JPH02203793A - ヒト免疫不全ウイルスタイプ１のエンベロープ遺伝子から誘導されたポリペプチドを含むワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 人免疫不全ウィルスタイプ１は、免疫系に特有な病理に
よシ全身感染を生じるレトロウィルスであシ、後天性免
疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因である病因学的病原体
である（Ｂａｒｒｅ−８ｉｎｏｎｓｓｉその他、１９８
３年：　　Ｐｏｐｏｖｉｃ　　その他、１９８４年）。

　ＨＩＶ−１の臨床上の隔離集団は、又、リンパ節障害
疾患関連ウィルス（Ｆｅｏｒｉｎ。

その他、１９８４年）とか、人−Ｔ細胞−白血病ウィル
スＩ　（Ｐｏｐｏｖｉｃ　　その他、１９８４年）とか
、それに、ＡＩＤＳ関連ウィルス（Ｌｅｖｙその他、１
９８４年）とも呼ばれて来た。

ＡＩＤＳは、世界的に流行する様になってしまって、そ
のワクチンを開発する事は、世界の公衆衛生にとって、
主要な優先事項となって来た。ＨＩＶ−１に感染した人
のうち、大多数の人々が、Ｔ　４１Ｊンパ球が消耗する
事が原因で免疫機能を次第に失う現象を示すのである。

これらのＴ４細胞は、成る特定の神経細胞と同様に、そ
の表面に１ＣＤ４と呼ばれる分子を有している。ＨＩＭ
−１は、そのウィルスの粒子のエンベロープに存在する
レセプターによシ、そのＣＤ４分子を認識し、これらの
細胞の中へ入り、その結果として、その細胞を自己複製
して、殺してしまうのである。有効なＡＩＤＳワクチン
というものは、ＨＩＭ−１のエンベロープにくっついて
、Ｔ４！Ｊンハ球、又は、その他の感染し易い細胞に１
そのＨＩＭ−１が感染しない様にする様な抗体を導出す
るものと考えてよいだろう。

ワクチンは、一般的には、健康人が疾病の病原体に曝さ
れる前に、免疫予防措置として与えられるものである。

然し乍ら、病原体く曝された後の免疫処置に、効力のあ
るＡＩＤＳワクチンを用いる事を、その病気に対する免
疫療法であると考えるのも、又、−理がある、（５ａｌ
ｋ　、　１９８７年）。

ＨＩＶ−１の！ンベｏ−プは、ＡＩＤＳワクチンの開発
に於て、将来最も有望な候補であると広く信じられてｂ
る（　Ｆｒａｎｅｉｓ　　及びＰｅｔｒｉｅｃｉａｎｉ
、　　１９８５年；　　Ｖｏｇｔ及びＨｉｒｓｈ、　１
９８６年；　　ＦａｕｃＬ　１９８６年）。

ＨＩＶ−１のエンベロープの蛋白質は、最初は、分子量
が１６０，０００の糖蛋白質（ｇｐ１６０）として合成
される。然る後、このｇｐ１６０という前駆物質は、分
裂して、分子量が１２０，０００の外面糖蛋白質（ｇｐ
１２ｏ）と分子量が４１．０００の膜内外の糖蛋白質（
ｇｐ４１）とＫなる。これらのエンベロープ蛋白質は、
ＡＩＤＳ患者の中の抗体にとっての主な目標抗原である
（’　Ｂａｒｌｎ　　その他、１９８５年）。天然のＨ
ＩＶ−１ｇｐ１２０　　は免疫原であり、ねずみ類、山
羊類、赤毛猿類、及び、チンパンジー類中に、減殺性抗
体を誘発する事が可能とｔＡ５事が分って来た（　Ｒｏ
ｂｅ７　ｖその他、１９８６年）。

感染した細胞中に天然のＨＩＶ−１エンベロープ蛋白質
が非常に少ない事と、ＨＩＶ−１に感染した細胞からＡ
ＩＤＳワクチンを調製するのに危険が伴う事という理由
によって、ＡＩＤＳワクチンとして用いる為ＫＨＩＶ−
１エンベロープ抗原を製造するのに、組換えＤＮＡ法が
今迄採用されて来た。組換えＤＮＡ技法は、ＡＩＤＳサ
ブユニットワクチンを製造するには最良の選択を示す様
に思われる。というのは、安全にして且つ廉価な免疫原
を大量に製造する事が出来るからである。

遺伝子により部分的に変見られたワクシニアウィルス組
換え体（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔ７その他、１９８６年；
　Ｈｕ　その他、１９８６年；　　Ｋｉｅｎｙ　その他
、１９８６年）、細菌の細胞（Ｐｕｔｎｓｙ　　その他
、１９８６年）、哺乳類動物の細胞（Ｌａｎｋｙその他
、１９８６年）、及び、昆虫の細胞の中で、ＨＩＭ−１
エンベロープは、蛋白質合成されて来た。ＨＩＶ−１ｇ
ｐ４１　　の中のアミノ酸連鎖から得られる合成ペプチ
ドも又、候補のＡＩＤＳワクチンとして、考えられて来
た（　Ｋｅｎｎｅｄ７　　その他、１９８６年） 組換えＨＩＭ−１エンベロープ蛋白質を製造するのに、
桿状ウィルス−昆虫細胞のベクターシステムを用いる事
は、１９８６年１０月１６日出願の米国特許出願一連番
号９２０，１９７号の同時係属、同時譲渡出願の中で、
開示されている。上に特記した特許出願、ならびに、本
文中に引用する出版物は、本文中に組み込まれて、本明
細書の一部をなしている。

このシステムは、ＨＩＭ−１蛋白質、及び、その他の蛋
白質を製造するのに、総じて役に立つという事が明らか
になって来た。例えば、桿状ウィルスのＡｕｔｏｇｒａ
ｐｈａ　　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　細胞核多角体病ウ
ィルス（ＡａＮＰＶ）は、感染した５ｐｄｏｐｔｅｒａ
　　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　　（シロナヤガ属の夜蛾）
の細胞（ｓｆ９細施）の中で、全長のｇｐ１６０　　及
び　ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子のいろんな部分を発
現させる為のベクターとして周込られて来ている。又、
上に特記した特許出願の中には、切頭ｇｐ１６０遺伝子
（組換え体番号Ａｅ３０４６）、組換え体Ａｃ３０４６
から製造した蛋白質、及び、そのＡｅ３０４６遺伝子生
成物の精製技法も開示されてお）、その技法には、ヒラ
マメのレクチン蔑和カクロマトグラフィーに続いて、ゲ
ル濾過クロマトグラフィーを用いる事が含まれている。

この様にして精製し、そして、凝集させて粒子状とした
ｇｐ１６０蛋白質は、ねずみ及び霊長類の動物に於て、
免疫原性が非常に強い事が発見された。

理想的なＡＩＤＳワクチンは、生物学的に実買上純粋で
あプ、且つ、非発熱性であるという様な必要条件に加え
て、−回乃至数回注射すれば長期間にわた）感染予防が
出来るものでなければならない。之は、通常、減毒した
活きたワクチンの場合の事である。死滅した細菌又はウ
ィルス、或いは、変性毒素又は蛋白質の如く細菌又はウ
ィルスから分離した物質を用すてワクチンを作る時は、
抗体反応が弱くて、はんの短時間だけ免疫が出来るだけ
といった結果になる事が屡々である。ワクチンに於ける
これらの欠陥を克服する為に、助剤と称する追加成分を
加えるが、この助剤は、免疫反応を励起するのを助ける
事が出来るという性質を持っている。人のワクチンに於
て広く周込られる助剤（Ｂｏｍｆｏｒｄ、　１９８５年
）は、アルミニウムの塩類（燐酸アルミニウム又紘水酸
化アルミニウム）のゲルであって、通常、アルミニウム
助剤と称されている。

〔発明の概要〕

組換えＨＩＶ−１ｇｐ１６０蛋白質は、７／Ｉ／ミニウ
ム化合物、例えば、燐酸アルミニウムの様な助材の上に
吸着させると、特にＡＩＤＳワクチンとして、格別役に
立つとい、う事が発見された。

この発明の一つの側面は、組換えクローン番号３０４６
の中で発見されたアミノ酸群１−７５７を取シ囲むＨＩ
Ｖ−１・ｎｖ遺伝子の一部に対して、ＡｅＮＰＶ発現ベ
クターが、遺伝暗号シーケンスを有している事とそのア
ミノ酸連鎖１−７５７によ）遺伝暗号を指定された組換
えＨＩＭ−１エンベロープ蛋白質を、昆虫の細胞の中で
製造する事とである。

この発明の他の側面は、その３０４６蛋白質を生じる桿
状ウィルス組換えウィルスから作りた遺伝子生成物から
、組換えエンベロープ蛋白質粒子を作る事とその３０４
６粒子を燐酸アルミニウムの凝集体に吸着させる事とか
ら成っている。

〔詳細な説明〕

ＨＩＭの外被の蛋白質の１−７５７アミノ酸の遺伝暗号
を指定する切頭ＨＩＶ−１ｇｐｔ６゜遺伝子（組み換え
型Ａｅ３０４６）を含んでいる組み換え型桿状ウィルス
　Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　　細
胞核多角病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）については、ＨＩＶ
−１からの遺伝子又は遺伝子の一部分を含む組み換え型
桿状ウィルスを作る為のクローニング法と共に、米国の
同時係属同時譲渡出願である一連番号９２０，１９７号
の中に記載されている。欠配のものは、Ａｃ３０４６発
現ベクターを作る為に用いられる遺伝子工学方法を詳細
に述べたものである。

次の説明に於て用いた材料は、酵素及び免疫学的試薬を
含めて、市販の供給源から得たものである０ この発明についての実施の詳細を、添附図面を参照にし
て、以下に述べる。即ち、 第１図は、大腸菌のプラスミドｐＮＡ２からＨＩＶ−１
外被遺伝子（ａｎｖ）を隔離培養するのに用いられるク
ローニング法を示している。細斜線を引すた領域がＨＩ
Ｍ−１のＤＮＡ連鎖で、空いた領域がクローニングベク
ターによる本のである。ｐ１７７４の黒色領域は、合成
オリゴヌクレオチドから作られており、ＳｍａＩ−Ｋｐ
ｎｌ断片として導入して、ｐ１６１４のＳｍａＩ−Ｋｐ
ｎＩの部位にしたのである。この合成オリゴヌクレオチ
ドの連鎖が示されているのである。

第２図は、桿状ウィルス発現ベクター　Ａｃ３０４６を
作るのに用いられる組み換えベクター（ｐ３０４６）を
作るのに用いられる方法を図示している。プラスミドｐ
ＭＧＳ３は、桿状ウィルスＡｃＮＰＶからの連鎖（直交
平行線模様をつけた部分）を、ｔｏｏの位置に、クロー
ニング部位のどちらの側にも有している。この部位は、
ＳｍａＬ　ＫｐｎＩ＊及び　ＢｇＩＩＩ　　に対する独
特な制限酵素のエンドヌクレアーゼの部位を有している
。４．００の位置から５′方向には、ＡｅＮＰＶポリへ
ドリンプロモーターがあシ、３′方向には、連鎖５’−
ＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡ−３’があって、この連鎖は、
３個の読み取りフレームの総てに綜訳コドンを有してい
る。プラスミドｐ１７７４の領域と合成オリゴヌクレオ
チドの連鎖の領域とは、第１図に記載した通りである。

プラスミド３０４６は、Ｓｍａ　ＩとＢ　ｇ　ＩＩＩ　
　の部位の間の連鎖以外ＯｐＭＧＳ３Ｏ総てとｐ　１７
７４（７）ＨＩＶ−１外被遺伝子とを包含している。

第３図は、Ａｃ３０４６の遺伝暗号指定連鎖の側面に位
置するＤＮＡのヌクレオチドの連鎖を示している。＋１
　と＋２２６４　との間の３０４６−ａｎマーＤＮＡ連
鎖を第４図に示す。

第４Ａ−４ｋ図は、＋１乃至＋２２６４間のＡｃ３０４
６中のｅｎｖ遺伝子の５′端に於ける合成オリゴヌクレ
オチド連鎖と共に、ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子の切片の実
際のＤＮＡ連鎖を示している。制限酵素エンドヌクレア
ーゼの部位の位置は、ＤＮＡ連鎖の上方に列記してあり
、予測されるアミノ酸の連鎖は、ＤＮＡ連鎖の下方だ列
記しである。基の数は、右及び左に番号をつけである。

第５Ａ−５Ｄ図は、Ａｃ３０４ｇからのｅｎｖ遺伝子の
ＤＮＡ連鎖を、ＬＡＶ−１からの公知のａｎマ遺伝子連
鎖と比較したものである０ＬＡＶ−１の連鎖は上方にあ
り、Ａｃ３０４６は下方にある。ＬＡＹ−１の連鎖の下
にある線（１）は、Ａｃ３０４６の中の連鎖が、この場
所に於ては同一であるという事を示している。用いたＤ
ＮＡ連鎖の番号付けは、Ｗａｉｎ　−Ｈｏｂｓｏｎ　　
その他によってＬＡＶ−ＩＫ対し１９８５年に記述され
たものである。

第６図は、人のＨＩＶ−１抗体が陽性の血清（上方の図
）、及び、ｇｐ１６０（ＩＪ５５゜ＫＬ５５）、又は、
ｇｐ１２０（ＡＢ５５．ＣＤ５５、ＧＨ５５）で免疫化
した動物からのアカゲザルの血清（下方の図）のＥＬＩ
ＳＡ終点稀釈滴定量を示している。ＥＬＩＳＡ滴定量は
、高純度のｇｐ１２０及びｇｐ１６０の蛋白質に対して
測定された。特殊結合の抗体は、山羊の抗人ＩｇＧ−Ｈ
ＲＰ複合体で測定された。テストに於いて、陽性反応を
示す血清のうちで最も高い稀釈度がその滴定量である。

次の例は、この発明の詳細な説明する例である。即ち、 例１ アミノ酸１−７５７に対する遺伝暗号を指定するＨＩＶ
−１連鎖を有する桿状ウィルスの組み換え型Ａｅ３０４
６の作成 遺伝暗号を指定する異質蛋白質の連鎖を桿状ウィルスベ
クター中にクローニングし発現するには、遺伝暗号を指
定する連鎖がポリヘトリン・プロモーター及び上流の連
鎖と一線に並び、そして、その反対側には、切頭ポリヘ
トリン遺伝暗号指定連鎖と一線に並んで、その結果、桿
状ウィルスのゲノムとの異体同形的組み換えが起こり、
その為に、異質の遺伝暗号指定連鎖がポリヘトリンφプ
ロモーター及び不活性ポリヘトリン遺伝子と一線に並ん
で移転する事になるという事が必要である。

従って、ＡＩＤＳのｅｎｖ遺伝子の構造に於いて用いる
様に、いろんな挿入ベクターが設計された。下記の挿入
ベクターＭＧＳ−３は、ＡＴＧ翻訳開始コドンを供給す
る様に設計された。このベクターの中に、異質の連鎖を
挿入すふには、その開始コドンにより作られた翻訳フレ
ームが異質の連鎖を貫いて正しく保たれる様に処理せね
ばｈらないＯ 挿入ベクターＭＧＳ−３は、精製した血小板ＡｃＭＮＰ
Ｖ隔離集団（ＷＴ−１）から隔離培養したＤＮＡのＥ　
ｃ　ｏ　ＲＩ　−Ｉ制限断片クローンから作られ、そし
て、次の如き構造上の特徴から成る様に設計された。；
即ち、ポリヘトリン遺伝子のＡＴＧ開始コドンから上流
の４０００　　ｂｐの連鎖；部位が指令する突然変異生
成により持ち込まれるポリリンカーであって、対応する
ポリヘトリンの正確な位置にあるＡＴＧ開始コドン、及
び、制限部位Ｓｍａ　Ｌ　Ｋｐｎ　Ｌ　ＢｇＩＩ＋　　
並びに１総てに共通な停止コドンとから成るポリリンカ
ー：ＫｐｎＩ制限部位（ポリヘトリン遺伝子の内部にあ
る）からｓ　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　−Ｉ・クローンの末端
のＥｅｏＲＩ制限部位に迄、つ々がりて延びる１７００
　　ｂｐ　　の連鎖。

例２ ＬＡＶｅｎマ遺伝暗号指定連鎖を有する桿状ウィルス組
み換え個体の作成 ＮＡ−２で表わされる組み換え型プラスミドは、ｐＵＣ
１８の中へ挿入された２１．８ｋｂ　体筒の無傷のＡＩ
ＤＳプロウィルスから成っていた。伝える処では、この
クローンは、成る特定の人細胞のトランスフェクション
を伴うウィルスを生じ得るので、感染性であった。（定
立　その他、１９８６年）。ＮＡ−２の中に含まれてい
る完全な外被遺伝子連鎖は、ＨＩＶのＬＡＶ菌株から得
られた０　（Ｂａｒｒｅ−８ｉｎｏｕａａｉその他、１
９８３年）。

そのＨＩＶ−１外被遺伝子は、下記の如く隔離培養され
、処理された。又、第１図を参照され度い。外被遺伝子
は、最初、３８４６　　ｂｐのＥｃｏ　Ｉ／Ｓａｃ　Ｉ
制限断片としてＮＡ−２から隔離、クローニングしてＥ
ｃｏＲＩ／Ｓａｃ　Ｉ制限部位ｐＵｃ１９　にした。こ
の結果出来たプラスミドをｐ７０８と表現した。続いて
、その外被遺伝子を、２８００　　ｂｐ　０Ｋｐｎ　Ｉ
制限断片として、再び隔離し、クローニングして、Ｋｐ
ｎ　Ｉ制限部位ｐＵｃ１８Ｋした。この結果出来たクロ
ーンをｐ１６１４と表現した。このＫｐｎＩ制限断片は
、外被遺伝子の若干先端が切断された破片を含んでいて
、その為に、１２１ｂＰ　　の末端がＮｌＣＮに相当す
る連鎖が欠けていた。遺伝子中のこの欠けた部分は、暗
号ペプチド連鎖を含んでいて、好ましい量のポリヘトリ
ン遺伝子コドンを用いて、ＬＡＶアミノ酸連鎖から設計
した二重撚りの合成オリゴマーを挿入する事により置き
換えられた。更に操作を容易にする為に１新しいＳｍａ
　Ｉ制限連鎖を、付随的に、ＡＴＧ開始コドンの代りに
入れた。そのＡＴＧ開始コドンは、挿入ベクターにより
将来供給する事にする。この結果出来たプラスミドをｐ
１７７４で表現した。

今、第２図について述べるならば、ｐ１７７４からの制
限断片は、種々の領域のＡＩＤＳ外被の遺伝暗号指定連
鎖を含んでおり、之をクローニングしてＭＧＳベクター
とし、挿入ベクターのＡＴＧ開始コドンが外被遺伝子の
コドンと一緒にフレーム中にある様にする。プラスさド
ベクターｐＭＧ８−３　　のＳｍａ　Ｉ／Ｂ　ｇ　Ｉ　
ＩＩ　　の部位の中へ挿入されたｐ１７７４から隔離培
養されたＳｍａＩ／ＢａｍＨＩ　　制限断片から成るｐ
３０４６を作る。このクローンは、ｇｐ１６０の１乃至
７５７のアミノ酸の遺伝暗号指定連鎖を含んでおり、Ｍ
ＧＳ−３ベクターにより供給される終止コドンを用いる
。

例３ 組み換え桿状ウィルスの調製と選択 ＨＩＶ　　ｅｎマ遺伝子組み換えプラスミドｐ３０４６
は、ＡａＭＮＰＶ　　ＤＮＡ（ＷＴ−１）で、燐酸カル
シウムが沈澱されて、更に、感染していない５ｐｏｎｄ
ｏｐｔｅｒａ　　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　　の細胞に加
えられた。そうすると、異体同形の組み換えにヨリ、キ
メラ遺伝子が、ＡｃＭＮＰＶゲノムの中へ挿入された。

組み換えウィルスは、血小板が吸蔵不能表形態である事
により、正体を確認された。

斯かる血小板は、細胞変性しても、正体を確認し得す結
果を現わし、細胞核の吸蔵を示さない。更に加えて、血
小板の精製を二回続けて実施して、純粋な組み換えウィ
ルスを得た。ＨＩＶのｅｎマ連鎖が特定の部位に挿入さ
れた事について、組み換えウィルスのＤＮＡを解析する
には、その制限特性と雑種形成特性とを、野性タイプの
ウィルスのＤＮＡと比較する事によった。

例４ 感染した昆虫細胞の中の組み換え桿状ウィルスからのＨ
ＩＶ　　ｅｎｖの発現 昆虫の細胞の中の組み換えウィルスからＨＩＶａｎｙ連
鎖が発現する事は、ポリへドリンプロモーターより下流
の発現ベクターのＡＴＧ開始コドンから、遺伝暗号を指
定された総てのアミノ酸を含めて前駆蛋白質の形で初期
翻訳生成物が合成されているという事になるのが当然で
ある。この初期の生成物は、組み換えベクターてより供
給されたコドンから翻訳されたアミノ酸群から成り立っ
ているであろう。Ａｃ３０４６の初期翻訳生成物は、末
端では、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−ＧｌＦ−Ａｒｇ−Ｖａ　ｌと
読むのが当然であり、その場合、Ａｒｇ（位置４）は、
元のＬＡＹクローンに於ては、位置２のＡｒｇである。

そのＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇ１７コドンは、クローニング法
を行った結果として供給される。

例５ ｇｐ１６０内挿、側面並置ＤＮＡのヌクレオチド連鎖 ｇｐ１６０内挿、側面並置ＤＮＡのヌクレオチド連鎖は
、ウィルス性発現ベクターＡｃ３０４６のＤＮＡから隔
離培養した制限断片から決定された。配列を決めるには
、次のステップが必要であった。８．９ｋｂｐ　　のＥ
ｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩの断片の精製を行うには、Ａ　ｃ
　３０４６ウイルスのＤＮＡを制限消化する事に依った
。Ａ　ｃ　３０４６ウイルスのＤＮＡは、ワクチンの生
産ロフトに対し用いられている培養基に存在する細胞外
ウィルスから２迄調製されて来た。

第２図に示す様に、８．９　　ｋｂｐのＥｃｏＲＶ−Ｂ
ａｍＨＩの断片は、完全無傷なｇｐ１６０遺伝子と１０
０　ｂｐの上流側置皿ｆｉｔＤＮＡと約１０００　ｂｐ
の下流側面並置ＤＮＡとから成り立っている。その中で
、１００　ｂｐの上流側面並置ＤＮＡと１００　ｂｐの
下流側面並置ＤＮＡとを含めて、完全無傷のｇｐ１６０
遺伝子のヌクレオチド連鎖を測定した。

簡単に云うと、配列法めを行った結果、クローニング法
から予測されたキメラ構造が明らかになった。ｇｐ１６
０の連鎖は、本質的圧は、Ｗａ　ｉ　ｎ−Ｈｏｂａｏｎ
その他（１９８５）が報告したのと同じであった。真実
と推定される翻訳開始コドンと翻訳終了コドンとの間の
２２５３基の連鎖は、７５１のアミノ酸コドンと２８の
可能性のあるＮ結合糖蛋白質化部位とを予言している。

ｇｐ１６０の推定分子量は、糖残分を含めて、約１４５
　、０００である。

側置皿ｔＤＮＡの２００基を、連鎖分析すると、第３．
４．５図に示す様な当を得た挿入を暗示したＯ 例６ ｇｐ１６０のアミノ酸連鎖 標準の自動Ｅｄｍａｎ式デグレーション法とＨＰＬＣ法
とを用いて、ｇｐ１６０の最初の１５の残滓の末端Ｎの
連鎖を測定すると、ＤＮＡ連鎖から予想したそれと同一
であった。末端Ｎのメチオニンは、ｇｐ１６０の蛋白質
には存在しない。この事は、ＡｅＮＰＶポリヘトリン蛋
白質も又、末端Ｎのメチオニン無しで作られているとい
う観測とも一致しているｏ　ＡｅＮＰＶ３０４６のＤＮ
Ａと精製したｇｐ１６０とを分析する事によ）決定され
た実際の５ｇｐ１６０　　のＤＮＡと末端Ｎの蛋白質連
鎖とを要約すると、次の様になる。

例７ 組み換えｇｐ１６０の精製 本発明の一つの見方は、Ａｅ３０４６発現ベクターの中
の遺伝暗号を指定された組み換えＨＩＶ−１外被蛋白質
の抽出と精製に用いられる方法である。組み換えＩ（Ｉ
Ｖ−１外被蛋白質ｇｐ１６０は、Ａ！３０４６で感染さ
せた後４−５日の間に、Ｓ、　　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ
　　の細胞の中で生産される。

ｇｐ１６０蛋白質の精製には、次の段階が必要である。

即ち、 １、細胞の洗滌 ２）細胞の溶解 ３、ヒラマメのレクチン親和性クロマトグラフィー ４、ゲル濾過クロマトグラフィー ５、透析 次の各段階は、２Ｘ１０’個の感染した細胞から得たＡ
ｅ３０４６に感染した細胞からの組み換えｇｐ１６０の
精製を記述したものである。即ち、細胞の洗滌 ５０　ｍＭ　ＯＴｒｉｍ緩衝剤（ｐＨ７，５）、１ｍＭ
のＥＤＴＡ、及び、１チのＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を
含む緩衝剤の中で、感染させた細胞を洗滌する。

この細胞をこの緩衝剤中に再懸濁し、標準的危方法で均
一にし、そして、ｓｏｏｏｒｐｍで２０分間遠心分離す
る。この操作を３回繰返す。

細胞の溶解 細胞を洗滌した後、５０ｍＭのＴｒｉｍ緩衝剤（ＰＨ８
，０−８，５’）、４１０デ；に＃ＶコーＡ／酸塩、１
嗟のＢ−メルカプトエタノール中で超音波をあてて分解
する事によシ、洗滌した細胞を溶解する。

超音波処理後は、核膜の残存物だけが無傷のま＼残って
おシ、之等は、３０分間５０００回転で遠心分離する事
により、除去される。その上澄液は、抽出されたｇＰ１
６０を含有しているが、光学顕微鏡で観察して測定して
も、無傷の細胞は全く含まれていない。

ゲル濾過 ゲル濾過は、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　　樹脂（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ社）を充填したＰｈａｒｍａｃｉａ　　社の５
．ＯＸ　５０　ａｍのガラス筒の中で行われる。ベツド
の総容積は、約１７５０ｍ１である。簡及び配管接続部
分の発熱を抑えると共に、衛生的に綺麗にする為に、少
なくとも６リツトルの０．１規定のＮａＯＨを、２４時
間にわたって、筒内を通過させる。筒からの排出水を、
紫外線照射流動室と監視装置と図表記録計（Ｐｈａｒｍ
ａｅｉａ社製）に連結し、然る後、ｙルｕｓ過緩衝液４
リットルで平衡させる。天然のま＼のｇｐ１６Ｇを筒に
加え、然る後、ゲル濾過緩衝液で展開する。その筒は、
その混合原液を分離して、大きく三つの紫外線吸収試料
部分とする。最初のピークは、約５００ｍｌと７００　
ｍｌの間で去り、次のピークが７００ｍ１と１４００ｍ
ｌの間で、そして三番目のピークが、１４００ｍ１と１
９００ｍ１の緩衝剤の間で去る。これと同じ特性図が、
小型の分析用の筒で観測されるが、この小型の筒から、
最初のピークは、分子量が２．０００．０００以上の物
質である事が測定されている。このピークは、高分子量
の脂質及び脂肪の錯体が濃縮しているせｂで半透明であ
る。このピークは、又、感染された細胞から抽出された
ｇｐ１６０を、１０嗟乃至２０幅含有している。明らか
に、このｇｐ１６０の試料部分は、それ自身又は他の細
胞成分と錯体を作って、高分子量の集合体を形成してい
る。第二の幅の広いピークは、ｇｐ１６０と分子量が約
１８．０００と２００，０００との間の蛋白質との大部
分を含有している。三番目のピークには、殆んど蛋白質
が含まれておらず、紫外線吸収の大部分は、試料中のＢ
−メルカプトエタノールによるものである。紫外線の吸
収度を追跡する事で、第二のピークを初めて検出したら
、筒からの排出液を直接、ヒラマメのレクチン筒へと連
結する。その第二のピークが筒を去ったら直ぐ、その排
出液をヒラマメのレクチン筒から取り外して、直接排水
口へと向けるのである。

ヒラマメのレクチン ヒラマメのレクチン親和性ゲル液（ＬｅｎｔｉｌＬｅｃ
ｔｌｎ−８ｅｐｈａｒｏｓｅ　　４　Ｂ　）は、Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ社から、バルクで購入した。このヒラマメ
のレクチンは、５ｅｐｈａｄｅｘへの親和性クロマトグ
ラフィーｒ依り、９８嗟以上の純度に部分離し、然る後
、臭化シアンを用いて、Ｓｅｐｈａｒｏｍｅ　４　Ｂ　
に結合させる事により固定される。その基質には、ゲル
ｍ１当シ、約２ｍｇの配位子を含んでいる。ヒラマメの
レクチン筒は、５．ＯＸ３０ｃｍのガラス筒（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社製）であって、１２５ｍ１のヒラマメのレ
クチン−８・ｐｈａｒｏｓｅ　　４　Ｂ　　ゲルを内部
に有している。親和性基質は、十分に洗滌し、メーカー
が推奨する方法により再生した後、再利用する。若し、
使用しない時は、０．９憾のＮａ　Ｃ１＊１ｍＭのＭｎ
　Ｃ１２）１ｍＭのＣａＣ１４、及び、０．０１１のメ
チロサールの溶液の中で、ゲルを筒に入れて保管する。

使用する毎に使用前に、筒を洗滌して、上記のヒラマメ
のレクチン緩衝液２５０ｍ１　で平衡させる。上記の如
く、ゲル濾過筒から、天然ｇｐ１６０が出ている時は、
その天然ｇｐ１６０を直接筒へ用いる。天然のｇｐ１６
０が一旦筒に結合したら、それを、０．１チのデオキシ
コール酸塩を含有するヒラマメのレクチン緩衝液８００
ｍ１で洗滌する。この状況のもとでは、ｇｐ１６０の総
てが筒に結合している。波長２８０ｎｍで紫外線監視装
置によυ測定される結合した糖蛋白質を溶出するには、
ヒラマメのレクチン緩衝液プラス０．３Ｍのアルファー
メチル　マンノサイドを用する。

精製の要約 感染した細胞１リツトルから、ｇｐ１６０を精製する事
を要約すると、次の通りに彦る。即ち、注：■ 蛋白質の総量は、２８０　ｎｍ 吸収度から見積った。

の波長での 例８ ｇｐｔｓｏの粒子の集合 本発明の一つの見方として、ｇｐ１６０の抗原は、精製
中に、２，０００，０００以上の分子量の粒子に集合さ
れる事が出来る事が分って来た。

ｇｐ１６０の蛋白質は、細胞から、８０−９０％が単量
体風（分子量が１６０．０００）で、１〇−２０チが重
合体風（粒子状）の混合物として抽出される。ゲルｒ過
段階で、ｇｐ１６Ｇの集合形態が取り去られる。この試
料部分（ゲル濾過筒を離れる最初のピークの時）から、
ｇｐ１６０を精製しようと試みると、それが他の細胞の
蛋白質、恐らくは細胞膜の断片迄もと複合化している事
が暗示される。然し乍ら、ゲル濾過筒を離れた第二のピ
ーク中のｇｐ１６０抗原は、約１６０，０００−３００
．０００の分子量を有しておるので、単量体か二量体の
形態が支配的である。ｇｐ１６０の集合体、又は、重合
体は、ヒラマメのレクチン筒の進展中に起るのである。

デオキシコール酸塩についての危険膠質粒子濃度（ＣＭ
Ｉ）の０．２ｔｓに略近い０．５１１のデオキシコール
酸塩中で、レクチン筒から抗原が溶出されるのであろう
と、或いは、そのｇｐ１６０が、０．１＋％のデオキシ
コール酸塩中で、筒から溶出されるのであろうと、抗原
が集合体を形成するという事が測定されて来た。

集合体の大きさは、高識別能力のＦＰＬＣ８ｕｐｅｒｏ
ｓｅ　　１２　　筒（Ｐｈａｎｍｃｉａ社製）で測定し
た。精製したｇｐ１６０の代表的なロフトから採取した
試料は、標準サイズのプループキシトランの分子量２，
０００．０００と同じか、それよシ大きいものが支配的
である様な大きさを有している。ヒラマメのレクチン筒
に結合したシ、洗滌し九）している間に、糖蛋白質化し
ない蛋白質が、ｇｐ１６０抗原との結合から取シ去られ
るので、ｇｐ１６０の疎水性の部分が分子間結合を形成
し始めるらしいのである。デオキシコール酸塩は、恐ら
＜ｇｐｉｓｏに結合しない、というのは、その濃度をそ
のＣＭＩ以上に保つ事が出来、その抗原は、依然として
錯体を形成するだろうからである。この抗原が集合して
集合体となるのは、それが−旦精製される場合にこの蛋
白質に内在する性質である様に思われる。ｇｐ１６０蛋
白質に存在する非常に疎水性の末端がＮの連鎖が、この
蛋白質が粒子を形成するという天性の能力に貢献してい
るという事はあシ得る事である。精製後、そのｇｐ１６
０錯体は、０．２ミクロンの醋酸繊維素のフィルターを
通して、余り蛋白質を失う事なく、無菌ｒ遇する事が出
来る。

粒子形成の解析 電子顕微鏡によシ、精製したｇｐ１６０を解析すると、
３０３０−１ＯＯｎ蛋白質蛋白形状子のある事が証明さ
れる。粒子の存在についての追加テストとして、精製し
たｇｐ１６０を、ゲルｒ過法で解析した。約１００μｇ
のｇｐ１６０を５ｕｐｅｒｏａｅ　　１２）ＦＰＬＣゲ
ルｒ過　ＨＲｌ　０／３０　　筒（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
　有限会社）に加えた。この筒は、先ず最初に、蛋白質
の分子量標準品で検定を行った。この筒から得た蛋白質
の性状は、蛋白質の標準品の分子量に対して溶出量が反
比例するという事に関しては、極めて再現性がある。こ
の筒は、単量体のｇｐ１６０を、重合体形状のものから
分離し、分子量が２　Ｘ　１０’以上の球形蛋白質を排
除する。この筒で操作を進めると、精製されたｇｌ）１
６０の実質１総てが、中空容積の中に溶出する、従って
２　Ｘ　１０’以上の分子量のものは、サイズ中にある
。

例９ ｇｐ１６０のアルミニウム化合物への吸着不溶性のアル
ミニウム化合物の免疫学的助剤としての有効性は、両相
への抗原の吸着の完全さにより左右される。本明細書の
一部の如く、ｇｐ１６０−アルミニウム化合物の錯体の
免疫原としての効能を減じる様なｐＨ以外では、アルミ
ニウム化合物が効率よ（ｇｐ１６０を吸収する様に、ア
ルミニウム化合物を作る事が出来るという事が発児され
た。アルミニウム化合物（燐酸アルミニウムのゲル）を
形成する量制御される因子は、次の通シである。：即ち
、 １、）抗原をアルミニウム化合物に吸着するのに最適の
ｐｕは、約５．０である。然し乍ら、ｐＨが７．５の時
と比較して、ｐＨが６．５の時は、ｇｐ１６０が免疫原
性を失う事が発見されたから、そのアルミニウム化合物
は、ｐＨが７，１±Ｏ−１で、作られた。とのｐＨに於
ても、尚依然として、実質上１００％のｇｐ１６０が吸
収されるであろうという事が発見された。

２）、）存在するＮａｃｌに依るイオン強度は、比較的
低くて、Ｏ，１５Ｍ以下である。

３、）燐酸す）　ＩＪウムに対して相対的に、塩化アル
ミニウムをモル濃度的に過剰にし、上澄液中に、フリー
の燐酸イオンが確実に存在しない様にする。

４、）ｇｐ１６０抗原は、新しく作成したアルミニウム
化合物に添加して、結晶の成長を止め、粒子の大きさを
最小にする様にする。

２００ｍ１のアルミニウム化合物を作って、精製したｇ
Ｐ１６０をアルミニウム化合物に吸着し、最終の抗原濃
度が４０μｇ／ｍｌとなる様にする操作につき、下記に
概要を示す。；即ち、試薬の調製（調剤ロフト全量で２
００ｍＬ）Ｌ）　　１００ｍＬの無菌で発熱物質の無い
壜又はビーカーの中ｋ、次の溶液を用意せよ。溶液１と
溶液に塩を混ぜ、苛性ソーダを混ぜ、そして、０．２μ
の醋ま繊維素製フィルターを通して濾過し、１００　ｍ
Ｌの無菌で発熱物質のない壜に入れる。

溶液Ｉ　　ＡｌＣｌ５１１６Ｈ２００，８９５グラムＮ
ａＨＡｃ　・３　ＨｔＯ０，１３６グラム４０　ｍＬの
ＷＦＩ水中に溶解 ０．２μ　フィルター 溶液２　　ＮＩＬ３ＰＯ・１２ＨｚＯＬ−２３４グラム
４０ｍＬのＷＦＩ水中に溶解 ０．２μ　フィルター 溶液３　　ＮａＯＨ２，０グラム １００　ｍＬのＷＦＩ水中に溶解 ０．２μ　フィルター 溶液４　　Ｔｒｉｓ　　　　　　　　　１．２５　　グ
ラム１００　ｍＬのＷＦＩ水中に溶解 ９０　ｍＬのＷＦＩに１ｍＬを加 え、０．５ＮのＨＣＩでｐＨを ７．５に調整し、そして、ＷＦＩ で１００　ｍＬにせよ。

２））３０分間、各溶液をオークレープで処理し、ゆっ
くシ排気せよ。室温に迄冷却せよ。

アルミニウム化合物の調製 １、）溶液１（塩化アルミニウムー醋酸ナトリウム）を
、調合容器に、２５ｍＬの無菌の使い捨てのピペットを
用いて加えよ。溶液１の容積を書き留めて、溶液の攪拌
を開始せよ。

２））溶液２（燐酸す）　ＩＪウム）を、容器に、２５
ｍＬの無菌の使い捨てのピペットを用いて加え、沈澱物
が形成されても攪拌を続けて、溶液２の容積を書き留め
よ。

３、）溶液３（水酸化ナトリウム）を加え、５分間攪拌
を続けよ。０．５　ｍ　Ｌの試料を採取して、そのｐＨ
を測定せよ。着し、ＰＨが７．０以下であれば、追加の
０．５ｍＬの水酸化ナトリウムを加えて、更に５分間攪
拌し、もう−度そのｐＨを測定せよ。

そのｐＨが、７．０と７．２との間になる迄、続けて実
施せよ。

４、）調合容器に加えた総容積（溶液１　＋　溶液２　
＋　溶液３）を測定し、然る後、無菌のＷＦＩを加えて
、容積が１００ｍＬになる様にせよ。

１）ＰＨ７，５の１ｍＭのＴｒｉｍ液１００ｍＬに入れ
た８０００μｇの精製したｇｐ１６０を、直ちに調合容
器の中へ直接加えよ。

６、）少くとも２０分間、攪拌を継続せよ、然る後、調
合されたそのワクチンを、無菌のガラス瓶に投薬せよ。

例１０ アルミニウム化合物に吸着されたｇｐ１６０の免疫原性 抗原製剤（ワクチン）の免疫原性を測定する一般に容認
された方法の一つは、抗原を一回分の投与量与えた一群
のハツカネズミに於ける独特の抗体反応を測定する事で
ある。４週間の終シに、そのハツカネズミから血を採取
して、その血清の抗体を、ＥＬＩＳＡ法（ｅｎｚｙｍｅ
　ｌｉｎｋｅｄＬｒｒｍｕｎｏａｂａｏｒｂａｎｔ　ａ
ｓｓａｙ酵素結合免疫吸収剤検定法）の如き標準の抗体
テストによシ測定して、指定された抗原（通常は、その
動物を免疫にする為に用いられる抗原）に対して高低を
測定する。

例９に述べた如く、アルミニウム化合物で吸着したｐＨ
６，０とｐＨ７，５の助剤無し精製ｇｐ１６０又は、Ｆ
ｒｅｕｎｄ　　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　　Ａｄｊｕｖａｎｔ
と混合し九精製ｇｐ１６０のノ１ツカネズミに於ける免
疫原性を以下に纒めて記し九。即ち、 平均ＥＬＩＳＡ値 １μｇ無し　８７０２０．１４０　５７１ｐＨ７，５ ４／６ 無し　８７０２０．１１０　２６チ　２／７ｐＨ６，０ アルミニウム　８７０２　１．０００　　９０チ化合物 ９／１０ Ｆｒｅｕｎｄ社８６０４　１．１０８　８３１のもの Ｆｒｅｕｎｄ社　８７０２　１．３９６　１００１　７
７’！のもの ０．１μｇ　　Ｆｒｅｕｎｄ社８６０４　０．４３４　
６７９６のも’　　　８７０５　１．００３　　６７チ
［株］　■免疫処置後２０日間で、ノ・ツカネズミから
採血し、その血清は、ゲル−精製ｇｐ１６０に対して、
ＥＬＩＳＡ検定法で、１：１０の稀釈液でテストした。

天然のＨＩＶ−１蛋白質に対して、市販のＥ　Ｌ　Ｉ　
Ｓ　Ａ　（　ＧｅｎｅｔｉｃＳｙａｔｓｍｓ　　有限会
社；ＥＩＡｔｍ　ＥＬＩＳＡ）検定法を用いて、１：４
００の稀釈液で行っても、同様な結果が得られた。

■　■血清変換し九ノ・ツカネズミの数（Ｐ）とテスト
した総数（Ｎ）との比 助剤を添加してないｇｐ１６０抗原を、−回分の投薬量
がＬＯμｇで免疫処置し九ノ・ツカネズミは、ｇｐ１６
０に対して抗体反応を現わす。（上表を参照）　然し乍
ら、アルミニウム化合物に吸着させたＬＯμｇのｇｐ１
６０で免疫化したノ為ツカネズミのグループに於ては、
もつと強い抗体反応が見られる。−回の投薬量が０．１
μｇ以下のｇｐ１６０であっても、完全なＦｒｅｕｎｄ
社製のものと混合したり、或いは、アルミニウム化合物
と調合したｇｐ１６０は、免疫化したハツカネズミのう
ちの５０−以上が、血清変換されるであろう。

ずっと低い値ではあるが、ｇｐ１６０は、ｐＨ　７．５
とｐＨ６．０での未調合抗原の如く、ノ・ツカネズミに
於ては免疫原性であったが、よ）ｐＨが低すと、免疫原
性の低下があった。

免疫性反応をひき出す候補ワクチンの能力は、非常に重
要な生物学的性質である。アルミニウム化合物憂調合し
たｇｐ１６０ワクチンが、動物に於て免疫原性であった
事を確認する為、そして、アルミニウム化合物の助剤が
免疫原性を増加させた事を確認する為に１次の実験を実
施した。第０日に、ハツカネズミ（群の数は１０）に、
−回分の投薬量（０．５μｇ　又は　５．０μｇ）のｇ
ｐ１６０単独、アルミニウム化合物に吸着させたｇｐ１
６０、又は、完全なＦｒｅｕｎｄ社製の助剤（ＣＦＡ）
中に入れたｇｐ１６０　　を注射した。

２８日目に、そのノ・ツカネズミから採血し、その血清
を、ＥＬＩＳＡ法（１：１０　　稀釈液）によシ、ｇｐ
１６０の抗体の存在について試験した。

２８日目に採血した血清からの結果を、下表に纒めであ
る。総てのグループに於て、ハツカネズミのうち５０９
６以上が、血清変換を示した。−回分の投薬量がどれで
あろうと総て、血清変換の数と平均の血清吸収量の示教
（ＥＬＩＳＡ検定法に於て、１：１０の稀釈液での　Ｏ
Ｄ　　　　ｎｍ）は、アルミニウム化合物に吸着したｇ
ｐ１６０を用いた方が、ｇｐ１６０単独で免疫化したハ
ツカネズミ中で得られるものよシも、高かった。之等の
結果は、アルミニウム化合物の助剤が、ｇｐ１６０抗原
の免疫原性を可成増加させるという事を表わしている。

例１２ 中性化データ ＨＩＶ−１中性化検定法は、抗体を調合する事で、鋭敏
な人の培養リンパ球の細胞にＨＩＶ−１ウイルスが感染
しない様になるか、どうかを測定する一般に容認された
方法である。ｇｐｌ　６０で免疫化した動物から採つ九
抗血清を、ＨＩＶ−１中性化検定法でテストした、そし
て、その結果を下記の表に纒めた。

モルモット、兎、及び、アカゲザルも、ｇｐ１６０で（
助剤として、アルミニウム化合物、又は、Ｆｒｅｕｎｄ
社品を用いて）免疫処理して来た。一般的に言って、之
等の動物の免疫処置は、ＨＩＶ−１外被蛋白質だ対して
、良好な抗体反応を作って来た。

例１３ チンパンジーに於ける免疫原性 発生宇土、チンパンジーは、人の最も近い親戚であって
、現在では、ＨＩＶ−１の感染てついての唯一の動物モ
デルである。三匹のチンパンジーに於ける安全性／免疫
原性の試験に際して、三匹のチンパンジーに、アルミニ
ウム化合物を調合したワクチン中にあ−る４０μｇ又は
８０μｇのｇｐ１６０で、免疫処置を施した。夫々のチ
ンパンジーは、４週間目で、４０μｇ及び８０μｇのｇ
ｐ１６０で、追加抗厚刺戟による免疫処置を、夫々に受
けた。−匹の実験対照標準の動物は、同じ時に１　ｍｌ
の塩水溶液でワクチン注射された。毎週、三匹のチンパ
ンジーの夫々からの血清試料を採って、三つの免疫学的
検定法を用すて、ｇｐ１６０に対する抗体及びＨＩＶ−
１ウイルス性抗原に対する抗体について、解析を行った
。その三つの検定法とは、ＭｉｃｒｏＧｅｎｅＳｙａ有
限会社に依り開発された精製ｇｐ１６０に対するＥＬＩ
ＳＡ検定法、Ｗｅ＠ｔａｒｎ　Ｂｌｏｔ　　解析法、及
び、市販されているＨＩＶ−Ｉ　　ＥＬＩＳＡ検定法で
ある。之等の解析の結果を、下記に述べる。；即ち、Ｅ
ＬＩＳＡ（ＭＧＳｅａｒｃｈ　　ＨＩＭ　　１６０）Ｅ
ＬＩＳＡ検定法、即ち、ＭＧＳ　ｅａｒｅｈ　　ＨＩＶ
　　１６０　（ＭＧＳｅａｒｃｈ　　とは、米国、コネ
チカヴト州、ウエストヘイブンのＭｉｃｒｏＧｅｎｅＳ
ｙｓ有限会社の商標である）は、ｇｐ１６０に対する免
疫吸着剤の一つであり、同時係属、同時譲渡の米国特許
出願一連番号９２０，１９７の中に記載されているもの
である。免疫処置前に採取した血清試料、及び、最初の
免疫処置に続く１１週間の間に採取した血清試料は、１
：１０乃至１：１００，０００に稀釈された、そして、
然る後、−ケ所に１１００ｎの精製ｇｐ１６０を含んだ
ニトロセルローズの細長片で抱く様圧した。終点稀釈滴
定量とは、山羊・抗人・ＩｇＧ−アルカリ・フォスファ
ターゼ複合体で検出する際、抗ｇｐ１６０の抗体に対し
て、そのテストが陽性であった様な最高の稀釈度の事で
ある。標準実験動物から採取した血清試料、及び、免疫
処置をした動物の前駆免疫血清からの血清試料は、陰性
であった。−回の投薬量８０ｐｇを貰ったチンパンジー
は、２週間迄、１；１００の稀釈度で陽性であったし、
−回の投薬量４０μｇを貰ったチンパンジーは、４週間
迄、１：１０の稀釈度で陽性であった。ｇｐ１６０に対
する抗体の滴定量は、５週間迄殖え続け、この時点で、
終点稀釈滴定量は、夫々、大兄、１：１００．０００　
とに２．０００　　であった。どちらの動物の場合も、
その抗体の滴定量は、６−１１週間の間で、はんの少し
下がった。この種の反応は、人のＢ型肝炎ウィルスのワ
クチンをワクチン注射したチンパンジーに於いて、普通
に見られる抗体反応に、量的にも質的にも類似している
。

市販のＥＬＩＳＡ試験 チンパンジーが血清変換しており、組み換えｇｐ１６０
に対する抗体を有していた事は、ＶａｘＳｙｎで免疫処
置したチンパンジー（ＶａｘＳｙｎ　　は、ＡＩＤＳワ
クチンについてのＭｉｃｒｏＧｅｎｅＳｙｓ社の商標で
ある）からの血清を、ＭＧＳｅａｒｅｈ　　ＨＩＭ１６
０　　ＥＬＩＳＡ法やＷｅｓｔｅｒｎ　　ｂｌｏｔａｎ
ａｌｙｓｅで解析する事で明らかとなった。チンパンジ
ー達が、又、天然のウィルスの外被蛋白質を見分ける抗
ＨＩｖの抗体をも作っているのかどうかを調べる為に、
前駆免疫の血清並びに１週間から１１週間迄の血清を、
免許を受けた市販のＥＬＩＳＡのテストキット、ＬＡＹ
　　ＥＩＡ＋７）テストキットでテストした。但し、Ｌ
ＡＶ　　ＥＩＡは、米国ワシントン州シャトル市のＧｅ
ｎｅｔｉｃＳｙｓｔｅｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの商
標であるｏ８０／’ｇのｇｐ１６０で免疫化した動物は
、２週間で、１：１００の稀釈度で陽性であったし、６
週間迄、抗体水単が増加を示し続けた。４０μｇで免疫
化した動物は、６週間で、１　：　１００の稀釈度で陽
性であった。

例１４ ｇｐ１２０とｇｐ４１との間の抗体の分布ワクチン注射
をした動物に於けるｇｐ１６０に対する抗体反応が、ｇ
ｐ４１又はｇｐ１２０又はその双方に向いているかどう
かを調べる事は、重要な事である。三種間の異なる組換
え型外被抗原に対して、放射免疫沈澱法（ＲＩＰ）、免
疫螢光検査法（ＩＰ’）、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　
　ａｎａｌｙｓｉｎ＊及び、量的ＥＬＩＳＡ法を含めて
、糧々の免疫学的方法を採用して、ＨＩＶ−１外被蛋白
質の種々の領域に対する抗体の分布を検出し測定した。

第６図は、次の三つの異なる組み換え抗原の免疫反応性
を纒めたものである。：　　（１）ｇＩ）１２０−ｒ（
組み換えＨＩＶ−１ｇｐ　１２０の先頭を切断したもの
で、分子のＣ端から約４０のアミノ酸が無くなっている
。）（２，）ｇｐ　１２０（全長が揃った組み換えＨＩ
ｖ−１ｇｐ　１２０　）、及び（３，）ｇｐ　１６０．
ＨＩＭ−１０抗体に陽性を示す個人５０人から採った人
の血清と３個のプールした人の血清とは、ｇｐ１６０と
は非常に反応が強かったが、ｇｐ１２０では反応が中程
度であり、先端を切断したｇｐ１２０では、抗体は殆ん
ど、或いは、全く反応しなかった。先端を切断したｇｐ
１２０は、ＨＩＶ−１の外側の糖蛋白の９０チ以上を表
わしているが、とのｇｐ１２０が、防御的な決定子を含
んでいるらしい。ＡＩＤＳ陽性の人の血清が、その外被
のこの領域に抗体を殆んど有していないという観察結果
は、ウィルス感染への免疫反応が十分には防御的で表い
という事実、並びに、人の陽性血清が、試験管内では、
通常低水準の中性化作用を表わすという事実と矛盾し々
い。

反対に、ｇｐ１６０免疫原、又は、先端を切断したｇｐ
１２０で免疫化されたアカゲザルは、ＨＩＶ−１の外被
の切頭ｇｐ１２０部分とも強く反応する抗体を有してい
る。ウィルスの外被に沿うた抗体認識部位の分布の差異
とサルに観察される滴定量が高い事が、サルの血清の中
性化滴定量が高いという事実の原因となっているかもし
れない。

人の血清並びに免疫のあるアカゲザルの血清と之等三つ
の組み換え外被抗原との免疫反応性を量的に評価した本
のを第７図に示す。テストしたサルの血清は総て、ｇｐ
１６０で免疫を与えた動物からの血清を含めて、切頭ｇ
ｐ１２０抗原（ｇｐ１２０−ｒ）Ｋ対して高い滴定量の
抗体を有している。

次に記すものは、本文上記に引用した文献の列記並びに
更により完全表内容説明である。

参考文献 Ａｄａｃｈｉ、　Ａ、Ｈ，Ｅ、　Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ、
　Ｓ、　ｘｏｅｎｔｇ。

Ｔ、　ＦｏｌｋＩｌ、　Ｒ，Ｗｉｌｌｅｙ、　Ａ、　Ｒ
ａｂｓｏｎ、　ａｎｄ　Ｍ。

Ｍａｒｔｌｎ、　１９８６．　　ｒ接触伝染性の分子ク
ローンを侵入感染させた人及び人以外の細胸に於ける後
天性免疫不全症候群関連レトロウィルスの製造」Ｊ、　
Ｖｉｒｏｌ、　５９：２８４−２９１゜Ｂａｒｉｎ　Ｆ
、　ＭＦ　ＭｅＬａｎｅ、　ＪＳ　Ａ１１ａｎｅ　ｅｔ
　　ａｌ。

ｒＨＴＬＶ−Ｉ［ｒのウィルスエンベロープ蛋白質ハ、
ＡＩＤＳ患者の中の抗体にとっての主要目標抗原を代表
するＪ　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２Ｂ：１０９４−１０９
６゜Ｂａｒｒ６−８ｉｎｏｕａｓｉ　　Ｆ、　ＪＣＣｈ
ｅｒｍａｎｎｅ　ＦＲｅｙ。

ｔｔｔａｌ、　１９８３．　ｒ後天性免疫不全症候群の
おそれのある患者からの向リンパ球性レトロウィルスの
分離Ｊ　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２０：８６８−８７１゜
ＢｏｍｆｏｒｄＲ，１９８５，ｒ助剤Ｊ　ｉｎ　Ａｎｉ
ｍａｌ　Ｃｅ１ｌＢｉｏｔｅｃｈ、　ｖｏｌ、２：２３
５−２５０．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓ３Ｉｎｃ、　　
（Ｌｏｎｄｏｎ）Ｌｔｄ。

Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ、　　Ｓ、　Ｍ　Ｒｏｂｅｒｔ
−ＧｕｒｏｆＬ　ＦＷｏｎｇ−８ｔａ１１．　ＲＣＧａ
１ｌｏ、　’Ｂ　Ｍｏ５ｓ、　１９８６．「組換えワク
シニアウィルスによるＨＴＬＶ−Ｉ［エンベロープ遺伝
子の発見Ｊ　Ｎａｔｕｒｅ、　３２０：５３５−５３７
゜Ｃｏｃｈｒａｎ　ＭＡ、　　ＢＬ　Ｅｒ１ｃａｏｎ、
　ＪＤ　Ｋｎｅｌｌ、　　ＧＥＳｍｉｔｈ、１９８７．
　　ｒサブユニットワクチンを製造する為の一般的方法
としての桿状ウィルス組換え体の使用Ｊ　Ｕｓｅ　ｏｆ
　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ｒｅｅｏｍｂｌｎａｎｔｓ
ａｓ　ａ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔ
ｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆｓｕｂｕｎｉｔ　ｖ
ａｃｃｉｎｅ８．　ｉｎ　Ｖａｃｅｉｎｅｓｓ　８７．
　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇｓ　Ｉ（ａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓ
ｓｓ　　ｉｎ　ｐｒ＠Ｉ。

Ｆａｕｃｉ、　Ａｎｔｈｏｎ７　Ｓ、　１９８６．　　
ｒ後天性免疫不全症候群を処理する戦略を開発する事に
関しての最近の出版物Ｊ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ。

８３　：　９２７８−９２８３゜ Ｆｅｏｒｉｎｏ、ＰＭ、ＶＳ　Ｋａｌｙａｎａｒａｎｍ
ａｎｅ　ＨＷＨａｖｅｒｋｏａ、　ｇｔ　ａｌ、　１９
８４．　ｒ後天性免疫不全症候群に罹かっている一組の
供血者と受血者のリンパ節障害疾患関連ウィルスの感染
Ｊ　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２５：６９−７２゜ Ｆｒａｎｅｉａ　ＤＰ＋　　ＪＣＰｅｔｒｉｃｃｉａｎ
ｉ、　１９８５．　ｒＡ　ＩＤＳ用ワクチンの展望とそ
れに向っての経路」Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｍｅｄ、　１５８６−１５９０゜Ｋｅｎｎｅｄ
７　ＲＣ＋　　ＲＤ　ＨｅｎｋｅＬ　　Ｄ　Ｐａｕｌｅ
ｔｉ、ＪＳＡｌｌａｎ、ＴＨＬｅｅ、Ｍ　Ｅａｓｅｘ、
ＧＲＤｒｅｅｓｍａｎ。

１９８６、　　ｒ合成ペプチドに対する抗血清は、ＨＴ
Ｌｖ−ｍエンベロープ糖蛋白質を認識する」５ｃｉｅｎ
ｃｅ、　２３１：１５５６−１５５９゜Ｋｉｅｎｙ　Ｍ
Ｐ、　Ｇ　Ｒａｕｔｍａｎｉ、　Ｄ　Ｓｃｈｍｉｔｔ、
　Ｋ　Ｄｏｔｔ。

５Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、　ＭＡｌｉｋｚｏｎ、　Ｍ
Ｇｉｒａｒｄ、　　ＳＣｈａｍａｒｅｔ、　Ａ　Ｌａｕ
ｒｅｎｔｅ　Ｌ　Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ、　　ａｎｄＪ
−Ｐ　Ｌｅｃｏｅｑ、　１９８６．　ｒ組換えワクシニ
アウィルスから発見されたＡＩＤＳウィルスｅｎマ蛋白
質」Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ、　４ニア９０−７９
５゜Ｈｕ、　Ｓ−Ｌ、　　ＳＧ　Ｋｏｓｏｗａｋｉ、　
ＪＭ　Ｄａｌｒｙｍｐｌａ。

１９８６、　ｒ組換えワクシニアウィルスに於けるＡＩ
ＤＳウィルスエンベロープ遺伝子の発見」Ｎａｔｕｒｅ
、　３２０：５３７−５４０゜Ｌａ５ｋ７ｅ　ＬＡ、　
　ＪＥ　Ｇｒｏｏｐｍａｎ、　ＣＷ　Ｆｅｎｎ１ｅ、　
ＰＭＢｅｎｚ＊　ＤＪ　Ｃａｐｏｎ、　ＤＪ　Ｄｏｗａ
ｂｅｎｋｏｅ　　ＧＲＮａｋａｍｕｒａ、ＷＭ　Ｎｕｎ
ｅａｓ　ＭＥ　Ｒｅｎｚ　ＰＷＢｅｒｍａｎ。

１９８６．５ｃｉｅｎｃｅ、２３３：２０９−２１２゜
ＬｅＹ３’＊　ＪＡ、ＡＤ　Ｈｏｆｆｍａｎ、ＳＭ　Ｋ
ｒａｍｅｒ＋　　ＪＡＬａｎｄｉａ＊　ＪＭ　Ｓｈｉｍ
ａｂｕｋｕｒａ、　ａｎｄ　ＬＳ　０ｓｈｉｒｏ。

１９８４、　ｍＡ　Ｉ　Ｄ　Ｓに罹かったサンフランシ
スコの患者からのリンパ細胞変性レトロウィルスの分離
」５ｃｉｅｎｃｅ、　２２５：８４０−８４２゜Ｐｏｐ
ｏｖｉｅ、　Ｍ、　Ｍ　Ｓａｒａｎｇａｄｈａｒａｎ、
　Ｅ　Ｒｅａｄ。

ａｎｄ　ＲＧａ１ｌｏ、　１９８４．　　ｒＡ　Ｉ　Ｄ
　Ｓに罹かった患者から、細胞変性レトロウィルス（Ｈ
ＴＬＶ−ＩＩＩ）を検出、分離、連続生産Ｊ　５ｃｉｅ
ｎｃｅ、　２２４：４９７−５００゜ Ｒｏｂｅｙ　ＷＧ、　　ＬＯＡｒｔｈｕｒ、　ＴＪ　Ｍ
ａｔｔｈｅｗｓ　ｇｔ　（Ｊｌ−１９８６、ｒＡの免疫
不全ウィルスの感染の予防に対する見通し：精製した１
２０−ｋＤａエンベロープ糖蛋白質は、減殺性抗体を誘
発するＪ　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８３ニ
ア０２３−７０２７゜５ａｌｋ、　Ｊ、　１９８７．　
　ｒ曝露後の免疫化によるＡ１、ＤＳ抑制についての見
通しＪ　Ｎａｔｕｒｅ、　３２７：４７３−４７６゜ Ｐｕｔｎｅ３’＊　ｓ、Ｄ、ｔ　Ｍａｔｔｈｅｗｓ　＊
　Ｔ、Ｊ、ｅ　Ｒｏｂｅｙｅ　ｗ、Ｇ、＊Ｌｙｎｎｅ　
Ｄ、Ｌ、＊　　Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ、　Ｍ−＋
　Ｍｕｌｌｅｒ。

Ｗ、Ｔ−＊　Ｌａｎｇｌｏｌｍ、　Ａ、Ｊ、ｅ　Ｇｈｒ
ａ７ｅｂ、　Ｊ、　ＰｅｔｔｓｗａＬＳ、Ｒ，ｅ　Ｊｒ
、Ｗｅｉｎｈｏｌｄ、　Ｋ、Ｊ、、　Ｆｉａｃｈｉｎｇ
ｅｒ、　Ｐ、Ｊ、＋Ｗｏｇ−８ｔａａｈＬ　Ｆ、ｅ　Ｇ
ａ１ｌｏｅ　Ｒ，Ｃ，ａｎｄ　ＢｏｌｏｇｎｅｓＬＤ、
Ｐ、　１９８６．　ｒウィルスエンベロープの大腸菌で
製造した破片に対するＨＴＬＶ−ｍ／ＬＡＶＩ殺性抗体
Ｊ　５ｅｉｅｎｅｅ、　２３４：１３９２−１３９５゜
Ｖｏｇｔ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｍ、Ｓ、　Ｈｉｒａｃｈ、
　１９８６．　ｒＡの免疫不全ウィルスに感染する事の
予防と治療についての見通しＪ　Ｒｅｖｉｅｗａ　ｏｆ
　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕａ　Ｄｉｓｅａｓｅ。

８：９９１−１０００゜ Ｖａｉｎ−Ｈｏｂａｏｎ、　Ｓ、、　Ｓｏｎｉｇｏ、　
Ｐ、ｅ　Ｄａｎｅｓ、　　０．。

Ｃｏｌ・、　ｓ、ｔ　ａｎｄ　Ａ１１ｚｏｎ、　Ｍ、　
　ｒ”Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓウィルスのヌクレオチド連鎖Ｊ　
ＬＡＹ、　１９８５．　Ｃｅ１ｌ　４０：９−１７゜

【図面の簡単な説明】

第１図はＨＩＶエンベロープ遺伝子の単離と設計とを示
す。 第２図は組換えベクターｐ３０４６の構造を示す。 第３図はＡｅ３０４６の遺伝暗号指定連鎖の側面と位置
するＤＮＡのヌクレオチドの連鎖を示している。 第４図はＡ　ｅ　３０４６のヌクレオチド連鎖及び予測
されるアミノ酸の連鎖を示す。 第５図はＬＡＹ−１と組換えＡｅ３０４６　　ｇｐ１６
０連鎖との比較を示す。 第６図はヒトのＨＩＶ−１抗体が陽性の血清（上図）及
びｇｐ１６０またはｇｐ１２０で免疫化した動物からの
アカゲザルの血清（下図）のＥＬＩＳＡ終点稀釈滴定量
を示している。 特許出願人　　マイクロジェネシス、インコーボｌイテ
ィド跳 、：ｊｉ： ！ｒ＝ ５ｕ二 ｊ０三 ！３三　　ｄ１三　　３藻三　　■三 ａ毬三　　部三　、５却＝　　５「 テ■コ　北ヨ　　部三　ｊ捉ヨ ■三　　足百三　　■三　　Ｊｌ三 Ｉ三　　３１　３揖三 ｌ三　　部＝　　５ｅ三 ｎ＝　　９Ｅ　　コ鍔三　　フ自三　　■三　　茨葺三
部三　　１瑚＝　自ｄ三 １三　　ＪＥ部三　！３三 田Ｈ三　　茹＝　　部三 ２１三　　ａａ三　　３Ｃ三 仝Ｍ’６三　丁的三　ｇａ葺三　―ｌ：　ｇに　右肩す
三１１三ミ　ぎｌ三 ２１三　　３１三 ぎ藷３　ｌ三 Ｓｉ三　　■三 ！３三　　■壬δ ａ部三　　■三 Ｂ部三　　ａａｉ′ｉ 苔Ｉ三　棺部三 ３０三　　１ 月口三　　８三 占口本　ンロ三 ５０三　　占騎三 ！３三　　フ耘三 Ｓし三　　ｙ１三 ３短三　　８三 ａ部三　　ｄロヨ　　茨騎三 Ｚ部三　　茨受三　　ぎ部三 ｉ三　　ｉ部三　、■三 市Ｓｌ’５’　＞　５３三　　肝壬！ 左目Ｅ　　　ａＱ三　　Ｓｉ三 コ部三　　ｇ１三　　肝玉 部三　　左百三　　８三 部三 一３８三 ３目三 ａ３三 Ｓｉ三　　１三　　ａＨ三 ントＥ　月口三　　ン享三 綽ヨ　　ｄ３三　　３捉三 ４藻三　　ｚ部三　２５揖三 ８６＝ 一υ− ！部三 二Ｉｌ：２譜 −ぺ＋− ぎ部三 巳占亘三°充盾３三　貫３ト三　；占ト　本自三　計ぎ
１三 クベー ！ロニ 甜６＝ １三 練玉 訂ｉ部三　訂５ｇ三　委５Ｈ三　尻５■三　Ｈ１三第５
Ｄ図 抗ｇｐ力価

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. （１）変性されていない、または天然のＨＩＶ−１エン
   ベロープ蛋白質。
2. （２）特許請求の範囲１の変性されない、または天然の
   組換えＨＩＶ−１エンベロープ蛋白質。
3. （３）特許請求の範囲１の実質的に生物学的に純粋なＨ
   ＩＶ−１エンベロープ蛋白質。
4. （４）ヒトのワクチンとして有用な純度と品質を有する
   特許請求の範囲１に記載の実質的に生物学的に純粋なＨ
   ＩＶ−１エンベロープ蛋白質。
5. （５）特許請求の範囲１の実質的に生物学的に純粋なｇ
   ｐ１６０蛋白質。
6. （６）ヒトのワクチンとして有用な純度と品質を有する
   特許請求の範囲１に記載の実質的に純粋な組換えＨＩＶ
   −１エンベロープ蛋白質。
7. （７）特許請求の範囲１の蛋白質とアジュバントを含む
   実質的に非発熱性のワクチン組成物。
8. （８）該アジュバントは粒状のアルミニウムホスフェー
   トである特許請求の範囲７の組成物。
9. （９）該アジュバントは粒状の水酸化アルミニウムであ
   る特許請求の範囲７の組成物。
10. （１０）特許請求の範囲１の蛋白質の少量と担体とから
    なる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療に有用な
    組成物。
11. （１１）特許請求の範囲１の組換えｇｐ１６０ＨＩＶ−
    １エンベロープ蛋白質。
12. （１２）特許請求の範囲１のＨＩＶ−１エンベロープ蛋
    白質を発現するための組換えＤＮＡ分子。
13. （１３）特許請求の範囲１のＨＩＶ−１エンベロープ蛋
    白質を発現するための組換えＤＮＡ分子。
14. （１４）特許請求の範囲１のＨＩＶ−１エンベロープ蛋
    白質を発現するための第４ａ〜４ｋ図に示されているＤ
    ＮＡ分子。
15. （１５）特許請求の範囲１のＨＩＶエンベロープ蛋白質
    を発現するためのＤＮＡ配列を含んでいる組換えＤＮＡ
    分子。
16. （１６）ｇＰ１６０ＨＩＶ−１エンベロープ蛋白質を発
    現するためのＤＮＡ配列を含んでいる特許請求の範囲１
    ５の組換えＤＮＡ分子。
17. （１７）Ａｃ３０４６によるＤＮＡ分子。
18. （１８）宿主昆虫中に発現された後回収された特許請求
    の範囲１の実質的に生物学的に純粋な変性されていない
    、または天然のＨＩＶ−１エンベロープ蛋白質。
19. （１９）特許請求の範囲１８の実質的に生物学的に純粋
    な変性されていない、または天然のｇｐ１６０ＨＩＶ−
    １エンベロープ蛋白質。
20. （２０）特許請求の範囲１８のＡｃ３０４６によって発
    現された実質的に生物学的に純粋な変性されていない組
    換えＨＩＶ−１エンベロープ蛋白質。
21. （２１）昆虫細胞中のＨＩＶ−１の変性されていないま
    たは天然のｇｐ１６０エンベロープ蛋白質の発現のため
    の特許請求の範囲１７の組換えＤＮＡ分子Ａｃ３０４６
    。
22. （２２）特許請求の範囲１の蛋白質の治療学上有効な量
    を患者に投与することからなるＡＩＤＳに感染した患者
    を治療する方法。
23. （２３）特許請求の範囲４の蛋白質の有効予防量をヒト
    に投与することからなるヒトにおけるＡＩＤＳを予防す
    るための方法。
24. （２４）組換えＨＩＶ−１エンベロープ蛋白質物質を発
    現した後細胞を回収し、かつ洗浄すること、該細胞を分
    離すること、得られた分離物にレクチン親和性クロマト
    グラフィーを行ないその後ゲルろ過クロマトグラフィー
    を行なうこと、そして得られた精製ＨＩＶ−１エンベロ
    ープ蛋白質物質を透析しかつ回収することからなる細胞
    中に発現された組換えＨＩＶ−１エンベロープ蛋白質物
    質を回収し精製する方法。
25. （２５）回収されるべきＨＩＶ−１エンベロープ蛋白質
    物質を含む該細胞はｐＨ７．５のトリスバッファー５０
    ｎＭと、ＥＤＴＡ１ｎＭと、そしてトライトンＸ−１０
    ０　１％とを含むバッファー溶液中での洗浄を受ける特
    許請求の範囲２４の方法。
26. （２６）細胞分離はｐＨ領域８．０〜８．５で５０ｎＭ
    のトリスバッファー中での音波処理によって行われる特
    許請求の範囲２４の方法。
27. （２７）該ゲルろ過はセファクリルレジンを含むカラム
    で行われる特許請求の範囲２４の方法。
28. （２８）該レクチン親和性クロマトグラフはレンチルレ
    クチンを用いて行われる特許請求の範囲２４の方法。
29. （２９）結果として回収された精製ＨＩＶ−１エンベロ
    ープ蛋白質物質は約２，０００，０００≦の分子量の粒
    子の範囲に集塊または集積されるｇｐ１６０である特許
    請求の範囲２４の方法。
30. （３０）該ＨＩＶ−１エンベロープ蛋白質物質はｇｐ１
    ６０である特許請求の範囲２４の方法。
31. （３１）該ＨＩＶ−１エンベロープ蛋白質物質は約２，
    ０００，０００≦の分子量を有する粒子の範囲に集塊ま
    たは集積されるｇＰ１６０である特許請求の範囲２４の
    方法。
32. （３２）約２，０００，０００≦の分子量を有しかつ微
    細に分割された粒状である特許請求の範囲１の変性され
    ていないまたは天然のＨＩＶ−１エンベロープ蛋白質。
33. （３３）該蛋白質物質はｇｐ１６０である特許請求の範
    囲３２の変性されていないまたは天然のＨＩＶ−１エン
    ベロープ蛋白質物質。
34. （３４）約３０〜１００ｎＭの実質的に球状の粒形状を
    有する特許請求の範囲１の変性されていないまたは天然
    のＨＩＶ−１エンベロープ蛋白質物質。
35. （３５）該蛋白質物質はｇｐ１６０である特許請求の範
    囲１の変性されていないまたは天然のＨＩＶ−１エンベ
    ロープ蛋白質物質。
36. （３６）該蛋白質物質が該組成物の中で約４０μｇ／ｍ
    ｌの濃度で存在しアラムと複合された変性されていない
    または天然のＨＩＶ−１エンベロープ蛋白質からなる免
    疫原組成物。
37. （３７）該蛋白質は約７．０〜７．２のｐＨでアラムと
    複合されるＨＩＶ−１エンベロープ蛋白質物質とアラム
    とを複合する方法。
38. （３８）該ＨＩＶ−１エンベロープ蛋白質物質はｇｐ１
    ６０である特許請求の範囲３７の方法。