JPS5824862A - フイブリノペプチドａのラジオイムノアツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、フィブリノペプチドＡ（以後、時々（３） ＦＰＡと呼ぶ）の濃度を測定するラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）法、このような方法において利用する抗凝固
試薬、およびこのような方法において利用する試薬を含
有するパッケージテストキットに関する。

現在、凝固系中の種々の物質の分析法について興味が増
大してきた。これらの物質のうちの１種すなわち、ＦＰ
Ａは、超凝固能力（ｈｙｐｅｒｃｏａｇｕａｂｉｌｉｔ
ｙ）の指示を与えるであろう。凝固系における一系列の
事象は、このプロセスにおける最初の事象としてＦＰＡ
を解放させる、フイプリノゲンへのトロンビンの作用を
生ずる。それ以上の作用はフィブリノペプチドＢを解放
させてフィブリンモノマーを生成し、このモノマーは他
の酵素の助けをかりて重合して不溶性のクロットとなる
。

ＦＰＡの定量に現在用いられている実験室のテストは、
不適切である。Ｈ，Ｌ、　Ｎｏ５ｅｌが開発した１つの
このようなＲＩＡテストは、Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏ
ｆ　ＦＰＡ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｂｌｏｏｄ　（ヒトの
血液中のＦＰＡの測定）、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅ
ｓｔ、　５４：４３−５３（１９（４） ７４）およびｐｏｔｅｎｔｉａｌ　Ｕｓｅ　ｏｆ　ＦＰ
Ａ　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｉｎ　　ｔｈｅ　Ｄｉａ
ｇｎｏｓｉｓ　　ａｎｄ　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　　
ｏｆ　Ｔｈｒｏｍｂ。

ｓｉｓ　（血栓症の診断および測定におけろＦ’ＰＡ測
定の可能性を包蔵する使用）、’ｐｈｒｏｍｂｏｓ　、
１）ｉａｔｈｅｓ。

ｈａｅｍｏｒｒｈ、　（Ｓｔｕｔｔｇ）　３３：４２６
（１９７５）中に記載されており、これらの両者の文献
を引用によってここに加える。このテストは、正常の循
環するフイプリノゲンの約２００ｎｙ−（約０．０９　
％）の生体内転化に相当する血漿の１ｍｌ当り２１ｇ−
のＦＰＡより少量を検出できる。しかしながら、試料の
収集および取り扱いは非常に１大であり、そしてＦＰＡ
レベルの誤まった増加がしばしば見られる。

本発明の目的は、絶えず一定した信頼性のある結果を提
供する。血漿中のＦＰＡのＲＩＡ手順を提供することで
ある。

本発明によれば、まず血液の試料を集めることからなる
、血漿中のＦＰＡの生体外濃度を測定する競合ＲＩＡ法
の改良が提供される。次いで、前記試料中のトロンビン
を抑制量のトロンビン抑制剤で抑制し、そして血漿を前
記試料から分離する。

次に、前記血漿の試料を、ラジオイムノアッセイ競合結
合条件下Ｋ、十分な量のＦＰＡに対する抗体および放射
活性で標識したＦＰＡと接触させ、その後抗体結合ＦＰ
Ａを結合しないＦＰＡから分離し、そして放射活性を測
定する。改良は、トロンビンな抑制するためにある種の
抑制剤を使用することを含む。

本発明の他の実施態様は、抑制剤の１種、キレート剤お
よび抗タンパク分解剤を含有する、ＲＩＡ法において使
用する抗凝固試薬に関する。

本発明の他の面は、このようなＲＩＡ法において利用す
る試薬を含有するパッケージテストキットに関する。

本発明において使用できるトロンビン抑制剤は、作用が
速く、すなわち、トロンビンをほとんど瞬間的に、たと
えば、１０秒より短かい時間で抑制し、血漿中で安定で
あり、すなわち、ＦＰＡをほとんどまたはまったく形成
させず、長期間安定であり、すなわち、使用前通常の貯
蔵寿命を有し、そしてトロンビンの本質的に不可逆的抑
制剤である。このような抑制剤の１種は、Ｄ−フェニル
アラニル−し−プロリル−Ｌ−Ｎ−（２−（１−クロロ
−７−クアニドへブタン−２−オン）　）　（以後、Ｄ
−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＡｒｇＣｂ２Ｃ１と呼））　オヨヒ
ソ（７）適当な塩類、たとえば、トロンビンを抑制しか
つ前述の性質、すなわち、作用が速く、血漿中で安定で
あるなどの性質を有する塩類である。

適白な塩類は、強いまたは弱い無機または有機の酸類か
ら誘導された酸付加塩類を包含する。適当な無機酸の例
は、ハロゲン含有酸、Ｔ：とえば、塩酸、フッ化水素酸
または臭化水素酸；リン含有酸、たとえば、リン酸、亜
すン酸１次亜リン酸；イオウ含有酸、ｆ二とえば、硫酸
、次亜硫酸またはチオ硫酸；および他の酸、たとえば、
硝酸またはマンガン酸である。適当な有機酸の例は、ギ
酸、酢酸、クロロ酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などで
ある。

酸付加塩は、適当な酸を含有する水溶液中に遊離塩基を
溶かし、そしてこの溶液を蒸発することにより塩を単離
することによって、あるいは遊離（７） 塩基と選択した酸とを有機溶媒中で反応させることＫよ
って、製造し、後者の場合において、塩は直接分離する
かあるいはこの溶液の濃縮により得ることができる。２
当量またはそれ以上の酸を使用するとき、多酸付加塩が
得られ、その場合分子中に１個より多い塩基性窒素原子
が存在する。１当量の酸を使用するとき、−酸付加塩が
得られる。

Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｈ２Ｃ１のＨＦ酸付加
塩および遊離塩基は、最近の刊行物、Ｋｅｔｈｅｒ、Ｔ
ｈｒｏｍｂｏｓｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ　１４：９６９−
９９３（１９７９）Ｋ記載されている手順に従って製造
できる。

述べたように、本発明の方法の第１工程は、血液試料を
集め、前記試料中のトロンビンを抑制し、そして前記試
料から血漿を分離することからなる。

血液試料は、通常の手段、たとえば、２０ゲージの針な
用いる静脈穿刺により集めることができる。一般に、５
〜１０　ｍ’ｌの血液を集める。。

血液試料はその後瞬間的にまたは直ちに抑制量の前述の
抑制剤の１種と合わせて、前記試料中のトロンビンを抑
制する。たとえば、抑制量は、全（８） 血の１　ｍｅ当り、約０．０１ｍｇ−１，０ｍ灰好まし
くは約０．０４〜約Ｑ、６ｎｔ９−である。有利には、
抑制剤と一緒に、キレート化量、たとえば、全血の１　
ｍ、８当り約２１ｎ１〜６ｍ？、好ましくは約３．５〜
４　、５　ｍｆのキレート剤、たとえば、エチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはエチレングリコールビス
（Ｂ−アミノエチルエーテル）Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ−四節酸
（ＥＧＴＡ）またはそれらの塩を合わせることによって
、生体外のトロンビンの発生は実質的にまたは完全に抑
制される。通常、ＦＰＡのタンパク分解を実質的に減少
させるかあるいは防止するための抗タンパク分解剤をも
抗タンパク分解量たとえば、全血の１　ｍ１３当り約５
０〜３００ＫＩＵ（カリクレイン抑制剤単位）好ましく
は約９０〜１５０　ＫＩＵの量で加える。このような抗
タンパク分解剤の例は、Ｔｒａｓｙｌｏｌ■（アプロチ
ニン）である。有利には、本発明のトロンビン抑制剤の
１種と一緒忙キレート剤およｄ抗タンパク分解剤を使用
することによって、収集の問題は有意に軽減し、そして
室温において数時間％たとえば、２〜４時間、４℃にお
いて数日間、たとえば％　１〜３日間、そして−２０℃
において数カ月間、たとえば２〜４力月間、安定な血漿
試料が得られる。

すべての３種類の物質は、有利には、水溶液、たとえば
、塩化す）　ＩＪウムまたは緩衝剤の水溶中で、便利に
結合して抗凝固試薬を形成できる。抗凝固試薬は十分な
量の抑制剤、キレート剤および抗タンパク分解剤を含有
し、これにより各々は、抗凝固試薬を血液に加えたとき
、その意図する機能を発揮する。通常、水性抗凝固試薬
の各１　ｍ、ｅ中に、約０．１ｍｆＦ〜約１ｍ？、好ま
しくは約０．４〜約０．６　ｍｆの抑制剤が存在し、約
２０ｍ１〜約６０ｔｎｙ−、好ましくは約２０ｍ１〜約
４５ｍ９−のキレート剤が存在し、そして約５００〜約
３０００ＫＩＵ７叶、好ましくは約９００〜約１５００
に１０癲の抗タンパク質剤が存在する。試薬は抗凝固量
で使用、たとえば水性試薬は、全血の１１１１１３当り
、約０．０５〜約１ｍ！、好ましくは約０．１〜約０．
２ｍｐの量で使用する。試薬のＩ）Ｈは、一般に約４〜
７である。

次に、血漿を常温において遠心分離することにより、た
とえば、１０００〜１５００　Ｘ！？において、十分な
時間、たとえば、２０分間４℃または室温において遠心
分離することにする。好ましくは、これは収集後できる
だけ速やかに実施する。

分離した血漿は適当な温度、たとえは、２０℃以下で、
本発明に従うＲＩＡアッセイにおいて使用するまで、貯
蔵する。

ＲＩＡ手順において血漿を使用する前に、通常それを前
処理［、て橋かけ反応性のフイプリノゲンおよびフィブ
リン（フイブリノゲン〕断片を血漿から除去しなくては
ならない。これは常法において、たとえば、血漿をアル
コールで沈殿させそしてｆ液を透析することによって、
あるいはベントナイトまたは他の同様な作用物質を血漿
に十分な量で添加して妨害物質を血漿から除去すること
によ、つて、実施できる。通常、ベントナイトのスラリ
ーを血漿混合物へ加える。次いで、血漿を混合し、最小
１２００　ＸＦ／において十分な時間、たとえば、２０
分間遠心分離する。上澄を取り出し。

（１１〕 そしてアッセイ法に使用する。

本発明の方法の第２工程は、ＲＩＡアッセイをＲＩＡ競
合結合条件下で常法において、たとえば、前述のＮ０８
ＳＥＬ刊行物に記載されるようにして、実施することか
らなる。基本的には、これは十分な量のＦＰＡに対する
抗体および放射活性で標識したＦＰＡを血漿試料に加え
、その後抗体結合したＦＰＡを結合しないＦＰＡから分
離し、そして放射活性を測定することからなる。

ＦＰＡ抗体と反応する放射活性で標識したＦＰＡを使用
できる。便利には、放射活性で標識したデスアミノチロ
シル−ＦＰＡ錯体な使用できろ。それは、たとえば、ｌ
−１２５または他の放射性同位体でクロラミンＴ法を用
いて標識することができる。この錯体な製造する詳細な
手順は、前述のＮ０８ＳＥＬ刊行物において見いだすこ
とができる。

一般に、ＦＰＡをｌ−１２５または他の放射性同位体で
約８００〜約１６００マイクロキユリー／マイクログラ
ムの比活性に標識する。この同位体標識ＦＰＡをこの分
野で知られているように希（１２） 釈して、反応媒質中で抗体と理想的な免疫測定会合を行
うことができる同位体標識試薬および最適なアッセイ感
度を得ることができる。この希釈は、ｐＨ約４〜１０の
適当な水性緩衝液を用いて実施できる。この希釈に用い
ることができる適当な緩衝液は、トリス（’ｌｌ’ｒｉ
ｓ）、商業的に入手できる、トリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタンを含有する水溶液；バルビタール、商業
的に入手できる５、５−ジエチルバルビッル酸の水溶液
および他のよく知られた緩衝液である。希釈度は、用い
る場合、初期の比活性、および所望の最適な計数および
アッセイの感度を実現するために要する所望の崩壊７分
（ＤＰＭ　）に依存しうる。

血漿の未知の試料を放射活性で標識したＦＰＡ試薬と混
合した後、抗体、たとえば、ＦＰＡと免疫反応しうる抗
体と放射活性ＦＰＡとを含有する抗体溶液を混合物へ加
える。抗体はＦＰＡおよび放射活性ＦＰＡＫ対する特異
性を有する。こうして、抗体の所定量によって結合され
た放射活性ＦＰＡの量は未知の血漿試料からの標識しな
いＦＰＡの存在で減少し、そしてこの効果は標識しない
ＦＰＡの濃度に直接関係する。

この分野で既知の方法を、ＦＰＡおよび標識ＦＰＡと反
応しうる抗体を得るために用いることができる。たとえ
ば、抗体は宿主動物、たとえば、ウサギを接種すること
によって製造することができる。接種後、ある期間を経
過させ、その間宿主は抗体を生成し、次いで抗血清をそ
の動物から放出させて抗体を得る。この抗体を、放射活
性で標識したＦＰＡの希釈に使用したものに類似する緩
衝物質中に、希釈してアッセイにおいて最高の性能を得
る濃度にして第１抗体試薬を形成する。たとえば、トレ
ーサー量の放射活性Ｆ　Ｐ　Ａ　（０，０１〜０．０９
Ｃｉ　）　（Ｄ２０〜８０　％、好ましくは３０〜７０
％を結合する程度に抗血清を希釈することが好ましい。

抗体を血漿の混合物へいったん加えると、得られた混合
物を、抗体結合ＦＰＡおよび結合しないＦＰＡの突質的
な平衡を生成する温度において十分な時間培養する。培
養期間中、希釈された抗血清中の抗体は放射活性ＦＰＡ
およびＦＰＡと免疫錯体を形成する。本発明の実施にお
いて、培養工程は約１５〜３７℃、好ましくは２０〜３
０℃の温度でほぼ４０〜１２０分間、好ましくは４０分
間実施することが好ましく、その後抗体によるＦＰＡの
結合は実質的平衡に到達することがわかった。

培養工程が完結したとき、結合しないＦＰＡを抗体結合
ＦＰＡから分離する。

分離は、木炭、あるいはイオン交換樹脂から本質的に成
る膜の薄いストリップを包含する常法により便利に実施
される。他の分離技術は第２抗体を使用する技術であり
、この第２抗体はＦＰＡＫ対して特異的ではないが、Ｆ
ＰＡと反応する抗体（第１抗体〕Ｋ対して特異的である
。第２抗体は、第１抗体を得た動物と異なる動物を、抗
体を得たが測定すべき抗原に対して特異的でない型の正
常動物のガンマグロブリンで、接種することによって製
造できる。第２抗体は、同位体標識抗原および第１抗体
の試薬の希釈に使用したものに類似する緩衝物質中に、
希釈して、アッセイにおいて最（１５） 高の性能を得る濃度にすることもできる。

分離を促進するために、ポリエチレｙ　ｆ　ＩＪ　：＝
ｙ　−ルまたは他の適当なポリマーを反応媒質中に、第
２抗体溶液の添加の後に、あるいはその前においてさえ
、別の試薬として加えることにより、供給することがで
きる。このポリマーのすべてまたは主要部分を、第２抗
体試薬へ前もって混入することにより、反応媒質中に供
給することが好ましい。

こうして、典型的には約１〜１５重量％、好ましくは約
３〜１２重量％、たとえば約７〜９重量％のポリマーを
第２抗体試薬中に含めて、反応媒質中のポリマーの濃度
を十分にして、同位体標識抗原または標識しない抗原を
有する第１水溶性抗体の間の免疫沈殿反応を加速するこ
とができる。

ＲＩＡテストのプロトコールは、因子の数に依存して変
化しうる。しかしながら、一般に、テスト試薬はすべて
室温に平衡化し、次いで前もって決定した濃度のＦＰＡ
を含有する標準の適当量を一系列の管に加えることがで
き、そして血漿の試料を他の系列の管に加えることがで
き、次いで標（１６） 識ＦＰＡ試薬およびＦＰＡ抗体試薬を順番に管のすべて
に加えることができ、次いでこれらの管を渦発生成させ
、ふたをし、そして培養する。第２抗体を分離に使用す
るとき、それを次に管へ加えることができる。典型的に
は１本発明によれば、管の培養は第２抗体の添加後不必
要であるが、管は必要に応じて培養することができる。

次いで、管を渦発生させ、遠心分離する。管をデカント
し、上澄な廃棄できろ。次いで管を計数し、そして標準
から得られた値を用いて標準曲線を構成できる。

標準曲線上に得られた値をプロットすることにより、未
知の試料について平均値を決定することができる。未知
のＦＰＡを定量するために実施する計算は、普通の方法
に従う。ゼロのＦＰＡを含有する管における計数を、１
００チに設定する〔Ｂ零以下の終止（ｃｌｏｓｉｎｇ　
）　）　。標準中のＦＰＡが増加するにつれて、計乾（
Ｂ終止として定義）は減少する。なぜならこれらの計数
はゼロ管における計数で割ってＢ／Ｂ零以下の値を得る
からである。

このＢ／Ｂ零以零値下値半対数グラフ用紙上ＦＰＡの濃
度に対してプロットできる。Ｂ／Ｂ零のロジン）　（ｌ
ｏｇｉｔ　）変換およびＦＰＡ濃度を用いて、曲線に直
線に変換できる。

ある場合において、特異抗体を含有しない非特異性結合
対照緩衝液を形成することが望ましいであろう。この対
照緩衝液を使用して、反応媒質から特別に分離されない
同位体標＠ｐｐＡを確認できる。これらの場合、真の結
合トレーサーは、非特異計数をすべての試料から減する
ことによって定量できる。

本発明のＲＩＡ法の実施において使用するため、必要な
試薬および物質を含有するパッケージテストキットを準
備する。パッケージは３種類以下の別々の成分を有する
ことができ、ここで同位体標識ＦＰＡ試薬、前記ＦＰＡ
に対して特異的である抗体試薬、および抗凝固試薬を準
備する。これらの試薬の各々をパッケージにおいて別々
の成分として準備して３成分のパッケージを形成するか
、あるいはこれらの試薬の１種またはそれ以上を組み合
わせて、３種類より少ない別々の成分を有するパッケー
ジを形成できる。また、テストパッケージは、３種類ま
たはそれより少ない成分圧加えて、追加の成分、たとえ
ば、標準試料および対照試料を調製するためのＦＰＡ試
薬、ＦＰＡに対して特異的でないがＦＰＡ抗体に対して
特異的である第２抗体試薬、血漿の前処理試薬、ならび
にテストを実施する装置、たとえば試薬を貯蔵するびん
、テストを実施しかつある場合において試薬、たとえば
、対照試料および標準試料を貯蔵する小びん、を含むこ
ともできる。このパッケージ全体を周囲温度で貯蔵しか
つ運搬し、そして使用者はそれを受は取った時、冷蔵庫
の温度、たとえば、２℃〜８℃において、使用するまで
、貯蔵することかできる。

以下の実施例により本発明をさらに説明するが。

本発明はこれらの実施例に限定されない。

フィブリノペプチドへのラジオイムノアッセイにおいて
使用する試薬を、次のようにして調製する： （１９） １、　０．１％のエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
、０．２％のウマアルブミン、０．０４％のシクロヘキ
シイミド、０．００５％のクロルアンフェニコール、０
．５８４９６の塩化ナトリウム、および０．００５％の
ＦＤ＆イエロー＃５を含有する０、０５モルのトリス緩
衝液中に、はぼ６ナノグラムのＮ−チロシルＦＰＡ　　
ｌ−１２５を含有する、フィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ
）Ｉ−１２５を調製する。この溶液のｐＨは、　８．４
０±０．０５である。

この溶液は１０マイクロＣｉより少ないｌ−１２５を含
有する。

２．０．０５モルのトリス緩衝液（０，１３３ｗ／７−
のエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、０．３０ｗ／
ｖ−のウマアルブミン、０．０４％のシクロヘキシイミ
ド、０．００５　ｗ／Ｖ　％のクロルアンフェニコール
、０・５８４　ｗ／Ｖ％の塩化ナトリウムおよび３３Ｋ
ＩＵ／ｆｒ１のアプロチニンを含有する）中で純粋なフ
ィブリノペプチドＡ抗原の適当な希釈を行うことによっ
て、フィブリノペプチドＡ標準を調製する−０−これら
の標準は０．０　、１．０　、２．０　、５．０　。

（２０） １０．０　、２０．０および４０．０ナノグラム／ｆｎ
１３に等しい。

３、　純粋なフィブリノペプチドＡ抗原なトリス緩衝タ
ンパク溶液（標準と同一）に１．３および８、（１−／
グラムＡ−の概算濃度で加えることＫよって、フィブリ
ノペプチド八品質対照物質を調製する。

４、　接合したフィブリノペプチドＡ−ウシ血清アルブ
ミン免疫原を前もって接種したウサギから放出させた抗
血清から、フィブリノペプチドＡ第１抗体試薬を調製し
た。この抗血清を０．０５モルのトリス緩衝液（０，１
０／Ｖ％のウマアルブミン、０．０４ｗ／ｖ％ノシクロ
ヘキシイミド、０．００５ＷＡＩチノクロルアンフエニ
コール、　０．００３５ｗ／ｖ％のＦＤ＆ブルーダイ＃
１．０．５８４　／Ｖチの塩化ナトリウムおよび１０　
ＵＳＰ　Ｋ単位／ｍ〕のヘパリンを含有する〕で１：１
００より大きい比率で希釈する。

５、防腐剤を含有する０、１モルのリン酸ナトリウム緩
衝液中Ｋ　６−５　Ｗ／Ｖ　％　Ｉ）分子量６．ＯｏＯ
〜７゜０００のポリエチレングリコールな含有する、ポ
リエチレングリコール第２抗体試薬を調製する。

６、　０．２０　Ｗ／Ｖ　％のウマアルブミン、０．０
４　％のシクロヘキシイミド、０．００５％のクロルア
ンフェニコールおよび０．５８４　％の塩化ナトリウム
を含有する０、０５モルのトリス緩衝液に、７５ｍぬ２
　のベントナイトを加えることによって、ベントナイト
スラリーな調製する。

７、　非特異結合緩衝液は、これが抗フィブリノペプチ
ドＡ抗血清を含有しない以外、第１抗体試薬と同一であ
る。

８、　４−０　’／ｖ　％のエチレンジアミン四酢酸、
１０００　ＫＩＵ／崎のアプロチニン（Ｔｒａｓｙｌｏ
ｌ■）、０．３〜０．６　ｍＶ’／ｍ−ｅ　のｏ−ｐｈ
ｅ−Ｐｒｏ−ＡｒｇＣｈ２Ｃｌ　および０−９　ｗ／ｖ
％の塩化ナトリウムを含有する抗凝固剤溶液を調製する
。この溶液のＩ）Ｈは４．５である。

５財の排気した血液収集管中に０．５１１の抗凝固剤を
、気密注射器により注入する。これらの管は使用するま
で４℃で貯蔵すべきである。

血液試料の収集および調製： ２０ゲージの一本の試料針を用いて、完全な静脈穿刺に
より血液を収集する。針を静脈にそう人した後、止血帯
を除く。適当な抗凝固剤を含有する排気した管中に、５
幅の血液を集めろ。おだやかに倒立させることにより、
血液と抗凝固剤を完全に混合する。

試料は、収集後できるだけすみやかに、１０００〜１５
００　Ｘ７で４℃または室温において２０分間遠心分離
すべきである。血漿を細胞から分離し、アッセイを行う
まで、−２０℃以下の温度において貯蔵する。

血漿試料の処置： １２Ｘ７５のガラス、ポリメチレンまたはポリエチレン
の管中に０．５唄１５００μｍ〕の血漿を分配する。渦
を発生させかつ最低１２００　ＸＳ’で１０分間遠心分
離する。注意して上澄を吸い出し、清浄な管へ移し、そ
のときベントナイト粒子を移したりあるいは吸い出さな
いように用心する。

アッセイ手順： （２３） １、要求するテスト成分を遠心分離器から取り出し、そ
して室温（２０〜２６℃）Ｋ平衡にさせる。

２、　０．００，１．００．２．００．５．ＯＯ，１０
，００゜２０．００および４０．００　ｎＶｒｒＬｅの
標準の各々の２００マイクロリツトルを、一系列の管に
加える。

２００μ２の患者の処理した試料を、他の系列の管へ加
える。対応する反復する組の非特異結合（ＮＳＢ）管を
、２００μ、＃の０．００　ｎＰ／ｙｙＪの標準の添加
により調製する。

３．１００　μ形のフィブリノペプチドＡ　　Ｉ　−１
２５反応溶液をすべての管中に分配する０４．６管を数
秒問おだやかに渦発生させて、完全な混合を確保する。

５．１００μ沼のＮＳＢ緩衝液を加えたＮＳＢ管を除外
して、１００μ、ｅのフィブリノペプチドＡ抗体溶液を
すべての管中に分配する。

６．６管を数秒問おだやかに渦発生して、完全な混合を
確保する。

７、管をおおい、そして室温（２０〜２６℃）（２４） で４０〜１２０分間培養する。

８、工程５．における抗体溶液の分散に用いたのと同じ
添加の順序および順次の時限を用いて、ＰＥＧ−第２抗
体溶液をよく混合し、そして１．０ｒｒＬ−ｅをすべて
の管へ分配する。数秒間激しく渦発生する。

９、すべての管を１２００ＸＰ以上において室温で２０
分間遠心分離する。

１０、管の内容物をデカントし、そして液体を廃棄する
。すべての管を吸取紙上に少なくとも５分間排液する。

管のリップを紙タオル上に軽くとんとんと打ちつけて、
残りの液体を吸収させる。

次いで、６管を最小１０，０００の計数を累積するため
に十分な期間放射活性について計数し、そして各濃度の
標準および患者の試料の正味の計数７分（ｃｐｍ）を測
定し、そして記録する。各標準、患者または対照の血清
の管の正味のｃｐｍ　をゼロｎ％／ｍＪ３の標準管の平
均の正味ｃｐｍで割り、そして１００を掛ける。商は、
ＦＰＡの不存在下の結合量に比べたＦＰＡの存在下の抗
体へ結合したＦＰＡＩ−１２５の比率（Ｂ／ＢＯパーセ
ント）を表わす。

半対数グラフ用紙の一次の軸上に各標準の二重反復テス
ト値の平均のＢ／ＢＯパーセントを、標準の濃度（ナノ
グラム／ミリリットル）の関数として、プロットするこ
とにより、標準曲線を構成する。各患者の血清および対
照血清の二重反復テスト値の平均のＢ／Ｂｏパーセント
を決定し、そしてこの標準曲線からの患者または対照の
血清のＢ／１３゜パーセント値についてのＦＰＡの濃度
をも決定する。ＦＰＡの正味のｃｐｍ値およびＢ／ＢＯ
パーセント値を下表１に記載する。

表　　１ ＦＰＡ　標準（ｎ　ｆ／ｍ１３　）　　平均の正味のＣ
ＰＭ　　Ｂ／Ｂｏ％０．０　　　３５・７５０　１００
．０１．０　　　３０．４０９　８５．１ ２・０２６嘗０４５　７２．９ ５・０１７・２７９　４８．３ １０．０　　　１０ｔ８５２　３０．４２０．０　　　
６＄４５５　１７．９ ４０．０　　　３，５２１　　９．８ 実施例■ 年令２５〜６０才の３５人の正常な被験者についての予
備データは、血漿の１１当り０．３〜１．７ナノグラム
の値を与えた。

多数のアッセイについて実験内および実験間において、
変動率は１０チより小であることが示された。０．１ナ
ノグラム／ミリリットル程度に低い値を、０．０ナノグ
ラム／ミリリツトルの標準と区別できる。

種々の量の純粋なフィブリノペプチドＡを加えた２種類
の別々の試料について、精度の研究な芙施した。これら
の試料をフィブリノペプチドＡについて測定し、そして
回復した値を期待値と比較シタ。平均の回復値（ｒｅｃ
ｏｖｅｒｙ　ｖｏｌｕｅ　）は１００．８チであった。

フィブリノペプチドＡが増大した血漿の試料（はぼ３０
ナノグラム／ミリリツトル）を段階希釈し、そしてフィ
ブリノペプチドＡＫついて測定した。希釈した試料は、
標準曲線全体を通じて直線的に回復した。

（２７ン 上のデータが示すように、この方法は０．３〜４０．０
ナノグラム／ミリリツトルのフィブリノペプチドへのレ
ベルにおいて、非常に精度が高く、感度が高く、そして
再現性がある。

（２８）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）第１に、血液の試料を集め、前記試料中のトロン
   ビンを抑制量のトロンビン抑制剤で抑制し、そして血漿
   を前記試料から分離し、第２に、前記血漿の試料を、ラ
   ジオイムノアッセイ競合結合条件下に、十分な量のフィ
   ブリノペプチドＡに対する抗体および放射活性で標識し
   たフィブリノペプチドＡと接触させ、その後、抗体結合
   フィブリノペプチドＡを結合しないフィブリノペプチド
   Ａから分離し、そして放射活性を測定することからなる
   、血漿中のフィブリノペプチドＡの濃度を測定する競合
   ラジオイムノアッセイ法において、トロンビアｆ）抑制
   剤として、　Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＡｒｇＣｈ２Ｃ１，
   その塩酸付加塩、そのフッ化水素酸付加塩、その酢酸付
   加塩およびそのクエン酸付加塩から成る群より選ばれた
   抑制剤を使用することを特徴とする方法Ｏ ・（２）血漿をベントナイトで前処理する特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 （３）キレート化量のキレート剤および抗タンパク分解
   量の抗タンパク分解剤が、抑制剤によるトロンビンの抑
   制の間Ｋ、存在する特許請求の範囲第２項記載の方法。 （４）（１１Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇｃｈ２Ｃ１、
   その塩酸付加塩、そのフッ化水素酸付加塩、その酢酸付
   加塩およびそのクエン酸付加塩から成る群より選ばれた
   ト０ンビンの抑制剤、（２）キレート剤および（３）抗
   タンパク分解剤の水溶液からなり、前記の抑制剤、キレ
   ート剤および抗タンパク剤の各々は、血液へ添加したと
   き、その意図する機能を発揮するために十分な量で存在
   する、ことを特徴とするフィブリノペプチドＡの生体外
   定量に関連して使用するトロンビン抑制用抗凝固試薬。 （５）キレート剤はＥＤＴＡ　＃　ＥＧＴＡおよびそれ
   らのナトリウム塩から成る群より選ばれる特許請求の範
   囲第４項記載の試薬。 （６）抗タンパク分解剤はアブ四チニンである特許請求
   の範囲第５項記載の試薬。 （７）キレート剤はＥＤＴＡ　、ＥＧＴＡおよびそれら
   のナトリウム塩から成る群より選ばれる特許請求の範囲
   第６項記載の試薬。 （８）放射性同位体標識フィブリノペプチドＡ試薬、フ
   ィブリノペプチドＡ抗体試薬、および特許請求の範囲第
   ４項記載の抗凝固試薬からなることを特徴とする血漿中
   のフィブリノペプチドＡの濃度のラジオイムノアッセイ
   用パッケージテストキット。 （９）フィブリノペプチドＡに対して特異的でないが、
   フィブリノペプチドへの抗体に対して特異的である第２
   抗体がさらに存在する特許請求の範囲第８項記載のパッ
   ケージ。 （１０）純粋なフィブリノペプチドＡ試薬の標準と対照
   試料をも含む特許請求の範囲第９項記載のパッケージ。 （１１）前記試薬はｐＨ約４〜約１０の水溶液で提供さ
   れる特許請求の範囲第９項記載のパッケージ。