JPH02203788A - 自己複製配列ｄｎａ - Google Patents
自己複製配列ｄｎａInfo
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- JPH02203788A JPH02203788A JP1024029A JP2402989A JPH02203788A JP H02203788 A JPH02203788 A JP H02203788A JP 1024029 A JP1024029 A JP 1024029A JP 2402989 A JP2402989 A JP 2402989A JP H02203788 A JPH02203788 A JP H02203788A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は自己複製配列ＤＮＡ、特にＢ細胞系での自己複
製に適した自己複製配列ＤＮＡに関するものである。
製に適した自己複製配列ＤＮＡに関するものである。
（発明の背景）
自己複製配列（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ Ｒｅｐｌｉ
ｃａｔｉｎｇＳｅｑｕｅｎｃｅ、 Ａ ＲＳ ）は真核
生物の染色体が自己複製する際の複製開始点であり、細
胞内で自律的に複製して増殖するＤＮＡ配列である。こ
のＡＲ３を含まないＤＮＡ断片は、細胞内に形質導入さ
れた場合宿主細胞の染色体内に組込まれなければ増殖し
ないのに対し、ＡＲ３を組込んだＤＮＡ断片はエピゾー
ム状態すなわち宿主の染色体に組込まれることなく染色
体外で増殖する。
ｃａｔｉｎｇＳｅｑｕｅｎｃｅ、 Ａ ＲＳ ）は真核
生物の染色体が自己複製する際の複製開始点であり、細
胞内で自律的に複製して増殖するＤＮＡ配列である。こ
のＡＲ３を含まないＤＮＡ断片は、細胞内に形質導入さ
れた場合宿主細胞の染色体内に組込まれなければ増殖し
ないのに対し、ＡＲ３を組込んだＤＮＡ断片はエピゾー
ム状態すなわち宿主の染色体に組込まれることなく染色
体外で増殖する。
このＡＲ５について、近年まで酵母で機能するものが報
告されていたが、（Ｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｏ
ｌ。
告されていたが、（Ｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｏ
ｌ。
ｃｅｌｌ、 Ｂｉｏｌ５．３．１８９８−２００８．
（１９８４） ） 、高等補乳動物のＡＲ５は発見さ
れていなかった。
（１９８４） ） 、高等補乳動物のＡＲ５は発見さ
れていなかった。
本発明者はマウス細胞で機能するマウスＤＮＡ由来のＡ
Ｒ５（ｐＡＲ３６５）を初めて見出しくＡｒｉｇａ ｅ
ｔ ａｌ、 Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、、７．
ｌ−６，（１９８７））、このＡＲ３がラット、ヒト
などの異種細胞でも機能することが報告した（Ｉｇｕｃ
ｈｉ−Ａｒｉｇａｅｔ ａｌ。
Ｒ５（ｐＡＲ３６５）を初めて見出しくＡｒｉｇａ ｅ
ｔ ａｌ、 Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、、７．
ｌ−６，（１９８７））、このＡＲ３がラット、ヒト
などの異種細胞でも機能することが報告した（Ｉｇｕｃ
ｈｉ−Ａｒｉｇａｅｔ ａｌ。
ＥＭＢＯＪ、、 ６．２３６５−２３７１． （１９８
７））。さらに発明者はヒト前骨髄細胞性白血病細胞株
ＨＬ−６０からもｃ−ｍｙｃ蛋白と結合するＤＮＡ配列
がＡＲ３（ｐＨＬｍｙｃ）であること、さらにヒトｃ−
ｍｙｃ遺１云子上流域のＨｉｎｄｌｌｒ −Ｐ ｓｔ
Ｉ領域にＡＲ５が存在し、このＡＲ３がマウスＡＲ３（
ｐＡＲ３６５）やヒトＡＲ３（ｐＨＬｍｙｃ）と相同性
があり、ＡＲ３には種特異性の無いことを明らかにして
いる（特開昭６３−１８５３８６．対応欧州特許出願の
公開公報： Ｅ Ｐ Ｏ，２５４，３１５Ａ ２ ）。
７））。さらに発明者はヒト前骨髄細胞性白血病細胞株
ＨＬ−６０からもｃ−ｍｙｃ蛋白と結合するＤＮＡ配列
がＡＲ３（ｐＨＬｍｙｃ）であること、さらにヒトｃ−
ｍｙｃ遺１云子上流域のＨｉｎｄｌｌｒ −Ｐ ｓｔ
Ｉ領域にＡＲ５が存在し、このＡＲ３がマウスＡＲ３（
ｐＡＲ３６５）やヒトＡＲ３（ｐＨＬｍｙｃ）と相同性
があり、ＡＲ３には種特異性の無いことを明らかにして
いる（特開昭６３−１８５３８６．対応欧州特許出願の
公開公報： Ｅ Ｐ Ｏ，２５４，３１５Ａ ２ ）。
また発明者は、このＡ ＲＳ （ＨｉｎｄｌｌＩ −Ｐ
ｓｔＩ領域）含有プラスミドを動物胚細胞に１大した
ところ、このプラスミドがエピゾーム状態すなわち染色
体に組込まれることなく自律複製して安定に保持される
ことが見い出し、ウィルスベクターによらないプラスミ
ドによる遺伝子導入動物を作製している（特願昭６３−
１６６９９２）。
ｓｔＩ領域）含有プラスミドを動物胚細胞に１大した
ところ、このプラスミドがエピゾーム状態すなわち染色
体に組込まれることなく自律複製して安定に保持される
ことが見い出し、ウィルスベクターによらないプラスミ
ドによる遺伝子導入動物を作製している（特願昭６３−
１６６９９２）。
このようにＡＲ３は導入プラスミドの大量複製、目的ペ
プチドの大量発現を可能とし、しかも宿主染色体ＤＮＡ
の損傷がない遺伝子導入動物の作製を可能にするもので
ある。
プチドの大量発現を可能とし、しかも宿主染色体ＤＮＡ
の損傷がない遺伝子導入動物の作製を可能にするもので
ある。
このＡＲ３について、発明者はさらに、ヒトｃ−ｍｙｃ
遺伝子上流域の旧ｎｄｌｌｌ −Ｐ ｓｔ Ｉ領域の特
定領域にＡＲ３とエンハンサ−機能が存在し、ＡＲ３は
自己複製の開始点となるばかりか、エンハンサ−機能と
同−或いは非常に近接した機能を有していることも明ら
かにしている（特願昭６３−２８４６４１）。
遺伝子上流域の旧ｎｄｌｌｌ −Ｐ ｓｔ Ｉ領域の特
定領域にＡＲ３とエンハンサ−機能が存在し、ＡＲ３は
自己複製の開始点となるばかりか、エンハンサ−機能と
同−或いは非常に近接した機能を有していることも明ら
かにしている（特願昭６３−２８４６４１）。
今回発明者は、エンハンサ−としてよく解析されている
マウスイムノグロブリンＨ鎖遺伝子中のＪ−Ｃイントロ
ン内に存在するエンハンサー部位について検討した結果
、その特定領域にＡＲ５が存在することを確認した。本
発明はこのような知見に基づきなされたものである。
マウスイムノグロブリンＨ鎖遺伝子中のＪ−Ｃイントロ
ン内に存在するエンハンサー部位について検討した結果
、その特定領域にＡＲ５が存在することを確認した。本
発明はこのような知見に基づきなされたものである。
（発明の目的）
すなわち本発明は、Ｂ細胞系において、宿主染色体外で
の自己複製による導入遺伝子の大量複製を可能とし、そ
れによるイムノグロブリンやその他の目的ペプチドを効
率よく大量生産することができる自己複製配列（ＡＲ３
）ＤＮＡを提供することを目的とする。
の自己複製による導入遺伝子の大量複製を可能とし、そ
れによるイムノグロブリンやその他の目的ペプチドを効
率よく大量生産することができる自己複製配列（ＡＲ３
）ＤＮＡを提供することを目的とする。
また本発明は、この自己複製配列ＤＮＡにより目的ペプ
チドを発現するプラスミド及び晴乳動物細胞、さらにそ
の使用方法を提供することも目的とする。
チドを発現するプラスミド及び晴乳動物細胞、さらにそ
の使用方法を提供することも目的とする。
（発明の構成）
このような本発明の目的は、イムノグロブリンＨ鎖遺伝
子中のＪ−Ｃイントロン内のエンハンサー部分に存在す
る自己複製配列ＤＮＡにより達成される。
子中のＪ−Ｃイントロン内のエンハンサー部分に存在す
る自己複製配列ＤＮＡにより達成される。
このような自己複製配列ＤＮＡとして、マウスの場合で
は、マウスイムノグロブリンＨ鎖中のＪ−Ｃイントロン
内のエンハンサー部分のＸｂａＩ−ＸｂａＩ領域（塩基
数的９６０）のＤＮＡ配列、同じ（エンハンサー部分の
ＰｓｔＩ −ＥｃｏＲＩ領域（塩基数３０３）のＤＮＡ
配列、同じく、エンハンサー部分のＰｓｔＩ−ＸｂａＩ
領域（塩基数的６００）のＤＮＡ配列が挙げられる。
は、マウスイムノグロブリンＨ鎖中のＪ−Ｃイントロン
内のエンハンサー部分のＸｂａＩ−ＸｂａＩ領域（塩基
数的９６０）のＤＮＡ配列、同じ（エンハンサー部分の
ＰｓｔＩ −ＥｃｏＲＩ領域（塩基数３０３）のＤＮＡ
配列、同じく、エンハンサー部分のＰｓｔＩ−ＸｂａＩ
領域（塩基数的６００）のＤＮＡ配列が挙げられる。
すなわち発明者は、パーキット・リンパ腫細胞ＢＬ２２
（ＩｇＭ産生細胞として、またｃ−ｍｙｃ蛋白の産生が
非常に多いことで知られている）の第１４染色体の遺伝
子Ｂ Ｌ ２２１４Ｑ”が、第１図に示すようにその後
半部はｃ−ｍｙｃ遺伝子のエクソン部分と同じであるの
に対し、その前半部はｃ−ｍｙｃ遺伝子のエンハンサ−
の代わりにＩｇ−Ｈ鎖遺伝子のエンハンサ−を備えてい
ること（Ｂａｔｔｅｙ ｅｔ ａｌ、 Ｃｅ１ｌ、 ３
４．７７９−７８７． （１９８３１）に着目し、Ｉ
ｇ−Ｈ鎖遺伝子のμスイッチ領域上流のＪ−Ｃイントロ
ン内のエンハンサー部分にＡＲ８が存在することを確認
し、本発明を完成したものである。
（ＩｇＭ産生細胞として、またｃ−ｍｙｃ蛋白の産生が
非常に多いことで知られている）の第１４染色体の遺伝
子Ｂ Ｌ ２２１４Ｑ”が、第１図に示すようにその後
半部はｃ−ｍｙｃ遺伝子のエクソン部分と同じであるの
に対し、その前半部はｃ−ｍｙｃ遺伝子のエンハンサ−
の代わりにＩｇ−Ｈ鎖遺伝子のエンハンサ−を備えてい
ること（Ｂａｔｔｅｙ ｅｔ ａｌ、 Ｃｅ１ｌ、 ３
４．７７９−７８７． （１９８３１）に着目し、Ｉ
ｇ−Ｈ鎖遺伝子のμスイッチ領域上流のＪ−Ｃイントロ
ン内のエンハンサー部分にＡＲ８が存在することを確認
し、本発明を完成したものである。
このＡＲ３はエンハンサ−領域と互いにｃｉｓに作用し
く同じ遺伝子に重複して存在し）、イムノグロブリンが
選択的に発現するＢ細胞系における染色体外での複製を
可能にするものである。
く同じ遺伝子に重複して存在し）、イムノグロブリンが
選択的に発現するＢ細胞系における染色体外での複製を
可能にするものである。
従って、任意の目的ペプチドをコードする遺伝子、プロ
モーターを選択して本ＡＲ３含有プラスミドを構築すれ
ば、トランスフェクトした導入細胞（特にＢ細胞系）内
でプラスミドの形で増殖し、目的ペプチドを効率よく生
産することができる。
モーターを選択して本ＡＲ３含有プラスミドを構築すれ
ば、トランスフェクトした導入細胞（特にＢ細胞系）内
でプラスミドの形で増殖し、目的ペプチドを効率よく生
産することができる。
生産する目的ペプチドは特に限定されず、任意のものを
選択することができる。例えば、インターフェロンやイ
ンターロイキンなどのリンホカイン類、インシュリン、
成長ホルモン、ヒト組織プラスミノーゲン、その地番種
酵素などのペプチド、蛋白、糖蛋白等の医薬等を挙げる
ことができる。ただし、本発明のＡＲ３はＢ細胞系の細
胞内での自己複製に適するものであるから、生産ペプチ
ドとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥなどの各種イムノ
グロブリンやＢ細胞系由来のリンホカイン等がさらに適
している。これらのペプチド遺伝子下流域には翻訳終了
用のポリＡシグナルを配列させるのが好ましい。
選択することができる。例えば、インターフェロンやイ
ンターロイキンなどのリンホカイン類、インシュリン、
成長ホルモン、ヒト組織プラスミノーゲン、その地番種
酵素などのペプチド、蛋白、糖蛋白等の医薬等を挙げる
ことができる。ただし、本発明のＡＲ３はＢ細胞系の細
胞内での自己複製に適するものであるから、生産ペプチ
ドとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥなどの各種イムノ
グロブリンやＢ細胞系由来のリンホカイン等がさらに適
している。これらのペプチド遺伝子下流域には翻訳終了
用のポリＡシグナルを配列させるのが好ましい。
形質転換した細胞内で外来ペプチド遺伝子を発現させる
ためには宿主細胞内に存在する蛋白で発現調節されるこ
とが望ましい。従って、本発明で用いられるプロモータ
ーとしては、宿主細胞内に存在する蛋白によりｍＲＮＡ
転写レベルを調節するようなプロモーターが好ましい０
本発明のＡＲ８はＢ細胞系の細胞内での自己複製に適す
るものであるから、イムノグロブリンプロモーターを用
いるのが特に望ましい、但し本発明は種々の細胞由来の
蛋白で外来遺伝子の発現が調節されるものだけでなく、
外部刺激により調節されるプロモーターを用いてもよい
０例えば、メタロチオネインプロモーターを用いて、細
胞外から投与した重金属により発現するようにしてもよ
い。またウィルスプロモーターを用いて、ウィルス感染
により発現するようにしてもよい。
ためには宿主細胞内に存在する蛋白で発現調節されるこ
とが望ましい。従って、本発明で用いられるプロモータ
ーとしては、宿主細胞内に存在する蛋白によりｍＲＮＡ
転写レベルを調節するようなプロモーターが好ましい０
本発明のＡＲ８はＢ細胞系の細胞内での自己複製に適す
るものであるから、イムノグロブリンプロモーターを用
いるのが特に望ましい、但し本発明は種々の細胞由来の
蛋白で外来遺伝子の発現が調節されるものだけでなく、
外部刺激により調節されるプロモーターを用いてもよい
０例えば、メタロチオネインプロモーターを用いて、細
胞外から投与した重金属により発現するようにしてもよ
い。またウィルスプロモーターを用いて、ウィルス感染
により発現するようにしてもよい。
このようなＡＲ３、目的ペプチド遺伝子、プロモーター
により構築するプラスミド・ベクターには、シグナル配
列を含めてもよい。この場合、生産ペプチドは細胞外に
分泌されるから、その回収、精製が容易になる。
により構築するプラスミド・ベクターには、シグナル配
列を含めてもよい。この場合、生産ペプチドは細胞外に
分泌されるから、その回収、精製が容易になる。
以上のプラスミド・ベクターを構築するための遺伝子操
作は全て慣用技術により行なえる（例えば、Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ ｅｔ ａｌ、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ （１９８２）参照）。
作は全て慣用技術により行なえる（例えば、Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ ｅｔ ａｌ、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ （１９８２）参照）。
このようにして得られたプラスミド・ベクターは、マイ
クロインジェクション法（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌＰ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７７、
７３８０． （１９８０））、レトロウィルスベクタ
ーを用いる方法（Ｗｅｉｓｓ ｅｔａｔ、 Ｍｏ１．Ｂ
ｉｏｌ、ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ ２ｎｄ
ｅｄ、： ＲＮＡＴｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ、 Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ（１９８２） ）やリン酸カルシウム法、リポゾ
ーム法、プロトプラスト融合法などを用いて、種々の哺
乳動物細胞を形質転換することができる。
クロインジェクション法（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌＰ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７７、
７３８０． （１９８０））、レトロウィルスベクタ
ーを用いる方法（Ｗｅｉｓｓ ｅｔａｔ、 Ｍｏ１．Ｂ
ｉｏｌ、ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ ２ｎｄ
ｅｄ、： ＲＮＡＴｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ、 Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ（１９８２） ）やリン酸カルシウム法、リポゾ
ーム法、プロトプラスト融合法などを用いて、種々の哺
乳動物細胞を形質転換することができる。
外来遺伝子を導入する宿主細胞は、ＡＲ５自体が種特異
性を持たないことから、そのＡＲ３由来の細胞の種と同
じである必要はなく、原理的に全ての哺乳動物種の細胞
を形質転換することができる。例えば、ヒト、マウス、
ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウ
マなどの細胞を形質転換することができるが、遺伝子解
析や細胞培養技術の進んでいるマウス又はヒトの細胞を
用いるのが特に好ましい。
性を持たないことから、そのＡＲ３由来の細胞の種と同
じである必要はなく、原理的に全ての哺乳動物種の細胞
を形質転換することができる。例えば、ヒト、マウス、
ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウ
マなどの細胞を形質転換することができるが、遺伝子解
析や細胞培養技術の進んでいるマウス又はヒトの細胞を
用いるのが特に好ましい。
この形質転換細胞を培養して外来遺伝子を発現させるこ
とにより、目的ペプチドを生産させることができる。な
お動物胚細胞を本発明のプラスミド・ベクターで形質転
換して、遺伝子導入動物を作製すれば、動物体細胞内で
目的ペプチドを産生させることもでき、本発明のペプチ
ド生産方法はこのようなものも含む。
とにより、目的ペプチドを生産させることができる。な
お動物胚細胞を本発明のプラスミド・ベクターで形質転
換して、遺伝子導入動物を作製すれば、動物体細胞内で
目的ペプチドを産生させることもでき、本発明のペプチ
ド生産方法はこのようなものも含む。
（実施例）
プラスミドｐ２４βＥに存在するマウスイムノグロブリ
ンＨ鎖遺伝子中のＪ−Ｃイントロン内に存在するエンハ
ンサー部位からＸｂａＩ−ＸｂａＩ領域（約９６０ｂｐ
）を切り出し、これをプラスミドｐＵｃ１１９（ファル
マシア社製）のＸ ｂａ Ｉ部位に挿入してプラスミド
ｐＩｇＥを作製した。
ンＨ鎖遺伝子中のＪ−Ｃイントロン内に存在するエンハ
ンサー部位からＸｂａＩ−ＸｂａＩ領域（約９６０ｂｐ
）を切り出し、これをプラスミドｐＵｃ１１９（ファル
マシア社製）のＸ ｂａ Ｉ部位に挿入してプラスミド
ｐＩｇＥを作製した。
第２図は当該ＸｂａＩ −ＸｂａＩ領域の位置を示す遺
伝子地図である。なおプラスミドｐ２４３Ｅはこの分野
の研究者であれば誰でも自由に入手可能なプラスミドで
ある。またプラスミドｐＩｇＥはｄａｍ” Ｅ、 ｃ
ｏｌｉ ＪＭ８３内で増殖し、このＥｃｏｌｉは微生
物工業研究所に既に寄託されている。
伝子地図である。なおプラスミドｐ２４３Ｅはこの分野
の研究者であれば誰でも自由に入手可能なプラスミドで
ある。またプラスミドｐＩｇＥはｄａｍ” Ｅ、 ｃ
ｏｌｉ ＪＭ８３内で増殖し、このＥｃｏｌｉは微生
物工業研究所に既に寄託されている。
その識別表示基はＥ、ｃｏｌｉ ＩＧＥであり、受託
番号は微工研菌寄第１０５１５号（ＦＥＲＭ Ｐ−１
０５１５）である。
番号は微工研菌寄第１０５１５号（ＦＥＲＭ Ｐ−１
０５１５）である。
この構築プラスミドｐＩｇＥを用いてＡＲＳアッセイを
行なった。すなわち、プラスミドｐＩｇＥをマウスＢリ
ンパ球系細胞Ｎ５−１、ヒトＢリンパ球系細胞Ｒａｊ
ｉ、ヒトＢリンパ球系細胞Ｂａ１ｉ７、マウス乳ガン細
胞ＦＭ３Ａにそれぞれトランスフェクトし、４０時間培
養後ハート法（Ｈｉｒｔ、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ
、、 ２６．３６５−３６９． （１９６７））によ
りプラスミドに対応する低分子量ＤＮＡを抽出した。
行なった。すなわち、プラスミドｐＩｇＥをマウスＢリ
ンパ球系細胞Ｎ５−１、ヒトＢリンパ球系細胞Ｒａｊ
ｉ、ヒトＢリンパ球系細胞Ｂａ１ｉ７、マウス乳ガン細
胞ＦＭ３Ａにそれぞれトランスフェクトし、４０時間培
養後ハート法（Ｈｉｒｔ、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ
、、 ２６．３６５−３６９． （１９６７））によ
りプラスミドに対応する低分子量ＤＮＡを抽出した。
抽出ＤＮＡをＥｃｏＲＩ処理（環状プラスミドを直線上
ＤＮＡにする）した後、Ｄｐｎ ＩまたはＭｂｏＩ処理
し、アガロース電気泳動にがけ、３２Ｐでラベルしたｐ
Ｕｃ１１９をプローブにしてサザーンプロット（Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、 ９３゜
５０３−５１７． （１９７５） ） した。
ＤＮＡにする）した後、Ｄｐｎ ＩまたはＭｂｏＩ処理
し、アガロース電気泳動にがけ、３２Ｐでラベルしたｐ
Ｕｃ１１９をプローブにしてサザーンプロット（Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、 ９３゜
５０３−５１７． （１９７５） ） した。
真核細胞に導入した各プラスミドはｄａｍ” Ｅ。
ｃｏｌｉ内で増殖されたものであり、この大腸菌内では
ＧＡＴＣサイト内のアデニン残基がメチル化される。し
かし真核細胞内にはりメチラーゼは存在しないから、真
核細胞内で新たに複製されたプラスミドＤＮＡはメチル
化されていないはずである。そこでアデニン残基がメチ
ル化されたＧＡＴＣサイトを切断部位とするＤｐｎ Ｉ
と、非メチル化アデニン残基を含むＧＡＴＣサイトを切
断部位とするＭｂｏＩとで、それぞれ抽出ＤＮＡを処理
した。
ＧＡＴＣサイト内のアデニン残基がメチル化される。し
かし真核細胞内にはりメチラーゼは存在しないから、真
核細胞内で新たに複製されたプラスミドＤＮＡはメチル
化されていないはずである。そこでアデニン残基がメチ
ル化されたＧＡＴＣサイトを切断部位とするＤｐｎ Ｉ
と、非メチル化アデニン残基を含むＧＡＴＣサイトを切
断部位とするＭｂｏＩとで、それぞれ抽出ＤＮＡを処理
した。
第３図に示すように、Ｎ５−１、Ｒａｊｉ、Ｂａ１ｉ７
などのＢ細胞系にｐＩｇＥをトランスフェクトした場合
には、抽出ＤＮＡはＤｐｎ Ｉ処理しても泳動度に影響
がなく （Ｄｐｎｌ抵抗性）、ＭｂｏＩ処理により切断
されており（ＭｂｏＩ感受性）、プラスミドｐＩｇＥは
エピゾーム状態で複製されていたことを示していた（第
３図第２，４段）。一方非Ｂ細胞系のＦＭ３ＡではＭｂ
ｏＩ感受性のプラスミドは存在するものの（同第４段最
下レーン）、細胞内増殖により生じるはずのＤｐｎ Ｉ
抵抗性のものは検出できなかった（同第２段最下レーン
）。なおＸｂａＩ −ＸｂａＩ領域を含まないｐＵｃ１
１９はいずれの細胞にトランスフェクトしてもＤｐｎ
Ｉ感受性、ＭｂｏＩ抵抗性を示し自己増殖していないこ
とを示した（第３図第３．５段）。
などのＢ細胞系にｐＩｇＥをトランスフェクトした場合
には、抽出ＤＮＡはＤｐｎ Ｉ処理しても泳動度に影響
がなく （Ｄｐｎｌ抵抗性）、ＭｂｏＩ処理により切断
されており（ＭｂｏＩ感受性）、プラスミドｐＩｇＥは
エピゾーム状態で複製されていたことを示していた（第
３図第２，４段）。一方非Ｂ細胞系のＦＭ３ＡではＭｂ
ｏＩ感受性のプラスミドは存在するものの（同第４段最
下レーン）、細胞内増殖により生じるはずのＤｐｎ Ｉ
抵抗性のものは検出できなかった（同第２段最下レーン
）。なおＸｂａＩ −ＸｂａＩ領域を含まないｐＵｃ１
１９はいずれの細胞にトランスフェクトしてもＤｐｎ
Ｉ感受性、ＭｂｏＩ抵抗性を示し自己増殖していないこ
とを示した（第３図第３．５段）。
このことからＩｇエンハンサ−のＸｂａＩ −ＸｂａＩ
領域にはＡＲ３が存在することがわかった。
領域にはＡＲ３が存在することがわかった。
次にこのＸｂａＩ −ＸｂａＩ領域についてさらに詳細
な検討を行なった。
な検討を行なった。
第４図に示すようにＸｂａＩ−ＸｂａＩ領域をＰｓｔＩ
及び（又は）ＥｃｏＲＩ処理して各断片を得て、これを
前述と同様にｐＵｃ１１９に挿入して各断片含有プラス
ミドを作製し、Ｎ５−１細胞にトランスフェクトしてＡ
ＲＳアッセイを行なった。
及び（又は）ＥｃｏＲＩ処理して各断片を得て、これを
前述と同様にｐＵｃ１１９に挿入して各断片含有プラス
ミドを作製し、Ｎ５−１細胞にトランスフェクトしてＡ
ＲＳアッセイを行なった。
第５図に示すように、ＰｓｔＩ −ＥｃｏＲＩ領域に対
応するプラスミドｐＩ ｇ （Ｐ−Ｅ） 、 Ｅｃ。
応するプラスミドｐＩ ｇ （Ｐ−Ｅ） 、 Ｅｃ。
ＲＩ−ＸｂａＩ領域に対応するプラスミドｐＩｇ（Ｅ−
Ｘ） 、ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ領域に対応するプラスミ
ドｐ Ｉ ｇ （Ｘ−Ｅ） 、 ＰｓｔＩ−ＸｂａＩ領
域に対応するプラスミドｐＩｇ（Ｐ−Ｘ）はいずれもＤ
ｐｎ Ｉ処理抵抗性を示し、各ＤＮＡ領域にはＡＲ３活
性があることがわかった。一方、ＸｂａＩ−ＸｂａＩ領
域の最上流部であるＸｂａＩ−ＰｓｔＩ領域は単独では
ＡＲ５活性を示さなかった。以上の結果から、Ｉｇエン
ハンサ−のＸｂａｒ−ＸｂａＩ領域の内、特にＰｓｔＩ
−ＥｃｏＲＩ領域（３０３ｂｐ） 、 ＥｃｏＲＩ−Ｘ
ｂａＩ領域（約３００ｂｐ）、ＰｓｔＩ−ＸｂａＩ領域
（約６００ｂｐ）がＡＲ５として機能することが明らか
になった。このＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ領域のＤＮＡ配列
を第６図に示す。
Ｘ） 、ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ領域に対応するプラスミ
ドｐ Ｉ ｇ （Ｘ−Ｅ） 、 ＰｓｔＩ−ＸｂａＩ領
域に対応するプラスミドｐＩｇ（Ｐ−Ｘ）はいずれもＤ
ｐｎ Ｉ処理抵抗性を示し、各ＤＮＡ領域にはＡＲ３活
性があることがわかった。一方、ＸｂａＩ−ＸｂａＩ領
域の最上流部であるＸｂａＩ−ＰｓｔＩ領域は単独では
ＡＲ５活性を示さなかった。以上の結果から、Ｉｇエン
ハンサ−のＸｂａｒ−ＸｂａＩ領域の内、特にＰｓｔＩ
−ＥｃｏＲＩ領域（３０３ｂｐ） 、 ＥｃｏＲＩ−Ｘ
ｂａＩ領域（約３００ｂｐ）、ＰｓｔＩ−ＸｂａＩ領域
（約６００ｂｐ）がＡＲ５として機能することが明らか
になった。このＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ領域のＤＮＡ配列
を第６図に示す。
なお図中、５゛末端及び３°末端には、Ｐ ｓｔ Ｉ及
びＥｃｏＲＩの認識・切断部位が示されている。
びＥｃｏＲＩの認識・切断部位が示されている。
以上のＡＲ３はＢ細胞系において選択的に発現し、しか
もエンハンサ−と同−或いは非常に近接した機能を有し
ているものと推測される。
もエンハンサ−と同−或いは非常に近接した機能を有し
ているものと推測される。
従来よりエンハンサ−として良く知られているＳＶ４０
エンハンサ−はＢ細胞系の細胞内では十分には機能せず
また自己複製機能が無いのに対し、本願のＡＲ５／エン
ハンサ−領域はＢ細胞系を用いた遺伝子発現、目的ペプ
チドの生産に適し、この点特に有用である。
エンハンサ−はＢ細胞系の細胞内では十分には機能せず
また自己複製機能が無いのに対し、本願のＡＲ５／エン
ハンサ−領域はＢ細胞系を用いた遺伝子発現、目的ペプ
チドの生産に適し、この点特に有用である。
従って、任意の目的ペプチドをコードする遺伝子、プロ
モーターを選択してＡＲ３含有プラスミドを構築すれば
、トランスフェクトした導入細胞内でプラスミドの形で
増殖し、目的ペプチドをより効率よく生産することがで
きる。またＢ細胞系は細胞内で生産された抗体を細胞外
に分泌するから、本願のＩ ｇ−ＡＲ３を用いれば、目
的ペプチドは細胞外に分泌され、効率良い採取が可能と
なる。さらに、このＡＲ５含有プラスミド・ベクターを
用いて特願昭６３−１６６９９２の方法に従って、遺伝
子導入動物を作製すれば、目的ペプチドは血清内に分泌
されることになるから、目的ペプチドを効率よく採取で
きる。
モーターを選択してＡＲ３含有プラスミドを構築すれば
、トランスフェクトした導入細胞内でプラスミドの形で
増殖し、目的ペプチドをより効率よく生産することがで
きる。またＢ細胞系は細胞内で生産された抗体を細胞外
に分泌するから、本願のＩ ｇ−ＡＲ３を用いれば、目
的ペプチドは細胞外に分泌され、効率良い採取が可能と
なる。さらに、このＡＲ５含有プラスミド・ベクターを
用いて特願昭６３−１６６９９２の方法に従って、遺伝
子導入動物を作製すれば、目的ペプチドは血清内に分泌
されることになるから、目的ペプチドを効率よく採取で
きる。
（発明の効果）
以上のように本発明のＡＲ３は、イムノグロブリンのエ
ンハンサ−領域に存在する自己複製配列（ＡＲ３）であ
り、エンハンサ−と同−或いは近接した機能を有し、Ｂ
細胞系で選択的に機能する。従って、Ｂ細胞系の培養細
胞或いは遺伝子導入動物などにおいて、効率よく目的ペ
プチドを生産することができる。
ンハンサ−領域に存在する自己複製配列（ＡＲ３）であ
り、エンハンサ−と同−或いは近接した機能を有し、Ｂ
細胞系で選択的に機能する。従って、Ｂ細胞系の培養細
胞或いは遺伝子導入動物などにおいて、効率よく目的ペ
プチドを生産することができる。
第１図はヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子、ＢＬ２２のｍｙｃ遺伝
子及びイムノグロブリンＨ鎖遺伝子の制限酵素開裂地図
比較図である。図中、口は非コード・エクソン、園はコ
ード・エクソン、ＰはＰｓｔＩ、ＲはＥｃｏＲＩ、Ｓは
５ｓｔＩ、ＣはＣ１ａＩである。 第２図はイムノグロブリンエンハンサ−領域内にＡＲ３
該当部分の遺伝子地図である。 第３図はｐＩｇＥのＡＲＳアッセイの結果を示すサザー
ンプロットパターン図である。図中、右端が泳動開始端
である。 第４図はＸｂａＩ −ＸｂａＩ領域内の各断片の相対位
置を示す図である。 第５図はＸｂａＩ−ＸｂａＩ領域内の各断片のＡＲＳア
ッセイの結果を示すサザーンプロットパターン図である
。図中、右端が泳動開始端である。 Ｆ２マウスのｐｍｙｃ （）（−Ｐ）体内分布を示すサ
ザーンプロットパターン図である。 第６図はＰｓｔＩ −ＥｃｏＲＩ領域の全ＤＮＡ配列図
である。
子及びイムノグロブリンＨ鎖遺伝子の制限酵素開裂地図
比較図である。図中、口は非コード・エクソン、園はコ
ード・エクソン、ＰはＰｓｔＩ、ＲはＥｃｏＲＩ、Ｓは
５ｓｔＩ、ＣはＣ１ａＩである。 第２図はイムノグロブリンエンハンサ−領域内にＡＲ３
該当部分の遺伝子地図である。 第３図はｐＩｇＥのＡＲＳアッセイの結果を示すサザー
ンプロットパターン図である。図中、右端が泳動開始端
である。 第４図はＸｂａＩ −ＸｂａＩ領域内の各断片の相対位
置を示す図である。 第５図はＸｂａＩ−ＸｂａＩ領域内の各断片のＡＲＳア
ッセイの結果を示すサザーンプロットパターン図である
。図中、右端が泳動開始端である。 Ｆ２マウスのｐｍｙｃ （）（−Ｐ）体内分布を示すサ
ザーンプロットパターン図である。 第６図はＰｓｔＩ −ＥｃｏＲＩ領域の全ＤＮＡ配列図
である。
Claims (10)
- （１）イムノグロブリンＨ鎖遺伝子中のＪ−Ｃイントロ
ン内のエンハンサー部分に存在する自己複製配列ＤＮＡ
。 - （２）マウスイムノグロブリンＨ鎖遺伝子中のＪ−Ｃイ
ントロン内のエンハンサー部分より切り出されたＸｂａ
I −Ｘｂａ I 領域（塩基数約９６０）の自己複製配列
ＤＮＡ。 - （３）マウスイムノグロブリンＨ鎖遺伝子中のＪ−Ｃイ
ントロン内のエンハンサー部分のＰｓｔ I −ＥｃｏＲ
I 領域（塩基数３０３）の自己複製配列ＤＮＡ。 - （４）マウスイムノグロブリンＨ鎖遺伝子中のＪ−Ｃイ
ントロン内のエンハンサー部分のＰｓｔ I −Ｘｂａ I
領域（塩基数約６００）の自己複製配列ＤＮＡ。 - （５）イムノグロブリンＨ鎖遺伝子中のＪ−Ｃイントロ
ン内のエンハンサー部分に存在する自己複製配列と、プ
ロモーター配列と、ペプチド遺伝子とを含有するプラス
ミド。 - （６）前記自己複製配列が、マウスイムノグロブリンＨ
鎖遺伝子中のＪ−Ｃイントロン内のエンハンサー部分の
、 Ｘｂａ I −Ｘｂａ I 領域（塩基数約９６０）、Ｐｓｔ
I −ＥｃｏＲ I 領域（塩基数３０３）又はＰｓｔ I
−Ｘｂａ I 領域（塩基数約６００）のいずれかのＤＮ
Ａ配列であることを特徴とする請求項第５項記載のプラ
スミド。 - （７）イムノグロブリンＨ鎖遺伝子中のＪ−Ｃイントロ
ン内のエンハンサー部分に存在する自己複製配列と、プ
ロモーター配列と、ペプチド遺伝子とを含有するプラス
ミドで形質転換された哺乳動物のＢ細胞系細胞。 - （８）前記自己複製配列が、マウスイムノグロブリンＨ
鎖遺伝子中のＪ−Ｃイントロン内のエンハンサー部分の
、 Ｘｂａ I −Ｘｂａ I 領域（塩基数９６０）、Ｐｓｔ
I −ＥｃｏＲ I 領域（塩基数３０３）又はＰｓｔ I −
Ｘｂａ I 領域（塩基数約６００）のいずれかのＤＮＡ
配列であることを特徴とする請求項第７項記載の哺乳動
物のＢ細胞系細胞。 - （９）イムノグロブリンＨ鎖遺伝子中のＪ−Ｃイントロ
ン内のエンハンサー部分に存在する自己複製配列と、プ
ロモーター配列と、ペプチド遺伝子とを含有するプラス
ミドで哺乳動物Ｂ細胞系細胞を形質転換し、形質転換さ
れた哺乳動物Ｂ細胞系細胞内で前記ペプチド遺伝子を発
現させることを特徴とするペプチド生産方法。 - （１０）前記自己複製配列が、マウスイムノグロブリン
Ｈ鎖遺伝子中のＪ−Ｃイントロン内のエンハンサー部分
の、 Ｘｂａ I −Ｘｂａ I 領域（塩基数約９６０）、Ｐｓｔ
I −ＥｃｏＲ I 領域（塩基数３０３）又はＰｓｔ I
−Ｘｂａ I 領域（塩基数約６００）のいずれかのＤＮ
Ａ配列であることを特徴とする請求項第９項記載のペプ
チド生産方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1024029A JP2880519B2 (ja) | 1989-02-03 | 1989-02-03 | 自己複製配列ｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1024029A JP2880519B2 (ja) | 1989-02-03 | 1989-02-03 | 自己複製配列ｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02203788A true JPH02203788A (ja) | 1990-08-13 |
| JP2880519B2 JP2880519B2 (ja) | 1999-04-12 |
Family
ID=12127093
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1024029A Expired - Fee Related JP2880519B2 (ja) | 1989-02-03 | 1989-02-03 | 自己複製配列ｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2880519B2 (ja) |
-
1989
- 1989-02-03 JP JP1024029A patent/JP2880519B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2880519B2 (ja) | 1999-04-12 |
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