JPH0219905B2

JPH0219905B2 -

Info

Publication number: JPH0219905B2
Application number: JP193181A
Authority: JP
Inventors: Mikio Kamyama; Kenichiro Okaniwa; Shozo Kikukawa
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 1981-01-09
Filing date: 1981-01-09
Publication date: 1990-05-07
Also published as: JPS57116258A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、水性液体中の成分を分析する為の多
層分析素子に関する。より詳しく述べれば、本発
明は試薬の保存性を改良した多層分析素子に関す
る。従来、体液中に存在する特定の生化学的物質を
検出する分析素子が開発され、臨床試験等に使用
されている。これらは分析素子に含浸させた試薬
が検出対象となる物質と反応して呈色する現象を
利用するものである。最近特に、濾紙等に試薬を
含漬させた分析素子が広く使用されている。例えば米国特許第3050373号、又は同第3061523
号等に記載されているように、濾紙の如き繊維質
多孔性層に試薬溶液を浸漬して乾燥して作られる
ものがある。更にそれを用いて検出する時に種々
の妨害をさける試みがなされている。例えば特公昭50−39558号公報に記載されてい
るように、濾紙に試薬溶液を含浸させて乾燥させ
たものをエチルセルロースの如き溶液に浸漬し乾
燥することによつて半透性膜を被覆し、過剰の液
体試料の吸収を抑制したり、該液体試料の保持性
をコントロールしたり、或いは更に特公昭53−
6551号公報に記載されているように、試薬を含浸
させた濾紙の上に織物又はウエブ等の細かい網で
覆い、手の接触等による汚染から保護することが
行われている。これらの分析素子はその取扱いが簡単であり且
直ちに結果が得られるが、しばしば分析素子を不
均一に呈色させ分析結果にバラツキを生じさせる
ため定量性が劣り、定性分析もしくは半定量分析
にとどまつている。これは濾紙の如き繊維質の多
孔質層においてはまずその構造上均一なものを得
ることが難しく、これに試薬を含浸させた場合に
も均一な試薬の分析が得られないのが普通であり
更には、繊維質の濾紙の如きものを用いる場合に
は所謂クロマトグラフ現象のため、試薬含有層の
中で分析サンプル成分又は反応試薬に過度の非均
一泳動が起こり局部的な高濃度化が起こるためで
ある。これら従来の分析素子の欠点を改善し、かつ従
来のものに比べ、飛躍的にその定量性を向上した
ものとして、例えば、特公昭53−21677号公報の
如き多層分析素子が知られている。しかしながら上記多層分析素子も、この担体中
に含まれる試薬が貯蔵期間中に重大な劣化を示
し、従つて分析の精度及び信頼性に著しく不利益
を与える。これらは多層分析素子を構成する素材
が、水性流体に対し透過性を有している為空気及
び水の影響を大きくうけ、分析素子に含まれる過
酸化水物が指示組成物を酸化するのに触媒作用を
示すペルオキシダーゼの活性を劣化させる事によ
る。従つて水性流体の成分の濃度を正確かつ矛循な
く比例し検知可能な生成物を生成する事が妨害さ
れる。上記保存性を改善する為に様々な試みがなされ
てきた。例えば米国特許第3630957号の如く、前
記担体を疎水性材料から製造する方法や、米国特
許第3212855号及び同第3598704号の如く、吸水性
担体に水溶性重合体もしくは親水性コロイドを添
加し、試薬を物理的に隔離する方法が開示されて
いる。しかしながら、いずれの方法も本質的な解
決にはつながつていない。一方特開昭54−50393号公報では、或る種の水
分散性共重合体を該試薬層に添加することで、保
存性を向上させることが可能であるむねの記載が
ある。しかしながら上記水分散性共重合体は、アニオ
ン性単量体を導入することが難しく、共重合体の
製造時に凝集を起こし、多層分析素子としての性
能を劣化させるという欠点を有している。本発明は、上記欠点を解消することにある。す
なわち本発明の第１の目的は、試薬の保存性を改
良した多層分析素子を提供する事にある。本発明
の第２の目的は、定量性を有し、かつ熟練した操
作技術を必要とする事なく簡易に測定できる多層
分析素子を提供する事にある。本発明のかかる目的及び、以下に述べる目的
は、光透過性支持体に、流体試料中の成分と反応
する少なくとも１種の試薬を含みかつ親水性コロ
イド物質を含む少なくとも一層の試薬層と、その
上方に多孔質担体層とを有する多層分析素子にお
いて、前記試薬層のうちの少なくとも一層に下記
一般式〔〕、〔〕又は〔〕で示される化合物
の少なくとも一つを主成分とする高分子界面活性
と、ビニル基を有する単量体とを乳化重合して成
る水分散性共重合体を少なくとも一種含有するこ
とを特徴とする多層分析素子によつて達成され
る。一般式〔〕式中、R₁は置換又は未置換の２価の有機基、
M₁は水素原子又は１価のカチオンを表わし、ｎ
は30〜95mol％、ｍは70〜5mol％を表わす。一般式〔〕式中、R₂、R₃はそれぞれ水素原子、ハロゲン
原子、アルキル基、アリール基、シアノ基又は
COOR₅基（R₅はアルキル基を表わす。）を表わ
し、各々同一であつても異なつていてもよい。
R₄は水素原子又は低級アルキル基を表わしM₂、
M₃、M₄、M₅はそれぞれ水素原子、又は１価の
カチオンを表わし、ａは30〜95mol％、ｂは70〜
0mol％、ｃは70〜0mol％である。但し、ｂ＋ｃ
は70〜5mol％である。一般式〔〕式中、R₆、R₇は水素原子、ハロゲン原子、ア
ルキル基、アリール基、シアノ基又はCOOR₉基
（R₉はアルキル基を表わす。）R₈は水素原子又は
低級アルキル基を表わしM₆、M₇、M₈、M₉は、
それぞれ水素原子又は１価のカチオンを表わす。
ｘは30〜70mol％、ｙは５〜50mol％、ｚは70〜
5mol％を表わし、ｙ＋ｚは70〜30mol％である。次に、本発明の高分子界面活性剤活性剤の代表
的具体例を以下に示すが、これらに限定されるも
のではない。

【表】

【表】前記高分子界面活性剤及びこれを用いた水分散
性共重合体の合成法に関しては、特開昭55−
50240号公報に詳述されており、それらに準じて
容易に合成することができる。本発明に用いられるビニル単量体は、疎水性を
有しラジカル重合が可能なものであれば、それら
を単独または二種以上用いる事は任意である。
又、疎水性ビニル単量体にアクリル酸の如き親水
性単量体を共重合させる事も可能である。ビニル単量体として好ましいものとしては、共
重合可能なエチレン性不飽和ニトリル類、スチレ
ン類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エス
テル類、アクリルアミド類、メタクリルアミド
類、ビニル異節環化合物、架橋性単量体、ハロゲ
ン化ビニル類、ハロゲン化ビニリデン類、ビニル
エステル類、ビニルエーテル類、共役ジエン類、
を挙げることができる。共重合可能なエチレン性不飽知ニトリルとして
は、例えばアクリロニトリル、メタクリロニトリ
ル、α−クロルアクリロニトリルを挙げることが
できる。スチレン類としては例えば、スチレン、ｐ−メ
チルスチレン、α−メチルスチレン、ｐ−クロル
スチレン、クロルメチルスチレンを挙げることが
できる。アクリル酸エステル類としては、例えばアクリ
ル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸−ｎ
−ブチル、アクリル酸−ｎ−プロピル、アクリル
酸−iso−ブチル、アクリル酸−sec−ブチル、ア
クリル酸−２−ヒドロキシエチル、アクリル酸−
２−ヒドロキシプロピルを挙げることができる。
メタクリル酸エステル類としては、例えばメタク
リル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル
酸−ｎ−ブチル、メタクリル酸−２−ヒドロキシ
エチル、メタクリル酸−２−ヒドロキシプロピル
を挙げることができる。アクリルアミド類としては例えばアクリルアミ
ド、ジアセトンアクリルアミド、メチロールアク
リルアミド、メチルアクリルアミドを挙げること
ができる。メタアクリルアミド類としては例えばメタアク
リルアミド、ベンジルメタアクリルアミドを挙げ
ることができる。ビニル異節環化合物としては、例えばＮ−ビニ
ルピロリドン、Ｎ−ビニルイミダゾール、ビニル
ピリジン類（例えば、４−ビニルピリジン、２−
ビニルピリジン等）を挙げることができる。架橋性単量体としては、例えばジビニルベンゼ
ン、エチレングリコールジメタアクリレート、ト
リメチロールプロパントリアクリレート、ペンタ
エリトリツトトリメタアクリレートを挙げること
ができる。ハロゲン化ビニル類としては、例えば、塩化ビ
ニル、フツ化ビニル等を挙げることができる。ハロゲン化ビニリデン類としては、例えば、塩
化ビニリデン、フツ化ビニリデン等を挙げること
ができる。ビニルエステル類としては、例えば、酢酸ビニ
ル、酪酸ビニル等を挙げることができる。ビニルエーテル類としては、例えば、ビニルメ
チルケトン、共役ジエン類、としては例えば、
１，３−ブタジエン、イソプレン、２，３−ジメ
チル−１，３−ブタジエン等を挙げることができ
る。更に、親水性ビニル単量体の例として、アクリ
ル酸、メタクリル酸、イタコン酸等の、カルボン
酸単量体及びその塩、３−メタクリロイルオキシ
プロパン−１−スルホン酸、２−アクリルアミド
−２−メチルプロパンスルホン酸等のスルホン酸
単量体及びその塩の如きものが挙げられる。前述の高分子界面活性剤は上記のビニル単量体
に対して、0.01重量％から、90重量％用いる事が
できる。好ましくは、0.5重量％から80重量％を
用いる事ができる。前述の如く種々のビニル単量体を単一又は二種
以上用いる事ができるが、好ましくは疎水性ビニ
ル単量体を50％以上99.5％以下用いる事ができ
る。好ましい疎水性ビニル単量体の例として、ア
クリル酸エステル、メタアクリル酸エステル類、
スチレン類を挙げる事ができる。本発明に係る水分散性共重合体は、前述の如く
本発明の高分子界面活性剤を用い、ビニル単量体
を水溶性ラジカル重合開始剤を用いて、通常の乳
化重合法を用いて重合する事ができるが、必要に
応じて低分子界面活性剤（例えば、アニオン性お
よびノニオン性界面活性剤）を併用する事も可能
である。例えば、撹拌装置、冷却管、温度計、窒素ガス
導入管付の１−四ツ口フラスコに、脱気蒸留水
600mlトラツクスＨ−45（日本油脂(株)製、界面活性
剤、有効成分30％）10ml化合物例(7)の高分子界面
活性剤7.79ｇ、ｎ−ブチルメタアクリレート43ｇ
エチルアクリレート35.21ｇを加え、冷却水を流
しながら窒素気流下室温で、200rpmの回転数で
撹拌を行なう。フラスコ内のモノマーが均一に乳化された所
で、内温を70℃に昇温し、過流酸カリウム、0.48
ｇ、メタ重亜硫酸ナトリウム0.35ｇを各々20mlの
脱気蒸留水に溶解した水溶液を同時に加え、
300rpmの回転数で、温度70℃で６時間重合させ
た後に室温に冷却する。これによつてポリマー固
形分11.8％、重合率99.9％の高分子界面活性剤
(7)／ｎ−ブチルメタアクリレート／エチルアクリ
レート＝９／50／41（重量比）の水分散性共重合
体を得る事ができる。他の高分子界面活性剤も同様の処方に準じモノ
マーを適宜選択して合成する事が可能である。本発明の光透過性支持体（以下本発明の支持体
という。）は、液体不浸透性であればその種類を
問わない。支持体として使用する特定材料は重要
ではないが、例えば、酢酸セルロース、ポリエチ
レンテレフタレート、ポリカーボネート、又はポ
リスチレンのような種々の重合体材料がこの目的
に適す。支持体の厚さは任意であるが、代表的に
は約50ミクロンから約250ミクロンとする。本発明に係る試薬層は直接本発明の支持体に被
覆することは可能であるが、場合によつては光透
過性下塗層を使用して試薬層と支持体との間の接
着性を高めることも可能である。試薬層を設ける
目的は、これに分析すべき成分と検知可能な生成
物を生成する反応を行なわせる試薬を含有させる
事にある。１種又は２種以上の試薬を、結合剤として親水
性コロイド物質中に分散又は溶解させた被覆物が
好ましい。親水性コロイド物質としては天然又は
合成の物質が好ましいが、更に好ましくはゼラチ
ン、ゼラチン誘導体、親水性セルロース誘導体及
びデキストラン、アラビアゴム、アガロース等の
ような多糖類及び合成の親水性物質、例えば、ポ
リビニルアルコール及びポリビニルピロリドンの
水溶性ポリビニル化合物、水溶性アクリルアミド
重合体等が含まれる。これらの選択は、検知可能
な生成物の光学的性質等によつて一部依存するこ
ともあり得る。本発明の水分散性共重合体は、該試薬層の親水
性コロイド物質に添加あるいは一部置換する事に
よつて前述の目的を達成する事ができる。これら
本発明の水分散性共重合体は該試薬層の総結合剤
量の約５〜約60％を含有する事ができ、更に好ま
しくは、約15〜約50％含有する事ができる。これによつて前述の目的及び他の目的が達成さ
れる。他の目的の１つに、塗布膜のカールを軽減
する事があり、更に他の目的の１つに、塗布膜の
寸度安定性を向上する事がある。上記目的は写真工業において周知の事ではある
が、多層分析素子の分野においても、これによつ
てより高い分析の信頼性を付与する事ができる。更に予期せざる効果として、呈色反応の発色濃
度が上昇した事が挙げられる。分析反応における
発色濃度の上昇は即ち検出感度の上昇につなが
り、著しく有利なものとなる事は言うまでもな
い。前述該試薬層中の試験試薬を適当に選択するこ
とによりグルコース、アルブミン、尿素窒素、ビ
リルビン、アンモニア、尿酸、コレステロール、
トリグリセリド、血清グルタミン酸オキザロ酢酸
トランスアミナーゼ、乳酸脱水素酵素、乳酸、ク
レアチニン、アミラーゼ、塩化物、カルシウムの
ような血液成分ならびに他の多くの成分の分析に
使用しうるように容易に構成することができる。これらの試験試薬の保存性向上に対し、本発明
の水分散性共重合体を添加する事は有効である
が、特に好ましい例として予め決められた成分を
酸化するのに触媒作用を示す適当な酵素、および
ペルオキシダーゼの存在下で過酸化物と反応して
検知可能な生成物を産生することができる指示組
成物、PHを調整するための化合物等が挙げられ
る。西ドイツ公開報第2735690号にその例が数多
く挙げられている。このような具体例の１つとし
て、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ、７−ヒドロキシ−１−ナフトール、４−アミ
ノアンチピリン塩酸塩、PH６のリン酸緩衝液系か
らなるグルコース分析用試薬が挙げられる。前述試薬層に対して多層分析素子を形成するた
めの多孔質担体層は、米国特許第3929158号及び
同4042335号に記載の如く、拡散層、反射層、遮
断層、下塗り層、濾過層、もしくはレジストレー
シヨン層を有する事ができる。これらは、同上特許明細書記載の如く、種々の
白色顔料に二酢酸セルロースを良溶媒と貧溶媒の
共存下にスラリー状に分散せしめ、前述の試薬層
上に塗布するものであり、これによつて一定の孔
径及び高い空隙率を有する層を形成させた非繊維
質多孔質媒層と称せられるものである。これと同
種のものとして、ミリポアフイルターの商品名で
知られる、ミクロフイルターも有用である事は言
うまでもない。一方上述の層と同様に特開昭56−
24576号明細書に記載の如き、繊維質多孔性担体
も用いる事が可能である。これらの層は、 (1) 一定容量の流体試料を単位面積当り一定容量
に試薬層内に均一に配布し (2) 流体試料中の分析反応を阻害する物質又は要
因を除去し、 (3) 分光光度分析を行う際に支持体を経て、透過
する測定光を反射する良好なバツクグラウンド
作用を行うという三つの機能を有する。これら三つの機能は、場合に応じて別々の層で
行なう事も、一つの層で全て行う事も任意であ
る。又例えば、前記機能の内、反射バツクグラウ
ンド機能のみ一つの層を用い、他の二つの機能を
一つの層にうけもたせるような組合せも可能であ
る。本発明で用いられる流体試料は、水溶液であれ
ば良いが、生物学的流体試料、例えば血液、リン
パ液、尿、などに適用される。血液は、通常全血
と呼ばれる血球成分（赤血球、白血球、血小板
等）を含むものも、これらをのぞいた血漿又は血
清を用いる事も可能である。分析に用いられる流体試料の量は目的によつて
選択されるが、通常微量分析で用いられる約５〜
約50μが好ましく、更には約８〜約20μが好
ましい。以上述べてきたように、本発明の素子は、それ
らを分析すべき流体試料と接触させ、かつ前記要
素内に生成された検知可能な生成物の濃度を種々
の分光学的測定方法により、測定する事から、前
記流体試料中の予め定められた成分の濃度を計算
する事により使用する。本発明に従い、種々の異なる素子を製造でき、
そして臨床化学の分野に限る事なく、他の化学的
研究の分野に用いる事が可能である。本発明の具体的態様及び、従来技術の分析素子
の比較を実施例を用いて述べるが、本発明がこれ
によつて限定されるものではない事は言うまでも
ない。実施例１厚さ180μの透明なポリエチレンテレフタレー
ト支持体上に (1) 試薬層として脱イオン化ゼラチン 160mg／ｄm² 高分子界面活性剤(7)／ｎ−ブチルメタアクリレ
ート／エチルアクリレート＝９／50／41（重量
比）から成るラテツクス 160mg／ｄm² １，７−ジヒドロキシナフタレン 6.60mg／ｄm² ４−アミノアンチピリン塩酸塩 9.70mg／ｄm² グルコースオキシダーゼ 244.1国際単位／ｄm² ペルオキシダーゼ 248AAP単位／ｄm² ジメドン 2.15mg／ｄm² ３，３−ジメチルグルタル酸 19.6mg／ｄm² を有する乾燥膜厚約30μの試薬層 (2) 非繊維質多孔層として酢酸セルロース 70.4mg／ｄm² 二酸化チタン 505.9mg／ｄm² オクチルフエノキシポリエトキシエタノール
（非イオン界面活性剤；商品名トリトンＸ−
100，ロームアンドハース社製） 13.8mg／ｄm² ポリウレタンポリマー 15.5mg／ｄm² から成る乾燥膜厚約140μの非繊維質多孔性媒体
層上記の本発明のグルコース分析用分析素子を分
析素子（）とし、他に非繊維質多孔性担体層の
かわりに一対の加圧的に対持されたローラーの間
を通しカレンダー処理した濾紙（東洋濾紙(株)製No.
７）を試薬層上にはりつけたものを、分析素子
（）とした。一方、比較分析素子（）として、本発明の水
分散性共重合体をゼラチンで置換したもの及び、
本発明の水分散性共重合体を特開昭54−50393号
記載の水分散性共重合体（メチルアクリレート／
３−アクリロイルオキシプロパンスルホン酸
Na／２−アセトアセトキシエチルアクリレート
＝88.75／4.75／6.5）に置換したものを、比較分
析素子（）とした。（但し、拡散層は非繊維質
多孔性担体層である。）上記分析素子（）、（）及び、比較分析素子
（）、（）を５℃、暗所及び25℃、暗所で20週
間放置した後、540nmで反射濃度を測定し、放置
前の測定置との差から保存後の劣化度 Δ（％）＝｛（D_R−D_RO）／D_RO｝×100 D_R：20週間放置後の540nmでの反射濃度 D_RO：放置前の540nmでの反射濃度）を求めた。

【表】以上表−１に示した如く、本発明の分析素子
は、比較分析素子に比べ放置によるカブリ生成が
少ない良好なものである事が判る。実施例２実施例１で用いた本発明のグルコース分析用分
析素子（）及び（）と比較分析素子（）を
用いて、250mg／dl、350mg／dl、500mg／dlのグ
ルコースを含有するコントロール血清10μを用
いて、37℃ ７分間インキユベーシヨンをした
後に、540nmの反射濃度を測定した。

【表】表−２に示した如く本発明の分析素子は、比較
分析素子に比べ発色濃度が高く、かつ傾きが大き
く、感度が高い事が判る。

Claims

【特許請求の範囲】１光透過性支持体に、流体試料中の成分と反応
する少なくとも１種の試薬を含みかつ親水性コロ
イド物質を含む少なくとも一層の試薬層と、その
上方に多孔質担体層とを有する多層分析素子にお
いて、前記試薬層のうちの少なくとも一層に下記
一般式〔〕、〔〕又は〔〕で示される化合物
の少なくとも一つを主成分とする高分子界面活性
剤と、ビニル基を有する単量体とを乳化重合して
成る水分散性共重合体を少なくとも一種含有する
ことを特徴とする多層分析素子。一般式〔〕〔式中、R₁は置換又は未置換の２価の有機基、
M₁は水素原子又は１価のカチオンを表わし、ｎ
は30〜95mol％、ｍは70〜5mol％を表わす。〕一般式〔〕〔式中、R₂、R₃はそれぞれ水素原子、ハロゲン
原子、アルキル基、アリール基、シアノ基又は
COOR₅基（R₅はアルキル基を表わす。）を表わ
し、各々同一であつても異なつていてもよい。
R₄は水素原子又は低級アルキル基を表わし、
M₂、M₃、M₄、M₅はそれぞれ水素原子、又は１
価のカチオンを表わし、ａは30〜95mol％、ｂは
70〜0mol％、ｃは70〜0mol％である。但し、ｂ
＋ｃは70〜5mol％である。〕一般式〔〕〔式中、R₆、R₇は水素原子、ハロゲン原子、ア
ルキル基、アリール基、シアノ基又はCOOR₉基
（R₉はアルキル基を表わす。）R₈は水素原子又は
低級アルキル基を表わしM₆、M₇、M₈、M₉は、
それぞれ水素原子又は１価のカチオンを表わす。
ｘは30〜70mol％、ｙは５〜50mol％、ｚは70〜
5mol％を表わし、ｙ＋ｚは70〜30mol％であ
る。〕２前記試薬が、前記流体試料中の成分を酸化し
て過酸化物にするのに触媒作用を果し得る酵素及
びペルオキシダーゼの存在下で前記過酸化水素に
よつて酸化され、検知可能な生成物を生成し得る
指示組成物を含んでなる特許請求の範囲第１項記
載の多層分析素子。