JPH0665987B2 - 分析要素 - Google Patents

分析要素

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JPH0665987B2
JPH0665987B2 JP57202157A JP20215782A JPH0665987B2 JP H0665987 B2 JPH0665987 B2 JP H0665987B2 JP 57202157 A JP57202157 A JP 57202157A JP 20215782 A JP20215782 A JP 20215782A JP H0665987 B2 JPH0665987 B2 JP H0665987B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、水性液体、特に生体液中の成分の定量的分析
を目的とする改良された分析要素に関するものである。
水、食料および生体中の成分の分析には多種多様な方法
が提案されている。その内でも、試料溶液中において、
分析しようとする被検物質（アナライト）の量に比例し
た着色物質の生成反応を進行させ、その色濃度を測光す
る方法は良く知られた分析原理であり、溶液分析法（湿
式法）としてのみでなく、乾式分析法にも利用されてい
る。すなわち、紙または吸収性の担体に、被検物質との
接触により呈色する試薬を含浸させた、いわゆるpH試験
紙類似の形状をした乾式の分析用シートがその例であ
る。
またさらに、乾式操作を利用しながらも精度の高い被検
物質の定量分析を可能とする一層もしくは多層構造から
なるシート状もしくはフィルム状の分析要素も知られて
いる。
このうち多層分析要素は、多層分析材料などとも表現さ
れる分析用具であり、各種のものが知られている。たと
えば、特公昭49−33800号、特開昭49−53888号、特開昭
50−137192号、特開昭51−40191号、特開昭52−3488
号、特開昭53−89796号、特開昭53−131089号などの各
公報には、支持体上に単層または複層の試薬層が設けら
れており、さらにその上に非繊維質多孔性展開層が積層
された構成からなる多層分析要素が開示されている。
これらの多層分析要素においては、その展開層に被検試
料を含有する水性液体試料を点着すると水性液体試料
は、単位面積当り均一な量を維持しながら試薬層中に浸
入し、発色反応を起こす。そして、一定時間後にその色
濃度の変化を測定することにより、水性液体試料中の被
検物質の濃度を知ることができる。
上記の多層分析要素を利用する分析の被検物質の代表的
な例としては、生体液、たとえば血液、尿、腸液、唾
液、髄液、膵液など、の中に含有されている各種の加水
分解酵素を上げることができる。また、加水分解酵素以
外にも、たとえば、同じく生体液に含有されているコレ
ステロール、トリグリセリド（中性脂肪）、グルコー
ス、尿酸などのような物質で、酸化還元酵素、特にオキ
シダーゼにより分解されて過酸化水素と低分子の化合物
を生成するような物質も多層分析要素の分析対象となる
被検物質の代表的な例である。
上記の加水分解酵素としては多種多様なものが知られて
いるが、多層分析要素は、その内でも高分子量の化合物
を基質とし、加水分解反応によって拡散性の低分子量化
合物を生成する酵素の分析に特に有用である。これらの
加水分解酵素の定量的分析は、臨床検査項目として重要
であり、簡便かつ精度の高い分析方法の開発の要求が高
い。これらの加水分解酵素の例としては、アミラーゼ、
リパーゼ、プロテアーゼ（例、トリプシン、キモトリプ
シン、ペプシンなど）、ペクチナーゼおよび各種キナー
ゼが挙げられる。
たとえば、血液中に存在するアミラーゼの量の測定は、
膵機能の検査手段として臨床上極めて重要である。アミ
ラーゼは、澱粉などのアミロース結合部分を加水分解
し、低分子量の多糖類、少糖類または単糖類を生成する
性質を有する加水分解酵素である。そして、アミラーゼ
は通常においては、その酵素活性を測定する方法により
試料液中の濃度の相対値を算出し、定量を行なってい
る。
前記の特開昭53−131089号公報には著しく簡単な操作に
よりアミラーゼ活性が測定できる乾式の多層分析材料
（分析要素）が記載されている。この多層分析要素は、
アミラーゼの基質、たとえば、澱粉に染料のような予め
検出可能な発色団を結合させた非拡散性基質を含む試薬
層と、非検物質すなわちアミラーゼの加水分解作用によ
って拡散性となった反応生成物を受容するためのレジス
トレーション層とを含む積層型の多層分析要素である。
この多層分析要素を用いてアミラーゼ活性を分析する方
法では、まず、予め検出可能な発色団（染料など）が結
合された非拡散性基質が、試料液の酵素の作用により加
水分解され、これにより発色団を有する拡散性の低分子
量化合物が生成する。この低分子量化合物は層中を拡散
し、ついにはレジストレーション層に受容され固定され
るので、レジストレーション層中に受容された発色団を
有する拡散性の低分子量化合物の量に対応する色濃度を
測光定量する操作により反応生成物の量を測定すること
ができる。
前記特開昭51−40191号公報は、上記特開昭53−131089
号公報に開示の分析要素に類似の層構成を有する分析要
素が開示されている。前者は、検出層で検知される手段
では本来検知できない化学種を反応試薬層に用意し、こ
れを非検物質の作用により、反応試薬層において、拡散
性でかつ検知可能な化学種に変換し、これを検出層で検
出する過程を含むのに対し、後者においては、反応試薬
層中に予め検知可能な化学種を含有させておくという相
違がある。
これらの技術にあっては、検出層あるいはレジストレー
ション層は拡散性化学種の単なる受容をその目的として
おり、その層内における発色反応などは想定されていな
い。従って、反応試薬層中に残存あるいは生成した検知
可能な化学種と、検出層あるいはレジストレーション層
中に捕捉あるいは受容された化学種とを明確に識別し、
定量性のある測定結果を得るためには、両層の間に色遮
蔽を目的とした光散乱性の放射ブロッキング層を設ける
ことが必須であった。
特開昭57−40649号公報には、上記の欠点を改善した多
層分析要素が記載されている。この多層分析要素におい
ては、そこに用意された基質層に含有されている基質と
非検物質の反応により生成する拡散性化合物は実質的に
無色であり、そして、この拡散性化合物が、分析要素内
に予め含有されていた色原体化合物と反応し、これによ
り初めて色素が形成される。この色原体化合物は通常、
基質層に積層されて設けられている呈色反応層に含有さ
れた状態で多層分析要素に予め導入されている。従っ
て、被検物質の作用を受ける前と後における基質と生成
物を光学的に識別することは極めて容易であるという特
徴を有するものである。
ところが、上記の開示技術において、拡散性化合物との
反応により色素を形成する色原体化合物としてジアゾニ
ウム化合物を使用した場合には、ジアゾニウム化合物の
安定性が悪く、また分解反応や望ましくない種々の副反
応を起すことがあるため、これにより分析の定量性が低
下する傾向があることが判明した。
「一般にジアゾニウム化合物は不安定であるが、クエン
酸、酒石酸、リン酸、ナフタレンスルホン酸などを反応
系に添加し、系のpHを低下させて酸性側に維持すると、
前記の分解反応や種々の副反応が抑制されることが知ら
れている。」また、ジアゾニウム化合物の安定化のため
に、ジアゾニウム化合物の対イオンとして、塩化亜鉛、
テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロアルミネート
などに由来する陰イオンを共存させることも知られてい
る。［Dinaburg,M.S.著「PHTOSENSITIVE DIAZO COMPO
UNDS」1964年、THE FOCAL PRESS社刊］。しかしなが
ら、反応系のpHを酸性にすることによってジアゾニウム
化合物の安定化という目的は達成されても、そのpHは被
検物質（アナライト）の最適pH（たとえばヒトのアミラ
ーゼについては、pH6.9を中心にしてpH6.5〜7.5）より
低くなってしまい、アナライトの酵素活性が発現され
ず、分析が不可能となる。
上記のようなジアゾニウム化合物の安定化における問題
点は、バインダーとして高分子カルボン酸を使用するこ
とにより解決され、さらに被検物質の分析のために利用
される反応を阻害することなくジアゾニウム化合物の安
定化が達成できることを見出し、この発明を既に特許出
願した（特願昭57−140736号）。
しかしながら、上記の発明について本発明者が更に検討
を行なったところ、バインダーとして高分子カルボン酸
を用いることによりジアゾニウム化合物の安定化は実現
し、目的とする定量分析が可能となるが、ジアゾニウム
化合物については呈色反応層からの拡散を防ぐ目的で疎
水性基をもつ化合物が選ばれるので、高分子カルボン酸
バインダーの存在下における水性溶媒に対する溶解性が
充分に高くないため、ジアゾニウム化合物と高分子カル
ボン酸バインダーとを含む水性塗布溶液を調製した場合
にジアゾニウム化合物の析出などの現象が見られること
があることを判明した。そして、その塗布溶液を用いて
呈色反応層を形成した場合には、その呈色反応層の表面
にジアゾニウム化合物が析出して、分離する傾向があ
り、そのような現象が発生した呈色反応層は分析要素の
分析精度の低下をもたらすことも判明した。
従って、本発明者は上記の問題の解決を目的として更に
検討を行なったところ、バインダーとして高分子カルボ
ン酸の代りに、カルボキシル基の一部に非イオン性界面
活性剤がエステル結合を介して結合している高分子カル
ボン酸を用いることにより、ジアゾニウム化合物の安定
化が達成できるのみならず、該バインダーの共存下にお
ける疎水性基をもつジアゾニウム化合物の水性溶媒に対
する溶解性が向上し、従って、塗布溶液および形成され
た呈色反応層などの層状構造体におけるジアゾニウム化
合物の析出などの現象の発生を効果的に防止することが
できることを見出した。
さらにまた、上記の非イオン性界面活性剤が結合した高
分子カルボン酸（以下においては高分子カルボン酸誘導
体ともいう）は、塗布水性溶液におけるジアゾニウム化
合物の安定化および可溶化に有効であるのみではなく、
その水性溶液における高い可溶化作用および低pH維持作
用により、安定な存在もしくは高い活性を維持するため
に低pHの条件下におくことが望ましい基質、酵素、色
素、色素形成性化合物などの各種の反応性試薬を層状に
形成して分析要素の試薬層とするためのバインダーとし
ても非常に有効であることも判明した。
従って、本発明は、酸性条件で安定であるか、もしくは
活性を示す反応性試薬とバインダーを主成分として含む
試薬層を少なくとも一層含む分析要素において、該バイ
ンダーが高分子カルボン酸を含み、かつその高分子カル
ボン酸の分子中に含まれているカルボキシル基の一部に
非イオン性界面活性剤がエステル結合を介して結合して
いることを特徴とする分析要素を提供するものである。
本発明の分析要素は、展開層、試薬層および支持体（通
常は、透明支持体）からなるシート状もしくはフィルム
状の多層分析要素の形態に構成して利用することが一般
的であるが、展開層および支持体は本発明の分析要素に
とって必須なものではない。
本発明の分析要素の分析対象物質、すなわち、非検物質
（アナライト）の代表的な例としては、プロテアーゼ
（例、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン等）、ア
ミラーゼ、リパーゼ、およびペクチナーゼなどの加水分
解酵素を挙げることができる。このような加水分解酵素
を分析するためには、本発明の分析要素は、ジアゾニウ
ム化合物およびバインダーを主成分として含むジアゾニ
ウム呈色反応層の上にカプラー基質層を積層してなる多
層分析要素の形態とし、該バインダーが高分子カルボン
酸を含み、かつその高分子カルボン酸の分子中に含まれ
ているカルボキシル基の一部に非イオン性界面活性剤が
エステル結合を介して結合しているようにした多層分析
要素の構成をとることが好ましい。
また、本発明の分析要素の被検物質は上記のような加水
分解酵素に限られるものでなく、たとえば、同じく生体
液に含有されているコレステロール、トリグリセリド
（中性脂肪）、グルコース、尿酸などのような物質で、
酸化還元酵素、特にオキシダーゼ、により分解されて過
酸化水素と低分子の化合物を生成するような物質も本発
明の分析要素の被検物質とすることができる。上記の物
質を例にとれば、それぞれの分解酵素として、コレステ
ロールについてはコレステロールオキシダーゼ、トリグ
リセリド（中性脂肪）についてはグリセリンオキシダー
ゼ、グルコースについてはグルコースオキシダーゼ、そ
して尿酸についてはウリカーゼなどのオキシダーゼが知
られており、オキシダーゼはペルオキシダーゼと組合せ
て用いられることが多い。これらのオキシダーゼおよび
ペルオキシダーゼは、その酵素活性の最適pHは酸性側
（たとえば、グルコースオキシダーゼについてはpH約5.
6、コレステロールオキシダーゼについてはpH約5.8、そ
してペルオキシダーゼについてはpH6.7）にある。従っ
て、これらのオキシダーゼおよび／又はペルオキシダー
ゼを反応性試薬として含有する試薬層を含む分析要素を
製造する場合に、本発明において用いる高分子カルボン
酸誘導体バインダー、すなわち、カルボキシル基の一部
に非イオン性界面活性剤がエステル結合を介して結合し
ている高分子カルボン酸をその試薬層のバインダーの全
部もしくは一部として用いることにより、それらのオキ
シダーゼおよび／又はペルオキシダーゼが均一にかつ安
定に含有されている試薬層を得ることができる。
本発明においてバインダーとして使用される高分子カル
ボン酸誘導体バインダーは、その骨格を形成する高分子
カルボン酸が、繰り返し単位としてカルボキシル基およ
びエチレン性不飽和二重結合を有する化合物から誘導さ
れた二価基を有し、それらのカルボキシル基の一部に非
イオン性界面活性剤がエステル結合を介して結合してい
るものであることが望ましい。
さらに、この高分子カルボン酸誘導体バインダーにおい
て、高分子カルボン酸部分に含まれる繰り返し単位のカ
ルボキシル基およびエチレン性不飽和二重結合を有する
化合物から誘導された二価基が一般式（Ｉ）： で表わされる二価基であることが特に望ましい。
本発明における高分子カルボン酸誘導体バインダーは、
たとえば、高分子カルボン酸を予め製造し、その高分子
カルボン酸と、分子中に水酸基を有する非イオン性界面
活性剤とを、必要に応じて触媒を用い、反応させること
により、高分子カルボン酸の分子中に多数含まれている
カルボキシル基の一部と、非イオン性界面活性剤の水酸
基との間にエステル化反応を起させ、これにより高分子
カルボン酸のカルボキシル基の一部に非イオン性界面活
性剤がエステル結合を介して結合した高分子カルボン酸
誘導体を製造するような方法により得ることができる。
高分子カルボン酸としては、アクリル酸共重合体、メタ
クリル酸共重合体、マレイン酸共重合体、マレイン酸モ
ノエステル（たとえば、マレイン酸のモノメチル、エチ
ル、プロピル、ブチル、アミルのエステル等）の共重合
体、イタコン酸共重合体、およびイタコン酸モノエステ
ル（たとえば、イタコン酸のモノメチル、エチル、プロ
ピル、ブチル、アミルのエステル等）共重合体が代表的
である。
上記の共重合体を生成するコモノマーとしては、アクリ
ル酸エステル（たとえば、メチル、エチル、プロピル、
ブチル、ペンチル、アミル、ヒドロキシエチルのエステ
ル等）、アルキルビニルエーテル（たとえば、メチル、
エチル、プロピル、ブチルのビニルエーテル等）、スチ
レン、ｐ−ヒドロキシスチレンおよびビニルトルエンを
挙げることができる。
高分子カルボン酸誘導体は、繰り返し単位としてカルボ
キシル基およびエチレン性不飽和二重結合を有する化合
物から誘導された二価基を一般には約10〜90モル％、好
ましくは30〜60モル％含有している。
本発明の高分子カルボン酸誘導体をバインダーとして使
用する場合においては、他の高分子化合物と混合して使
用してもよい。たとえば、所望により、ポリスチレンス
ルホン酸、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロ
パンスルホン酸）、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−ビ
ニルピロリドン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロ
キシプロピルセルロース、エチルセルロース、カルボキ
シメチルセルロース、アガロースなどの高分子化合物と
混合して使用することができる。
高分子カルボン酸誘導体は、分析要素の試薬層に含有さ
れている反応性試薬と、被検物質（アナライト）もしく
はアナライトの分解物との反応を阻害することなく、ジ
アゾニウム化合物、オキシダーゼなどの反応性試薬を安
定化できるという条件を満足するならばその分子量に特
別の制約はないが、層状に形成する際の塗布技術におい
てバインダーとして適合する物性を備えるという観点か
ら、およそ３万〜500万の範囲、好ましくは５万〜100万
の範囲の分子量を有していることが望ましい。その上限
を越えると、粘度が高すぎて塗布が困難であるし、逆に
下限以下であると、塗布液の粘度が低すぎて、均一に塗
布することが困難になるばかりでなく、ジアゾニウム塩
などの反応性試薬が析出しやすくなる場合があり、従っ
て均一な呈色反応層が得られなくなることもある。
以下に記載する高分子カルボン酸は、本発明において使
用する高分子カルボン酸誘導体の骨格を形成する高分子
カルボン酸として特に好ましいものである。（括弧内は
共重合比）。
（１）メチルビニルエーテル・マレイン酸共重合体（5
0:50）、分子量約30万〜90万 （２）スチレン・マレイン酸共重合体（50:50）、分子
量約５万〜20万 （３）マレイン酸・アクリル酸ブチル共重合体（50:5
0）、分子量約５万〜約20万 上記の高分子カルボン酸はいずれも公知化合物であり、
例えば以下の方法によって製造される。
一般にカルボキシル基を有するモノマー、たとえば、ア
クリル酸、マレイン酸、無水マレイン酸と、他のコモノ
マー、たとえば、メチルビニルエーテル、スチレン、ア
クリル酸エステルとを重合溶媒、たとえば、水、メタノ
ール、エタノール、酢酸エチル、トルエン、アセトン、
メチルエチルケトンなどの中で混合し窒素置換した後、
重合触媒、たとえば、過酸化ベンゾイル、アゾビスイソ
ブチロニトリルなどを添加し加熱下に撹拌して高分子カ
ルボン酸を得ることができる。
また、この種の高分子カルボン酸は市販品としても入手
可能である。たとえば、米国のGAF社からGANTREZ−ANの
商品名で市販されている各種のメチルビニルエーテル・
無水マレイン酸共重合体をその一例として挙げることが
できる。その製造法の詳細は、たとえば、大津隆行、竹
本喜一共著、「ビニル重合実験法」、共立出版（1964
年）に記載されている。
本発明において使用される高分子カルボン酸誘導体に、
高分子カルボン酸に結合された状態で含有される非イオ
ン性界面活性剤については、その分子中に水酸基を有す
るものであれば特に制限はないが、非イオン性界面活性
剤が一般式（II）： CH2CH2O （II） で表わされる繰返し単位を含むものであることが望まし
い。
また、上記の非イオン性界面活性剤は、一般式（II
I）： ＲCH2CH2OnH （III） ［ただし、Ｒは、炭素数２〜22のアルキル基、炭素数４
〜12のアルキル基を置換基として有するアリール基、炭
素数９〜19のアルキル基を有するアルキルカルボニルオ
キシ基、もしくは炭素数２〜22のカルボン酸により少な
くとも１個の水酸基がエステル化されているソルビタン
（1,4−アンヒドログルシトールまたは1,5−アンヒドロ
グルシトール）、またはソルビトール（グルシトール）
残基であり、そしてｎは２〜40の整数である］を有する
ものであることが特に望ましい。
上記の一般式（III）を有する非イオン界面活性剤の例
としては次のような化合物を挙げることができる。
（１）ポリオキシエチレンアルキルエーテル（一般式
（III）においてＲが炭素数２〜22のアルキル基である
化合物）： たとえば、アルキル基が、エチル、プロピル、ブチル、
ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デ
シル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシ
ル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オク
タデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、イ
ソブチル、イソアミルなどのアルキル基で、一分子中に
含まれているオキシエチレン基の数が２〜40のもの。
（２）ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル
（一般式（III）においてＲが炭素数４〜12のアルキル
基を置換基として有するフェニル基である化合物）： たとえば、アルキル基が、ペンチル、ヘキシル、ヘプチ
ル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシ
ル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサ
デシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エ
イコシル、イソブチル、イソアミルなどのアルキル基
で、一分子中に含まれているオキシエチレン基の数が２
〜40のもの。
（３）ポリオキシエチレンアルキルエステル（一般式
（III）においてＲが炭素数９〜19のアルキル基を有す
るアルキルカルボニルオキシ基である化合物）： たとえば、アルキル基が、ノニル、デシル、ウンデシ
ル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシ
ル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナ
デシル、エイコシルなどのアルキル基で、一分子中に含
まれているオキシエチレン基の数が２〜40のもの。
（４）ポリオキシエチレンソルビタン脂肪族カルボン酸
エステル（一般式（III）においてＲが炭素数２〜22の
脂肪族カルボン酸により少なくとも１個の水酸基がエス
テル化されているソルビタン残基である化合物）： たとえば、脂肪族カルボン酸が酢酸、プロピオン酸、酪
酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、カ
プリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、
パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、アラキン
酸、ベヘン酸、イソプロピオン酸、イソ酪酸、イソ吉草
酸、イソステアリン酸などのいずれかであり、その１個
ないし３個によりエステル化されているソルビタン残基
を有し、かつ一分子中に含まれているオキシエチレン基
の数が２〜40のもの。
（５）ポリオキシエチレンソルビトール脂肪族カルボン
酸エステル（一般式（III）においてＲが炭素数２〜22
の脂肪族カルボン酸により少なくとも１個の水酸基がエ
ステル化されているソルビトール残基である化合物）： たとえば、脂肪族カルボン酸が酢酸、プロピオン酸、酪
酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、カ
プリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、
パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、アラキン
酸、ベヘン酸、イソプロピオン酸、イソ酪酸、イソ吉草
酸、イソステアリン酸などのいずれかであり、その１個
ないし４個によりエステル化されているソルビトール残
基を有し、かつ一分子中に含まれているオキシエチレン
基の数が２〜40のもの。
（６）上記の（１）ないし（５）に例示された化合物の
うちで、オキシエチレン基のほかにオキシプロピレン基
をさらに、ブロックもしくはランダム共重合体の形態で
含む化合物。
次に本発明の分析要素の構成および使用の態様を、アミ
ラーゼなどの加水分解酵素の定量分析に有用なジアゾニ
ウム化合物およびバインダーからなる呈色反応層と、そ
の上に付設されたカプラー基質層を含む多層分析要素を
例にとり、詳しく説明する。
呈色反応層に含有されるシアゾニウム化合物はジアゾ反
応により呈色する化合物であり、たとえば、下記の化合
物が代表的に用いられる。
これらのジアゾニウム化合物は、染色および写真の分野
においてよく知られたジアゾ染料を生成しうる化合物で
あり、また分析化学においても呈色化合物としてよく知
られている。その合成法の詳細は、たとえば、細田豊
著、「染料化学」137〜149頁、技報堂（1968年）に記載
されている。
呈色反応層は、前記の高分子カルボン酸誘導体バインダ
ーおよびジアゾニウム化合物を含む溶液（一般には有機
溶媒を含有する水性溶媒の溶液）を層状に塗布したの
ち、この塗布層を適宜乾燥して形成される。ジアゾニウ
ム化合物の量は、分析対象のアナライトが関与する呈色
反応の反応式に従って定まるものである。呈色反応層は
乾燥厚さでおよそ１〜50μｍ、好ましくは２〜30μｍの
範囲の厚さをもつように形成される。
呈色反応層の上に積層されるカプラー基質層は、実質的
に無色でジアゾニウム化合物と反応して色素を形成しう
る色素形成性反応基を有し、アナライトの作用により水
の存在下に拡散しうる拡散性化合物を生成することがで
きる基質からなる非拡散性カプラーを含有する層であ
る。カプラー基質層は、たとえば、上記の非拡散性カプ
ラーと親水性バインダーを含む水溶液または水分散液を
呈色反応層の表面上に層状に塗布したのち、この塗布層
を適宜乾燥して形成することができる。
色素形成性反応基は、酵素反応により低分子化されたの
ち、発色反応を行なうために親水性バインダー中を拡散
泳動する必要があるので、分子中に可溶性基、たとえ
ば、スルホン基、カルボキシル基、ヒドロキシル基を有
することが好ましい。この可溶性基は、後記する連結基
の一部に導入されていても好ましい結果を与える。
非拡散性基質に連結基を通して連結される色素形成性反
応基としては、通常、写真系で用いられる各種カプラ
ー、すなわち、ピラゾリン−５−オン、ナフトール、フ
ェノール、アシルアセトアニリドなどがある。これらの
カプラーは連結基と結合する必要があるのでアミノ基、
ヒドロキシル基などを有していなければならない。ま
た、写真業界でよく知られたカプリング位に離脱基を有
する二当量カプラーも用いることができる。
上記のカプラーのほか、アリールアミン（たとえば、N,
N−ジメチルフェニレンジアミン、Ｎ−メチル−Ｎ−
（2,6−エポキシ）プロピルアニリン、Ｎ−メチル−Ｎ
−ヒドロキシメチルアニリンなど）なども使用すること
ができる。
色素形成性反応基は、目的の酵素反応を阻害するか否
か、合成上の難易度、酵素反応の至適pHにおける化合物
の安定性などを考慮して選択される。この色素形成性反
応基は、酵素反応により低分子化して拡散性を獲得した
基質由来の化合物と共に呈色反応層へ拡散すべきもので
あるから、色素形成性反応基自体は拡散性であることが
好ましい。
目的に応じて選択された色素形成性反応基を連結基を介
して非拡散性基質に結合させてカプラー基質を得る方法
としては、染料業界で広く用いられている「反応性染
料」の技術が用いることができる。たとえば、K.Venkat
araman編「The Chemistry of Synthetic Dyes」第V
II巻（New York,Academic Press,1972年発行）には、
天然高分子である多種類のセルロースや蛋白質繊維であ
る羊毛、絹などの分子と染料分子を結合する「連結基」
の具体例および結合方法等について詳しく記載されてお
り、本発明に用いる非拡散性基質を製造するためにこれ
らの技術を利用して色素形成性反応基と非拡散性基質と
を連結基を介して結合し、カプラー基質として用いうる
化合物を得ることができる。
好ましい連結基の例としては、ｓ−トリアジン残基
（例、ｓ−トリアジン−2,5−ジイル基、ｓ−トリアジ
ン−2,4,6−トリイル基、６−クロロ−ｓ−トリアジン
−2,4−ジイル基など）、ピリミジン残基（例、ピリミ
ジン−2,4−ジイル基、ピリミジン−2,5−ジイル基、ピ
リミジン−2,4,6−トリイル基、4,5−ジクロロピリミジ
ン−2,6−ジイル基など）、オキシ基などを挙げること
ができる。
色素形成性反応基の具体例としては次のような基を挙げ
ることができる。（ただし、５−ピラゾロンは、２−ピ
ラゾリン−５−オンを意味する） 4,6−ビス（８−ヒドロキシ−3,6−ジスルホ−１−ナフ
チルアミノ）−ｓ−トリアジン−２−イル基 ４−アニリノ−６−（８−ヒドロキシ−3,6−ジスルホ
−１−ナフチルアミノ）−ｓ−トリアジン−２−イル基 ４−クロロ−６−（８−ヒドロキシ−3,6−ジスルホ−
１−ナフチルアミノ）−ｓ−トリアジン−２−イル基 ４−クロロ−６−（１−ｐ−スルホフェニル−５−ピロ
ゾロン−３−イルアミノ）−ｓ−トリアジン−２−イル
基 4,5−ジクロロ−６−（８−ヒドロキシ−３−スルホ−
１−ナフチルアミノ）−２−ピリミジル基 ４−クロロ−６−［３−（１−ｍ−スルホフェニル−５
−ピロゾロン−３−イルアミノ）アニリノ］−ｓ−トリ
アジン−２−イル基 ４−ｍ−スルホアニリノ−６−（２−ヒドロキシ−５−
クロロアニリノ）−ｓ−トリアジン−２−イル基 ４−（８−ヒドロキシ−3,6−ジスルホ−１−ナフチル
アミノ）−６−（１−フェニル−５−ピラゾロン−３−
イルアミノ）−ｓ−トリアジン−２−イル基 ４−［β−（Ｎ−エチル−４−トリクロロメチルアニリ
ノ）エトキシ］−６−（８−ヒドロキシ−3,6−ジスル
ホ−１−ナフチルアミノ）−ｓ−トリアジン−２−イル
基 ４−ｐ−スルホアニリノ−６−（３−ｐ−スルホフェニ
ル−4,4−ジクロロ−５−ピラゾロン−３−イルアミ
ノ）−ｓ−トリアジン−２−イル基 そして上記の基のスルホ基の代りに対イオンとしてアル
カリ金属陽イオン（例、Li 、Na 、Ｋ ）が結合した
スルホナト基（−SO3 ）が結合した基、 （1,3,3−トリメチル−６−ｐ−ホルミルフェニル−６
−アゾニアオクチル）オキシ基に対イオンとして塩素陰
イオンが結合した基 カプラー基質層に含有される上記の色素形成性反応基を
含むカプラー基質が、アナライトの作用によることなく
呈色反応層へ拡散することは、アナライトの作用によら
ない呈色、すなわち「かぶり」が発生することを意味
し、分析精度の低下をもたらすので、確実にこれを防止
しなければならない。
カプラー基質層を塗布により形成する場合には、カプラ
ー基質を一種または二種以上のポリマーからなるバイン
ダー溶液中に溶解または分散した液を塗布、乾燥して用
いる。しかしながら、カプラー基質自体が高分子量であ
る場合には、バインダーを用いずに塗布あるいは含浸な
どの方法によっても形成することができる。たとえば、
紙、布、多硬質プラスチック膜などにカプラー基質を含
浸させるなどの前処理を行なったのち、呈色反応層上に
ラミネートなどの手段によって積層することも可能であ
る。
このカプラー基質層に用いうる親水性バインダーとして
は各種の親水性バインダーがある。その例としては、ゼ
ラチン、アガロース、アルギン酸ナトリウム、カルボキ
シメチルセルロースなどの天然親水性高分子物質、そし
てポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビ
ニルピロリドン、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリヒド
ロキシエチルメタクリレート、アクリル酸コポリマー、
マレイン酸を含むコポリマーなどの親水性合成高分子物
質などを挙げることができる。
これらのうちから、使用状況やアナライトの特性、塗布
特性などを考慮して適当なバインダーを選択する。たと
えば、プロテアーゼの分析材料用バインダーとしてはゼ
ラチンは不適当であり、主としてアガロースが用いられ
る。また、アナライトの分子量が大きい場合（たとえ
ば、アミラーゼなど）には、アナライトをカプラー基質
層中へ効率良く拡散させるため、膨潤率の大きいバイン
ダー、たとえば、ポリアクリルアミドを使用することが
望ましい。アナライトとバインダーの分子量からみた相
互の適合性はこの分野ではよく知られており、詳細な説
明は不要であろう。
親水性バインダーポリマーのうちで一般的に適している
のは、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリアクリル
酸ナトリウム、およびアクリル酸を含むコポリマーであ
る。
カプラー基質層には非拡散性カプラー基質、親水性バイ
ンダーのほかにも、塗布性能、拡散性化合物の拡散性、
反応性、保存性などの諸性能の向上を目的として、界面
活性剤、pH調節用試薬、微粉末、酸化防止剤、その他有
機物あるいは、無機物からなる各種添加剤を加えること
ができる。
カプラー基質層の層厚に特に制限はないが、塗布層とし
て設けるためには約１〜50μｍ、特に好ましくは、約２
〜30μｍの範囲の層厚が適当である。
ただし、ラミネートによる積層などの塗布以外の方法に
よる場合には、膜厚は、数十μｍから数百μｍの範囲で
大きく変化しうる。
上記の多層分析要素は基本的には上記のカプラー基質層
および呈色反応層から構成されるが、必要ならば、カプ
ラー基質層と反対側の呈色反応層の下側に光透過性水不
透過性支持体を設けることができる。このような支持体
としては、ポリエチレンテレフタレート、セルロースエ
ステル（セルロースジアセテート、セルローストリアセ
テート、セルロースアセテートプロピオネートなど）、
ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレートなどのフ
ィルム類やガラス板など厚さ約50μｍから約2mmまでの
公知の水不透過性透明支持体を用いることができる。
支持体が疎水性で呈色反応層との接着が不充分な場合に
は、支持体の表面を親水化する処理（例えば、紫外線照
射、電子線照射、火焔処理、アルカリによる加水分解な
ど）を施すか、または支持体の表面に、支持体と試薬層
の親水性バインダーの両者に対して適当な大きさの接着
力を有する物質からなる下塗層を設けたり、支持体の表
面にその光透過性を著しく現象させない範囲で微細な凹
凸を形成させる処理（ブラシかけ、電解エッチング等）
を施すなどの公知の補助処理を施すことができる。
多層分析要素には、さらに必要に応じて拡散防止、試料
の均一展開、光遮蔽、接着などを目的としたその他の機
能層を積層付設して利用することができる。
拡散防止層の機能は、アナライトによる作用を受ける前
に非拡散性基質の他層への拡散を完全に防止し、かつ拡
散性となった反応生成物（拡散性化合物）の拡散を妨げ
ないことにある。勿論、呈色反応層中のジアゾニウム化
合物のカプラー基質層中への拡散を防止する機能も有す
る。拡散防止層に用いられる材料は、カプラー基質層に
用いられるものと同様の親水性ポリマー類である。これ
らのうち特に適当なポリマーは、ゼラチン、アガロー
ス、ポリビニルアルコールであって、これらは非拡散性
基質と生成物（拡散性化合物）の間の拡散性の差を明確
にするのに適した特性を有している。この拡散防止層中
にもカプラー基質層に関して述べたと同様各種の添加物
を加えることができる。
拡散防止層はその機能から理解されるように、カプラー
基質層と呈色反応層との間に設けられ、通常約0.5〜５
μｍの厚さを有する。
多層分析要素は、カプラー基質層の上（呈色反応層から
遠い側）に展開層を付設した形態とすることもできる。
展開層は繊維質又は非繊維質多孔性媒体からなり、アナ
ライトを含有する試料液体が滴下又は点着されたとき
に、これをほぼ均一に展開してカプラー基質層に送りこ
む機能を持つ層である。
このような多孔性媒体としては、種々の孔径を持つポリ
マー濾過膜（メンブランフィルター）、セファデック
ス、アガロース、デキストラン等の非繊維質媒体があ
り、また、パルプ、綿、絹、羊毛のような天然繊維、セ
ルロースエステル、ビスコースレーヨンのような半合成
繊維、ポリアミド、ポリエステル、ポリオレフィンのよ
うな合成繊維、更に、繊維質無機材料、例えば、ガラス
繊維、着色ガラス繊維、石綿等、などの各種の繊維質材
料を織物、フェルト、連続空隙含有不織布などの形にし
て用いることができる。
また、ブラッシュポリマー（一般名：メンブランフィル
ター）を用いることもでき、また、珪藻土または微結晶
材料（例えば微結晶セルロース）などの微多孔体を結合
剤中に均一に分散した構造体、ガラスや合成高分子物質
の微小球形ビーズを相互に点接触させて結合剤で保持し
た多孔性構造体、TiO2もしくはBaSO4等の微細粉末を均
一に分散させたブラシュポリマーなどを用いることもで
きる。さらに、親水化処理した織物として、洗浄水洗し
脱脂して乾燥した織物、洗浄水洗し脱脂した後に界面活
性剤、湿潤剤、親水性ポリマー、またはTiO2もしくはBa
SO4微粉末などを分散した親水性ポリマーを少量含浸さ
せた織物がある。このような親水化処理した織物を展開
層として用いる技術および織物の詳細については、特開
昭55−164356号公報に具体的に詳細に記載されており、
その記載に従って多層分析要素に利用することができ
る。
展開層の厚さは約50μｍから約1mm、好ましくは80から4
00μｍ、そして、さらに好ましくは100から300μｍの範
囲である。
上記の多層分析要素のカプラー基質層と呈色反応層との
間には、色遮蔽層または光反射層を設けることもでき
る。さらに展開層と色遮蔽層または光反射層との間に、
展開層を強固に接着する目的で液体試料に対して透過性
の接着層を設けることができる。色遮蔽層、光反射層、
接着層については前述の公開公報に詳細に記述されてお
り、多層分析要素において、その記述に従って設けるこ
とができる。
色遮蔽層または光反射層としては、TiO2微粉末またはBa
SO4微粉末等の白色微粉末が親水性バインダーポリマー
に分散されてなる厚さ約１μｍから約50μｍ、好ましく
は約２μｍから約20μｍの範囲の層、あるいはアルミニ
ウム等の白色または淡色の金属光沢をもつ微粉末が親水
性バインダーポリマーに分散されてなる厚さ約２μｍか
ら約50μｍ、好ましくは約２μｍから約20μｍの層、あ
るいはアルミニウム等の白色または淡色の金属からなる
厚さ約５μｍから約100nm、好ましくは約5nmから約50nm
の液体試料透過性の多項性金属薄層などの層を設けるこ
とができる。
接着層としては、カプラー基質層、色遮蔽層または光反
射層などにバインダーとして用いられている液体試料お
よびアナライトに対して透過性の親水性ポリマーと同種
のポリマーからなる厚さ約0.5μｍから約10μｍ、好ま
しくは約0.7μｍから約５μｍの層の範囲の層を設ける
ことができる。親水性ポリマーからなる接着層に展開層
を接着するには、親水性ポリマー水溶液をカプラー基質
層、色遮蔽層または光反射層の上に塗布し、そののちの
半乾きのときに、あるいは乾燥後に接着層の表面を水ま
たは界面活性剤を含む水で湿潤させておいて、その表面
に多項性材料を接触させ、適当な圧力をかけて接着層に
一様に接着することができる。また接着層の上に多孔質
層を形成しうる溶液または分散液を塗布することによっ
ても展開層が強固に接着した多層分析要素を得ることが
できる。
次にアミラーゼ活性測定用の多層分析要素を具体例とし
て、さらに詳しく説明する。
本発明による分析要素の一実施態様としてのアミラーゼ
分析用多層分析要素は、たとえば、アミラーゼの基質で
あるセミロース結合を含む化合物、たとえば澱粉に色素
形成性反応基を結合させた非拡散性基質と親水性バイン
ダーとからなるカプラー基質層、拡散防止層および基質
に結合した色素形成性反応基と反応して色素を形成する
ジアゾニウム化合物と親水性バインダーとからなる呈色
反応層とを透明なプラスチックフィルム上に重層塗布し
た構成をしている。
澱粉分子は本来非常に大きいため非拡散性であって反応
前には呈色反応層の中へ拡散することはないので、色素
形成性反応基とジアゾニウム化合物とは隔離された状態
で保持されており、多層分析要素は実質上無色である。
被検物質であるアミラーゼを含む試料水溶液が基質層に
点着されるとアミラーゼが水媒体と共に基質層中に拡
散、浸透する。次いでアミラーゼによる加水分解作用が
進行し、基質のカプラー化澱粉分子が切断される。この
カプラー化澱粉の切断により生成した色素形成性反応基
が結合した少糖類（拡散性化合物）が呈色反応層中に拡
散していき、そこでジアゾニウム化合物とカップリング
反応を起し、はじめて色素が形成される。アミラーゼの
活性は澱粉の加水分解速度に比例し、一方、色素形成速
度は呈色反応層中に拡散した色素形成性反応基が結合し
た少糖類の量に比例する。従って、一定時間内に形成さ
れた色素の量を測光することによって、アミラーゼの活
性を知ることができる。
以上のようにして色素形成反応速度を測定し、予め既知
量のアミラーゼを用いて作成した検量線と上記の色素形
成反応速度とから、被検液中のアミラーゼ活性を測定す
る。この方法においては、多層分析要素は被検液の適用
前にほぼ無色であるため、反応後に測光によって得られ
る光学濃度値は、酵素反応の結果として形成された色素
量そのものに比例する。従って従来より知られているブ
ルースターチ法あるいは特開昭53−131089号公報に開示
された乾式分析法において利用されているブルースター
チ類似の、予め色素を澱粉に結合した染料基質を用いる
方法において必要とされる未反応基質と基質反応物との
測光時での完全な分離操作は不要となる。
また、本発明の多層分析要素の実施態様においては、光
遮蔽層を用いることなく透過光により測定することも可
能である。
以下、この多層分析要素について、具体的にその構成お
よび材料を説明する。
本発明の実施態様の多層分析要素の具体的な層構成の例
を第１図ないし第４図に示す。第１図の多層分析要素
は、光透過性水不透過性支持体10の上に、その支持体か
ら遠い側から順に、実質的に無色でジアゾニウム化合物
と反応して色素を形成し得る色素形成性反応基を有し、
アナライトの作用により前記色素形成性反応基を有し実
質的に無色でかつ親水性バインダーの中を水の存在下に
拡散しうる拡散性化合物を生成しうる被拡散基質を親水
性バインダーの中に含んでなるカプラー基質層50、そし
て前記の色素形成性反応基と反応して色素を形成しうる
ジアゾニウム化合物を高分子カルボン酸誘導体バインダ
ーの中に含んでなる呈色反応層20が積層された構成から
なるものとして示されている。すなわち、非拡散性基質
とジアゾニウム化合物とは互いに隔離されていればよ
い。
第２図の多層分析要素は呈色反応層20とカプラー基質層
50との間に拡散防止層30が設けられた構成の多層分析要
素である。拡散防止層の機能については後に詳しくは説
明する。
第３図は、多層分析要素の別の層構成からなる実施態様
を示す概念図であり、光透過性水不透過性支持体10の上
に呈色反応層20、拡散防止層30、カプラー基質層50、展
開層70をこの順に積層した構成よりなる。
第３図の多層分析要素を用いた場合、アナライト（例、
アミラーゼ）を含有する試料液体の一滴が展開層に点着
されると展開層でほぼ均一に展開されて、カプラー基質
層50に浸入する。カプラー基質層中ではアナライトの作
用によって非拡散性基質から拡散性化合物が生成し、カ
プラー基質層50から拡散防止層30を通過して呈色反応層
20に拡散していく。反応生成物たる拡散性化合物には色
素形成性反応基が結合しているので、呈色反応層20に到
達すると、その色素形成性反応基とジアゾニウム化合物
とが反応して色素が形成される。アナライトが加水分解
酵素の場合には、酵素が高分子量であるので拡散防止層
30を通過することができず、非拡散性基質と共にカプラ
ー基質層50にとどまる。以上の結果、酵素活性に比例し
て色素が形成されることになるので、生成した色素量を
測定することにより、点着された試料液体の酵素活性を
知ることができる。色素量の測定にはその色素の吸収波
長領域における透過または反射による光学的測定が適し
ているが、目的や必要とする精度によっては目視による
判定も可能である。
第４図は、第３図に示した構成からなる多層分析要素に
おいて、拡散防止層30の代りに光遮蔽層40が設けられた
構成を示している。
以下では説明を理解しやすくするために第１図の構成の
多層分析要素を例にとり、必要に応じて第２図ないし第
４図に示した多層分析要素に設けられている追加の機能
層の説明を加えながら、本発明の分析要素を詳細に説明
する。
カプラー基質層50は、非拡散性基質が実質的に無色であ
るので、無色を示す。呈色反応層20もジアゾニウム化合
物として無色の化合物を選択することにより無色とする
ことができる。両層ともその層厚が最大で約50μｍであ
るので透明であり、従って、第１図に示した多層分析要
素は透明である。アナライトを含む試料液体（水性溶
液、すなわち溶媒または分散媒として水を含む溶液また
は分散液）が多層分析要素の上に点着されると、アナラ
イトの作用によりカプラー基質層50の中で非揮発性のカ
プラー基質が加水分解に代表される化学反応を受けて、
無色の拡散性化合物が生成する。この無色の拡散性化合
物がカプラー基質層50の親水性バインダーマトリクスの
中と呈色反応層20の高分子カルボン酸誘導体バインダー
マトリクスの中を、主に試料液体に含まれていた溶媒ま
たは分散媒としての水に由来する水の存在下に拡散し、
呈色反応層20の中に存在するジアゾニウム化合物に接触
し、ジアゾカップリング反応がおこり色素が形成され
る。従って、一定の条件下で一定時間反応させた後、呈
色反応層20で生成した色素量を測光定量することによ
り、試料液体の中に含まれるアナライトの量または活性
値を知ることができる。
上記の多層分析要素は前述したように水性液体試料、特
に、血液、尿、唾液、髄液、腸液、膵液などの生体液中
の加水分解酵素活性の測定に有効である。血液中の加水
分解酵素、たとえば、アミラーゼの酵素活性の測定に
は、従来ではいずれの方法によっても、採血全血から遠
心分離などの方法により血しょう又は血清を分離し、こ
れを試料液体として用いてきた。その理由は、全血中に
多量に存在するヘモグロビンによる測光時の干渉を排除
できなかったことにある。
上記の多層分析要素は、機能層の一つとして、光遮蔽層
を組み込むことにより、従来実施されてきた分析法にお
いては不可能であった全血をそのまま試料液体とする酵
素活性の測定をも可能となる。
上記の多層分析要素は、試料液体の点着後に初めて呈色
反応が進行する形式の分析要素であるので、反応終了後
の測光は分析要素の下面からでもよく、また、透過測光
でも反射測光でもよい。
上記の多層分析要素において、呈色反応層とカプラー基
質層との間に光散乱性の高い光遮蔽層を設けることによ
り、カプラー基質層の上面にまで浸入した赤血球やヘモ
グロビンに基づく干渉を遮断することができる。従っ
て、透明支持体を通して呈色反応層中の色濃度を反射測
光する方法を利用することにより、全血を試料液体とす
る直接測定も可能となる。
上記の多層分析要素の層構成の一例が第４図に示されて
いる。すなわち、光遮蔽層40はそれ自身、拡散性の干渉
物質および／またはジアゾニウム化合物の拡散防止の機
能も果すので、特に拡散防止層を設ける必要はなくな
る。また血清中にも混入するヘモグロビン、ビリルビ
ン、乳びなどは血清分析において干渉物質となるもので
あるが、上記の多層分析要素に用いられる拡散防止用の
層は、これらの干渉物質の下層への拡散を完全にブロッ
クするので、光遮蔽層を設けた場合には、溶血、高ビリ
ルビン、乳びなどを含む血清試料の分析も誤差なく実施
することができる。
上記のような構成からなる多層分析要素に用いられる非
拡散性基質とは分析の目的となるアナライトの作用によ
り、分子の大きさ、形状、解離度などの物性が著しく変
化し、結果として、多層分析要素の親水性バインダー層
中での拡散性が著しく増大する物質をいう。非拡散性基
質の具体例は生体液中に含まれる各種酵素の基質が挙げ
られる。これらのうち多層分析要素に有効に適用できる
ものの例としては加水分解酵素があり、その具体例とし
てはプロテアーゼ（例、トリプシン、キモトリプシン、
ペプシンなど）、アミラーゼ、リパーゼおよびペクチナ
ーゼを挙げることができる。これらの加水分解酵素をア
ナライトとする場合、非拡散性基質としてはそれぞれの
加水分解酵素の基質、すなわち、蛋白質、アミロース、
グリセリドまたはペクチンに実質的に無色の色素形成反
応基を結合させたものが用いられる。
なお、上記においては本発明の分析要素の代表的な実施
態様の一つであるジアゾニウム化合物および高分子カル
ボン酸誘導体からなる呈色反応層とカプラー基質層とか
らなる多層分析要素について詳しく説明したが、前述の
ように、本発明の分析要素は、このような構成からなる
ものに限られるものではない。
たとえば、上記の多層分析要素についても、呈色反応層
とカプラー基質層とは必ずしも積層した形態で設ける必
要はなく、たとえば、第５図に図示されているように試
薬層を、ジアゾニウム化合物と高分子カルボン酸誘導体
とからなるカプセル状の呈色反応相61がカプラー基質相
62内において隔離された状態にて存在するような単一層
として構成することもできる。
また、第５図において、試料溶液の試薬層60への均一も
しくは略均一の展開拡散を別に用意した装置、用具など
を用いて実現する場合には、展開層70の付設を省略する
ことも可能である。さらに、試薬層60を自己支持性とす
れば、光透過性水不透過性支持体10もまた分析要素にと
って必須とはいえない。すなわち、本発明の分析要素
は、その目的および必要とする分析精度などによって
は、単一の試薬層のみからなる構成とすることも可能で
ある。
また、本発明の分析要素の分析対象となる被検物質（ア
ナライト）についても、前述のように、各種のものを想
定することができる。そして、本発明の分析要素の物理
的構成および用いる試薬についても、その分析目的およ
び分析精度などに応じて、各種の物理的構成および化学
的構成をとることができる。
前述した通り、たとえば、コレステロール、トリグリセ
リド（中性脂肪）、グルコース、尿酸などのような生体
液に含有されている物質で、酸化還元酵素、特にそれぞ
れに対応するオキシダーゼにより分解されて過酸化水素
と低分子の化合物を生成するような物質もまた、本発明
の分析要素の非検物質とすることができる。すなわち、
それぞれの分解酵素であるオキシダーゼは、その酵素活
性の最適pHが酸性側に寄っているものが多いので、本発
明の高分子カルボン酸誘導体バインダーを用いて層状体
を形成することにより分析要素の試薬層とすることがで
きる。
たとえば、上記の生体液に含有されている物質とオキシ
ダーゼとの反応により過酸化水素が発生することから、
この過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下において色
素形成カップリング反応をおこすような色素形成性化合
物、たとえば、1,7−ジヒドロキシナフタレン、４−ア
ミノアンチピリンおよびペルオキシダーゼとの組合せを
試薬層自体、あるいは試薬層の隣接層などに予め含有さ
せておくことにより、前述のカプラー化基質とジアゾニ
ウム化合物とを用いたアミラーゼの分析操作とほぼ同様
にして、定量的な分析を行なうことができる。
以下に本発明の分析要素の実施例および比較例を記載す
るが、それらは本発明を限定するものではない。なお、
実施例１〜３および比較例１〜３において用いたカプラ
ー化澱粉は次に示す合成例により得られたものである。
［合成例］ （１）色素形成性反応基（反応性カプラー）の合成： J.T.Thurstton等の方法［J.Amer.Chem.Soc.,73，
（７）,2981−2983（1951）］による塩化シアヌルと１
−アミノ−８−ヒドロキシナフタレン−3,6−ジスルホ
ン酸（Ｈ酸）モノナトリウム塩（以下、Ｈ酸Na塩と記
す）からの反応性カプラー、２−［８−ヒドロキシ−3,
6−ビス（ナトリウムスルホナト）−１−ナフチルアミ
ノ］−4,6−ジクロロ−ｓ−トリアジンの合成： 塩化シアヌル36.9gを熱アセトン150mlに溶解し、次いで
500mlの氷水に注ぎ、微細化して懸濁液にした。次い
で、140gのＨ酸Na塩、16gの水酸化ナトリウムを300mlの
水に溶解した液を０〜４℃の上記塩化シアヌル懸濁液に
滴下した。次いで、これに2N水酸化ナトリウム水溶液25
0mlを滴下した。反応液を徐々に室温に戻し、１時間撹
拌した。この反応液を４のアセトンに注入して晶析さ
せ、析出物を濾取した。得られた化合物はＨ酸とは異な
った紫外線吸収を示し、高速液体クロマトグラフィーに
より、生成した化合物（反応性カプラー）の含有が90％
以上であることが確認された。
（２）色素形成性反応基を有する非拡散性基質（カプラ
ー化澱粉）の合成： 水２に20gの水酸化ナトリウムを溶解し、さらにコー
ンスターチ46gを添加し撹拌したところ透明な糊状物と
なった。これに上記の（１）で得た反応性カプラー12g
を加え、室温で８時間撹拌した。反応液を希塩酸で中和
したのち1.5のアセトンを加え澱粉を沈澱させた。上
澄液をデカンテーションにより除去し、次いで、沈澱物
を２の蒸留水に溶解させた。溶解後に5gの塩化ナトリ
ウムを加え、さらにアセトン1.5gを加えて再沈澱させ
た。この操作を３回繰返すことにより、未反応の原料お
よび低分子化合物を除去した。
得られた沈澱物はカプラー化澱粉であり、この沈澱物を
凍結乾燥した。こうして得られたカプラー化澱粉を水で
膨潤させたのち、分散機で微粒子化すると水に容易に溶
解した。また、このものは１％水酸化ナトリウム水溶液
に均一に溶解し、その吸収スペクトルは前記反応性カプ
ラーと一致した。
反応性カプラーの反応仕込み比率を変えて上記と同様の
反応操作を実施したところ、反応性カプラーが異なった
割合に導入されて、反応性カプラーの分子数対グルコー
ス単位数の比率が１／18から１／50の範囲で種々の比率
をもつカプラー化澱粉が得られた。
得られたカプラー化澱粉の酵素活性を検定するために、
アミラーゼ定量用の市販品の染料化デンプンDyamy1−Ｌ
（ダイアミル−L:商標）と類似した方法で発色濃度を測
光した。
カプラー化澱粉460mg、燐酸一カリウム140mg、そして燐
酸二カリウム176mgを25mlの蒸留水に溶解してカプラー
化澱粉水溶液を調製した。発色液としては、市販のFast
Red Ｂ Salt CI−37125（ジアゾニウム塩含量約20
％）300mgを5gの蒸留水に溶解して用いた。
検定用アミラーゼ溶液としては、唾液を0.9％の塩化ナ
トリウムと７％のアルブミンとを含む水溶液で希釈し、
200ソモギ（Somogyi:単位／dl）と検定された試料を用
いた。
（３）操作法： ２本の試験官（Ａ、Ｂ）にカプラー化澱粉溶液1mlを各
々取り、別の２本の試験管（Ｃ、Ｄ）にダイアミル−Ｌ
の染料化基質溶液を各々1ml取った。各試験管は37℃で
３分間インクベーションし、試験管ＡおよびＣには各々
100μの検定用アミラーゼ溶液を、また試験管Ｂおよ
びＤには各々100μの0.9％塩化ナトリウムと７％アル
ブミンとを含む水溶液を添加した。
各試験管はその後37℃で10分間インクベーション、ダイ
アミル−Ｌ沈澱別（Dyamyl−Ｌ Precipitant）4mlを添
加してアミラーゼの酵素反応を停止させた。
次いで試験管ＡおよびＢには更に前記ジアゾニウム塩の
発色液を100μ加え発色させた。
全試験管を300rpmで10分間遠心分離したのち、上澄部を
Ａ、Ｂについては波長530nmの光で、Ｃ、Ｄいついては
波長540nmの光で測光して光学濃度値を求めた。その結
果を第１表に示す。
反応性カプラーのグルコース単位に対する結合比の異な
るカプラー化澱粉について同様の検定実験を実施したと
ころ、試験管Ａに対応する上澄液の光学濃度が0.23から
1.9までの広範囲な値が得られた。
以上の検定実験により、前記の（２）において得られた
カプラー化澱粉に対してアミラーゼは正常に作用すると
結論された。
［実施例１］ A.アミラーゼ活性測定用分析要素の製造 （１）呈色反応層形成用塗布液の調製 水100mlに、メチルビニルエーテル・無水マレイン酸
（モル比1:1）共重合体（商品名:GANTREZ AN 139（GA
F社製）、固有粘度［η］＝1.0〜1.4）5gおよびポリオ
キシエチレンノニルフェニルエーテル（１分子中にオキ
シエチレン基を平均10個含有）1gを加え、80℃にて30分
間加熱してエステル化反応を進行させ、バインダー溶液
を調製した。
別に、２−メトキシ−５−テトラデシルオキシカルボニ
ルベンゼンジアゾニウムテトラフルオロボレート0.150g
を、アセトン2mlとエチルアルコール4mlからなる混合溶
媒に溶解してジアゾニウム塩溶液を調製し、これを撹拌
下に前記の反応液（バインダー溶液）に添加した。添加
終了後、この混合液（呈色反応層形成用塗布液）を20分
間観察したが、混合液は透明な溶液の状態を維持してい
た。
（２）呈色反応層の形成 ゼラチン下塗層を有する無色透明のポリエチレンテレフ
タレート（PET）フィルム（厚さ180μｍ）の上に、上記
（１）で調製した呈色反応層形成用塗布液を10μｍの乾
燥塗布厚になるようにして塗布したのち、これを50℃で
空気乾燥して呈色反応層を形成した。乾燥後の呈色反応
層は透明度の高い状態を維持していた。
（３）拡散防止層の形成 水50ml、二酸化チタン微粉末80g、およびｐ−ノニルフ
ェノキシグリセリン（25％水溶液）0.5gからなる混合物
をボールミル型粉砕機にて充分粉砕し、これにアガロー
ス３％水溶液300gを添加して混合したのち、呈色反応層
の上に塗布、乾燥して、拡散防止層を形成させた。
得られた拡散防止層の乾燥後の厚さは６μｍであった。
（４）カプラー基質層の形成 前記の合成例において得られたカプラー化澱粉（反応性
カプラー分子数／グルコース単位数＝１／30）10g、燐
酸水素二カリウム2.6g、燐酸二水素一カリウム2.1g、水
105g、ポリアクリルアミド（５％水溶液）80g、および
ｐ−ノニルフェノキシグリセリン（25％水溶液）2gから
なる混合物を溶液状とし、これをナイロンメッシュ濾過
シートを用いて濾過してカプラー基質層形成用塗布液を
調製した。
この塗布液を拡散防止層の上に塗布、乾燥して、カプラ
ー基質層を形成させた。得られたカプラー基質層の乾燥
後の厚さは10μｍであった。
（５）展開層の付設 ポリエステルと木綿との混紡布（混紡比：ポリエステル
／木綿＝75／25）を、ポリアクリルアミド（平均重合
度:18,000、0.8％水溶液）150gおよびｐ−ノニルフェノ
キシグリセリン（25％水溶液）1gからなる水溶液に浸漬
して親水化処理を行なった。
上記の（４）までの工程によりカプラー基質層までを付
設したPETフィルムのカプラー基質層の表面をｐ−ノニ
ルフェノキシグリセリン（0.2％水溶液）で湿潤させた
のち、その上に上記の親水化処理した混紡布を圧着し、
次いで、これを乾燥した。
B.アミラーゼ活性の測定 新鮮なヒト唾液を７％アルブミン生理食塩水で希釈する
ことにより6,000U／の活性値を持つアミラーゼ標準液
を調製した。このアミラーゼ標準液10μを、上記にお
いて製造したアミラーゼ活性測定用分析要素（分析フィ
ルム）の上に点着（スポット）させ、37℃で加水分解反
応を進行させた。マクベス反射濃度計を用いて加水分解
反応の進行を、分析要素の呈色反応層の反射濃度を測定
することにより観察した。得られた結果を第１表に示
す。
［比較例１］ A.アミラーゼ活性測定用分析要素の製造 （１）呈色反応層形成用塗布液の調製 実施例１において、バインダー溶液として、水100mlに
メチルビニルエーテル・無水マレイン酸共重合体（固有
粘度［η］＝1.0〜1.4）5gを溶解した溶液を用いた以外
は同様にして、これに、同一のジアゾニウム塩溶液を撹
拌下に添加した。添加終了後、この混合液（呈色反応層
形成用塗布液）を20分間観察したところ、混合液には結
晶が析出していた。
（２）呈色反応層の形成 実施例１と同一のPETフィルムの上に、上記（１）で調
製した呈色反応層形成用塗布液を10μｍの塗布厚にて塗
布したのち、これを50℃で空気乾燥して呈色反応層を形
成した。乾燥後の呈色反応層の表面には多量の結晶の析
出が観察された。
以後は、実施例１と同様にして、拡散防止層、カプラー
基質層、および展開層を形成付設して多層型の分析要素
を製造した。
B.アミラーゼ活性の測定 上記において製造したアミラーゼ活性測定用分析要素
（分析フィルム）を用いて実施例１と同様にしてアミラ
ーゼ活性の測定を、分析フィルムに点着されたアミラー
ゼ標準液による加水分解反応の進行を、分析要素の呈色
反応層の反射光学濃度を測定することにより観察した。
得られた結果を第１表に示す。
［実施例２］ A.アミラーゼ活性測定用分析要素の製造 （１）呈色反応層形成用塗布液の調製 水100mlに、メチルビニルエーテル・無水マレイン酸
（モル比1:1）共重合体（商品名:GANTREZ AN 119（GA
F社製）、固有粘度［η］＝0.1〜0.5）5gおよびポリオ
キシエチレンモノステアレート（１分子中にオキシエチ
レン基を約10個含有）1gを加え、80℃にて30分間加熱し
てエステル化反応を進行させ、バインダー溶液を調製し
た。
別に、２−メトキシ−５−テトラデシルオキシカルボニ
ルベンゼンジアゾニウムテトラフルオロボレート0.150g
を、アセトン1mlとエチルアルコール4mlからなる混合溶
媒に溶解してジアゾニウム塩溶液を調製し、これを撹拌
下に前記の反応液（バインダー溶液）に添加した。添加
終了後、この混合液（呈色反応層形成用塗布液）を20分
間観察したが、混合液は透明な溶液の状態を維持してい
た。
（２）呈色反応層の形成 ゼラチン下塗層を有する無色透明のポリエチレンテレフ
タレート（PET）フィルム（厚さ180μｍ）の上に、上記
（１）で調製した呈色反応層形成用塗布液を10μｍの乾
燥塗布厚になるようにして塗布したのち、これを50℃で
空気乾燥して呈色反応層を形成した。乾燥後の呈色反応
層は透明度の高い状態を維持していた。
以後は、実施例１と同様にして、拡散防止層、カプラー
基質層、および展開層を形成付設して多層型の分析要素
を製造した。
B.アミラーゼ活性の測定 上記において製造したアミラーゼ活性測定用分析要素
（分析フィルム）を用いて実施例１と同様にしてアミラ
ーゼ活性の測定を、分析フィルムに点着されたアミラー
ゼ標準液による加水分解反応の進行を、分析要素の呈色
反応層の反射光学濃度を測定することにより観察した。
得られた結果を第２表に示す。
［比較例２］ A.アミラーゼ活性測定用分析要素の製造 （１）呈色反応層形成用塗布液の調製 実施例２において、バインダー溶液として、水100mlに
メチルビニルエーテル・無水マレイン酸共重合体（固有
粘度［η］＝0.1〜0.5）5gを溶解した溶液を用いた以外
は同様にして、これに、同一のジアゾニウム塩溶液を撹
拌下に添加した。添加終了後、この混合液（呈色反応層
形成用塗布液）を20分間観察したところ、混合液には結
晶が析出していた。
（２）呈色反応層の形成 実施例１と同一のPETフィルムの上に、上記（１）で調
製した呈色反応層形成用塗布液を10μｍの乾燥塗布厚に
なるようにして塗布したのち、これを50℃で空気乾燥し
て呈色反応層を形成した。乾燥後の呈色反応層の表面に
は多量の結晶の析出が観察された。
以後は、実施例１と同様にして、拡散防止層、カプラー
基質層、および展開層を形成付設して多層型の分析要素
を製造した。
B.アミラーゼ活性の測定 上記において製造したアミラーゼ活性測定用分析要素
（分析フィルム）を用いて実施例１と同様にしてアミラ
ーゼ活性の測定を、分析フィルムに点着されたアミラー
ゼ標準液による加水分解反応に進行を、分析要素の呈色
反応層の反射光学濃度を測定することにより観察した。
得られた結果を第２表に示す。
［実施例３、および比較例３］ A.アミラーゼ活性測定用分析要素の製造 （１）呈色反応層形成用塗布液の調製 水100mlに、メチルビニルエーテル・無水マレイン酸共
重合体（固有粘度［η］＝1.0〜1.4）5gおよび第３表に
記載した非イオン性界面活性剤1gを加え、80℃にて30分
間加熱してエステル化反応を進行させ、バインダー溶液
を調製した。
別に、２−メトキシ−５−テトラデシルオキシカルボニ
ルベンゼンジアゾニウムテトラフオロボレート0.180g
を、アセトン2mlとエチルアルコール4mlからなる混合溶
媒に溶解してジアゾニウム塩溶液を調製し、これを撹拌
下に前記の反応液（バインダー溶液）に添加した。添加
終了後、この混合液（呈色反応層形成用塗布液）を20分
間観察した結果を第３表に示す。
（２）呈色反応層の形成 ゼラチン下塗層を有する無色透明のポリエチレンテレフ
タレート（PET）フィルム（厚さ180μｍ）の上に、上記
（１）で調製した呈色反応層形成用塗布液を10μｍの乾
燥塗布厚になるようにして塗布したのち、これを50℃で
空気乾燥して呈色反応層を形成した。乾燥後の呈色反応
層の状態を観察した結果を第３表に示す。
［実施例４］ A.コレステロール測定用分析要素の製造 （１）呈色反応層形成用塗布液の調製 水100mlに、メチルビニルエーテル・無水マレイン酸共
重合体（固有粘度［η］＝0.1〜0.5）5gおよびポリオキ
シエチレンモノステアレート（１分子中にオキシエチレ
ン基を約25個含有）2gを加え、80℃にて30分間加熱して
エステル化反応を進行させ、バインダー溶液を調製し
た。
別に1,7−ジヒドロキシナフタレン0.80gをアセトン2ml
に溶解した溶液を、上記のバインダー溶液（反応液）に
添加し、これにさらに４−アミノアンチピリン0.9gおよ
びペルオキシダーゼ（EC1.11.1.7）40、000IUを添加し
て呈色反応層形成用塗布液を得た。
（２）呈色反応層の形成 ゼラチン下塗層を有する無色透明のポリエチレンテレフ
タレート（PET）フィルム（厚さ180μｍ）の上に、上記
（１）で調製した呈色反応層形成用塗布液を10μｍの乾
燥塗布厚になるようにして塗布したのち、これを50℃で
空気乾燥して呈色反応層を形成した。乾燥後の呈色反応
層は透明度の高い状態を維持していた。
（３）拡散防止層の形成 水50mlに、二酸化チタン微粉末80g、ポリオキシエチレ
ンｐ−イソオクチルフェニルエーテル（非イオン性界面
活性剤）0.5g、アガロース8g、コレステロールエステラ
ーゼ（EC3.1.1.13）100,000IU、およびコレステロール
オキシダーゼ（EC.1.1.3.6）20,000IUを分散溶解させ、
この分散液を呈色反応層の上に塗布、乾燥して、拡散防
止層を形成させた。得られた拡散防止層の乾燥後の厚さ
は６μｍであった。
（４）展開層の付設 平均口径３μｍのメンブランフィルター（商品名、ミク
ロフィルターFM300、富士写真フィルム（株）製）を、
0.2％ポリオキシエチレンｐ−イソオクチルフェニルエ
ーテル水溶液に浸漬して親水化処理を行なった。
上記の（３）までの工程により拡散防止層までを付設し
たPETフィルムの核酸防止層の表面を0.2％ポリオキシエ
チレンｐ−イソオクチルフェニルエーテル水溶液で湿潤
させたのち、その上に上記の親水化処理したメンブラン
フィルターを圧着し、次いで、これを乾燥した。
B.コレステロールの測定 コレステロールを種々の濃度で含有するコレステロール
標準液10μを、上記において製造したコレステロール
測定用分析要素（分析フィルム）の展開層に点着（スポ
ット）し、37℃に保ち加水分解反応を進行させた。マク
ベス反射光学濃度計を用いて加水分解反応の進行を、６
分後における分析要素の呈色反応層の反射光学濃度を測
定することにより観察した。得られた結果を第４表に示
す。
［比較例４］ A.コレステロール測定用分析要素の製造 （１）呈色反応層形成用塗布液の調製 実施例１において、バインダー溶液として、水100mlに
メチルビニルエーテル・無水マレイン酸共重合体（固有
粘度［η］＝0.1〜0.5）5gを溶解した溶液を用いた以外
は同様にして、これに、色素形成性化合物（1,7−ジヒ
ドロキシナフタレンおよび４−アミノアンチピリン）お
よびペルオキシダーゼを添加して呈色反応層形成用塗布
液を得た。
（２）呈色反応層の形成 実施例１と同一のPETフィルムの上に、上記（１）で調
製した呈色反応層形成用塗布液を10μｍの乾燥塗布厚に
なるようにして塗布したのち、これを50℃で空気乾燥し
て呈色反応層を形成した。乾燥後の呈色反応層の表面に
は多量の結晶の析出が観察された。
以後は、実施例４と同様にして、拡散防止層、および展
開層を形成付設して多層型の分析要素を製造した。
B.コレステロール活性の測定 上記において製造したコレステロール活性測定用分析要
素（分析フィルム）を用いて実施例４と同様にしてコレ
ステロール活性の測定を、分析フィルムに点着された種
々の濃度のコレステロール標準液による加水分解反応の
進行を、６分後における分析要素の呈色反応層の反射光
学濃度を測定することにより観察した。得られた結果を
第４表に示す。
【図面の簡単な説明】
第１図乃至第５図は、それぞれ本発明の分析要素の実施
態様である多層分析要素の構成の例を示す模式的断面図
である。 第１図は、支持体、呈色反応層、およびカプラー基質層
からなる多層分析要素を表わす。 第２図は、支持体、呈色反応層、拡散防止層、およびカ
プラー基質層からなる多層分析要素を表わす。 第３図は、支持体、呈色反応層、拡散防止層、カプラー
基質層、および展開層からなる多層分析要素を表わす。 第４図は、支持体、呈色反応層、光遮蔽層、カプラー基
質層、および展開層からなる多層分析要素を表わす。 第５図は、支持体、試薬層（呈色反応相とカプラー基質
相が一層とされた形態の試薬層）、および展開層からな
る多層分析要素を表わす。 10:支持体、20:呈色反応層、30:拡散防止層、40:光遮蔽
層、50:カプラー基質層、60:試薬層、61:呈色反応層、6
2:カプラー基質層、70:展開層

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】酸性条件で安定もしくは活性を示す反応性
    試薬とバインダーとを含む試薬層を少なくとも一層含む
    分析要素において、該バインダーが高分子カルボン酸を
    含み、かつその高分子カルボン酸の分子中に含まれてい
    るカルボキシル基の一部に非イオン性界面活性剤がエス
    テル結合を介して結合していることを特徴とする分析要
    素。
  2. 【請求項２】高分子カルボン酸が、繰り返し単位として
    カルボキシル基およびエチレン性不飽和二重結合を有す
    る化合物から誘導された二価基を有し、それらのカルボ
    キシル基の一部に非イオン性界面活性剤がエステル結合
    を介して結合しているものである特許請求の範囲第１項
    記載の分析要素。
  3. 【請求項３】高分子カルボン酸が、繰り返し単位として
    カルボキシル基およびエチレン性不飽和二重結合を有す
    る化合物と、アクリル酸エステル、アルキルビニルエー
    テル、スチレンおよびスチレン誘導体、アクリロニトリ
    ル、酢酸ビニル、エチレン、プロピレン、イソブチレン
    からなる群より選ばれるコモノマーと共重合体で、それ
    らのカルボキシル基の一部に非イオン性界面活性剤がエ
    ステル結合を介して結合しているものである特許請求の
    範囲第１項もしくは第２項記載の分析要素。
  4. 【請求項４】カルボキシル基およびエチレン性不飽和二
    重結合を有する化合物から誘導された二価基が一般式
    （Ｉ）： で表わされる二価基であり、そして、 非イオン性界面活性剤が一般式（II）： CH2CH2O （II） で表わされる繰返し単位を含む特許請求の範囲第２項記
    載の分析要素。
  5. 【請求項５】非イオン性界面活性剤が一般式（III）： ＲCH2CH2OnH （III） ［ただし、Ｒは、炭素数２〜22のアルキル基、炭素数４
    〜12のアルキル基を置換基として有するアリール基、炭
    素数９〜19のアルキル基を有するアルキルカルボニルオ
    キシ基、もしくは炭素数２〜22のカルボン酸により少な
    くとも１個の水酸基がエステル化されているソルビタン
    またはソルビトール残基であり、そしてｎは２〜40の整
    数である］を有するものである特許請求の範囲第１項乃
    至第４項のいずれかの項記載の分析要素。
  6. 【請求項６】反応性試薬が、酸化還元酵素、そして多層
    分析要素に導入された被検物質と該酸化還元酵素との反
    応による生成物の作用により色素を形成することのでき
    るジアゾニウム化合物とからなる特許請求の範囲第１項
    記載の分析要素。
  7. 【請求項７】展開層、試薬層、および透明支持体層をむ
    多層分析要素の形態にある特許請求の範囲第１項乃至第
    ６項のいずれかの項記載の分析要素。
  8. 【請求項８】被検物質がグルコース、コレステロール、
    トリグリセリド、または尿酸である特許請求の範囲第７
    項記載の分析要素。
  9. 【請求項９】被検物質がアミラーゼである特許請求の範
    囲第７項記載の多層分析要素。
  10. 【請求項１０】ジアゾニウム化合物およびバインダーを
    含むジアゾニウム呈色反応層の上にカプラー基質層を積
    層してなる多層分析要素において、該バインダーが高分
    子カルボン酸を含み、かつその高分子カルボン酸の分子
    中に含まれているカルボキシル基の一部に非イオン性界
    面活性剤がエステル結合を介して結合していることを特
    徴とする分析要素。
  11. 【請求項１１】被検物質がアミラーゼである特許請求の
    範囲第10項記載の多層分析要素。
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