JPH02200A - 腫瘍壊死因子抑性蛋白質及びその精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のレセプターへの結
合抑制能力及びＴ（Ｆの細胞毒性抑制能力を有しＴＮＦ
の有害な効果に対して使用することのできるＴＮＦ抑制
蛋白質、その塩、その機能的誘導体及びその活性）２ク
シヨンに関する。また本発明は、　ＴＮＦ抑制蛋白質の
精製法、実質的に精製された該蛋白質、及び組換えＤＮ
Ａ技術による該蛋白質のクローニング並びにその製造に
関する。更に本発明は、ＴＮＦの有害な効果に対して保
護するだめの、上記蛋白質、その塩、その機能的誘導体
、又はその活性フラクションを含む薬学的組成物に関す
る。

発明の背景 腫瘍壊死因子−α（ＴＮＰαン及びリンホトキシン又は
ＴＮＦ−α（以後、ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βの両者をＴ
ＮＦと言５）は細胞に対して多くの効果を及ばずサイト
カインであるＣ　Ｗａｌｌａｃｈ、　Ｉ）、　（１９８
６Ｌインターフエロン７Ｃ工ｏｎ　Ｇｒｏｓｓｅｒ、　
Ｅｄ、　）、　Ｘ）ｐ。

８３−１２２　＊　Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ、　
Ｌｏｎｄｏｎ；Ｂｅｕｔｌｅｒ、　Ｂ、と（１６）ｒａ
ｍｌ、　Ａ、　（１９８７）　＊　Ｎ１３”ｚｎｇｌａ
ｎｄ　、Ｔ、　Ｍｅｄ。、３１＜Ｓ：３７９−３８５）
。

ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βは特定の細胞表面レセプター
く結合することによってその効果を始めて発揮する。そ
の効果のいくつかは組織にとって有益なものである。即
ち、ＴＮＦ−αは、例えば腫瘍細胞またはウィルス感染
細胞を破壊し、顆粒球の抗菌活性を増大する。しかしな
がら、　ＴＮＦ−αは有害な作用も明らかに有している
。ＴＮＦ−αが過剰に産生されるとそれはいくつかの疾
患の主たる病原体としての役割りを演するという明らか
な証拠がある。しかして、ＴＮＦ−αの管脈構造に及ぼ
す作用は、敗血性ショック症状の主たる原因であること
が知られている［　Ｔｒａｃｅｙ、　Ｌ　、Ｔ、　ｅｔ
　ａｍ、、　（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３４　；
　４７０−４７４　）　６　イ＜つかの疾患においては
、　ＴＮＩＩＦはアジポサイトの活性を抑制するために
あるいは食欲不振を引き起こす（ＴＮＦ−αはカシエフ
チンとも言われている〕ために、体重の大幅な減少（悪
態症ンを起こす原因ともなる。またＴＮ１？′−αは、
リューマチ疾患における組織障害のメゾイエイタ−でも
ある （　Ｂｅｕｔｌｅｒ、上記と同じ］。マたＴＮＦ−αは
、移植片対宿主反応において観察される障害の主たるメ
ゾイエイタ−であることが報告され℃いる。

従って、内因的に形成されるＴＮＦ−α又は外部から投
与されるＴＮＩＩ’−αを中和しあるいはその作用を除
去する方法を開発する必要がある。このような方法を開
発する本発明者らの最初の試みは、ＴＮＦ−αの細胞毒
性を中和するモノクローナル抗体を開発することであっ
た。そしてこのようなモノクローナル抗体は、敗血性シ
ョックを引き起こすような条件下でＴＮＦ−αの致死効
果に対してマウスを保護する作用を有することが明らか
にされた（　σ、ｓ、ｐａｔｅｎｔ　８ｅｒｉａｌＡ　
０６／　８０８．２６２　；１９８５年１２月１２日出
願）。しかしながら、ムリンモノクローナル抗体を用い
た治療は、特に繰返し投与する場合には、ヒトに対して
適切な治療法とは必ずしも言えないものである。従って
、ＴＮＦ−αの効果を中和することのできる生物学的試
薬を開発することが必要である。

本出願の優先権主張出願日前においては、ＴＮＦ−αの
細胞毒性を中和する生物学的試薬の存在を示す報告はな
されていない。３５−　ｋｄａの免疫抑制糖蛋白質であ
るウロモジリン（ｕｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）が姫娠した女
性の尿から単離されたことを記載する報告はある［　Ｍ
ｕｃｈｍｏｒｅ、　Ａｎｄｒｅｖ　’Ｖ、とＤ８０ｋｅ
ｒ。

Ｊｅａｎ　　Ｍ、　　（１９８５）　　５ｃｉｅｎｃｅ
　　２　２　９　　；　　４　７　９　−４８１　］。

そしてウロモゾリンはインターロイキン１（工Ｌ−１）
の高親和性リガンドでありモして工Ｌ−１の強力な抑制
剤であることが示されている［：　Ｍｕｃｈｍｏｒｅ、
　Ａｎｄｒｅｗ　Ｖ、とＤｅｃｋｅｒ、　Ｊｅａｎ　Ｍ
。

（１ｑＢ６　）　Ｊ、Ｂ１０１．ＯＭｍ、　２６１　：
　１３４０４−１３４０７　：　Ｂｒ０Ｗｎ、に、Ｍ、
ａｔａｌ、　＜　１９８６　）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、ｆｆ８Ａ　８３　：９１１９−９１２
３１゜また後になって、ウロモゾリンは、正常人の尿中
に最も豊富に存在する腎由来の蛋白質であるタム−ホー
ス７オール糖蛋白質と同じであることが示された（　ｐ
ｅｎｎｌｃａ、Ｄｉａｎｏ　ａｔ　ａｌ、　（１９８７
）ｓｃｔｅｎｃｅ　２３６　：　８３−８８　］　ｏ他
の１つの工Ｌ−１抑制因子が発熱患者の尿中に見出され
たことがいくつかの文献に報告されている［　Ｌｌａｏ
。

Ｚｅｎｇｈｖａ　ａｔ　ａｍ、　（１９８４）　、Ｔ、
Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１５９　：１２６−１３６　；　８
ｅｃｋｉｎｇａｒ、　Ｐｈ１ｌｌｉｐｐｅ　ｅｔ、　ａ
ｍ。

（１９８７＞　：ｒ、工ｍｍｕｎｏ１．１５９　：　１
５４６−１５４９）。この工Ｉ、−ｉ抑制因子は組換え
工Ｌ−１＊工Ｌ−１α及び工Ｌ−１βに対して多くの生
物学的活性をある程度及ぼすことが示されている。ヒト
ＴＮＦ−αは工Ｌ−１のいくつかの生物学的活性と同じ
活性を有しているが、この工Ｌ−１抑制因子はＴＮＦ−
αの生物学的活性を抑制しない〔８θｃｋｉｎｇｅｒ。

ｐｈｌｌｘｌｐｐｅ　ａｔ　ａｌ、　（１９８７＞　Ｊ
、工ｍｍｕｎ０１゜１３９　：　１５４１−１５４５）
。

本出願の優先権主張出願後に、ウロモゾリンとタム−ホ
ースフォール糖蛋白質はレクチン様相互作用により組換
え工Ｌ−ｉα、工Ｌ−１β及びＴＮＦ−αと結合するこ
とが報告されており、そしてこの事実がこれらリンホカ
インの循還レベルを調節する上で重要な役割りをはたし
ていることが提案されている［　ｇｅａｓｉｏｎ、０ａ
ｔｈｅｒｉｎｅ　ｅｔ　ａｍ、　（１９８７）ｓｃｉｅ
ｎｃｅ２３７　：　１４７９−１４８４）。つａモジリ
ンは、標的腫瘍細胞の溶解によってモニターした所、　
ＴＮＦ’−αの細胞毒性を抑制はしないが、糖鎖な介し
てｒｅｄ、　ＴＮＦ−αと相互に作用し、この相互作用
がＴＨＦ及び他のリンホカインの毒性のｉｎ　ＶｉＶＯ
でのクリアランスの促進及び／又は該毒性のｉｎ　Ｖｉ
ＶＯでの減少に重要であることが示されている（　ｓｈ
ｅｒｂｌｏｍ、Ａｎｎｅ　ｐ、　（１９８８）　Ｊ、　
Ｂ１１１゜Ｏｈ６１ｍ、　　２６３　　：　５４１　８
−５４２４　］。

８ｅｃｋｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、の最近の報告による
と、発熱患者の尿から得られるＴＮＦ−αヒト抑制因子
はＴＮＦ−αの細胞毒性を抑制する４　０−６０　Ｋｄ
＆の蛋白質であることが記載されている［：Ｊ、Ｂｘｐ
。

Ｍｅｄ、（１９８８）１６７：１５１１−１５１６］。

そしてそれはウロモジリンとも相違し、また上記した工
Ｌ−ｉ抑制因子とも相違することが示されている。

発明の要旨 本発明によれば、ＴＮＦの効果を中和することのできる
ＴＮＦ抑制蛋白質、その塩、その機能的誘導体及びその
活性フラクションが提供される。

この中和作用は、ＴＮＦ′が細胞表面レセプターに結合
するのを阻害する作用を測定するとともに、ＴＮＦ−α
の細胞毒性の減少度を測定することによって判定できる
。

また本発明は、実質的に純粋な形態にあり蛋白質の不純
物を含まない該ＴＮＦ抑制蛋白質に関する。

更に本発明は、ＴＮＩＰ抑制蛋白質の精製方法に関する
。

更に本発明は、該蛋白質をコードするヌクレオチド配列
を含む組換えＤＮＡ分子、該分子を含むしてＴＮＩＰ抑
制蛋白質を製造する方法に関する。

本発明のＴＮＦ抑制蛋白質、その塩、その機能的誘導体
及びその活性２２クシヨンは、ＴＮＦの有害な効果九対
して哺乳動物を保護するための薬学的組成物の活性成分
として使用される。

図面の説明 第１Ａ図は、σ’ｌｔｒｏｇｅｌ　ＡＯＡ　４４デル濾
過カラムからのＴＮＦ抑制蛋白質の溶出パターンを示す
。

２つの２ｔｎｔ画分を集め、２５８ｎｍでの吸収による
蛋白質量（□）、１２５ニーＴＮＦ−αがその細胞表面
レセプターに結合するのを阻止する能力（冶−−べ〕、
及びＴＮＦ−α細胞毒性抑制能（−ｍ−）についてテス
トした。ＴＮＦ抑制活性の主要ピークは、主蛋白質ぎ−
クの少し前に浴出した。

第１Ｂ図は、σｌｔｒｏｇｅｌ　ＡＯＡ　４４　Ｊｆル
濾過を行なう前に水に対して透析した場合のＴＮＦ抑制
蛋白質の溶出パターンを示す。

第２図は、ムリンＡ９Ｍ胞を、シクロへキシミド（ＯＨ
工）（ａ）、ＴｎＩｌｌ−α−ＯＨ工（ｂ）、あるいは
ＴＮＦ−α−ＯＨ工とＴＮＦ抑制蛋白質（ｃ）で処理し
た時の形態を示す。

第３図は、ＴＮＦ抑制蛋白質の精製の第２工程の結果を
示す。カルボキシメチル（ｃＭ）セファロースで精製し
たＴＮＦ抑制蛋白質を、ｎｏｎｏ　８５１５カチオン交
換カラムの８×２一部分に付し、１０ｍＭクエン酸及び
０．０２％ナトリウムアシドを含むＯ−３５０ｍＭｓａ
ｃｚバッファー溶液（ｐＨ５，０）のリニア−グラジェ
ント（−−一−−）で溶出した。

流速０．５ｄ／分で溶出せしめて０．５−画分を集め、
ムリンＡ９細胞に対するＴＮＦ　ＩＩ細胞毒性の抑制に
ついてテストした。ＴＮＦ抑制蛋白質の主要部分は％　
１　ｓｏ−１ｏｏｍＭＮａｔ：ａの塩濃度で？Ｉ出Ｌし
、−（１２２２２２１）。２８０ｎｍでの吸収によつ℃
核蛋白質をモニターした（□）。

第４図は、ＴＮＦ抑制蛋白質の精製の第６エ程の結果を
示す。ＯＭ−セファロース及びＭＯｎｏ　Ｓで１１１８
シた活性蛋白質を、５ｍＭナトリウムポレート及び０．
０２％ナトリウムアジドを含むバッファー（ＰＨ９，０
）に対して透析し、Ｍｏｎｏ　Ｑ　５１５アニオン交換
カラムに付した。結合蛋白質を、０−６０ｍＭ　ＮａＣ
ｊリニアーグラジェント次いで６０−３００６０−３Ｏ
０リニアーグラジエントで、流速０．５ｗｄ／分で溶出
させた（　−−−−−）。０．５−画分を集め、ムリン
Ａ９ｍ１１胞尤対する’ｒＮＦ’細胞毒性の抑制につい
てテストした。２８０叱での吸収を測定することによっ
て、溶出中の蛋白質をモニターした（　　）。図に示し
たように、３０−４０　ｍＭの塩濃度で活性を示す大部
分が溶出した。

第５図は、逆相ＨＰＬＣでのＴＮＦ抑制蛋白質の分離を
示す。Ｍｏｎｏ　Ｑ５１５から浴出した活性蛋白質を、
　Ａｑｕａｐｏｒｅ　ＲＰ−３００ＨＰＬＣ力２ム（Ｂ
ｒｏｗｎｌｅｅＬａｂｓ　）の１．６一部分に注入しｓ
　０．３　％　ＴＦＡ　（バッファー７）水溶液で流速
０．５ｔ１１ｔ／分で流した。

次いで、０−２０％アセトニトリルバッファー？溶液リ
ニアーグラジェントで５分間溶出し、次いで２０−５０
％リニアーグラジェントで６０分間、更に５０−８０％
リニアーグラジェントで５分間溶出した（　−−一−−
）。０．５−画分を集め、ムリンａ９ｉｆＢＪ胞に対す
る’Ｉ’ＮＩＦ細胞毒性の抑制についてテストした。７
ＡＩオレスカミ７　（ｆｌ、ｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ　
）で自動的に反応後、それぞれの画分のサンプルの相対
螢光度を測定することによって、溶出中の蛋白質濃度を
モニターした（□）。ＴＮＦ抑制活性部分が、分離した
蛋白質ピークとともにシャープなピークとして浴出した
。

第６図は、各精製工程における活性物質のサンプルをＳ
ＤＢ　ＰＡＧＥ　［Ｌ（１６）ｍｍｌｉσ、　Ｋ、　ｅ
ｔ　ａｌ、　。

（１９７０）ｎａｔｕｒｅ　２２７　：　６　Ｂ　□　
）で分析した結果を示す。ＣＭ−セファロース、ＭＯｎ
ｏ　Ｓ。

Ｍｏｎｏ　Ｑから溶出した活性画分であってそれぞれ５
μｇの蛋白質を含む活性画分のアリコートを、６％ｓｐ
ｓ（ｗ／ｖ）及び１５％β−メルカプトエタノール（１
１／Ｖ　）を含む３倍ａＫサンプルバッファーと混合し
、１５％ポリアクリルアミドｒルに付した。ＨＰＬＣＲ
Ｐ　３００カラムから溶出した画分２ｌ−２５（レーン
Ｅｆ、　Ｆ、　Ｃｋ）のサンプルも同様に処理してｒル
に付した。分子量マーカーとして、α−２クトアルデミ
ン１４．４　ｋＤａ　、大豆トリノシンインヒビター２
０．１　ｋＤａ　、カルポニツクアンヒー２−ゼ３　Ｑ
　ｋＤａ　、オボアルデミン４３　ｋＤａ。

ウシ血清アルブミン６７　ｋＤａ及びホスホリラーゼｂ
、　９４　ｋＤａの混合物を、シーンムに流した。レー
ン■では、ブランクとしてサンプルバッファーのみを流
した。蛋白質バンドを銀発色により視覚化せしめた。画
分２１．２２及び２３は、見掛は分子ｔ　２６−２８　
ｋＤａの単一バンドを示した。これらの画分は、ムリン
Ａ９細胞に対するＴＮＦ−α細胞毒性の抑制についてテ
ストした所、活性を示すことが見出された。

発明の詳細な記述 本発明によれば、ＴＡＰのレセプターへの結合を抑制し
ＴＮＦの細胞毒性効果を抑制する能力のあるＴＮ１１′
抑制蛋白質、その塩、その機能的誘導体、及びその活性
フラクションが提供される。

本発明によれば、ＴＮＦ抑制蛋白質はＴＮＦ−α及びＴ
ＮＦ−βの両者の生物学的活性を抑制できることが見出
された。しかして、ＴＮＦ抑制蛋白質によるこれら２つ
のサイト力インＣ本明細書ではＴＮＦと言う〕の抑制も
本発明に包含される。

本発明のＴＮＦ抑制蛋白質はヒトの尿中に見出される。

ヒト尿の濃縮物から得られるその粗調製物を、σｌｔｒ
ｏｇｅｌ　ＡＯＡ　４４１”ル濾過カラムを用いたクロ
マトグラフィーに付した時には、それは４０−８０　ｋ
Ｄａの見掛は分子量を示した。蛋白質の不純物を実質的
に含まない、実質的に精製された蛋白質は、還元条件下
でＳｎ２　ＰＡＧＩにより分析した場合には、約２６−
２８　ｋＤａの見掛は分子量を示し、逆相高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）では単一ピークとして移動
した。その活性は、ヒト　ＨｅＬａ細胞及びＦＢ１１線
維芽細胞の細胞レセプターへのＴＮＦ−αの納会を抑制
する能力及び／又はムリンＡ９細胞に対するＴＮＦ−α
の細胞毒性の抑制能力によって測定した。

更には、以下に示すアミノ酸配列をそのＮ−末端に含ん
でいるという特徴を有する。

上記式において、１４番目のＸで示されるアミノ酸は同
定されなかった。４番目の位置にシスティン（０７８）
が存在するのは理論的に裏付けられている。なぜなら、
そのようなものとしてＰＴＨ（フェニルチオヒダントイ
ン）　ｃｙ、ｓを同定−ｊルＣとができず、他のアミノ
酸残基もこの位置では検出されなかったためである。

本明細書で言う１塩”とは、蛋白質分子のカルボキシ基
の塩及びアミノ基の酸付加塩の両者を指す。カルボキシ
基の塩は公知の方法によって形成することが出来、例え
ば、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、鉄
塩、亜鉛塩などの無機塩：列えは、トリエタノールアミ
ン、アルギニノもしくはりシン、ピペリジン、プロカイ
ンなどのアミンと゛形成される有機塩基との塩等が挙げ
られる。酸付７１０塩としては、例えば、塩酸、硫酸な
どの無機酸との塩：例えば酢酸、オキデル酸などの有機
酸との塩等が挙げられる。

本明細書で言う″′機能的誘導体”とは、アミノ酸残基
の側鎖又はＮもしくはＣ−末端の官能基から公知の方法
によって調製される誘導体を包含するものであり、それ
らが薬学的に許容し得るものである限り、即ち、それら
が蛋白質の活性を破壊せずそしてそれらを含む組成物に
対して毒性を与えるものでない限り不発明に包含される
。

これらの誘導体としては、例えば、カルボキシ基の脂肪
族エステル；アンモニア、第１級アミン又は第２級アミ
ンとの反応から得られるカルボキシ基のアミｒ；アシル
部分（例えばアルカノイル又はカルボサイクリックアロ
イル）との反応で形成されるアミノ酸残基の７リーアミ
ノ酸のＮ−アシル誘導体；アシル部分との反応で形成さ
れるフリーカルボキシ基（例えばセリル、スレオニル残
基のカルボキシ基）の０−アシル誘導体などが挙げられ
る。

ＴＮＦ抑制蛋白質の１活性フラクシヨン″としては、例
えば、蛋白質分子のみのポリペプチド鎖の断片もしくは
前駆体；関連分子あるいは糖残基、リン酸残基などの残
基な有する蛋白質分子のポリペプチド鎖の断片もしくは
前駆体；蛋白質分子あるいは糖残基自体の凝集体などが
包含される。但しこれらの７２クシヨンは、ＴＮＦのレ
セプターへの納会を抑制する能力を有しそしてｉｎ　Ｖ
ｉｔｒ。

で細胞に対するＴＮＦの細胞毒性の抑制能力を有してい
なければならない。

１、　　ＴＮＦ抑制蛋白質の予備的特徴付は及び最初の
精製 粗精製物の状態での予備的特徴付けの段階において、Ｔ
ＮＦ抑制蛋白質の以下の特性及び活性が観察された。

（ａ）　　ＴＮＦ抑制活性は、病人と同様に健常人の尿
中でも見出される。

（ｂ）　　活性蛋白質は、１０ｋＤａ分子量排除膜を通
しては透析できない。

（ｃ）　　［Ｔｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｏＡ４４　ｌ’ル濾
過カラムを用いたクロマドグ２フイーに付した時の活性
ＴＮＦ抑制蛋白質の見掛は分子型は、４０　ｋＤａと８
０　ｋＤａの間であった。水に対して充分に透析した場
合でも、この方法での蛋白質の挙動には変化はなかつｒ
、：（第１Ａ及び８１！ＩＢ図ン。

（ｄ）　　分離等電点法で測定した活性蛋白質の等電点
は、ＰＦ′ｉ６と８の間であつ′た。

（１３）　　コンカナバリン−Ａセファロースに活性蛋
白質の１部が結会し、そしてそれはメチル−α−Ｄ−マ
ンノピラノシドで特異的に溶出′できた。このことは該
蛋白質が糖蛋白質であることを示している。

（ｆ）　　ＴＮＦ抑制活性は熱に対して不安定であった
。

（ω　ＴＮＦ抑制蛋白質の生物学的活性は、各種のプロ
テアーゼインヒビターによっては阻害されなかった。こ
のことは、ＴＮＦ抑制のメカニズムは粗尿中に存在する
蛋白質加水分解活性によっては説明できないことを示し
ている。

（ｈ）　　ＴＮＦ−αの細胞表面レセプターへの結合の
抑制は、ＴＮＦ抑制蛋白質をＴＮＦと同時に適用した時
にのみ生じた（表１ン。

しかして、本発明のＴＮＦ抑制蛋白質は、上記したいく
つかの特性、即ち、（ａ）’ｒル濾過での見掛は分子皺
、（ｂ）等電点、及び（ｃ）水に対して透析した時に蛋
白質のかなりの程度の凝集は観察されない、などの特徴
から、ウロモジリンとは相違する。

部分精製ＴＮＦ抑制蛋白質調裂物は、以下に示す方法に
より、尿蛋白質のｒル濾過による分画によって得られる
。

１Ｑ　ｋＤａ分子分子除膜を用いた限外濾過、次いで５
ｏｏｏ分子量排除膜（Ａｍ１ｃｏｎ　ＹＭ　５　メｙプ
レン）を用いた限外濾過により、尿を濃縮する。濃縮物
を、１ｍＭ　Ｍｇ２＋及びｌ　ｍＭａａ”＋を含むＰＢ
８（リン酸緩衝化食塩水〕に対して透析し、同じ緩衝液
で平衡化したコンカナバリン−Ａセファロースカラムに
付した。カラムを洗浄し、次いでカラムに特異的に結合
した蛋白質を０．５Ｍメチル−α−Ｄ−マンノピラノシ
ドで溶出させた。ＴＮＦ−αのレセプターへの結合を抑
制する活性を示す、全部ではないが大部分はレクチンに
特異的に吸着され、そしてメチル−α−Ｄ−マンノピラ
ノシドで溶出できる。

コンカナバリン−Ａから溶出される蛋白質６．５■のサ
ンプル’ｇＰＢ８に対して透析し、次いで２Ｘ４５ｃｒ
ＩＬσｌｔｒｏｇｅｌ　ＡＯＡ　４４カラム（ＬＫＢ。

３ｗｅｄｅｎ　）を用いたｒル濾過により分画した。溶
出蛋白質の２５８　ｎｍでの吸収を測定した（−）。

２ｆＲ１の画分を集め、１：２０に希釈して、後述する
２、１の方法（冶−■）及び２．２の方法によりＴＮＦ
−αに対する保護能力を調べた。２．２の方法は、７５
σ／−濃度のＴＮＦ−αが適用できＢａ１ｂ　／Ｑ−Ｏ
Ｌ、７細胞が使用できるように改良したものである。１
２時間後に、中性赤色染料の取り込みを測定することに
よって（−）　（第１Ａ図］−細胞の生存を調べた。

コンカナバリン−Ａから溶出する同じサンプルを、蒸留
水に対して４８時間透析に付し、次いで不溶性蛋白質を
除くためにスピンした。次いで凍結乾燥し、更にＰＢＳ
中で再構成し、上記と同様にしてＵｌｔｒｏｇθｌ　Ａ
ＯＡ　４４カラムを用いたクロマトグラフィーに付した
。画分な集め、上記と同様にしてアッセイした。保護活
性の分画パターンには有意な変化は認められなかった（
第１Ｂ図ン。

分子量マーカー（ウシ血清アルブミン（５７ｋＤａ　。

オボアルプミン４３　ｋＤａ　、大豆トリプシシインヒ
ビター２Ｑ、１ｋＤａ及びチトクローム０１２．３　ｋ
Ｄａ＞の保持時間と比較した所、約５０−７０　ｋｐａ
の見掛は分子量の最大活性を有する主要蛋白質のピーク
の少し前に、活性部分が溶出することが見出された。

１２５ニーＴＮＦ−αと蛋白質とを共に細胞に適用した
時にのみ、尿濃縮物中に存在するＴＩＩＰ抑制蛋白質に
よる１３１５ニーＴＮＦ−αの細胞への結合の減少が観
察され、蛋白質を細胞に最初に適用しＴＮＩＩ’−αを
適用する前に蛋白質を除いた場合には、このような結合
の減少は観察されなかった。この事実は、ＴＮＦの細胞
への結合の抑制は、ＴＮＦ抑制蛋白質の細胞九対する効
果によるものでもなく、また尿中にＴＮＦ−α自身が存
在することによるものでもなく、むしろ本発明の蛋白質
とＴＮＦ−αとのある種の相互作用によるものであるこ
とを示すものである。

２、本発明のＴＮＦ抑制蛋白質のアッセイ谷精製工程に
おいては、２つのアッセイ法を用いて、＃！４なる一分
中のＴＮ？抑制蛋白質の活性をモニターした。

細胞に結合したＴＮＦの麓のアッセイは、工５ｒ（１６
）ｌ、ｆ３．ｅｔ　ａｍ、　（１９８６＞　Ｄｎｍｕｎ
ｏｌ、Ｌｅｔｔθｒａ１　２　：　２１　７−２２４　
ａ、　ＨＯｌｔｍａｎｎ、　Ｈ，とＷａ：Ｌｌａａｈ。

Ｄ−（１９８７＞　　：ｒ、工Ｍｕｎ０１．１３９：１
１６１−１１６７に記載された方法と同様にして実施し
た。

１５ｕ＋ウエルプレート中のＤＭＩＣＭ　（ダルベツコ
の修正イーグル最少必須培地）に％２．５Ｘ１０８セル
／ウェルの密度で細胞（Ｈ８Ｌａ又はＦＳ１１包皮線維
芽細胞）を接種した。５９ｂ　Ｃ０２で６７℃で２４時
間インキュベーション後・、プレートを氷に移し、生育
培地を除き、ＴＮＦ’抑制蛋白質を含むサンプルのアリ
コートを、ラベル化”５ｌ−ＴＮＦ−α（Ｉ　Ｑ５ｃｐ
ｍ）　１０−２−＝ツを含む０．１５−リン＃ＬＷｋ衝
化食塩水（ＰＢ８）［１ｍＭｏａ２”　　１ｍＭＭｇ”
０．５岬／１１１ｔウシ血清アルデきン（ＢＳＡ）及び
０．１チナトリウムアゾド（ＰＢ８７ＢＥＩム）を１加
〕と混合し、ＭＡｍに適用し、久いで４℃で２時間イン
キュベートした。次いで細胞をＰ　Ｂ　８７Ｂ　８　Ａ
でリンスし、放射活性測定用バイアルに移し、ガンマカ
ウンターで２ベル量を定量した。アッセイ系に非ラベル
化ＴＮＦを過剰に加えて、非特異的結合址を測定し、全
ての場合においてこの値を差し引いた。

このバイオアッセイは、シクロヘキシイミｒ（ＯＨ工）
感作細胞に対するＴＮＦ’の細胞毒性効果及び中性赤色
染料取り込み法によるその定量（ｗａｌｌａｃｈ、Ｄ　
（１９８４）　１．工ｍｍｕｎｏ１．１５２　”２４６
４−２４６９）に基づき開発したものである。

蛋白質の存在をテストすべきサンプルを、４°０でＤＭ
ＥＭで一連の２倍希釈を行ない、これに４０σｇ　／　
ｄ　ＴＮＦ−α及び４００μｇ／−シクロヘキシイミド
（ＯＨエンを含む同様の培地の等量を加える。

９６−ウェル丸底マイクロプレート［１００μＬ　ＤＭ
Ｅ！１Ｍ−０８（５％胎児ウシ血清及び５％ウシ血清を
含む）とともにふりンＡ９細胞を接種する（　１．５Ｘ
　１０’セル／ウエル）。

一連の希釈した蛋白質−ＴＮＩＰ−α−ＯＨ−ＯＨ−の
１００μＪアリコートをそれぞれのウェルに適用し、更
に細胞を１４時間インキュベートした。

中性レッドと共に２時間インキュベートし、過剰の染料
を洗い流し、５ｏｒｅｎａｏｎクエン酸緩衝液−エタノ
ール混合物で細胞に取り込まれた中性レッドを抽出し、
次いでＭｉａｒＯ，ｅｌｉａａオートリーダーにより５
７０　ｎＩｎで比色定量を行なうことによって、細胞の
生存を測定した。

ＴＮＦ抑制活性の１σ／−を、ＴＮＦ殺効果に対する有
意な保護を与える希釈倍率として定義した（Ｐ＜０．０
５）。

このバイオアッセイは労力をあまり必要とせずまた放射
ラベル化物質を使用しないため、精製工程における蛋白
質活性をモニターするのには好ましく用いることができ
る。このバイオアッセイにおいては、個々のウェルから
細胞をカウント用バイアルに移す必要がなく、またＭｉ
ｃｒｏｅ１１ｓａオートリーダーを用いることにより多
くのアッセイ結果をより迅速疋記録することができる。

このバイオアッセイ条件で処理したふりンＡ９細胞の形
態は第２図に示した通りである。第２図の（ａ）には、
ＯＨ工だけでインキュベートした細胞が示されており、
（ｂ）にはＴＮＰ−α−ＯＨ−ＯＨ−でインキュベート
した細胞が示されており、（ｃ）にはＴＮＦ抑制蛋白質
（前記した０Ｍセファロースで精製後のもの）とともに
ＴＮＦ−α−ＯＨ−ＯＨ−でインキュベートした細胞が
示されている。ＴＮＰ−αの細胞毒性に対するＴＮＦ抑
制蛋白質の保護効果は（ｃ）から極めて明らかである。

３、　　ＴＮＦ抑制蛋白質の精製 本発明の好ましい態様においては、本発明の実質的に精
製された蛋白質は、以下に示す工程から得られる。

（ａ）、ヒト尿の透析濃縮物から粗蛋白質画分を回収す
る； （ｂ）、工程（ａ）で得られる粗蛋白質画分をイオン交
換クロマトグラフィーに付して、ＴＮＦのレセプターへ
の結合抑制能力及びＴＮＦの細胞毒性抑制能力で規定さ
れる部分精製されたＴＮＦ抑制蛋白質の活性画分を得： （ｃ）、工程〔ｂ）で得られる部分精製されたＴＮＦ抑
制蛋白質の活性画分を逆相高圧液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）に付して、　ＴＮＦのレセプターへの結合
抑制能力及びＴＮＩ！’の細胞毒性抑制能力で規定され
る実質的ＩＣＭ製されたＴＮＦ抑制蛋白質の活性画分を
得：次いで、 （ｄ）、工程（ｃ）の実質的に精製された蛋白質であっ
て、還元条件下での８ＤＢ　ＰＡＧＥで約２６−２８ｋ
Ｉ）ａの分子量を有し、逆相ＨＰＩＩＯで単一ピークと
して移動し且つＴＮＦのレセプターへの結合抑制能力及
びＴＮＦの細胞毒性抑制能力を有する蛋白質を回収する
。

上記工程（ｂ）のイオン交換クロマトグラフィーは、カ
ルｒ＊シメｆルセ７７０−ス、ＭｏｎｏｓＨＲ５１５Ｉ
ＰＰＬＣ及びＭｏｎｏ　Ｑ、　ＨＲ５１５ＦＰＬＯカラ
ムを好ましくはこの順序で用いて６ステツプで実施する
のが好マシイ。逆相ＨＰＬＣはＡｑｕａｐｏｒｅ　ＲＰ
　３００カラムで実施するのが好ましい。

好ましい態様においては、精製の全ての工程において、
蛋白質濃度を測定しく　２８０　ｎｍでの吸光度、又は
代表的なアリコートとフルオレスカミンとの自動化反応
後に相対値光度を測定することによる）、モして前記２
．２で述べたバイオアッセイによりＴＮＦ−α細胞毒性
の抑制を測定して、条稍農工程をモニターした。

６．１　　尿濃縮物の調美 健常人ドナーから得た女性の尿２００１を、孔サイズ０
．４５　μｍ　Ｏ）　Ｐｅ１ｉｃｏｎメンプレンでのマ
イクロ濾過に付す。次いで、得られる濾液を、１０ｋＤ
ａの分子量排除Ｐθ１ｌｉｃｏｎメンプレンを用いた限
外濾過で濃縮して終濃度５００−とする。得られる濃縮
物を、１ｍＭベンズアミジン及び０．１％ナトリウムア
ジドを含むリン酸緩衝化食塩水に対して透析する。

２．７　Ｘ　１０ｃｒＩＬＯＭセファロースカチオンイ
オン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）を、０．０２
％ナトリウムアジドを含むｉ　ＭＮａＣｊ、　１ＱｍＭ
クエン酸緩衝液（ｐｉ（５，［］）（バッファーａ）で
あらかじめ洗浄し、０．０２％ナトリウムアシドを含む
１Ｑ　ｍＭクエン酸緩衝液（ＰＨ５，０）で平衝化した
。上記した６、１の工程の尿濃縮物を、１００倍容量の
バッファーＡで２回透析し、８０００ｒｐｍで・１５分
間スピンした。得られる上溝を４℃で流速２−７分で０
Ｍ−セファロースカラムに付し、５０ｆＲｔ画分を集め
た。蛋白質が検出されなくなるまでバッファーＡ（約１
５００ｍｇ）でカラムを洗浄し、次いで０．０２％ナト
リウＡ７ゾドを含む２００　ｍＭ　ＮａＣｊ。

ｉ　Ｑ　ｍＭクエン酸緩衝液（ＰＨ５，０）（バッファ
ーＢ）の５倍カラム容量で溶出しＣ５画分）、次いでバ
ッファーＣの３倍カラム容量で溶出した（３画分ン。画
分を集め、前記したテストを行なった。

ＴＮ？抑制蛋白質の生物学的活性を示す主要部分は、バ
ッファーＢによる溶出の第２番目の画分中に見出された
。

Ｍｏｎｏ　ｓ　ＨＲ５／　５カラＡ　（Ｐｈａｒｍａ＋
Ｊａ　）を、０．０１％ナトリウムアシドを含む１Ｑｍ
Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ５，０）（バッファーＡ）で、
安定なベースラインが得られるまで（２８Ｑ　ｎｍにて
Ｕｖディテクターでもモニターした）洗浄した。ＣＭ−
セファロースカラムから溶出した活性画分を集め、１０
０倍容量のバッファーＡで２回透析した。得られるサン
プルを、カラムの最大結合能が達成されるまで（２８η
］カラムの８×２一部分に注入した。、平らなベースラ
インが観察されるまで、カラムをバッファーＡで洗浄し
た。結合蛋白質を、バッファーＡのリニアーＮａＣｊグ
ラゾエント（０−３５０ｍＭ）で溶出した。グラジェン
トを流速０．５ｄ／分で４０分間流した。次いでカラム
を５５０　ｍＭＮａｃｚバッフ７−Ａ（バｙｙ７−Ｄ）
で１０分間洗浄した。３５　Ｑ　ｍＭ　Ｎａ（：、！の
濃度で溶出しなかった蛋白質が、バッファーＣでカラム
から溶出した。０．５−画分を集め、前記したようにし
てテストした。得られる結果は第６図に示した。

活性を示す主要部分は、１８０−２８０−２２Ｏ′ｃｚ
の濃度に対応する画分２０−２３に溶出していることが
判った。

Ｍｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ５１５カラＡ　（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ　）を、安定なベースラインが得られるまで、０．０
２％ナトリウムアシドを含む５　ｍＭナトリウムポレー
ト緩衝液（ＰＨ９，０）（バッファーＥ）で洗浄した。

Ｍｏｎｏ　８カラムから溶出した活性画分を集め、１０
０倍容量のバッファーＥで２回透析した。得られるサン
プルをカラムの２一部分に注入し、ベースラインが平ら
になるまでバッファーＥをカラムに流した。バッファー
ＥのリニアーＮａ（Ｊグラジエン）　０−６０　ｍＭで
６０分間、次いでバッファーＥのリニアーＮａＣｔグラ
ゾエント６０−３００ｍＭで３０分間、結合蛋白質を溶
出させた。カラムを、３００ｍＭＮａｃｚバッファーＥ
で１０分間次いで１Ｍ　Ｎａ０ｆバツフアーＥで流速０
．５ｍ／分で４分間洗浄した。０．５−画分を集め、活
性及び蛋白質量をテストした。第４図に示したように、
活性を示す大部分は、約４０　ｍＭ　Ｏ）　Ｎａ（Ｊ濃
度の画分１５−１８中に溶出した。

６．５　　逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）逆相ＨＰＬＣ！カラムＡｑｕａｐｏｒｅ　ＲＰ　３０
０４．６Ｘ　３　Ｑ　ｎｍ　（Ｂｒｏｗｎｌｅｓ　Ｌａ
ｔｌ　）を、フルオレスカミン検出系で安定なベースラ
インが得られるまで、０．６％トリフルオロ酢＃１（Ｔ
ＦＡ）水溶液（バッファーＦ）であらかじめ洗浄した。

Ｍｏｎｏ　Ｑカラムから溶出した活性画分を集め、カラ
ムの１．６一部分に注入した。螢光光度計で蛋白質が検
出されなくなるまで、カラムにバッファーＦを流速０．
５ｍｇ／分で流した。次いで、バッファーＦの〇−２０
％アセトニトリルリニアーグラゾエントで５分間、２０
−５０％アセトニトリルリニアーグラジェントで６０分
間、最後に５０−８０％アセトニトリルリニアーグラジ
ェントで５分間、流速０．５ｄ／分で溶出した。次いで
、８０チアセトニトリルで１５分間カラムを洗浄した。

０．５−画分を集め、蛋白質量及び活性をアッセイした
。第４図に示されるように、単離された蛋白質ピークと
共に画分２ｌ−２３（画分２２にピークを有する）に活
性部分がシャープに溶出した。これらの画分は２７襲ア
セトニトリルに対応していた。

６゜６ＢＤＢ−ＰＡＧＥ 精製結果をモニターするために、Ｌ（１６）ｍｍｌ　ｉ
σ、Ｌ。

ａｔ　ａｌ、　（１９７Ｑ　）　Ｎａｔｕｒｅ　２２７
　：　６８　Ｑに記載された方法により、ナトリウムド
デシルスルフェートポリアクリルアミｒｒル電気泳動（
８Ｄ８−ＰＡＧｍ）を実施した。上記工程６．２．６，
３及び五４のイオン交換カラムから溶出した５μｇ蛋白
質を含む活性画分のサンプル（シーｙＢ：ｏＭ−セファ
ロースカラムから溶出した活性画分；レーンａ　：　Ｍ
ｏｎｏ　Ｂカラムから溶出した活性画分：レーンＤ　：
　Ｍｏｎｏ　Ｑカラムから溶出した活性画分）、あるい
は逆相ＨＰＬＣで得られる画分２１−２３の４０　ｐｉ
サンプル（レーンに−Ｇ　）を、６％ＳＤ８（ｗ／ｖ）
及び１５　％　（Ｖ／Ｖ）β−メルカフトエタノールを
含む６倍濃度のサンプルバッファーと混合し、１５％ア
クリルアミドｒルに付した。対照分子量として、分子量
マーカー混合物（α−ラクトアルブミン１４．４　ｋＤ
ａ　、大豆トリプシンインヒビター２Ｑ、ｉ　ｋＤａ　
、カルボニックアンヒドラーゼ３　Ｑ　ｋＤａ　、オボ
アルプミン４３　ｋＤａ　、ウシ血清アルブミン６７１
■ａ及びホスホリラーゼｂ９４ｋＤａ）を上記と同様に
処理し、レーンＡに付した。サンプルバッファーをブラ
ンクとしてレーンＨに付した。ｒルを１６０ボルトで流
し、蛋白質バンドな銀染色により発色させた［　０ａｋ
ｌｅｙ、　Ｂ、　Ｒ，ａｔ　ａｌ。

Ａｎａｌ、Ｂｉｏａｈｅｍ、　１０５　：　６６１　］
　ｏ　Ｋ　６図に示したように、精製したＴＮＦ抑制蛋
白質は、見掛は分子量２６−２８　ｋＤａを有する単一
ピークとして移動した（レーンに−Ｇ）。

６．７　　蛋白質マイクロ配列自動分析本発明の実質的
に精製されたＴＮＦ抑制蛋白質のサンプル（１−５μｇ
、それぞれ５０−２５０−２００ｐを、あらかじめ処理
したバイオプレン被覆ガラスファイバーディスに適用し
た。この乾燥ディスクを、オンラインＩＩ！ＰＬＣＰＴ
Ｈ−アミノ酸アナライデー（Ｍｏｄｅ１１２０）及びデ
ータ入手とプロセッシングユニットＭｏｄｅ１９００を
備えた自動パルス液ガス相蛋白質マイクロ配列分析機（
Ｍｏｄｅ１４７５）（全てＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ
ａｔｅｍ工ｎｃ、　Ｐｏ５ｔｅｒＱｉｔ７．　ＱＡ、　
［Ｔ、８Ａ　）でＩｇｍａｎ分解繰返シサイクルに付し
た。コンぎニーターで得られる配列ななまデータと比較
し、必要に応じて修正した。配列データを確認するため
、それぞれ独立に３回分析を実施した。最初の収率は４
０％以上であり、このことは、調製物中の主要蛋白質（
２７）ｃＤａバンド）は得られる配列と関連しているこ
とを示している。

ＴＮＦ抑制蛋白質のＮ−末端配列は、以下に示すアミノ
酸配列を有している。

１４番目のアミノ酸は同定されなかった。４番目のシス
ティン残基については、その存在は理論的である。なぜ
なら、ＰＴＨ’（フェニルチオヒダントイン）　ａｙｇ
がそのように同定できず、池のアミノ酸残基はこの位置
では検出されなかったためである。

ＰＡ８ＴＰ　ｆｌｉによるＮａｔｉｏｎａｌ　ＢｉＯｍ
ｅ（ＬｉＣａｌＲｅ（１６）ａｒａｈ　ＰＯｕｎｄａｔ
ｌｏｎ蛋白質ライブ２リー（Ａ１６まで］のコンぎニー
ターサーチでは、公知の蛋白質と有意な相同性を示さな
かった。

４、　　ＴＮＸＰ抑制蛋白質の遺伝子工学更に本発明は
、本発明のＴＮＦ抑制蛋白質をコードするヌクレオチド
配列を含むＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を含む複製可能な
発現ベクター、該ベクターによって形質転換された宿主
に関する。こコテ言つ１ＤＮＡ分子”トハ、ｒ　／　Ａ
　ＤＮＡ、　ＣＤＮＡ。

合成りＮＡ及びそれらの組合わせを含む意味である。

ＴＮＰ抑制蛋白質のクローニングはいくつかの異なる方
法によって実施することができる。七の１つのアプロー
チは、ＴＮＰ抑制蛋白質に対して特異的抗体Ｃポリクロ
ーナル又はモノクローナル】を得、これを用いてＴＮＦ
抑制蛋白質のＱＤＮＡをクローン化する方法である。こ
のアプローチは以下に示す６つの工程からなる。

（ａ）、抗体の調製 ＴＮＦ抑制蛋白質に対する抗体は以下のいずれかの方法
を用いることにより得られる。ａち、本発明の実質的に
精製されたＴＮＦ抑制蛋白質を用いる方１ｉ：ＴＮＦ抑
制蛋白質の知られた配列、例えばＮ−末端配列などと同
じ１つまたはその以上の合成ペゾチＶを用いる方法：あ
るいは、　ＴＮＰ抑制蛋白質のアミノ酸配列から推定さ
れる可能なヌクレオチド配列の１つをプロティンＡをコ
ードする遺伝子と融合しＥ、　ｃｏｌｉにてプロティン
Ａ−ＴＩＪＰ’抑制蛋白質融合体を発現せしめることに
よる方法によって得られる。

ポリクローナル抗体な得るには、実質的に精製されたＴ
１Ｊ１１′抑制蛋白質又はその合成ペゾチドを担体蛋白
質に納会したものをラビットに注射する。

モノクローナル抗体を得るには、プロティンＡ−ＴＮＦ
抑制蛋白質融合合成遺伝子なｌｉｉ、００１にて発現せ
しめ、生成する照会蛋白質な工ｇ（）セファロースカラ
ムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精
製しマウスに注射する。あるいは、本発明の実質的［！
製されたＴＮＦ抑制蛋白質をマウスに直接注射する。

（ｂ）、ＴＮＦ抑制蛋白質産生細胞のアッセイＴＮＦ抑
制蛋白質に対する抗体を用いて、螢光抗体法又はウェス
タンプロット法によりＴＮＦ抑制蛋白質産生細胞を捜す
。

（ｃ）、産生細胞からのＣＤＮＡの調製ＴＮＦ抑制蛋白
質産生細胞からＩｎＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用い
てＱＤＮＡを調製する。得られるＣ　ＤＮＡなλｇｔ１
１などの発現ベクターにクローン化し、抗体を用いてス
クリーニングする。λｇｔ１１発現ベクターは、そのβ
−がラクトシダーゼ終止コドンから５６塩基上流の非反
復ＥＩＱＲ工部位に７　ｋｂまでのＤＮＡを挿入するの
に用いることができる。従って、゛外来配列ＤＮＡをこ
の部位に挿入し、適当な条件下で照会蛋白質として発現
することができる。λｇｔ１１発現ベクターは、抗体プ
ローブを用いたスクリーニングを行な５　ｃＤＮＡライ
ブラリーの構築にｔ￥ｆに有用である（　Ｈｕｙｎｈ、
　Ｔ、　Ｖ。

ａｔ　ａｌ、　：　Ｄａ、ｖｉｄ　Ｇｌｏｖｅｒ　Ｃｅ
ｄ、　）、　ＤＮＡ　ＯｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ　：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ
、工ＲＬｐｒｅｓｓ、ｏｘｆｏｒｄ　（１９８４）　ｐ
Ｐ−４９−７８）。

他の１つの方法では、ＴＮＦ抑制蛋白質の断片の配列、
例えばＮ−末端アミノ酸配列などから得られる配列を有
する合成オリゴヌクレオチド又はその混合物を調製し、
このオリがヌクレオチド又はそのその混合物を、　ＴＮ
Ｆ抑制蛋白質をコードするゲノムＤＮＡ又はＯＤＮＡを
クローニングするだめのプローブとして用いる。

ゲノムＤＮＡには天然に生じるイントロンが含まれる楊
会もあり含まれない場合もある。ゲノムＤＮＡは、ガえ
ば、適当な細胞から抽出し公知の方法によりｆＩｖｌ！
１シて得ることができる。ヒトゲノムＤＮＡなどの好適
なりＮＡ調製物は、制限酵素によって酵素的に開裂する
ことができ、またランダムに切ることができ、得られる
断片は遺伝子２イブラリ゛−を構築するために適当な組
換えベクターに挿入される。次いで、得られるベクター
は、本発明のＴＮＦ抑制蛋白質をコードする配列を同定
するために合成オリゴヌクレオチドプローブでスクリー
ニングすることができる。

あるいはまた、　ｍＲＮＡを本発明の’ｒｌｌｌＦ抑制
蛋白質を発現する細胞から単離し、これを用いて公知の
方法により０ＤＮＡを調製することができる。得られる
ＣＤＮＡは、２本鎖に変換後、クローン化し、得られる
クローンについて、適当なプローブを用いて目的とする
配クリなコードする（！ＤＮＡであるか否かをスクリー
ニングする。目的とするクローンが単離されると、ゲノ
ムＤＮＡと実質的に同様の方法により（！　ＤＮＡを増
輸する。しかしながら、０ＤＮＡの場合にはイントロン
や介在配列は存在しない。

プローブとして用いるオリゴヌクレオチドを合成するた
めに、インタフ）　ＴＮＦ抑制蛋白質の配列分析を実施
するか、あるいはそのペプチド断片を得そのアミノ酸配
列のｔ￥ｆ徴付けを行なうことができる。ペプチド断片
を得るには、精製された蛋白質調製物を、公知の方Ｅｌ
ｉ　（０１ｋｅ、　Ｙ、　ａｔ　ａｌ。

（１９８２）　、Ｔ、Ｂｉｏｌ、Ｏｈｅｍ、　２５７　
：　９７５１−９７５８］により、例えばトリプシン、
キモトリプシン、パパインなどのプロテアーゼを用いた
消化などのフラグメンテーションに付す。消化により得
られるペプチド断片な逆相Ｈ１ａＯで分離し、自動アミ
ノ酸配列分析法により配列決定を行なう。

前記したように、ＴＮＦ抑制蛋白質のＮ−末端部分の最
初の１６個のアミノ酸罠対応する配列を、自動配列分析
機を用いて決定した。そして以下に示すアミノ酸配列が
得られた。

１つまたはそれ以上の適当なペプチド断片の配列が決定
され、または蛋白質の部分配列が決定されたら、それら
をコードするＤＮＡ配列について調べる。遺伝子コドン
の縮重により、１つまたはそれ以上のコドンな用いて特
定のアミノ酸をコードすることができ、従って１つまた
はその以上の異なるオリイヌクレオチドを調製すること
ができ、これらのいずれもがＴＮＦ抑制蛋白質ペゾチド
断片をコードすることができる［　Ｗａｔｓｏｎ、　Ｊ
、　Ｄ、　。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　
Ｇｅｎｅ；　３ｒｄ　ｅｄ、　；Ｗ、　Ａ、　Ｂ１９ｎ
ｊａｍｉｎ、工ｎｃ、Ｍｅｎ１ｏ　Ｐａｒｋ、ＯＡ（ｉ
　９７７　Ｌｐｐ。３５６−３５７）。しかしながら、
これらのオリがヌクレオチｒのうち１つだけが、遺伝子
のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含んでい
る。このようなオリゴヌクレオチドが存在しておりそし
てそのオリゴヌクレオチドは他のオリイヌクレオチドが
存在していてもＤＮＡとハイブリダイズすることが出来
るため、単一のオリゴヌクレオチドを用いてペプチドを
コードする遺伝子をクローン化するのと同じ方法で、一
連の未分画のオリゴヌクレオチドをそのまま用いること
ができる。ペプチドをコードするオリデヌクレオチｒ１
あるいはＴＮＦ抑制蛋白質断片をコードすることのでき
る理論的に“最も可能性の高い”配列を含む一連のヌク
レオチｙｔヌクレオチドのセット）を用いることにより
［Ｌａｔｈｅ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）；Ｊ、
　Ｍｏｌθａ、ｎ１ｏ１．１８３　：　１−１２に記載
された１コドン使用ルール”に従い〕、相補性オリゴヌ
クレオチドの配列を同定することが出来、あるいはＴＮ
？抑制蛋白質もしくはその少なくとも１部をコードする
１最も可能性の高い”配列とハイブリダイズすることの
できるヌクレオチドのセットもしくはそのような配列の
セットを同定することが出来る。次いで、このような相
補性配列を含むヌクレオチドを合成し、本発明のＴＮＦ
抑制蛋白質の遺伝子を同定し単離するだめのプローブと
して用いることができる［　Ｍａｎｉａｔｉｄ、　Ｔ、
ｅｔ　ａｍ、ｌＪｏｌｅｃｕｌａｒｏｌｏｎｉｎｇ：　
Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ｃｏｌｄ
　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ。

（１９８２））。

ＴＮＦ抑制蛋白質の断片をコードすることのできる１つ
の適当なオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの
セット（あるいはそのようなオリゴヌクレオチドと相補
性を示すオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチＶの
セット）が上記したようにして同定されるとそれらオリ
ゴヌクレオチドが合成され、次いで、ＤＮＡにハイブリ
ダイズされる。好ましくは目的とする遺伝子を発現でき
る細胞から誘導されたＣｊＤＮＡｇ製物とハイブリダイ
ズされる。そしてかかるハイブリダイズは、好ましくは
、目的とする遺伝子を高レベルで産生する細胞からＲＮ
Ａを抽出し逆転写酵素を用いて対応するＣＤＮＡに変換
すること等によってＣＤＮＡ源が目的とする配列を豊富
に含むようにした後に、行なうのが好い。

核酸のハイブリダイゼーション法は一般的な技術であり
、例えば、Ｍａｎｌａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒｏｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　Ｍａｎｕａｌ　（上記と同じ）：Ｈａｙｍｅｓ、Ｂ、
Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＨ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、工ＲＬＰｒｅｓｓ、　０ｘｆｏ
ｒｄ、　Ｅｎｇｌａｎｄ　（１９ｆ３５　）に記載され
ている。上記したヌクレオチド又はオリイヌクレオチド
のセットのプローブを用いいてハイブリダイゼーション
を行なうことにより、ＣＤＮＡ又はゲノムライブラリー
からハイブリダイズするＤＮＡ配夕１」を同定すること
ができ、次いで、得られるＤＮＡ配列は分析に付されて
、本発明の’ＩＪＦ’抑制蛋白質のコード配列をどの程
度含んでいるか測定される。

同様の方法によって、組織プラスミノ−ｒンアクチベー
ターなどのいくつかのヒト蛋白質の遺伝子がクローン化
されている（　ｐｅｎｎｉｃａ、　Ｄ、ａｔ　ａｌ。

（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ　３０１　：　２１４−２２
１　：）。

上記した方法によって得られる本発明のＴＥＦ抑制蛋白
質をコードするＤＮＡ分子は、−収約方法［Ｍａｎｎｉ
ａｔｉｓθｔ　ａｌ　（上記と同ン〕により、適当に構
築された発現ベクターに挿入される。ホモポリマーチイ
ル化、又は合成りＮＡリンカ−もしくは平滑末端すｐ（
−ジョンを用いた連結化により、２本鎖ＣＤＮＡがプラ
スミドベクターに連結される。

ＤＮＡＩＪガーゼを用いてＤＮＡ分子が連結され、アル
カリホスファターゼ処理によって望ましくない連結が除
かれる。

目的とする蛋白質を発現できるためには、遺伝子発現を
可能にし蛋白質の産生な可能にするように、目的とする
蛋白質をコードするＤＮＡに転写及び翻訳調節領域が結
合された特定のヌクレオチド配列が、発現ベクターに含
まれていなければならない。最初に、遺伝子が転写され
るためには、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプ
ロモーターがその遺伝子の上流に存在していなければな
らず、このプロモーターにポリメラーゼが結合して転写
工程が開始される。このようなプロモーターには各種の
プロモーターが使用でき、これらはそれぞれ相違する効
果Ｃ強力プロモーター及び弱いプロモーターなど）を持
っている。プロモーターは、真核細胞、原核細胞によっ
ても相違する。

本発明で使用されるプロモーターには、例えば、バクテ
リオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ６２２の
β−２クタマーゼ遺伝子のｂ工ａプロモーター　ｐＰＲ
３２５のりａ９ムフエニコールアセチルトランスフエラ
ーゼのＯＡ７７°ｒ２モーターなどの構成（ｃｏｎｓｔ
ｉｔｕｔｉｖｅ　）プロモーター　あるいはバクテリオ
ファージλのメジャーライト及びレフトプロモーター（
ＰＬ及びＲＲ）、１４．Ｃ０１１のｔｒｐ、　ｒｅｃＡ
、　１ａｃＺ、　ｌａｃ工、　ｏｍｐｙ及びｇａｌプロ
モーター、　ｔｒｐ４ａｃハイブリッドプロモーターな
どの誘導プロモーター（Ｇ１１Ｑｋ、　Ｂ、Ｒ，（１９
８７ンＪ、工ｎｄ、ＭｉＣｒＯｂｉＯ１，１：　２７７
−２８２１がある。

ｍＲＮＡの産生社を多くするために強力なプロモーター
を使用する外に、原核細胞にて高レベルの遺伝子発現を
達成するためには、ｍＲＮＡの有効な転写を確かなもの
にすることのできるリポプーム結合部位を使用すること
も必要である。この１つの例が、開始コドンの上流の適
当な位置にあり１６　Ｓ　ＲＮＡの６′−末端配列と相
補性を示すシャイン−ダルが〕配列（８Ｄ配列）である
。

真核生物宿主の場合には、宿主の性質に応じて、異なる
転写及び翻訳調節配列が使用される。これらは、アデノ
ウィルス、ウシパピローマウィルス、シミニアンウィル
スなどのウィルスから誘導できる。これらの場合には、
調節シグナルは；高レベルの発現を有する特定の遺伝子
に関連している。

例工ば、ヘルペスウィルスのＴＫプロモーターｓｖ　４
０初期プロモーター、酵母ｇａｌ　４遺伝子プロモータ
ーなどが挙げられる。抑制及び活性化のいずれもが可能
な転写開始調節シグナルを選ぶこともでき、この場合に
は遺伝子の発現を調節することが可能となる。

本発明のＴＮＦ抑制蛋白質をコードするヌクレオチゾ配
列、及び作動可能なように連結された転写及び翻訳調節
シグナルを含むＤＮＡ分子は、目的とする遺伝子を宿主
細胞のクロモ・戸−ムに組込むことのできるベクターに
挿入される。ＤＮＡ分子をそのクロモシームに安定に組
込んだ細胞は、１つもしくはそれ以上のマーカーによっ
て選択できる。

このマーカーは、発現ベクターを保持する宿主細胞の選
択を可能にするものである。マーカーは、栄養要求性宿
主に対して原栄養性を与えるもの、あるいは抗生物質、
銅などの重金属等の抗微生物剤に対して耐性を与えるも
のである。選択マーカー遺伝子は、発現すべきＤＮＡ遺
伝子配列に直接連結してもよく、あるいは−緒にトラン
スフェクトして同じ細胞（導入してもよい。更には、１
本鎖結合蛋白質ｍＲＮＡの合成を最適に行なうためのエ
レメントも必要である。このようなエレメントとしては
、転写プロモーター　エンハンサ−１終止シグナルと共
にスプライスシグナルなどがある。

このようなエレメントを導入した０ＤＮＡ発現ベクター
トシては、例えばＯｋａｙａｍａ、Ｈ，、（１９８３＞
Ｍｏｌ、Ｃｏ１．Ｂｌｏｌ、　３　：　２８０に記載さ
れたものなどがある。

好ましい態様においては、得られるＤＮＡ分子は、宿主
において自己複製可能なプラスミドもしくはウィルスベ
クターに導入される。特定のプラスミドもしくはウィル
スベクターを選択する上で重要な要素は、該ベクターが
導入された細胞が容易に認識され且つ該ベクターが導入
されない細胞から区別して容易に選択できるかというそ
の容易性：宿主細胞において存在する目的とするベクタ
ーのコーー数；及び、異なる種の宿主細胞間でベクター
を望ましく移動できるか否かという点である。

好ましい原核生物ベクターとしては、例えば、１）Ｂ１
０２２　、　ＯＯ’ｌＥ１．　　ｐＳｏ　１０１　、ｐ
ＡＯＹＯＩ　８４などのＥ、０Ｏ１１で複製可能なプラ
スミド（Ｍａｎｉａｔｉｓａｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　Ｏｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙＭａｎｕａｌ　（上記と同じ＞　）　；　ｐｃ１９４
．ｐｃ２２１゜ｐＴ１２７などのバチルスプラスミド（
Ｇｒｙｃｚａｎ。

Ｔ、、　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕ１ａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ
　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ　（１９８２）
　Ｉ　Ｉ）Ｐ−３０７−３２９］　：　ｐ工Ｊ１０１な
どのストレプトマイセスシラスミＷ　（Ｋｅｎｄａｌｌ
、　Ｌ　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、。

（１９８７）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　ｉ　６９
　：　４１７７−４１８３］　：φ０６１などのストレ
ゾトマイセスバクテリオ７アーゾ［ｃｈａｔｅｒ、　Ｋ
、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、　＊５ｉｘｔｈ　ｌ：ｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａ：ｌ　ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ａｃ
ｔｌｎｏｍｙ−ｃｅｔａｌｅｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ａ
ｋａｄｅｍｉａｉ　ＫａｉｄＯ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ。

Ｈｕｎｇａｒ５’（１９８６）、　１）Ｉ）＝　４５−
５４］　＃’／ニードモナスプラスミド（Ｊｏｈｎ、　
Ｊ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、　。

（１９８６）　Ｒｅｖ、工ｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｅ、　８
　：　６９３−７０４　　）；　　工ｚａｋｉ、＋、　
　Ｋ、　　（１９７８）　　：ｒｐｎ、：ｒ。

Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、　３６：　７２９−７４２　］な
どがある。

好ましい真核原物シラスミＶとしては、例えばＢＰＶ、
７クシニア、Ｓσ４０，２−ミクロンサークル、これら
の誘導体などが挙げられる。このよ５なプラスきドはよ
く知られたものである［　Ｂｏｔａｔｅｉｎ、　ｐ、　
ｅｔ　ａｍ、　（１９８２）　ＭｉａｍｉＷｉｎｔ、　
８ｙｍｐ、　１９　：　２６５−２７４　；　Ｂｒｏａ
ｃｈ。

Ｊ、Ｒ，、：　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｔｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ　：　１ｉｆｅ　ａｙｃｌｅ　ａｎｄ工ｎｈｅ
ｒｉｔａｎｃｅ。

ａｏｌａ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｔ＋０ｒ
ａｔＯｒ７．　Ｃｏ１ｄ　Ｅｌｐｒｉｎｇｕａｒｂｏｒ
、　ＮＹ、　１）Ｉ）、　４４５−４９０　（１９８１
）；Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、Ｒ，、（１９８２）　□ｅｌ
１２３　：　２０３−２０４　；ＢＯｌｌＯｎ、　Ｄ、
Ｐ、、　ｅｔａ：Ｌ、　（ｉ　９３Ｑ　）：Ｊ、　０１
ｉｎ、　Ｈａｍａｔｏｌ、　０ｎａｏｌ、　１Ｑ　：　
３９−４８；Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｃｅ１ｌ　
Ｂｉｏｌｏｇｙ　：　Ａ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ
Ｔｒｅａｔｉｓｅ、　Ｖｏ：Ｌ、　３　：　Ｇｅｎｅ　
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃｐｒｅｓｓ、
　ＮＹ、　Ｉ）Ｉｌ、　５６３−６０８　（１９８０＞
　）。

構築体を含むベクター又はＤＮＡ配列が発現用に調製さ
れたら、形質転換、トランスフェクション、コンシュデ
ージョン、フロドプラスト融合、エレクトロポレーショ
ン、リン酸カルシウム沈澱、直接マイクロインジェクシ
ョンなどの各種の方法によって、ＤＮＡ構築体は適当な
宿主に導入される。

本発明に用いる宿主細胞は原核細胞又は真核細胞のいず
れでもよい。好ましい原核細胞宿主としては、例えば、
　Ｂ、Ｃ０１１，バチルス、ストレゾトマイセス、シン
イドモナス、サルモネラ、セラチアなどのバクテリア等
がある。最も好ましい原核細胞宿主はＦＪｃｏｌｉであ
る。特に興味あるバクテリア宿主は、例えば、ｍ、ｃｏ
ｌｌＫ　１２株２９４（ＡＴＯＣ３１４４６６）：　Ｌ
ＣＯ１ｉＸ１７６６（ＡＴＯＯ３１５３７）　；　Ｆ、
ｃｏｌｉＷ３１１　Ｑ　（Ｆ−ラムダ−１原栄養性（Ａ
ＴＯＯ２７３２５））；ザルモネラチフイムリウム、セ
ラチアマルセツセンス、各種のプソイドモナスなどの腸
内バクテリア等がある。このような宿主の場合には、蛋
白質はグリコジル化されない。また、原核細胞宿主は、
発現プラスミドのレゾリコーン配列及びコントロール配
列と親和性を有していなければならない。

好ましい真核細胞宿主は、ヒト、モンキー、マウス、チ
ャイニーズハムスター卵巣（ＯＨＯ）ＩＩＩＢ胞などの
哺乳動物細胞であり、これらの細胞は、正確な構成もし
くは正確な部位でのグリコジル化などの、蛋白質分子に
対する翻訳後の修正を行なうことができる。また、酵母
もグリコジル化などの、翻訳後のベプチｒ修正を行なう
ことができる。強力プロモーター配列、及び酵母での目
的とする蛋白質の産生に利用される高コピー数プラスミ
ドを用いた多くの組換えＤＮＡ技術が知られている。酵
母は、クローン化された哺乳動物遺伝子生産物のリーダ
ー配列を認識することができ、リーダー配列を保持した
ペプチド（即ちプレペゾチＶ）を分泌する。

ベクターの導入後、宿主細胞は、ベクターを保有するＭ
Ｍの生育を選択することのできる選択培地で生育される
。クローン化遺伝子配列の発現により、目的とするＴＮ
Ｆ抑制蛋白質又はその断片が産生される。次いで、発現
された蛋白質が、本明細書において記述した精！Ｒ法（
セクション６〕により、あるいは抽出、沈澱、クロマト
グラフィー電気泳動などを用いた他の慣用的方法により
、単離精製される。

本発明の蛋白質を精製するのに好ましく用いることので
きる更なる精製手段は、アフィニティークロマトグラフ
ィーである。この目的のために、ＴＮＦ抑制蛋白質に対
するモノクローナル抗体が調製され、カラム中のデルマ
トリックスに吸着される。組換え蛋白質を含む粗調製物
がカラムに流される。この時に、蛋白質は特異的抗体に
結合し、他方不純物はカラムから流出される。洗浄後、
−もしくはイオン強度を変化させて目的とする蛋白質を
デルから浴出する。

本発明に用いるモノクローナル抗体は、慣用的ハイプリ
ドーマ法［Ｋｏｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｍ、　　（Ｉ　９７
５　）Ｎａｔｕｒｅ　２５６：　４９５　：　ＫＯｈｌ
ｅｒ　ａｔ　ａｍ。

（１９７６）　ｍｕｒ、　、ｒ、工ｍｍｕｎｏ１．６：
　５１１　）によって調製できる。−収約にこの方法は
、目的とする精製蛋白質抗原、又はウシ血清アルブミン
などの適当な担体に結合した目的とする蛋白質のＮ−末
端部分の配列を有する合成ペプチドで動物を免疫化する
工程をその方法の１工程として含んでいる。免疫化され
た動物の牌細胞を単離し、適当なミエローマセルライン
と融合させる。融合後、得られるハイシリドーマ細胞な
ＨＡＴ培地中で維持し、次いでクローン化する。か（し
て得られる）１イブリドーマ細胞をアッセイして、ＴＮ
Ｆ抑制蛋白質と結合する抗体を分泌するクローンを同定
する。

同定後、サスペンションカルチャーで、又は適当な宿主
マウスの腹膜にクローン化細胞を注射して腹水液中で、
目的とするクローン化細胞を大量に生育させる。

免疫吸着カラムを用いたアフィニティー精製法では、こ
のようにして／Ｓイブリドーマから得られそして精製後
カラムに吸着されたモノクローナル抗体は、ＴＮＦ抑制
蛋白質のｎｍに極めて有効である。

５、有用性及び組成物 ＴＮＦ抑制蛋白質、その塩、その機能的誘導体及びその
活性２ラクジヨンは、哺乳動物でのＴＮＦの有害な効果
を中和するために、即ち、過剰なＴＮＦが内因的に形成
されるあるいは外部から投与される状態を処置するため
に使用される。

更に本発明は、薬学的に許容し得る担体、及び活性成分
としての本発明のＴＮＦ抑制蛋白質、その塩、その機能
的誘導体又はその活性フラクションを含む薬学的組成物
に関する。かがる組成物は、敗血性ショック、悪態症、
移植片対宿主反応、リウマチ性関節炎などの自己免疫疾
患等の、内因的なＴＮＦの産生過剰状態に対して使用す
ることができる。投与方法は、同様の薬剤の投与法と同
様であり、そして投与対象者の状態によってその方法は
変動する。即ち、例えば、敗血性ショックの揚会には静
注であり、リウマチ性関節炎の場合には局部注射（１例
えばひざ）あるいは継続点滴などである。本発明の組成
物は、ＴＮＩＰＯ）過剰投与によるＴＮＦ中毒の状態に
使用することもできる。

本発明の薬学的組成物は、蛋白質又はその誘導体と生理
学的に許容し得る担体、安定化剤、希釈剤などと混会す
ることによって調製することか出来、そして例えば投与
用バイアル中で凍結乾燥することにより単位投与形態と
することができる。投与すべき活性化合物の置は、投与
ルート、病気、患者の状態などによって変動する。リウ
マチ性関節炎の炎症状態の場合の局所注射は、敗血性シ
ョックなどの静脈点滴の場合より、より少ないＴＮＦ抑
制抑制蛋白質体重に応じて投与される。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図は、σｌｔｒｏｇｅｌ　ＡＣＡ　４４　’Ｉ”
　ｋ濾過カラムからのＴＮＦ抑制蛋白質の溶出パターン
を示す。 第１Ｂ図は、σｌｔｒｏｇｅｌ　ＡＯＡ　４４デル濾過
に付ず前に水に対して透析した場合のＴＮＦ抑制蛋白質
の浴出パターンを示す。 第２図は、生物の形態を示す写真であり、シクロヘキシ
イミド（ＯＨエバａ）、ＴＮＦ−α−ＯＨ工（ｂ）、あ
るいはＴＮＦ抑制蛋白質とともにＴＮＦ−α−ＯＨ工（
ｃ）で処理したムリンＡ９細胞の形態を示す。 第６図は、ＴＮＦ抑制蛋白質の第２の′ＩＮ製工程の結
果を示す。 第４図は、　ＴＮＦ抑制蛋白質の第６のｆｐｔ製工程の
結果を示す。 第５図は、逆相ＨＰＬ○によるＴＮＦ抑制蛋白質の分離
を示す。 第６図は、各精製工程における活性物質を含むサンプル
を１９Ｄ８　ＰＡＧＦｉで分析した結果を示す写真であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）（ａ）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のレセプターへの
   結合；及び （ｂ）ＴＮＦの細胞毒性効果；を抑制することのできる
   ＴＮＦ抑制蛋白質、その塩、その機能的誘導体、及び／
   又はその活性フラクシヨン。 （２）その粗調製物をＵｌｔｒｏｇｅｌＡＣＡ４４ゲル
   濾過カラムを用いたクロマトグラフィーに付した時に、
   約４０−８０ｋＤａの見掛け分子量を有する請求項１の
   ＴＮＦ抑制蛋白質。 （３）実質的に精製された形態にある請求項１のＴＮＦ
   抑制蛋白質。 （４）実質的に精製された形態にある該蛋白質を還元条
   件下のＳＤＳＰＡＧＥにより分析した時に、約２６−２
   ８ｋＤａの見掛け分子量を有する請求項１又は３のＴＮ
   Ｆ抑制蛋白質。 （５）逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で
   単一ピークとして移動する請求項１又は３のＴＮＦ抑制
   蛋白質。 （６）ヒトＨｅＬａ及びＦＳ１１線維芽細胞の細胞表面
   レセプターにＴＮＦ−αが結合するのを抑制する能力を
   有する請求項１−５のいずれかのＴＮＦ抑制蛋白質。 （７）ムリンＡ９細胞に対するＴＮＦ−αの細胞毒性効
   果を抑制する能力を有する請求項１−６のいずれかのＴ
   ＮＦ抑制蛋白質。 （８）そのＮ−末端部分に以下のアミノ酸配列を有する
   請求項１−７のいずれかのＴＮＦ抑制蛋白質：【遺伝子
   配列があります】 （式中、Ｘは同定されていないアミノ酸残基を示し、４
   番目の位置のＣｙｓの存在は理論的に裏付けられている
   ）。 （９）実質的に精製されたＴＮＦ抑制蛋白質の製造法で
   あつて、 （ａ）、ヒト尿の透析濃縮物から粗蛋白質画分を回収し
   ； （ｂ）、上記工程（ａ）で得られる粗蛋白質画分をイオ
   ン交換クロマトグラフィーに付して、ＴＮＦのレセプタ
   ーへの結合及びＴＮＦの細胞毒性効果を抑制できる能力
   によつて規定されるＴＮＦ抑制蛋白質の部分精製活性画
   分を得； （ｃ）、上記工程（ｂ）で得られる部分精製活性画分を
   逆相高圧液体クロマトグラフー（ＨＰＬＣ）に付して、
   ＴＮＦのレセプターへの結合及びＴＮＦの細胞毒性効果
   を抑制できる能力によつて規定されるＴＮＦ抑制蛋白質
   の実質的に精製された活性画分を得；次いで（ｄ）、上
   記工程（ｃ）の実質的に精製された蛋白質であつて、還
   元条件下のＳＤＳ　ＰＡＧＥで見掛け分子量が約２６−
   ２８ｋＤａであり逆相ＨＰＬＣで単一ピークとして移動
   し、ＴＮＦのレセプターへの結合及びＴＮＦの細胞毒性
   効果を抑制できる能力を有する蛋白質を回収する； ことを含む上記製造法。 （１０）工程（ｂ）のイオン交換クロマトグラフィーを
   、カルボキシメチルセフアロース、Ｍｏｎｏ　Ｓ　ＨＲ
   ５／５ＦＰＬＣ及びＭｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ　５／５　ＦＰ
   ＬＣを用いて好ましくはこの順序で３工程で行なう請求
   項９の製造法。 （１１）工程（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の画分の活性を
   、ヒトＨｅＬａ及びＦＳ１１線維芽細胞の細胞表面レセ
   プターへのＴＮＦ−αの結合を抑制するＴＮＦ抑制蛋白
   質の能力によつて規定する請求項９の製造法。 （１２）工程（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の画分の活性を
   、ムリンＡ９細胞に対するＴＮＦ−αの細胞毒性効果を
   抑制するＴＮＦ抑制蛋白質の能力によつて規定する請求
   項９又は１０の製造法。 （１３）請求項９−１２のいずれかによつて製造される
   請求項１又は３のＴＮＦ抑制蛋白質。 （１４）請求項３のヒトＴＮＦ抑制蛋白質。 （１５）組換え蛋白質である請求項１のＴＮＦ抑制蛋白
   質。 （１６）請求項１のＴＮＦ抑制蛋白質をコードするヌク
   レオチド配列を含むＤＮＡ分子。（１７）ヌクレオチド
   配列がゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡである請求項１６のＤ
   ＮＡ分子。（１８）請求項１６のＤＮＡ分子を保持し、
   形質転換宿主細胞にて請求項１−８のいずれか又は請求
   項１５のＴＮＦ抑制蛋白質を発現することのできる複製
   可能な発現ベクター。（１９）請求項１８の複製可能な
   発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 （２０）請求項１９の原核宿主細胞。 （２１）請求項１９の真核宿主細胞。 （２２）（ａ）、請求項１９の形質転換宿主細胞を適当
   な培養培地で培養し；次いで （ｂ）、ＴＮＦ抑制蛋白質を単離する； ことを含むＴＮＦ抑制蛋白質の製造法。 （２３）請求項２２の製造法によつて製造されるＴＮＦ
   抑制蛋白質。 （２４）薬学的に許容し得る担体、及び活性成分として
   のＴＮＦ抑制蛋白質、その塩、その機能的誘導体、又は
   その活性フラクシヨンを含む薬学的組成物。 （２５）哺乳動物におけるＴＮＦの有害な効果を中和す
   るのに使用するためのＴＮＦ抑制蛋白質、その塩、その
   機能的誘導体又はその活性フラクシヨン。 （２６）過剰なＴＮＦが内因的に形成される又は外部か
   ら投与される状態の処置に使用するためＴＮＦ抑制蛋白
   質、その塩、その機能的誘導体又はその活性フラクシヨ
   ン。