JPH02200191A - 蛋白質及びその発現と分泌に関する領域 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は蛋白質の発現、分泌に関わる領域に関するもの
である。さらに詳しくは本発明はエルビニア（Ｅｒｗｉ
ｎｉａ）属細菌のペクチン酸リアーゼ■の遺伝子の発現
、分泌生産に関与する領域を含有するＤＮＡ分子または
その誘導体に関する。更に、本発明は前記領域及びペク
チン酸リアーゼＩＩＩ遺伝子を含む組換えプラスミドを
用いたペクチン酸リアーゼ■の製造法及びペクチン酸リ
アーゼ■に関する。

〔従来の技術〕

ペクチン酸リアーゼはこうぞ、みつまた等のバルブ化に
応用する研究がなされており、工業的な用途が開発され
つつある。この用途に検討されているペクチン酸リアー
ゼはエルビニア属細菌の培養物から分離精製されており
、ペクチン酸リアーゼを安価に大量に製造する技術が望
まれている。

遺伝子組換えを利用して蛋白質を大量に製造しようとす
る試みは多く行われており、この技術に関する報告は既
に多い、特に大腸菌を宿主とする宿主ベクター系は、宿
主やベクターの種類が豊富で、最も遺伝子操作が容易で
ある。しかしながら大腸菌は、菌体外へ蛋白質を分泌で
きないという欠点があり、大腸菌にとって有害な蛋白質
の製造や蛋白質を大量に生産せしめるに適していない。

一方、この大腸菌で蛋白質を分泌生産せしめるベクター
もいくつか知られている。たとえば好アルカリ性バチル
スの遺伝子と大腸菌のコリシン因子由来のプラスミドｐ
Ｍ８９とを結合してなるプラスミドｐＥＡＰ　２　　［
ＣＫａ　ｔｏら、Ｅｕｒｊ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、、　１８，３３９（１９８３）
、５ｅｒｒａＬｉａ　ｔａａｒｃｅｓｃｅｎｓのプロテ
アーゼ遺伝子（Ｙａｎａｇｉｔａら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｆｏｌ、　。

用鉦１０８３（１９８６）　）等がある。

しかしながらこのようなベクターはまだ多（知られてお
らず、またこれらのベクターを用いても全てのポリペプ
チドを分泌生産できるものでない。

エルビニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔ
ｏｖｏｒａ）はダラム陰性菌で腸内細菌群に分類されて
おり、大腸菌と近縁であるが、ペクチン酸リアーゼをは
じめいくつかの酵素を分泌生産する。

一般にダラム陰性菌は細胞膜が脂質二重層になっている
ために酵素蛋白質などを分泌生産しないと言われている
が、このエルビニア・カロトボラのペクチン酸リアーゼ
がその膜を越えて培養液中に分泌される機構は明らかで
ない。

エルビニア属細菌のペクチン酸リアーゼの遺伝子で大腸
菌を形質転換し、ペクチン酸リアーゼを大腸菌で分泌生
産せしめた例（（Ｔｓｕｙｕｍｕら、Ｓｙｍｂｉｏｓｉ
ｓ、ｉ、　１０３　（１９８６））がある、しかし特開
昭６３−６８０８７号の場合、ペクチン酸リアーゼ■は
大腸菌では分泌生産されず、この違いがどのような原因
に起因するのか明らかではない。

エルビニア属細菌の生産するペクチン酸リアーゼには複
数のアイソザイムが存在し、それらのいくつかについて
報告されている。（Ｋｏｔｏｕｊａｎｓｋｉら、Ａｎｎ
ｕ、Ｒｅｖ、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ、、　２５．４０
５　（１９８７））エルビニア・クリサンセミ（Ｅ、ｃ
ｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）の場合、５つのアイソザイム
が知られており、アルカリ性、弱アルカリ性、中性の３
つに大別されている。エルビニア・カロトボラは２種類
のアルカリ性のアイソザイムと弱アルカリ性のアイソザ
イムを持っている。

エルビニア・カロトボラＥｒの場合、アルカリ性のペク
チン酸リアーゼを２種類生産することが報告されている
が、それら以外のペクチン酸リアーゼの存在は知られて
いない、　　（Ｓｕｇｉｕｒａら、Ｊ、Ｇｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｏｉｌ、、３０，１６７　　（１９８４）
ゴこれら２つのアルカリ性酵素は第１表のような性質を
示す。本発明の酵素はこれら２つの酵素とは性質が異な
り、新規な酵素である。

〔発明が解決しようとする課題〕

特開昭６３−６８０８７号にあるベクターは宿主をエル
ビニア属細菌とした場合、異種蛋白質を分泌生産せしめ
ることができるが、該ベクターを用いて大腸菌を宿主と
して異種蛋白質を生産せしめた場合、分泌生産しないと
いう欠点があった。

大腸菌は遺伝的な解析のすすんでいる汎用的な宿主であ
り、大腸菌で分泌生産に適したベクター系の種類も多く
ないことから大腸菌での分泌生産ベクターを開発するこ
とは実用上、また研究を進める上で有利である。

本発明者らは、エルビニア・カロトボラＦ！ｒから新規
なペクチン酸リアーゼ■の遺伝子のクローニングに成功
し、その後鋭意研究を重ね本発明を完成するに至った。

すなわち本発明はエルビニア属細菌のみならず、大ｍ菌
においても蛋白質を分泌生産せしめる能力のあるプラス
ミドに関するものである。

またペクチン酸リアーゼ■はトランスエリミネーション
によりガラクツロン酸のポリマーを分解するものである
が、従来より知られたペクチン酸リアーゼ１．ＩＩとは
性質が異なる新規な酵素であり、本発明はペクチン酸リ
アーゼＩＩＩ遺伝子により形質転換された形質転換株に
よるペクチン酸リアーゼの新規な製造方法を提供するも
のである。

〔課題を解決する為の手段〕

本発明はエルビニア属細菌のペクチン酸リアーゼＩＩＩ
遺伝子の発現及び分泌に関わる領域を含有するＤＮＡに
関する。

更に詳しくは、本発明は下記のＤＮＡ配列を含んでなる
蛋白質の発現及び分泌に係る領域をコードするＤＮＡ分
子又はその誘導体にある。

ＡＣＣＡＡＡＧＴＴＡ　　ＴＴＴＧＧＡＡＡＣＴ　　８
八ＡＡＧＴＡＡＡＡ　　ＡＴＡＡＬ、’ｌ１ｌＬ＋１ペ
クチン酸リアーゼ■の構造遺伝子はペクチン酸すアーゼ
Ｉ遺伝子との比較から月６番目付近にある開始コドンの
ＡＴＧから始まると考えられ、この＾ＴＧから１７９−
１８１番目のＧＣＧまでの配列が分泌のためのシグナル
配列であると考えられる。またＲＮＡポリメラーゼが認
識、結合する領域である一３５領域、−１０領域のコン
センサス配列として、３３番目から３８番目の配列ＴＴ
ＧＡＡＡおよび４９番目から５５番目の配列ＴＡＴＡＡ
Ａが、またリボゾームがｍＲＮＡに結合するサイトであ
るＳＤ配列として１０１番目から１０６番目の配列ＡＧ
ＧＡＧが、それぞれ該当するものと考えられる。また本
発明はこれらの配列の誘導体も含むものである。そして
、この誘導体とは上記ＤＮＡ分子の天然のまたは人為的
に得られる変異体、これらの配列から化学的、または生
物化学的に誘導され得る類似のＤＮＡ配列であって、発
現および分泌機能を有するものをいう。

本発明はまた次のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列
からなる蛋白質の分泌に係るペプチドをコードするＤＮ
Ａ分子又はその誘導体にある。

Ｎｌ２−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐ
ｒｏ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−八Ｉａ−Ｇｌｎ
−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａ すなわち、該アミノ酸配列は下流に続く蛋白質を菌体外
へ分泌せしめるだめのシグナル配列である。

なお、上記ＤＮＡ配列は、前述の通り蛋白質、特にペク
チン酸リアーゼ■の遺伝子の発現及び分泌に関与する領
域であって、この酵素の発現及び分泌を促進するもので
あるが、しかし、上記ＤＮＡ配列はこの酵素以外の他の
蛋白質の発現及び分泌にも有効なものである。また、上
記アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列についてもペク
チン酸リアーゼ■の分泌にを効であると共に他の蛋白質
の分泌にも有効である。

更に、本発明はペクチン酸リアーゼＩＩＩ遺伝子または
その誘導体を含んでなるプラスミドを形質転換して得ら
れる形質転換株を培養し、その培養物からペクチン酸リ
アーゼ■を得ることを特徴とするペクチン酸リアーゼ■
の製造方法にあり、更にまた新規なペクチン酸リアーゼ
■にある。

以下に本発明の詳細な説明する。

（ペクチン酸リアーゼＩＩＩ遺伝子の単離）ペクチン酸
リアーゼＩＩＩ遺伝子はペクチン酸リアーゼ■のＮ末端
アミノ酸近傍のアミノ酸配列に相当する塩基配列をプロ
ーブとしてエルビニア・カロトボラＥｒの染色体遺伝子
バンクから探し出すことができる。

染色体遺伝子バンクはエルビニア・カロトボラＥｒの染
色体をＥｃｏＲＩで消化後、７ｇ　ｔＷＥＳ・　λＢの
ＥｃｏＲＩサイトに導入し、大腸菌ＢＮＮ　４５株に完
成させて作成した。バンクから目的のペクチン酸リアー
ゼのクローンを得るために、ペクチン酸リアーゼ■のＮ
末端アミノ酸配列に相当するＤＮＡ配列を化学合成し、
プラークハイブリダイゼーションにより、陽性のプラー
クを選抜した。得られたプラークのファージＤＮＡを大
量に調製し、ＥｃｏＲＩにより外来遺伝子を切り出して
ｐＢＲ３２９のＥｃｏＲＩす・イトにつなぎ、ｐＮＮ　
１を得た。

ペクチン酸リアーゼＩＩＩ遺伝子はペクチン酸すアーゼ
Ｉｉｉ伝子の近傍に位置しており、ペクチン酸すアーゼ
Ｉ遺伝子を含むプラスミドｐＮＮ　ｌのペクチン酸すア
ーゼＩ遺伝子の下流に見出すことができる。この領域の
制限酵素地図は第１図に示す通りであって、ペクチン酸
リアーゼ■のＮ末端アミノ酸配列に対して作成したプロ
ーブとハイブリダイズする領域はＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ　
Ｉの０．３　Ｋｂのフラグメントである。

このフラグメントおよびＰｓｔＩサイトから上流の塩基
配列をジデオキシチェーンターミネーション法により決
定するとＳＤ配列、ＴＡＴＡボックス、シグナル領域と
思われる配列、及びその下流に構造遺伝子が連結されて
いる。（第２図）構造遺伝子はＥｃｏＲＩサイトより更
に下流に続いていたためＥｃｏＲＩサイト以下の遺伝子
を新たに以下に示す方法でクローニングし直した。

プラスミドｐＮＮ　３は第３図に示す方法により構築さ
れる。

すなわち、ｐＮＮ　１を旧ｎｄＩ［Ｉ及びＰｓｔＩで切
断してｌ１ｉｎｄ　ｍ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片（１，９Ｋｂ
）を得、ｐＵｃ１１９のマルチクローニングサイトのＰ
ｓｔ　Ｉ　、　Ｈ４ｎｄｎＩサイトの間にサブクローニ
ングしてｐＮＮｌｌを構築する。一方エルビニア・カロ
トボラＥｒの染色体ＤＮＡを調製し、Ｐｓｔｌで切断し
て２．２Ｋｂのフラグメントを調製し、先に調製したｐ
ＮＮｌｉのＰｓｔｌサイトに挿入、連結してプラスミド
ｐＮＮ　３を得る。

このプラスミドを大腸菌８８１０１株に形質転換し、ペ
クチンを含む寒天培地上でハロが形成されることを指標
にしてペクチン酸リアーゼを生産する大腸菌形質転換株
を得ることができる。宿主となる大腸菌は特に限定され
るものではないが、大腸菌１０１（宝酒造製）が例示さ
れる。得られた大腸菌形質転換株ＨＢＩＯＩ／ｐＮＮ　
３は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１
０４７９号として寄託されている。

該形質転換株大腸菌ＨＢＩＯＩ／ｐＮＮ　３はアンピシ
リンを含むＬＢ培地、またはカザミノ酸、グルコースを
添加したＭ９培地で培養することにより培養物中にペク
チン酸リアーゼ■を分泌、生産する。

ペクチン酸リアーゼの生産に用いる培地は上記の培地に
限られるものでなく、大腸菌の増殖可能な培地であれば
いずれの培地でも用いることができる。

（エルビニア属細菌によるペクチン酸リアーゼ■の生産
） プラスミドｐＮＮ　３を大腸菌ＨＢＩＯＩ／ｐＮＮ　３
から調製し、Ｉｔｏ　ら（八ｇｒｆｃ、Ｂｉｏ１．ｃｈ
ｅｍ、　、５二２．２９３　（１９８８）　）の方法に
従って、エレクトロポレーションによりエルビニア・カ
ロトボラＢｒに形質転換し、アンピシリン耐性を指標と
して形質転換株を選抜した。

該形質転換株をアンピシリンを含むＬＢ培地で前培養し
、ペクチン、カザミノ酸を含むＭ９培地で培養すると培
養物中にはペクチン酸リアーゼが大量に生産される。

ペクチン酸リアーゼの生産に用いる培地は上記の培地に
限られるものでなく、エルビニア属細菌の増殖可能な培
地であればいずれの培地も用いることができるが、その
例として炭素源として廃糖蜜、果汁、果汁の絞りかす、
ペクチン、ペクチン酸、ガラクツロン酸、ブドウ糖、蔗
糖、麦芽糖等が挙げられる。また窒素源としてはコーン
ステイープリカー、大豆粉、カゼイン、カザミノ酸、酵
母エキス、肉エキス、ペプトン等の他無機態のアンモニ
ウム塩、硝酸塩が挙げられる。

また、その他りん酸、Ｆｅ”、　Ｍｇ、　Ｃａ”、　Ｍ
ｎ”Ｚｎ”、　Ｎａ”＋　Ｋ’などの無機塩を含むこと
が望ましい。

ペクチン酸リアーゼ■は従来知られた方法、例えばゲル
濾過、イオン交換、吸着カラム等の各種クロマトグラフ
ィーを単独で、またはこれらを組み合わせることにより
精製することができる。特にカルボキシメチルトヨバー
ル（東ソー製）等陽イオン交換樹脂、ハイドロキシアパ
タイト、ゲル濾過、等電点電気泳動を組み合わせて用い
る方法が有効である。

培養上清中のペクチン酸リアーゼは、ヒドロキシアパタ
イトのカラムクロマトグラフィーにより流出溶剤として
りん酸カリウムの１０ｍＭから２００ｍＭの濃度勾配で
分画すると、ペクチン酸リアーゼＩ及びペクチン酸リア
ーゼ■の活性画分の他に両者の中間にペクチン酸リアー
ゼ■の高い活性画分を含んでおり、ペクチン酸リアーゼ
■が多量に生産されることを確かめられた。　（第４図
）。

またエルビニア・カロトボラＥｒの野生株の培養物中に
は第４図に示す通りペクチン酸リアーゼ■の活性は殆ど
ない。

精製したペクチン酸リアーゼ■の理化学的性質は次の通
りである。

（１）作　用 ポリガラクツロニドに作用し、ガラクツロン酸のα−１
，４結合を切断し、還元末端に二重結合を持つ不飽和ガ
ラクツロン酸を生成する。

（２）基質特異性 ペクチン、脱エステル化されたペクチン酸、α−１，４
結合により結ばれたガラクツロン酸のオリゴマー、還元
末端が不飽和ガラクツロン酸であるオリゴガラクッロニ
ドに作用する。

（３）至適ｐＨ ｐＨ１０，０で活性が最大となり、ｐＨ６〜１１の範囲
で安定である。

（４）至適温度及び熱安定性 至適温度は６０゛Ｃであり、４０°Ｃまでの熱安定であ
る。

（５）金属イオン、阻害剤の影響 Ｃａイオンにより活性化され、その至適Ｃａ１１１度は
０．２ｍＭである。またＥＤＴＡＳＥＧＴＡ−より阻害
される。

（６）分子量 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分子量は
約３６，０００である。

このペクチン酸リアーゼ■の性質を従来公知のペクチン
酸リアーゼＩおよび■と比較した結果は第１表の通りで
あり、ペクチン酸リアーゼ■が新規酵素であることが判
る。

至適Ｃａ濃度（ｍＭ）　　　　０．２　　０．６　　０
．２分子量　　３６，５００３７．０００３６，０００
ＥＤＴＡによる阻害　　　＋　　　＋　　　＋ＥＧＴＡ
による阻害　　　＋　　　＋　　　十以下、実施例によ
り本発明の詳細な説明する。

〔実施例〕

遺伝子の取り扱いに関する一般的な操作、例えば染色体
ＤＮＡ、プラスミドの菌体からの抽出、調製、制限酵素
による消化、アガロースゲル電気泳動、ゲルからのＤＩ
’ＪＡの回収、ＤＮＡフラグメントの結合、形質転換な
どの操作は特にことわりがないかぎり一般の底置、例え
ば“’ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ、　ａ　１ａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ”　（Ｍａｎｉａｔｔ
ｓ　　ら、Ｇｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））、　「バイオテクノ
ロジー実験マニュアルｊ　（山内ら編、三共出版）に従
って行なった。

また実験に供した制限酵素等の酵素類はとくにことわり
がない限り全酒造製、日本ジーン類、東洋紡績型を用い
た。

１・６　　ン　１アーゼ■゛　　　の プラスミドｐＮＮ　１の制限酵素サイト及び、ペクチン
酸すアーゼＩ遺伝子の位置を第１図に示した。

ｐＮＮ　ｌを含有する大腸菌ＨＢＩＯＩ／ｐＮＮ　１を
ＬＢ培地で一夜３７°Ｃで振盪培養し、集菌後アルカリ
ー３ＤＳ法によりプラスミドｐＮＮ　１を調製した。

ｐＮＮ　１を旧ｎｄｌ［Ｉ及びＥｃｏＲＩで消化し、０
．８％のアガロースゲル電気泳動によって分離し、２．
２ｋｂの旧ｎｄＩ［ｒ−ＥｃｏＲＩフラグメントをゲル
から抽出し、フェノール、クロロホルム抽出して精製し
た。

同様にｐＮＮ　１からＢｃｏＲＩ消化によりＥｃｏＲＴ
−ＥｃｏＲＩフラグメント（８，７ｋｂ）　、旧ｎｄＩ
［［消化により旧ｎｄＩ［ｒ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメ
ント（５，１ｋｂ）を調製した。

２．２ｋｂの旧ｎｄ　ｍ−ＥｃｏＲＩフラグメントは更
にＢａｎ１−Ｐｓｔ　Ｉ　、またはＢａｎ　ＩＩ−Ｐｓ
ｔｌで消化し、またＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメン
ト（８，７ｋｂ）は旧ｎｄｌｌ［で、ＨｉｎｄＩ［−Ｈ
３ｎｄｍフラグメント（５，１ｋｂ）はＰｓｔｌでそれ
ぞれ更に消化し、１．５％アガロースゲル電気泳動にか
けた。

泳動後のゲルはハイボンドＮフィルター（アマジャム社
製）にプロットし、ペクチン酸すアーゼＩ遺伝子のＮ末
端付近の配列０．４ｋｂをプローブにしてサザンブロッ
ティングを行いＸ線フィルムにより検出した。

ペクチン酸すアーゼＩ遺伝子とは異なるＰｓｔＩ−Ｅｃ
ｏＲＩフラグメント（０，３ｋｂ）および該フラグメン
ト（０，３ｋｂ＞を含むフラグメントがプローブと強く
ハイブリダイズした。

次にこのＰｓｔ　Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメント及びＰｓ
ｔＩ−旧ｎｄｌ［Ｉフラグメント（１，９ｋｂ）をプラ
スミドｐｕｃ１１９マルチクローニングサイトのＰｓｔ
　Ｉ　、　ＥｃｏＲＩサイト及びＰｓｔＩ、旧ｎｄＩ［
［サイトの間にそれぞれサブクローニングし、ジデオキ
シチェーンターミネーシッン法により塩基配列を決定し
た（第２図）。

ペクチン酸リアーゼ■の構造遺伝子はペクチン酸すアー
ゼＩ遺伝子との比較から１１６番目付近にある開始コド
ンのＡＴＧから始まると考えられ、二〇ＡＴＧから１７
９−１８１番目のＧＣＧまでの配列が分泌のためのシグ
ナル配列であると考えられる。またＲＮＡポリメラーゼ
が認識、結合する領域である３５領域、−ｔｏｉｕ域の
コンセンサス配列には３３番目から３８番目の配列ＴＴ
ＧＡＡＡおよび４９番目から５５番目の配列ＴＡＴＡＡ
Ａが、またリボゾームがｍＲＮＡに結合するサイトであ
るＳＤ配列には１０１番目から１０６番目の配列ＡＧＧ
ＡＧＡが、それぞれ該当するものと考えられる。

また次のアミノ酸配列が下流に続く構造遺伝子にコード
される蛋白質を菌体外へ分泌する指令となるシグナル配
列であると考えられる。

ＮＨ，−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−八ｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａ ペクチン酸リアーゼ■の構造遺伝子はＨｃｏＲＩサイト
を越えてさらに下流へ続いているので、以下に示すよう
にエルビニア・カロトボラＥｒの染色体ＤＮＡから残り
の構造遺伝子を再度クローニングした。

エルビニア・カロトボラＥｒの染色体ＤＮＡをＥｃｏＲ
ｌ、　ＰｓｔＩ＋旧ｎｄＩ［［、またＥｃｏＲＩ＋Ｈｉ
ｎｄｌＩ［で消化し、ペクチン酸リアーゼＩＩＩ遺伝子
を含むＰｓｔｌ−ＥｃｏＲＩフラグメント（０，３ｋｂ
）をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行
なうと、ペクチン酸すアーゼＩ遺伝子とは別に２．２ｋ
ｂのＰｓｔＩ−Ｐｓｔｌフラグメントにハイブリダイズ
することが明らかとなった。

そこで第３図に示した方針でクローニングを試みた。ｐ
ＮＮ　１の旧ｎｄＩ［［−Ｐｓｔｌフラグメント（１，
９ｋｂ）をｐＵｃ１１９のマルチクローニングサイトに
サブクローニングしてｐＮＮｌｌを構築した。またエル
ビニア・カロトボラＥｒの染色体ＤＮＡをＰｓｔｌで消
化し、０．８アガロースゲル電気泳動法約２．２ｋｂの
フラグメントをゲルから抽出調製し、ｐＮＮｌｌのＰｓ
ｔｌサイトに挿入し、大腸菌ＨＢＩＯＩに形質転換して
アンピシリン耐性を示し、ｐＮＮ　１のＰｓｔ　Ｉ　−
ＥｃｏＲＩフラグメント（０，３ｋｂ）をプローブとし
てコロニーハイブリダイゼーションで、さらにペクチン
酸リアーゼの活性を示すことを指標にして形質転換株を
選抜した。これらの株からプラスミドを抽出し、ペクチ
ン酸リアーゼＩと制限酵素地図の異なるプラスミドｐＮ
Ｎ　３を得た。この株は工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託した（微工研菌寄第１０４７９号）。

このプラスミドｐＮＮ　３の０．３ｋｂのＰｓｔ　Ｉ　
−ＥｃｏＲＩフラグメントの塩基配列はｐＮＮ　１のＰ
ｓローＥｃｏＲＩフラグメント（０，３ｋｂ）と完全に
一致しており、ｐＮＮ　３は当初目的としたペクチン酸
リアーゼＩＩＩ遺伝子であると考えられる。

２、　　　　によるペ　　ン　ｉアーゼの大腸菌）ＩＢ
ＩＯＩ／ｐＮＮ　３を５０μｇ／ｒｄのアンピシリンを
含むＬＢ培地で定常期まで培養し、遠心除菌後上清のペ
クチン酸リアーゼ活性を、Ｓｕｇｉｕｒａの方法（Ｊ、
Ｇｅｎ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、３０．１６
７（１９８４））により測定した。ペクチン酸リアーゼ
活性は１５０単位／−であった。

エルビニ　・カロ　ボーに　　ペ　チンプラスミドｐＮ
Ｎ　３をエルビニア・カロトボラＥｒ（東北大保存国株
、ＡＭＳ６０Ｂ２）にＴｔｏらの方法（Ａｇｒｊｃ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、皿、２９３（１９８Ｂ））でエ
レクトロポレーシヨンにより形質転換し、アンピシリン
に耐性を示す株を選抜した。なお、この株は微生物工業
技術研究所において受託されなかった。該形質転換株を
１００μｓ／ｄのアンピシリンを含むＬＢ培地で１夜３
０°Ｃで振盪培養した。遠心除菌後、培養上清を２０ｍ
Ｍりん酸カリウム緩衝液に対して透析し、該緩衝液で平
衡化したＣＭ−）ヨバール力ラムに直した。溶出は０〜
０．５　　ＮａＣ１で行ない、活性画分を集めて限外濾
過により濃縮し、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−７５カラム（
２，５φｘ９０ｃｍ）にかけた。活性画分を集め、ヒド
ロキシアパタイトカラムに通し、１０から２００ｍＭの
りん酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，８）で溶出し、各両分
のペクチン酸リアーゼ活性を測定した。結果は第４図に
示す通りであって、ペクチン酸リアーゼ■は従来より知
られているペクチン酸リアーゼ■。

■とは異なる位置に溶出され、従来知られていない両分
に強い活性を示した。生産されたペクチン酸リアーゼＩ
、　　Ｉｌ、　ＩＩＩの活性の総和は野生株のそれと比
較すると約５倍であった。

精製したペクチン酸リアーゼ■の至適ｐＨは１０．０　
（第５図）ｐＨ６〜１１の範囲で安定（第２表）、至適
温度は６０°Ｃ（第６図）４０°Ｃまでの熱に安定（第
７図）であった。また、カルシウムイオンにより活性化
され（第３表）、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡにより阻害された
。

Ｍ　ｅ　ｔ　ａ　１　　　　　　　　ａｃｔｉｖｉｔｙ
　　（ｕｎｉｔｓ／ｒｕｔ）Ｃａ　　　　　　　　　　
　　　　　　２８　、５Ｃｄ　　　　　　　　　　　　
　　　　　＜１Ｚｎ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　ＯＣｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
＜１Ｍｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＯＳｒ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＩＭｇ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　＜１Ｎｉ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　０６゜０ ７．０ Ｂ、０ ９．０ １０．０ に−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｋ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ Ｔｒｔｓ−）ＩＣＩ Ｃａｐｓ−ＮａＯＨ 〔比較例〕 エルビニア・カロトボラの野生株をＬＢ培地で１夜３０
°Ｃで振盪培養した。遠心除菌後、培養上清をヒドロキ
シアパタイトカラムに通し、１０から２０ｈＭのりん酸
カリウム緩衝液（ｐ　Ｈ６，８）で溶出し、各百分のペ
クチン酸リアーゼ活性を測定した。結果は第４図に示す
通りであって、ペクチン酸リアーゼ■の両分には殆ど活
性が見られない。

〔発明の効果〕

本発明により、ペクチン酸リアーゼの発現及び分泌に係
るＤＮＡ配列が提供され、このＤＮＡ配列を用いること
によって微生物によるペクチン酸リアーゼの産生収率が
高められた。

更に、新規酵素ペクチン酸リアーゼ■が提供された。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＮＮ　１の制限酵素地図であり、履］で示し
た領域が本発明のＤＮＡ分子を含む領域である。 第２図は本発明のＤＮＡ分子を含むペクチン酸リアーゼ
ＩＩＩ遺伝子の塩基配列及び該配列により決定したペク
チン酸リアーゼのアミノ酸配列、また比較のために特開
昭６３−６８０８７発明のペクチン酸すアーゼ■遺伝子
の塩基配列及びアミノ酸配列を示す。 この図におし゛て、＊印はペクチン酸すアーゼＩ遺伝子
と■遺伝子と一致する塩基部分を示し、枠で囲った部分
は両者のアミノ酸配列が一致する部分を示す。 第３図は本発明の遺伝子配列を含むペクチン酸リアーゼ
ＩＩＩ遺伝子を含むプラスミドの構築方法を示す。黒塗
りの太線で示した部分はＥ、ｃａｒｏｔｏｖｏｒａＥｒ
の染色体ＤＮＡに由来する領域を示す。 白抜きの太線は再度クローニングしたＥ、ｃａｒｏｔｏ
ｖｏｒａＥｒの染色体ＤＮＡに由来する領域を示す。 第４図はプラスミドｐＮＮ　３を含むＥ、ＣａｒＯｔＯ
ＶＯｒａＥｒの培養上清をヒドロキシアパタイトカラム
により精製したときの溶出曲線を示す。また比較例とし
て、プラスミドを含まないＩＥ、ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ
　Ｅｒの培養上清を同様に精製した際の結果を示す、■
。 ■、■はそれぞれペクチン酸リアーゼｒ、ｎ、ｍを示す
。Ｏ−Ｏは野生株、・−・はｐＮＮ　３を含むＥ、ｃａ
ｒｏｔｏｖｏｒａ　Ｅｒの結果を示す。ムームは溶出に
用いたりん酸カリウムの濃度を示す。 第５図はペクチン酸リアーゼ■の至適ｐＨを示す。ｐＨ
７，０，７，５は５０ｍＭりん酸カリウム（×）。 ｐＨ７，４〜ｐＨ９，０は５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（Δ）、　ｐＨ８，９〜ｐＨ１０，８は５０ｍＭ　Ｃａ
ｐｓ−ＮａＯ）Ｉ　（○）を用いて測定した。 第６図はペクチン酸リアーゼ■の至適反応温度、第７図
はペクチン酸リアーゼ■の温度安定性を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）下記のＤＮＡ配列を含んでなる蛋白質の発現及び分
   泌に係る領域をコードするＤＮＡ分子又はその誘導体 【遺伝子配列があります】 ２）下記のアミノ酸配列からなる蛋白質の分泌に係るペ
   プチドをコードするＤＮＡ分子又はその誘導体 ＮＨ＿２−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
   Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌ
   ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌ
   ｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａ ３）蛋白質がエルビニア属細菌のペクチン酸リアーゼI
   II遺伝子である請求項１又は２記載の蛋白質発現及び分
   泌に係る領域 ４）下記の性質を有するペクチン酸リアーゼIII（１）
   作用 ポリガラクツロニドに作用し、ガラクツロ ン酸のα−１，４結合を切断し、還元末端に二重結合を
   持つ不飽和ガラクツロニドを生成する。 （２）基質特異性 ペクチン、脱エステル化されたペクチン酸、α−１，４
   結合により結ばれたガラクツロン酸のオリゴマー、還元
   末端が不飽和ガラクツロニドであるオリゴガラクツロニ
   ドに作用する。 （３）至適ｐＨ ｐＨ１０．０で活性が最大となり、ｐＨ６〜１１の範囲
   で安定である。 （４）至適温度及び熱安定性 至適温度は６０℃であり、４０℃までの熱安定である。 （５）金属イオン、阻害剤の影響 Ｃａイオンにより活性化され、その至適Ｃａ濃度は０．
   ２ｍＭである、またＥＤＴＡ、ＥＧＴＡより阻害される
   。 （６）分子量 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に より分子量は約３６，０００である。 ５）ペクチン酸リアーゼIII遺伝子またはその誘導体を
   含んでなる組換えプラスミドで大腸菌もしくはエルビニ
   ア属に属する細菌を形質転換し、得られた形質転換株を
   培養し、その培養物よりペクチン酸リアーゼIIIを得る
   ことを特徴とするペクチン酸リアーゼIIIの製造方法。