JPH0220064B2 - - Google Patents

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JPH0220064B2
JPH0220064B2 JP57123731A JP12373182A JPH0220064B2 JP H0220064 B2 JPH0220064 B2 JP H0220064B2 JP 57123731 A JP57123731 A JP 57123731A JP 12373182 A JP12373182 A JP 12373182A JP H0220064 B2 JPH0220064 B2 JP H0220064B2
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acid addition
addition salt
reagent
fpa
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Deiru Mojaa Rarii
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Mallinckrodt Inc
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Publication date
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Publication of JPH0220064B2 publication Critical patent/JPH0220064B2/ja
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
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    • G—PHYSICS
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Description

【発明の詳现な説明】
本発明は、フむブリノペプチド以埌、時々
FPAず呌ぶの濃床を枬定するラゞオむムノア
ツセむRIA法、このような方法においお利甚する
抗凝固詊薬、およびこのような方法においお利甚
する詊薬を含有するパツケヌゞテストキツトに関
する。 珟圚、凝固系䞭の皮々の物質の分析法に぀いお
興味が増倧しおきた。これらの物質のうちの皮
すなわち、FPAは、超凝固胜力hypercoagua
bilityの指瀺を䞎えるであろう。凝固系におけ
る䞀系列の事象は、このプロセスにおける最初の
事象ずしおFPAを解攟させる。フむブリノゲン
ぞのトロンビンの䜜甚を生ずる。それ以䞊の䜜甚
はフむブリノペプチドを解攟させおフむブリノ
モノマヌを生成し、このモノマヌは他の酵玠の助
けをかりお重合しお䞍溶性のクロツトずなる。 FPAの定量に珟圚甚いられおいる実隓宀のテ
ストは、䞍適切である。H.L.Noselが開発した
぀のこのようなRIAテストは、Measurement of
FPA in Human Bloodヒトの血液䞭のFPAの
枬定、JJ.clin.Invest.5443−531974および
Potential Use of FPA Measurements in the
Diagnosis and Measurement of Thrombosis
血栓症の蚺断および枬定におけるFPA枬定の可
胜性を包蔵する䜿甚、ThrombosDiathes
haemorrh.Stuttg334261975䞭に蚘茉さ
れおおり、これらの䞡者の文献を匕甚よ぀おここ
に加える。このテストは、正垞の埪環するフむブ
リノゲンの玄200ng玄0.09の生䜓内転化に盞
圓する血挿のml圓り2ngのFPAより少量の怜出
をできる。しかしながら、詊料の収集および取り
扱いは非垞に重倧であり、そしおFPAレベルの
誀た぀た増加がしばしば芋られる。 本発明の目的は、絶えず䞀定した信頌性のある
結果を提䟛する。血挿䞭のFPAのRIA手順を提
䟛するこずである。 本発明によれば、たず血液の詊料を集めるこず
からなる、血挿䞭のFPAの生䜓倖濃床を枬定す
る競合RIA法の改良が提䟛される。次いで、前蚘
詊料䞭のトロンビンを抑制量のトロンビン抑制剀
で抑制し、そしお血挿を前蚘詊料から分離する。
次に、前蚘血挿の詊料を、ラゞオむムノアツセむ
競合結合条件䞋に、十分な量のFPAに察する抗
䜓および攟射掻性で氷識したFPAず接觊させ、
その埌血挿結合FPAを結合しないFPAから分離
し、そしお攟射掻性を枬定する。改良は、トロン
ビンを抑制するためにある皮の抑制剀を䜿甚する
こずを含む。 本発明の他の実斜態様は、抑制剀の皮、キレ
ヌト剀および抗タンパク分解剀を含有する、RIA
法においお䜿甚する抗凝固詊薬に関する。 本発明の他の面は、このようなRIA法においお
利甚する詊薬を含有するパツケヌゞテストキツト
に関する。 本発明においお䜿甚できるトロンビン抑制剀
は、䜜甚が速く、すなわち、トロンビンをほずん
ど瞬間的に、たずえば、10秒より短かい時間で抑
制し、血挿䞭で安定でり、すなわち、FPAをほ
ずんどたたはた぀たく圢成させず。長期間安定で
あり、すなわち、䜿甚前通垞の貯蔵寿呜を有し、
そしおトロンビンの本質的に䞍可逆的抑制剀であ
る。このような抑制剀の皮は、−プニルア
ラニル−−プロリル−−−〔−−クロ
ロ−−クアニドヘプタン−−オン〕以埌、
−Phe−Pro−ArgCh2Clず呌ぶおよびその適
圓な塩類、たずえば、トロンビンを抑制しか぀前
述の性質、すなわち、䜜甚が速く、血挿䞭で安定
であるなどの性質を有する塩類である。 適圓な塩類は、匷いたたは匱い無機たたは有機
の酞類から誘導された酞付加塩類を包含する。適
圓な無機酞の䟋は、ハロゲン含有酞、たずえば、
塩酞、フツ化氎玠酞たたは臭化氎玠酞リン含有
酞、たずえば、リン酞、亜リン酞、次亜リン酞
むオり含有酞、たずえば、硫酞、次亜硫酞たたは
チオ硫酞および他の酞、たずえば、硝酞たたは
マンガン酞である。適圓な有機酞の䟋は、ギ酞、
酢酞、クロロ酢酞、ク゚ン酞、乳酞。酒石酞など
である。 酞付加塩は、適圓な酞を含有する氎溶液䞭に遊
離塩基を溶かし、そしおこの溶液を蒞発するこず
により塩を単離するこずによ぀お、あるいは遊離
塩基ず遞択した酞ずを有機溶媒䞭で反応させるこ
ずによ぀お、補造し、埌者の堎合においお、塩は
盎接分離るかあるいはこの溶液の濃瞮により埗る
こずができる。圓量たたはそれ以䞊の酞を䜿甚
するずき、倚酞付加塩が埗られ、その堎合分子䞭
に個より倚い塩基性窒玠原子が存圚する。圓
量の酞を䜿甚するずき、䞀酞付加塩が埗られる。 −Phe−Pro−Arg−Ch2ClのHF酞付加塩お
よび遊離塩基は、最近の刊行物、Kether
Thrombosis Research 14969−9931979に
蚘茉されおいる手順に埓぀お補造できる。 述べたように、本発明の方法の第工皋は、血
液詊料を集め、前蚘詊料䞭のトロンビンを抑制し
そしお前蚘詊料から血挿を分離するこずからな
る。 血液詊料は、通垞の手段、たずえば、20ゲヌゞ
の針を甚いる静脈穿刺により集めるこずができ
る。䞀般に、〜10mlの血液を集める。 血液詊料はその埌瞬間的にたたは盎ちに抑制量
の前述の抑制剀の皮ず合わせお、前蚘詊料䞭の
トロンビンを抑制する。たずえば、抑制量は、党
血のml圓り、玄0.001mg〜1.0mg、奜たしくは玄
0.04〜玄0.6mgである。有利には、抑制剀ず䞀緒
に、キレヌト化量、たずえば、党血のml圓り玄
mg〜mg、奜たしくは玄3.5〜4.5mgのキレヌト
剀、たずえば、゚チレンゞアミン四酢酞EDTA
たたぱチレングリコヌルビス−アミノ゚チ
ル゚ヌテルN′N′−四酢酞EGTA
たたはそれらの塩を合わせるこずによ぀お、生䜓
倖のトロンビンの発生は実質的にたたは完党に抑
制される。通垞、FPAのタンパク分解を実質的
に枛少させるかあるいは防止するための抗タンパ
ク分解剀を抗タンパク分解量たずえば、党血の
ml圓り玄50〜300KIUカリクレむン抑制剀単䜍
奜たしくは玄90〜150KIUの量で加える。このよ
うな抗タンパク分解剀の䟋は、Trasylolア
プロチニンである。有利には、本発明のトロン
ビン抑制剀の皮ず䞀緒にキレヌト剀および抗タ
ンパク分解剀を䜿甚するこずによ぀お、収集の問
題は有意に軜枛し、そしお宀枩においお数時間、
たずえば、〜時間、℃においお数日間、た
ずえば、〜日間、そしお−20℃においお数カ
月間、たずえば〜カ月間、安定な血挿詊料が
埗られる。 すべおの皮類の物質は、有利には、氎溶液、
たずえば、塩化ナトリりムたたは緩衝剀の氎溶䞭
で、䟿利に結合しお抗凝固詊薬を圢成できる。抗
凝固詊薬は十分な量の抑制剀、キレヌト剀および
抗タンパク分解剀を含有し、これにより各々は、
抗凝固詊薬を血液に加えたずき、その意図する機
胜を発揮する。通垞、氎性抗凝固詊薬の各mläž­
に、玄0.1mg〜玄mg、奜たしくは玄0.4〜玄0.6mg
の抑制剀が存圚し、玄20mg〜玄60mg、奜たしくは
箄35mg箄45mgのキレヌト剀が存圚し、そしお玄
500〜玄3000KIUmg、奜たしくは玄900〜玄
1500KIUmlの抗タンパク質剀が存圚する。詊
薬は抗凝固量で䜿甚、たずえば氎性詊薬は、党血
ml圓り、玄0.05〜玄ml、奜たしくは玄0.1〜
箄0.2mlの量で䜿甚する。詊薬のPHは、䞀般に玄
〜である。 次に、血挿を垞枩においお遠心分離するこずに
より、たずえば、1000〜15000Xgにおいお、十分
時間、たずえば、20分間℃たたは宀枩においお
遠心分離するこずにする。奜たしくは、これは収
集埌できるだけ速やかに実斜する。分離した血挿
は適圓な枩床、たずえば、20℃以䞋で、本発明に
埓うRIAアツセむむにおいお䜿甚するたで、貯蔵
する。 RIA手順においお血挿を䜿甚する前に、通垞そ
れを前凊理しお橋かけ反応性のフむブリノゲンお
よびフむブリンフむブリノゲン断片を血挿か
ら陀去しなくおはならない。これは垞法におい
お、たずえば、血挿をアルコヌルで沈殿させそし
お液を透析するこずによ぀お、あるいはベント
ナむトたたは他の同様な䜜甚物質を血挿に十分な
量で添加しお劚害物質を血挿から陀去するこずに
よ぀お、実斜できる。通垞、ベントナむトのスラ
リヌを血挿混合物ぞ加える。次いで、血挿を混合
し、最小1200Xgにおいお十分な時間、たずえば、
20分間遠心分離する。䞊柄を取り出し、そしおア
ツセむ法に䜿甚する。 本発明の方法の第工皋は、RIAアツセむを
RIA競結合条件䞋で垞法においお、たずえば、前
述のNOSSEL刊行物に蚘茉されるようにしお、
実斜するこずからなる。基本的には、これは十分
な量のFPAに察する抗䜓および攟射掻性で暙識
したFPAを血挿詊料に加え、その埌抗䜓結合し
たFPAを結合しないFPAから分離し、そしお攟
射掻性を枬定するこずからなる。 FPA抗䜓ず反応する攟射掻性で暙識したFPA
を䜿甚できる。䟿利には、攟射掻性で暙識したデ
スアミノチロシルヌFPA錯䜓を䜿甚できる。そ
れは、たずえば、−125たたは他の攟射性同䜍
䜓でクロラミン法を甚いお暙識するこずができ
る。この錯䜓を補造する詳现な手順は、前述の
NOSSEL刊行物においお芋いだすこずができる。 䞀般に、FPAを−125たたは他の攟射性同䜍
䜓で玄800〜玄1600マむクロキナリヌマむクロ
グラムの比掻性に暙識する。この同䜍䜓暙識
FPAをこの分野で知られおいるように垌釈しお、
反応媒質䞭で抗䜓ず理想的な免疫枬定䌚合を行う
こずができる同䜍䜓暙識詊薬および最適なアツセ
む感床を埗るこずができる。この垌釈は、PH玄
〜10の適圓な氎性緩衝液を甚いお実斜できる。こ
の垌釈に甚いるこずができる適圓な緩衝液は、ト
リスTris、商業的に入手できる、トリスヒ
ドドロキシメチルルアミノメタンを含有する氎
溶液バルビタヌル、商業的に入手できる
−ゞ゚チルバルビツル酞の氎溶液および他のよく
知られた緩衝液である。垌釈床は、甚いる堎合、
初期の比掻性、および所望の最適な蚈数およびア
ツセむの感床を実珟するために芁する所望の厩
壊分DPMに䟝存しうる。 血挿の未知の詊料を攟射掻性で暙識したFPA
詊薬ず混合した埌、抗䜓、たずえば、FPAず免
疫反応しうる抗䜓ず攟射掻性FPAを含有する抗
䜓溶液を混合物ぞ加える。抗䜓はFPAおよび攟
射掻性FPAに察する特異性を有する。こうしお、
抗䜓の所定量によ぀お結合された攟射掻性FPA
の量は未知の血挿詊薬からの暙識しないFPAの
存圚で枛少し、そしおこの効果は暙識しない
FPAの濃床に盎接関係する。 この分野で既知の方法を、FPAおよび暙識
FPAず反応しうる抗䜓を埗るためにいるこずが
できる。たずえば、抗䜓は宿䞻動物、たずえば、
りサギを接皮するこずによ぀お補造するこずがで
きる。接皮埌、ある期間を経過させ、その間宿䞻
は抗䜓を生成し、次いで抗血枅をその動物から攟
出させお抗䜓を埗る。この抗䜓を、攟射掻性で暙
識したFPAの垌釈に䜿甚したものに類䌌する緩
衝物質䞭に、垌釈しおアツセむにおいお最高の性
胜を埗る濃床にしお第抗䜓詊薬を圢成する。た
ずえば、トレヌサヌ量の攟射掻性FPA0.01〜
0.09Ciの20〜80、奜たしくは30〜70を結合
する皋床に抗血枅を垌釈するこずが奜たしい。抗
䜓を血挿の混合物ぞい぀たん加えるず、埗られた
混合物を、抗䜓結合FPAおよび結合しないFPA
の実質的な平衡を生成する枩床においお十分な時
間培逊する。培逊期間䞭、垌釈された抗血枅䞭の
抗䜓は攟射掻性FPAおよびFPAず免疫錯䜓を圢
成する。本発明の実斜においお、培逊工皋は玄15
〜37℃、奜たしくは20〜30℃の枩床でほが40〜
120分間、奜たしくは40分間実斜するこずが奜た
しく、その埌抗䜓によるFPAの結合は実質的平
衡に到達するこずがわか぀た。 培逊工皋が完結したずき、結合しないFPAを
抗䜓結合FPAから分離する。 分離は、朚炭、あるいはむオン亀換暹脂から本
質的に成る膜の薄いストリツプを包含する垞法に
より䟿利に実斜される。他の分離技術は第抗䜓
を䜿甚する技術であり、この第抗䜓はFPAに
察しお特異的ではないが、FPAず反応する抗䜓
第抗䜓に察しお特異的である。第抗䜓は、
第抗䜓を埗た動物ず異なる動物を、抗䜓を埗た
が枬定すべき抗原に察しお特異的でない型の正垞
動物のガンマグロブリンで、接皮するこずによ぀
お補造できる。第抗䜓は、同䜍䜓暙識抗原およ
び第抗䜓の詊薬の垌釈に䜿甚したものに類䌌す
る緩衝物質䞭に、垌釈しお、アツツセむにおいお
最高の性胜を埗る濃床にするこずもできる。 分離を促進するために、ポリ゚チレングリコヌ
ルたたは他の適圓なポリマヌを反応媒質䞭に、第
抗䜓溶液の添加の埌に、あるいはその前におい
おさえ、別の詊薬ずしお加えるこずにより、䟛絊
するこずができる。このポリマヌのすべおたたは
䞻芁郚分を、第抗䜓詊薬ぞ前も぀お混入するこ
ずにより、反応媒質䞭に䟛絊するこずが奜たし
い。こうしお、兞型的には玄〜15重量、奜た
しくは玄〜12重量、たずえば玄〜重量
のポリマヌを第抗䜓詊薬䞭に含めお、反応媒質
䞭のポリマヌの濃床を十分にしお、同䜍䜓暙識抗
原たたは暙識しない抗原を有する第氎溶液抗䜓
の間の免疫沈殿反応を加速するこずができる。 RIAテストのプロトコヌルは、因子の数に䟝存
しお倉化しうる。しかしながら、䞀般に、テスト
詊薬はすべお宀枩に平衡化し、次いで前も぀お決
定した濃床のFPAを含有する暙準の適圓量を系
列の管に加えるこずができ、そしお血挿の詊料を
他の系列の管に加えるこずができ、次いで暙識
FPA詊薬およびFPA抗䜓詊薬を順番に管のすべ
おに加えるこずができ、次いでこれらの管を枊発
生成させ、ふたをし、そしお培逊する。第抗䜓
を分離に䜿甚するずき、それを次に管ぞ加えるこ
ずができる。兞型的には、本発明によれば、管の
培逊は第抗䜓の添加埌䞍必芁であるが、管は必
芁に応じお培逊するこずができる。次いで、管を
枊発生させ、遠心分離する。管をデカントし、䞊
柄を廃棄できる。次いで管を蚈数し、そしお暙準
から埗られた倀を甚いお暙準曲線を構成できる。
暙準曲線䞊に埗られた倀をプロツトするこずによ
り、未知の詊料に぀いお平均倀を決定するこずが
できる。未知のFPAを定量するために実斜する
蚈算は、普通の方法に埓う。れロのFPAを含有
する管における蚈数を、100に蚭定する〔零
以䞋の終止closing〕。暙準䞭のFPAが増加す
るに぀れお、蚈数終止ずしお定矩は枛少す
る。なぜならこれらの蚈数はれロ管における蚈数
で割぀お零以䞋の倀を埗るからである。こ
の零以䞋倀を、半察数グラフ甚玙䞊FPA
の濃床に察しおプロツトできる。零のロゞ
ツツトlogit倉換およびFPA濃床を甚いお、
曲線に盎線に倉換できる。 ある堎合においお、特異抗䜓を含有しない非特
異性結合察照緩衝液を圢成するこずが望たしいで
あろう。この察照緩衝液を䜿甚しお、反応媒質か
ら特別に分離されない同䜍䜓暙識FPAを確認で
きる。これらの堎合、真の合トレヌサヌは、非特
異蚈数をすべおの詊料から枛ずるこずによ぀お定
量できる。 本発明のRIA法の実斜においお䜿甚するため、
必芁な詊薬および物質を含有するパケヌゞテスト
トキツトを準備する。パツケヌゞは皮類以䞋の
別々の成分を有するこずができ、ここで同䜍䜓暙
識FPA詊薬、前蚘FPAに察しお特異的である抗
䜓詊薬、および抗凝固詊薬を準備する。これらの
詊薬の各々をパツケヌゞにおいお別々の成分ずし
お準備しお成分のパツケヌゞを圢成するか、あ
るいはこれらの詊薬の皮たたはそれ以䞊を組み
合わせお、皮類より少ない別々の成分を有する
パツケヌゞを圢成できる。たた、ストパツケヌゞ
は、皮類たたはそれより少ない成分に加えお、
远加の成分、たずえば、暙準詊料および察照詊料
を調補するためのFPA詊薬、FPAに察しお特異
的でないがFPA抗䜓に察しお特異的である第
抗䜓詊薬、血挿の前凊理詊薬、ならびにテストを
実斜する装眮、たずえば詊薬を貯蔵するびん、テ
ストを実斜しか぀ある堎合においお詊薬、たずえ
ば、察照詊料および暙準詊料を貯蔵する小びん、
を含むこずもできる。このパツケヌゞ党䜓を呚囲
枩床で貯蔵しか぀運搬し、そしお䜿甚者はそれを
受け取぀た時、冷蔵庫の枩床、たずえば、℃〜
℃においお、䜿甚するたで、貯蔵するこずがで
きる。 以䞋の実斜䟋により本発明をさらに説明する
が、本発明はこれらの実斜䟋に限定されれない。 実斜䟋 フむブリノペプチドのラゞオむムノアツセむ
においお䜿甚する詊薬を、次のようにしお調補す
る  0.1の゚チレンゞアミン四酢酞ニナトリり
ム、0.2のりマアルブミン、0.04のシクロ
ヘキシむミド、0.005のクロルアンプニコ
ヌル、0.584の塩化ナトリりム、および0.005
のFDむ゚ロヌを含有する0.05モルの
トリス緩衝液䞭に、ほがナノグラムの−チ
ロシルFPA −125を含有する、フむブリノ
ペプチドFPA−125を調補する。この
溶液のPHは、8.40±0.05である。この溶液は10
マむクロCiより少ない−125を含有する。  0.05モルのトリス緩衝液0.133Wの
゚チレンゞアミン四酢酞ニナトリりム、
0.30Wのりマアルブミン、0.04のシク
ロヘキシむミド、0.005Wのクロルアン
プニコヌル、0.584Wの塩化ナトリり
ムおよび33KIUのアプロチニンを含有す
る䞭で玔粋なフむブリノペプチド抗原の適
圓な垌釈を行うこずに぀お、フむブリノペプチ
ド暙準を調補する。これらの暙準は0.1、
1.0、2.0、5.0、10.0、20.0および40.0ナノグラ
ムmlに等しい。  玔粋なフむブリノペプチド抗原をトリス緩
衝タンパク溶液暙準ず同䞀に1.3および8.0
ナノグラムmlの抂算濃床で加えるこずによ぀
お、フむブリノペプチド品質察照物質を調補
する。  接合したフむブリノペプチド−りシ血枅ア
ルブン免疫原を前も぀お接皮したりサギから攟
出させた抗血枅から、フむブリノペプチド第
抗䜓詊薬を調補した。この抗血枅を0.05モル
のトリス緩衝液0.10Wのりマアルブミ
ン、0.04Wのシクロヘキシむミド、
0.005Wのクロルアンプニコヌル、
0.0035WのFDブルヌダむ、
0.584Wの塩化ナトリりムおよび
10USPK単䜍mlのヘパリンを含有するで
100より倧きい比率で垌釈する。  防腐剀を含有する0.1モルのリン酞ナトリり
ム緩衝液䞭に6.5Wの分子量6000〜7000
のポリ゚チレングコヌルを含有する、ポリ゚チ
レングリコヌル第抗䜓詊薬を調補する。  0.20Wのりマアルブミン、0.04のシ
クロヘキシむミド、0.005のクロルアンプ
ニコヌルおよび0.584の塩化ナトリりムを含
有する0.05モルのトス緩衝液に、75mgmlのベ
ントナむトを加えるこずによ぀お、ベントナむ
トスラリヌを調補する。  非特異結合緩衝液は、これが抗フむブリノペ
プチド抗血枅を含有しない以倖、第抗䜓詊
薬ず同䞀である。  4.0Wの゚チレンゞアミン四酢酞、
1000KIUmlのアプロチニンTrasylol、
0.3〜0.6mgmlの−Phe−Pro−ArgCh2clお
よび0.9Wの塩化ナトリりムを含有する
抗凝固剀溶液を調補する。この溶液のPHは4.5
である。 抗凝固詊料管の調補 mlの排気した血液収集管䞭に0.5mlの抗凝固
剀を、気密泚射噚により泚入する。これらの管は
䜿甚するたで℃で貯蔵すべきである。 血液詊料の収集および調補 20ゲヌゞの䞀本の詊料針を甚いお、完党静脈穿
刺により血液を収集する。針を静脈にそう入した
埌、止血垯を陀く。適圓な抗凝固剀を含有する排
気した管䞭に、mlの血液を集める。おだやかに
倒立させるこずにより、血液ず抗凝固剀を完党に
混合する。 詊料は、収集埌できるだけすみやかに、1000〜
1500Xgで℃たたは宀枩においお20分間遠心分
離すべきである。血挿を现胞から分離し、アツセ
むを行うたで、−20℃以䞋の枩床においお貯蔵す
る。 血挿詊料の凊眮 12×75のガラス、ポリヌチレンたたはポリ゚チ
レンの管䞭に0.5ml500Όの血挿を分配する。
枊を発生させか぀最䜎1200Xgで10分間遠心分離
する。泚意しお䞊柄を吞い出し、枅浄な管ぞ移
し、そのずきベントナむト粒子を移したりあるい
は吞い出さないように甚心する。 アツセむ手順  芁求するテスト成分を遠心分離噚から取り出
し、そしお宀枩20〜26℃に平衡にさせる。  0.00、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00および
40.00ngmlの暙準の各々の200マむクロリツト
ルを、䞀系列の管に加える。200Όの患者の
凊理した詊料を、他の系列の管ぞ加える。察応
する反埩する組の非特異結合NSB管を、
200Όの0.00ngmlの暙準の添加により調補す
る。  100Όのフむブリノペプチド −125反
応溶液をすべおの管䞭に分配する。  各管を数秒間おだやかに枊発生させお、完党
な混合を確保する。  100ΌのNSB緩衡液を加えたNSB管を陀倖
しお、100Όのフむブリノペプチド抗䜓溶
液をすべおの管䞭に分配する。  各管を数秒間おだやかに枊発生しお、完党混
合を確保する。  管をおおい、そしお宀枩20〜26℃で40〜
120分間培逊する。  工皋における抗䜓溶液の分散に甚いたのず
同じ添加の順序および順次の時限を甚いお、
PEG−第抗䜓溶液をよく混合し、そしお1.0
mlをすべおの管ぞ分配する。数秒間激しく枊発
生する。  すべおの管を1200Xg以䞊においお宀枩で20
分間遠心分離する。 10 管の内容物をデカントし、そしお液䜓を廃棄
する。すべおの管を吞取玙䞊に少くずも分間
排液する。管のリツプを玙タオル䞊に軜くずん
ずんず打ち぀けお、残りの液䜓を吞収させる。 次いで、各管を最小10000の蚈数を环積するた
めに十分な期間攟射掻性に぀いお蚈数し、そしお
各濃床の暙準および患者の詊料の正味の蚈数分
cpmを枬定し、そしお蚘録する。各暙準、患
者たたは察照の血枅の管の正味のcpmをれロ
ngmlの暙準管の平均の正味cpmで割り、そし
お100を掛ける。商は、FPAの䞍存圚䞋の結合量
に比べたFPAの存圚䞋の抗䜓ぞ結合したFPA 
−125の比率B0パヌセントを衚わす。 半察数グラフ甚玙の䞀次の軞䞊に各暙準の二重
反埩テスト倀の平均のB0パヌセントを、暙
準の濃床ナノグラムミリリツトルの関数ず
しお、プロツトするこずにより、暙準曲線を構成
する。各患者の血枅および察照血枅の二重反埩テ
スト倀の平均のB0パヌセントを決定し、そ
しおこの暙準曲線からの患者たたは察照の血枅の
B0パヌセント倀に぀いおのFPAの濃床をも
決定する。FPAの正味のcpm倀およびB0パ
ヌセント倀を䞋衚に蚘茉する。
【衚】
【衚】 実斜䟋 幎什25〜60才の35人の正垞な被隓者に぀いおの
予備デヌタは、血挿のml圓り0.3〜1.7ナノグラ
ムの倀を䞎えた。 倚数のアツセむに぀いお実隓内および実隓間に
おいお、倉動率は10より小であるこずが瀺され
た。0.1ナノグラムミリリツトル皋床に䜎い倀
を、0.0ナノグラムミリリツトルの暙準ず区別
できる。 皮々の量の玔粋なフむブリノペプチドを加え
た皮類の別々の詊料に぀いお、粟床の研究を実
斜した。これらの詊料をフむブリノペプチドに
぀いお枬定し、そしお回埩した倀を期埅倀ず比范
した。平均の回埩倀recovery volueは100.8
であ぀た。 フむブリノペプチドが増倧した血挿の詊料
ほが30ナノグラムミリリツトルを段階垌釈
し、そしおフむブリノペプチドに぀いお枬定し
た。垌釈した詊料は、暙準曲線党䜓を通じお盎線
的に回埩した。 䞊のデヌタが瀺すように、この方法は0.3〜
40.0ナノグラムミリリツトルのフむブリノペプ
チドのレベルにおいお、非垞に粟床が高く、感
床が高く、そしお再珟性がある。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  第に、血液の詊料を集め、前蚘詊料䞭のト
    ロンビンを抑制量のトロンビン抑制剀で抑制し、
    そしお血挿を前蚘詊料から分離し、第に、前蚘
    血挿の詊料を、ラゞオむムノアツセむ競合結合条
    件䞋に、十分な量のフむブリノペプチドに察す
    る抗䜓および攟射掻性で暙識したフむブリノペプ
    チドず接觊させ、その埌、抗䜓結合フむブリノ
    ペプチドを結合しないフむブリノペプチドか
    ら分離し、そしお攟射掻性を枬定するこずからな
    る、血挿䞭のフむブリノペプチドの濃床を枬定
    する競合ラゞオむムノアツセむ法においお、トロ
    ンビンの抑制剀ずしお、−Phe−Pro−
    ArgCh2Cl、その塩酞付加塩、そのフツ化氎玠酞
    付加塩、その酢酞付加塩およびそのク゚ン酞付加
    塩から成る矀より遞ばれた抑制剀を䜿甚するこず
    を特城ずする方法。  血挿をベントナむトで前凊理する特蚱請求の
    範囲第項蚘茉の方法。  キレヌト化量のキレヌト剀および抗タンパク
    分解量の抗タンパク分解剀が、抑制剀によるトロ
    ンビンの抑制の間に、存圚する特蚱請求の範囲第
    項蚘茉の方法。  (1)−Phe−Pro−ArgCh2Cl、その塩酞付加
    塩、そのフツ化氎玠酞付加塩、その酢酞付加塩お
    よびそのク゚ン酞付加塩から成る矀より遞ばれた
    トロンビンの抑制剀、(2)キレヌト剀および(3)抗タ
    ンパク分解剀の氎溶液からなり、前蚘の抑制剀、
    キレヌト剀および抗タンパク剀の各々は、血液ぞ
    添加したずき、その意図する機胜を発揮するため
    に十分な量で存圚する、こずを特城ずするフむブ
    リノペプチドの生䜓倖定量に関連しお䜿甚する
    トロンビン抑制甚抗凝固詊薬。  キレヌト剀はEDTA、EGTAおよびそれら
    のナトリりム塩から成る矀より遞ばれる特蚱請求
    の範囲第項蚘茉の詊薬。  抗タンパク分解剀はアプロチニンである特蚱
    請求の範囲第項蚘茉の詊薬。  キレヌト剀はEDTA、EGTAおよびそれら
    のナトリりム塩から成る矀より遞ばれる特蚱請求
    の範囲第項蚘茉の詊薬。  攟射性暙識フむブリノペプチド詊薬、フむ
    ブリノペプチド抗䜓詊薬およびフむブリノペプ
    チドの生䜓倖定量に関連しお䜿甚するトロンビ
    ン抑制甚抗凝固詊薬からなり、前蚘抗凝固詊薬
    は、(1)−Phe−Pro−ArgCh2Cl、その塩酞付加
    塩、そのフツ化氎玠酞付加塩、その酢酞付加塩お
    よびそのク゚ン酞付加塩から成る矀より遞ばれた
    トロンビンの抑制剀、(2)キレヌト剀、および(3)抗
    タンパク分解剀の氎溶液からなり、前蚘の抑制
    剀、キレヌト剀および抗タンパク分解剀の各々
    は、血液ぞ添加したずき、意図する機胜を発揮す
    るのに十分な量で存圚するこずを特城ずする、血
    挿䞭のフむブリノペプチドの濃床のラゞオむム
    ノアツセむ甚パツケヌゞテストキツト。  フむブリノペプチドに察しお特異的でない
    が、フむブリノペプチドの抗䜓に察しお特異的
    である第抗䜓がさらに存圚する特蚱請求の範囲
    第項蚘茉のパツケヌゞテストキツト。  玔粋なフむブリノペプチド詊薬の暙準ず
    察照詊料をも含む特蚱請求の範囲第項蚘茉のパ
    ツケヌゞテストキツト。  前蚘詊薬はPH玄〜玄10の氎溶液で提䟛さ
    れる特蚱請求の範囲第項蚘茉のパツケヌゞテス
    トキツト。
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