

（Ｂ）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としてはＢａ１ｂ／ｃマウス由来の８−アザ
グアニン耐性株として、ＳＰ２１０−Ａｇ１４（以下Ｓ
　Ｐ　２１０と省略する）を使用した。

細胞融合を行う１週間前まで２０μｇ／ｍｌの８−アザ
グアニン、１５％ＦＣ３を含むＤＭＥＭで培養し、その
後細胞融合日まで１５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭを使用し
た。細胞融合直前に、５Ｐ２１０は無菌的にＤＭＥＭで
１１０００ｒｐで１０分間遠心洗浄を２回繰り返し調製
した。

（Ｃ）細胞融合 上記（Ａ）項で調製した肺臓細胞と上記（Ｂ）項で調製
した骨髄腫細胞を５＝１の割合で混合遠心（１０００ｒ
ｐｍ、１０分）し細胞ペレットを集めた。遠心チューブ
を軽くたたいて細胞ペレットを壁面にうずく広げた。そ
の中に３７℃に暖めておいた５０％ＰＥＧ　（ＭＥＲＫ
社製ポリエチレングリコール４０００）を含むＤＭＥＭ
溶液０．５ｍｌを遠心チューブを回しながら少しずつ滴
下した。１分間ゆっくりと遠心チューブを回転させ混合
した後、３０秒に１ｍｌの割合で遠心チューブを回転し
ながら３７℃に加温しておいたＤＭＥＭを１０回加えた
。つぎにＦｅ２を２ｍｌゆっくりと入れ、１１０００ｒ
ｐ、１０分間遠心した。細胞ペレットを１５％ＦＣＳと
ｌＸｌ０−’Ｍヒポキサンチン、４Ｘ１０−’Ｍアミノ
プテリン、１．６Ｘ１０−５Ｍチミジンを含むＤＭＥＭ
　（以下ＨＡＴ培地と省略する）で２回遠心洗浄（１０
００ｒｐｍ、１０分間）した。この培養液を９６ウエル
ブレー）　（Ｆａ　ｌ　ｃｏｎ＃３０４２）に５Ｘ１０
’細胞個／ウェルになるように２００μＩずつ分注した
。３日目ごとにＨＡＴ培地を１００μｌ／ウエル交換し
た。３週間後からは、ｌＸｌ０−’Ｍヒポキサンチン、
１．６Ｘ１０−’Ｍチミジンと１５％ＦＣＳを含むＤＭ
ＥＭ　（以下ＨＴ培地と省略する）を培地交換に用いた
。

（Ｄ）ハイブリドーマの選択 ９６ウエルプレートに細胞コロニーが認められるｌＯ０
日目後から固相酵素免疫測定法を行い、培養上清に特異
的抗体が存在するかどうか調べた。

９６ウエルプレート平底（インターメッド社製）に、各
抗原２μｇ　／　ｍ　１を５０μｌ／ウェル分注し、３
７℃で１．５時間静置する。ウェルに残っている溶液を
除去し、ＰＢＳに０．０４％ツイーン（ｔｗｅｅｎ）−
２０を含んだ溶液（以下ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後
、０．１％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡ）を溶解し
たＰＢＳ−Ｔ溶液３００μｌを各ウェルに加えて、３７
℃で１．５時間ブロッキング処理した。つぎに各ウェル
に上記培養上清を１００μｍずつ分注し３７℃で１．５
時間静置した。これらのウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗
浄した後、ペルオキシダーゼ標識ラビット抗マウスＩｇ
Ｇ抗体（ジャクソン社製）４０００倍希釈を５０μｍ／
ウェルずつ分注し、３７℃で１，５時間静置した。ＰＢ
Ｓ−Ｔ溶液で３回洗浄したのち、基質溶液（１，２％　
２，２−アジノジ＝（３−エチルベンズチアゾリン硫酸
）−ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び０．０１％過酸
化水素（Ｈ２０□）を含有する０、１Ｍクエン酸緩衝液
（ｐＨ５，１））を各ウェルに１００μｍ添加した。３
０分間室温で放置し、２００ｍＭシュウ酸溶液を１００
μｌを加えて酵素反応を停止させた。４１５ｎｍでの吸
光度を測定し、酵素活性が認められたウェルに特異的モ
ノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマが存在する
ことがわかる。以上のようにして、抗体価の強い抗体産
生ハイブリドーマを取得した。

（Ｅ）コンデショニングメデウムの調製２６ゲージの注
射針をつけた注射器に１０ｍ１の冷蔵しておいた０、３
４Ｍサッカロース溶液を吸い取った。Ｂａ１ｂ／ｃマウ
ス（♂）をを椎脱臼させ、無菌的に腹腔内に上記溶液を
注入した。

注入後５分以内に左側腹部に１８ゲージの注射針をつけ
水冷しておいた注射器にて腹腔内溶液を回収した。氷冷
しておいた遠心チューブに上記回収液を流し込み、１１
０００ｒｐで５分間遠心分離した。遠心後上清を廃棄し
、細胞ベレットに］５％ＦＣ５−ＤＭＥＭを加え攪拌し
プッシュに入れた。３７℃、５％炭酸ガス濃度、９５％
湿度で一晩培養した。培養上清を集め、０．２２μｍの
メンブレンフィルターで濾過し、これをコンデショニン
グメデウムとした。

（Ｆ）クローニング 抗体産生を認めるハイブリドーマについて限界希釈法を
用いて単一クローンにした。上記（Ｅ）項で作製したコ
ンデショニングメデウムを１ｍｌ含む１（ＡＴ培地２０
ｍ１を用意した。クローニングしたいハイブリドーマ細
胞を各ウェルに１個になるように上記培養液中に調整し
、２００μｌ／ウエルずつ９６ウエルプレート（Ｆａｌ
ｃｏｎ＃３０４２）に分注した。培養１０日目前後から
細胞コロニーが認められるウェルについて、上記（Ｄ）
項に記載した固相酵素免疫測定法に準じて抗体産生ハイ
ブリドーマを選択し、さらに再度クローニングを繰り返
し単一／１イブリドーマを樹立した。最終的に２７クロ
ーンの／Ｘイブリドーマを確立した。

（Ｇ）抗体の精製 Ｂａ１ｂ／ｃマウス（♂）６〜１０週令の腹腔にブリス
タン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン
）を０．５ｍｌ／匹投与した。２週間後上記（Ｆ）項で
得られた各特異的抗体産生ハイプリドーマ株をマウス腹
腔内に各クローンについて２Ｘ１０６細胞個／匹移植し
た。１０日目前後に生成した腹水を、１８ゲージの注射
針を腹腔に差し込み、１／２０量の０．２Ｍ−ＥＤＴＡ
をいれた遠心チューブに滴下させた。遠心チューブを４
００Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、上清を集めた。採取し
た上清を５０％硫酸アンモニウム沈殿分画法にしたがっ
て粗精製し、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ
溶液に透析後、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾
過をおこない精製した。メルカプトエタノール還元下で
の１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で１本の
重鎮と１本の軽鎖の２本のバンドになったことで抗体の
純度を確認した。

（酵素標識法によるヒトプロティンＣの測定）（Ａ）抗
ヒトプロティンＣ抗体の固定化未処理マイクロタイター
プレート（９６ウエル・ヌンクプレート、インターメツ
ド社製）の各ウェルにＯ，１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ９，６）に溶解した３μｇ　／　ｍ　１のマウス由
来の抗ヒトプロティンＣ抗体の溶液２００μ工を加えて
、４℃−夜インキユベートした。次に、各ウェルの溶液
を除去し、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、０．１％ＢＳ
Ａを溶解したＰＢＳ−Ｔ溶液３００μｌを各ウェルに加
えて、４℃でブロッキング処理しそのまま保存した。

（Ｂ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰ）標識
抗体の調製：０．３Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８
，１）に溶解したＨＲＰ溶液（５ｍｇ／　ｍ　１　）に
１％　１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのエタ
ノール溶液０．１ｍｌを加え、室温にて１時間反応させ
た。その溶液に０．０６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１．０
ｍｌを添加し３０分反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナ
トリウムを０．１６Ｍのエチレングリコール１．Ｏｍｌ
を加えて除去した後、０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ９，５）で透析した。次に、マウス由来抗ヒトプ
ロティンＣインヒビター・モノクローナル抗体５ｍｇを
加えて５〜６時間反応させた。水素化ホウ素ナトリウム
５ｍｇを添加して４℃中で一夜放置した。この後、未反
応の水素化ホウ素ナトリウムを除去するため、０．８５
％塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７，１）に対して４℃で一夜攪拌しながら透析
した。上記反応物をＴＳＫ−ゲルＧ−３０００５Ｗ　（
東ソー株式会社製、商品名）を用いて高速液体クロマト
グラフィーにて精製し、ＨＲＰｅＡ２抗体とした。同様
にして、抗ヒトα１アンチトリプシン抗体の標識抗体も
同様に調製した。

（Ｃ）血液中のヒトプロティンＣの定量本実施例中の（
Ａ）で記述した方法で作製したマイクロタイタープレー
トを室温にもどし、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した後、既知
量の活性化ヒトプロティンＣ・インヒビター複合体を含
む標準血液を各ウェルにそれぞれ２０μｍ加えた。つぎ
に本実施例（Ｂ）で得た２つのＨＲＰ標識抗体をＰＢＳ
−Ｔ溶液で希釈し、各ウェルに１００μｌずつ添加した
。そのまま室温で３時間インキュベートした後、溶液を
除去しＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。それに、１．２
％　ＡＢＴＳ及び０６０１％過酸化水素（Ｈ２０□）を
含有する０、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，１）から成
る基質溶液を各ウェルに２００μｍ添加し、室温で３０
分間酵素反応させた後、２００ｍＭシュウ酸溶液を１０
０μｌ加えて酵素反応を停止させた。上記マイクロタイ
タープレートを各ウェルについて、波長４１５ｎｍ、対
照波長４９２ｎｍの吸光強度を自動マイクロタイタープ
レートリーダー（東ソー株式会社製、ＭＰＲ−Ａ４、商
品名）で測定した。

結果を表１に示す。

表１ 表１から明らかなように、試料中のヒトプロティンＣは
１〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲で定量できることが確認さ
れた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 試料中の活性化ヒトプロテインＣを測定する方法におい
   て、 （ａ）・活性化ヒトプロテインＣを特異的に認識する、
   固相に固定化されたモノクローナル抗体（１）、 ・試料、 ・ヒトプロテインＣインヒビターを特異的に認識すると
   ころの標識されたまたは標識さ れていないモノクローナル抗体（２） ・および、ヒトα＿１アンチトリプシンを特異的に認識
   するところの標識されたまたは標識されていないモノク
   ローナル抗体（３） を接触させ （ｂ）（ａ）で標識されていないモノクローナル抗体（
   ２）、（３）を使用した場合には（ａ）で生じる免疫反
   応生成物、またはモノクローナル抗体（２）および（３
   ）を特異的に認識する標識された抗体を接触させ、 （ｃ）遊離の又は固定化された標識化抗体の標識を、直
   接的または間接的に検出して免疫反応生成物を定量する ことを特徴とする活性化ヒトプロテインＣの測定方法。