JPS61233700A - 分子クロ−ンされたエイズ関連ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、分子クローニングによって導かれた免疫学的
産物、並ひにその使用方法に関するものである。さらに
詳しくは、後天性免疫不全症候群（エイズ、ＡＩＤＳ）
のウィルス性病原物質の検出のための診断用産物（診断
剤）、並ひに該症候群に対するワクチン接種に用いられ
るワクチンとして有用な免疫学的ポリペプチドに関する
ものである。本発明はまた、エイズ・レトロウ、イルス
逆転写酵素のポリペプチド、並びにその使用方法に関す
るものである。

発明の背景 従来、様々なウィルス性感染物質に対する免疫応答の分
析的研究は、その様な病原体を、（ａ）かかる病原体に
対する免疫応答を検出するための診断剤、あるいは（１
））かかる病原体による感染Ｉこ対する抵抗性（耐性）
を与えるためのワクチン、として用いられるウィルス性
ポリペプチドを単離するのに充分な量培養することがし
ばしば困難であったことから、制限されてきた。

分子クローニングの発達によって、病原性物質から導か
れる遺伝子産物を非病原性の形で、事実上無制限な量、
発現させ得る手段が得られたことにより、これらの制限
の内、いくつかは克服された。

インフルエンザウィルス（１）、手足口病ウィルス（２
）、肝炎ウィルス（３）、小水飽性口内炎ウィルス（４
）、および狂犬病ウィルス（５）由来の抗原が大腸菌（
Ｅ。

ｃｏｌｉ）内で発現した、という報告があるが、幾つか
の研究室からは、原核生物内で発現したＢ型肝炎の表面
抗原は、天然に生じる抗原に対する抗血清と免疫学的に
反応しないという報告も出されている（６）。

後天性免疫不全症候群〔以後、エイズ（ＡＩＤＳ）と称
する〕は、細胞媒介免疫に対して顕著な影響を及ぼす、
成人の免疫系における荒療性の疾患である。この疾患は
、モノクローナル抗体０ＫＴ４（７）によって定義され
るヘルパー／インジューサー表現型Ｔ４を持っているＴ
　−ＩＪンパ球の喪失に基づくと思われる重いリンパ欠
乏症を呈するのが特徴である。その他の臨床上の所見に
は、主として、時折みられるニューモジステイス・カル
ニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　　ｃａｒＩｎｉｉ　）
による肺炎の如き感染症、並びにカボジ肉腫（Ｋａｐｏ
ｓｉｓ　ｓａｒｃｏｍａ　）が含まれる（７）ｊ プレーエイズ、即ち、エイズの発現に先立ってしばしば
現われる症候群は、慢性の全身性リンパ節疾患を特徴と
している。プレーエイズ患者の約１０９６がＡＩＤＳＩ
こ至ることが報告されている（８）。

エイズ発現の危険性を有する主な集団にけ、同性愛およ
び同性愛の男性、静注薬の常習者、血液製剤の被投与者
（主として第■因子による治療を受けている血友病患者
）、並びに輸血を受けた人々が含まれる（７）。この症
候群の疫学的研究により、エイズは密接な接触、または
血液または血液産物との接触により伝達される感染性物
質によって引き起こされるということがわかった（７）
。

最近の研究報告は、前記のヒ）　Ｔ　−ＩＪンパ球性ウ
つルステアルＩＩＴ　Ｌ　Ｖ　−■オヨヒＨＴＩ−Ｖ　
−Ｈと関連したヒトレトロウィルスが、エイズノ病原物
質であるかもしれないことを示唆している（８゜９．１
０）。最近、いくつかの実験室において、エイズ感染に
関連したレトロウィルスを単離し、増殖させている。ガ
ロ（Ｇａｌｌｏ）は、エイズ患者から単離したウィルス
をＨＴｉ、Ｖ−Ｊと命名い１１）、これを、許容細胞で
あるＴ−セルライン中で増殖させた（１２）。同様に、
パスツール研究所（ＰａｓｔｅｕｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ
、パリ）のルユ・モンテニュー（Ｔ−ｕＣＭｏｎｔａｇ
ｎｉｅｒ　）は、エイズ患者の体内にＬ　Ａ　Ｖ　（リ
ンパ腺症関連ウィルス）と命名されたウィルスを発見し
た。このＬ　Ａ　ＶとＨＴＩ−Ｖ　−［とか同類または
同一であるらしいという報告がある（１３゜１４）。さ
らに最近になって、エイズ患者から、ＡＲＶ　（エイズ
関連ウィルス）と命名されたウィルスを単離して同定し
、クローンした例がある（１凪これらの、並びにその他
のエイズ・レトロウィルスを、本明細書中では、エイズ
関連レトロウィルスと称することとする。

ＨＴＬＶ　−ＩＩＩ　ハ約Ｉ　Ｑ　ｋ　ｌ）　ノＲＮＡ
カラｆｉル’ｆツムを有するレトロウィルスであると考
えられている。このウィルス粒子は多くのタンパク質で
構成されたカプシドを含有している。最も重要なコアタ
ンパク質はＰ−２４と命名され、約２４，０００ダルト
ン相当の分子量を有している。このＰ−２４コアタンパ
ク質はＨＴ　Ｌ　Ｖ　−Ｉｆｆゲノムのｇａｇ　ｆｆｆ
ｉ域にコードされている前駆体ポリペプチドの一部とし
てインビボで合成される。この前駆体ポリペプチドが、
感染した細胞内でプロセス（プロセッシング）されると
、Ｐ−２４およびその他のウィルス性タンパク質が形成
される。加えて、’ｇ　ｐ　−４１と呼ばれるエンベロ
ープタンパク質（分子量、４１．０００ダルトン）もウ
ィルス粒子の構成４分であって、これはｆ（ＴＬＶ−１
［のｅｎｖ　　領域にコードされている。

夏ｉＴｒ、ｖ−ｎｒ　のエンベロープタンパク質ｐｐ−
４１に対する抗体が、エイズおよびプレーエイズ患者の
血清から検出された。エイズ患者の約８８％、プレーエ
イズ患者の約７９％がｆ（ＴＬＶ−ＩＩｒエンベロープ
タンパク質に対する、検出可能な抗体を保有している（
１６）。ある研究者は、９０〜１００％の割合でその様
な抗体への血清学的変換（セロコンバージョン）がある
との報告を行っている（８）。

さらに、ｇｌ）−４１エンベロープタンパク質；こ対す
る抗体に加えて、トＩＴＬＶ−１１１コアタンパク質ｐ
−２４！こ対する抗体、およびＰ−５５、Ｐ−６０と称
されるＨＴＬＶ−■タンパク質、並びにｇｐ患者から検
出された（１６．１７）。従って、これらまたはその他
のまだ解明されていない抗原に対する抗体が検出される
と、それはエイズに関連した物質にさらされたが、ある
いは、その様な物質によって生産的感染を受けたことを
明らかに示している。

さらに、これらのウィルス性ポリペプチド配列のあるも
のは、ワクチンとして用いて中和抗体の生産を惹起（誘
導）し、エイズ感染に対する抵抗性を付与することもで
きる。高力価の免疫応答の誘導を容易にするために、望
ましくないウィルス性の配列を除去すると共ｆこ、ウィ
ルス性ポリペプチドと、高い免疫原性を有するポリペプ
チドとの融合物の如き、変異配列を得る必要がある。

従って、本発明は、エイズ関連レトロウィルスのウィル
ス性抗原であって、非病原性でありかつ、エイズの検出
のための診断剤として用い得るものを原核性生物内で発
現させることを目的とするものである。

また本発明は、天然に存在しているエイズ関連ポリペプ
チド配列の変異型組成のポリペプチドからなる、エイズ
検出のための診断用産物を原核生物内で発現させること
を１］的とするものである。

さらに本発明は、エイズ関連ポリペプチドの融合ポリペ
プチド類を含む、エイズに対するワクチンとして用いら
れるエイズ関連ポリペプチドまたはその変異体を発現さ
せることを目的とするものである。

さらにまた本発明は、転写酵素阻害物質を同定するため
の分析（測定）に用いるために、エイズＲＮＡ依存性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を発現させることを目
的とするものである。

発明の要約 エイズ−関連レトロウィルスの全ゲノムをクローンし、
その配列を決定した。本発明によりエイズ−関連ポリペ
プチドをコードしているＤＮＡが同定され、組換え原核
生物細胞または哺乳類細胞の培養系に用いられ、予め決
定されたエイズ−関連ポリペプチド、並びにその誘導体
、および、それらのアミノアミノ酸配列変異体が合成さ
れた。

エイズ−関連ポリペプチドの誘導体１・こは、グリコシ
ル化されていない、または様々１でグリコシル化された
ポリペプチド類、並びにホルミルメチオニルＮ−末端種
（ｓｐ、ｅｃｉｅｓ　）　　が含まれる。

正常なエイズ−関連ウィルスポリペプチドの変異体は、
上記正常なポリペプチドの１またはそれ以上のアミノ酸
残基が欠失され、または他の残基で置換されるととによ
り、あるいは、１またはそれ以上のアミノ酸残基が挿入
されることにより得られる。これらの変異体には正常な
ポリペプチドから得られる、予め決定されたフラグメン
ト（欠失変異体）、エイズ−関連ウィルスポリペプチド
またはそのフラグメントと、エイズ−関連ウィルスポリ
ペプチド以外の第２のポリペプチドまたはそのフラグメ
ントとの融合物（融合または挿入変異体）、並びに以上
全てのもの１・こおいて、１個のアミノ残基が置換され
ているものが含まれる。

本発明は、本発明のポリペプチドをコードしているＤＮ
Ａ、並ひにその様なりＮＡが桟能的（操作可能）に挿入
されたベクター、並びにそれによって形質転換された哺
乳類または原核生物の細胞培養を提供するものである。

本発明において生産されたエイズ−関連レトロウィルス
の、予め決定されたポリペプチド配列は、天然に産生さ
れる（存在している）その他のエイズ関連ポリペプチド
を本質的に（実質上）含有していない。これらのポリペ
プチドは、相補的な抗体と特異的に結合し得る抗原決定
基を、少くとも１個含有している。本明細書中に記載し
た具体的なポリペプチド配列は、Ｐ−２４、Ｐ−１５、
Ｅ′、逆転写酵素お６Ｌびエンベロープ（ｅｎｖ）の各
ポリペプチドである。本発明の好ましい実施態様におい
ては、エイズ関連レトロウィルスの予め決定されたポリ
ペプチド配列のフラグメントおよび／またはその融合物
であって、相補的な抗体と特異的に結合し得る抗原決定
基を少くとも１個有するものが得られる。この態様の１
種のものとして、Ｐ−２４のＣ末端部分と全Ｐ−１５配
列が取り出された。この先端を切断されたＰ−２４は大
腸菌内で発現されるが、エイズ関連レトロウイルスに対
する抗体と予想外の反応性を示す。特に好ましいフラグ
メントはＥ′ポリペプチドフラグメントと同様に、無傷
のウィルスと競合して正常な宿主細胞受容体と結合し得
るｅｎｖ　　タンパク質ｇｐ１２０のフラグメントであ
る。

融合ポリペプチドは、（ａ）相補的な抗体と特異的に結
合し得る抗原決定基を少くとも１個有する、エイズ関連
レトロウィルスの予め決定されたポリペプチド配列、ま
たはそのフラグメント、および（ｂ）エイズ関連レトロ
ウィルスに対する抗体の存在を分析するために生物学的
採取された試料中に正常に存在している抗体と、免゛疫
学的な反応を行わない第２のポリペプチド配列、を含む
。融合ポリペプチドがワクチンの成分として用いられる
ものである場合には、第２のポリペプチド配列はまた、
その様なワクチンの適用対象内に天然ζこ存在している
ポリペプチドと交差反応し得る抗体を惹起（誘導）しな
いものでなければならない。この場合には、酵母以外の
低級真核生物から得られたポリペプチドが有用である。

融合ポリペプチドの１種のものでは、ヒト成長ホルモン
（ＨＧ　ｒ−Ｔ　）のポリペプチド配列をコードしてい
るＤＮＡ配列がＨＴＬＶ−ｍ（ｆ）ｐ−２４およびＰ−
１５ポリペプチド配列をコードしているＴ）ＮＡ配列の
５′側に位置している。このものは、相補的な抗体と特
異的に結合するＨＧＨ−ｐ２４融合ポリペプチドとして
、大腸菌内で発現され、プロセスされる。同様に、Ｅ′
ポリペプチドや、ｇｐ４１およびｇｐ１２０の如きｅｎ
ｖ　　ポリペプチドと合成または原核性のウィルス性ポ
リペプチドとの融合物も得られる。これらの成果は、エ
イズに関連したウィルス性の抗原を、エイズ感染者によ
って天然に産生される抗体を検出するために、融合ポリ
ペプチドとして発現させ得ることを証明するものである
。

本発明のポリペプチドは、それを薬学的に許容し得る賦
形剤と一緒に治療上有効な投与剤形に製剤化し、エイズ
にかかりやすい動物に投与して、その様なポリペプチド
配列に対する抗体の産生を導くこともできる。

１つの目的は、エイズ関連レトロウィルスから得たＲＮ
Ａ依存性ＤＮＡポリ、メラーゼ（逆転写酵素）の予め決
定されたポリペプチド配列を含む、または該ポリペプチ
ド配列からなる１つのポリペプチドを、その様なエイズ
関連逆転写酵素の阻害化合物を同定するための測定法（
定量法）に用いるためにクローンし、発現させることで
ある。その様な化合物は、エイズ関連レトロウィルスに
よる感染を阻止する、あるいは、感染者の体内で、その
様なレトロウィルスが播種されることを阻ＩＪ二するた
めに、薬物として投与することができる。

図面についての簡単な記述 第１図は、生きているＨＴＬＶ　−１１［レトロウィル
スから得たＰ−２４コアタンパク質のアミノ末端ポリペ
プチドのアミノ酸配列、並びに、それから演絖的に推定
された、対応するＤＮＡ配列を示している。

第２ａ〜２ｊ図は、ｆ−ＩＴ　Ｌ　Ｖ　−Ｎ　　ゲノム
ＤＮＡ配列、推定のポリペプチド配列、並びに部分的な
制限地図を示す図である。末端の繰り返しく反復）配列
（”ｋ”）および特異的な領域（５′・末端のＵ５、お
よび３′末端のＵ３）が示されている。ｇａｇ　　領域
、逆転写酵素（“ｐｏｌ”）、エンベロープ（”ｅｎｖ
”）並ひにＥ′およびＰ′タンパク質と帰属された推定
の位置も示されている。ｓｄおよびｓａは、それぞれス
プライス供与・部位およびスプライス受容部位を表わす
１３重複した（オーバーラツプした）アミノ酸配列は、
推定のｍＲＮＡスプライシング現象を表わしている。代
替的に記した塩基類は、クローン間に見出される相違点
を示しており、ウィルス集団の株間に認められる変異を
表わすものである。

５４２　ｋ図は、プロウィルスＤＮＡと、これと重複す
るｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローン群の制限酵素地図である。

第２１図は、ウィルスの、推定のｍＲＮＡスプライシン
グ活性、並びに得られたメツセンジャー類およびそれに
よってコードされているタンパク質類を示す図である。

第３図はｐ　７．１１をサブクローンするのに用いた組
立て計画を示す模式図である。

第４図はＰ−２４の発現ベクターおよび先端を切断され
たＰ−２４の発現ベクターの組立て模式第５図はＰ−２
４混成（ｃｏｍｐｏｓ　ｉ　ｔ　ｅ　）　　ポリペプチ
ドの発現ベクター、並びに先端を切断されたＰ−２４混
成ポリペプチドの発現ベクターの組立てに関する模式図
である。

第６図はＩ）ＤＥ−２４、ＰＤＥ２４△ＨＤ３、ｐ　Ｈ
ＧＨｐ　−２４△Ｂおよびｐ　ＨＧＨｐ　−２４△ＨＤ
３によって発現されたポリペプチドをウェスタンプロッ
ト法にかけて得た像である。プロットの処理にはウサギ
抗−ＨＴＬＶ−■抗体を用いた。

第７図はｐＤＥ　−２４によって発現されたポリペプチ
ドをウェスタンプロット法にかけて得た像である。プロ
ットの処理には、エイズ患者から得たヒト血清を用いた
。

第８ａ、９ａおよび１．　Ｏａ図は、プラスミドｐｔｒ
ｐＬＥ、ｇｐ４１、ｐｔｒｐｒ、Ｅ、Ｅ’およびｐＳＶ
Ｅ　、Ｅ’　ｒ）ｆＩＦＲの構造を示す模式図である。

これらのプラスミドはそれぞれ、ｒ−ＩＴＬＶ−１１１
のｅｎｖ　　タンパク質の融合物およびＥ′タンパク質
の融合物を細菌内で発現させるため、並びに、融合して
いないＥ′タンパク質をＣＩ−１０セルライン中で発現
させるために用いられる。

第８１）、９１）および１０１）図は、それぞれ、ｐｔ
ｒｐ　ＬＥ、ｇｐ４１、ｐｔｒｐＬＥ、Ｅ’　によって
コードされているタンパク質融合物、並びにｐ　Ｓ　Ｖ
　Ｅ　。

Ｅ’　ｒ）ＨＦＲによってコードされている非融合Ｅ′
タンパク質の合成を示すポリアクリルアミドゲル電気泳
動の泳動パターンの模写図である。

＋１１１２図は制等な真核動物の組換え細胞培養中でｅ
ｎＶ　タンパク質を調製するのに用いられるＩＩＴ　Ｌ
　Ｖ−１’［ゲノムの領域を示す図である。

第１１ｂ図は、咄乳類細胞培養形質転換体の培養物中に
Ｉ（ＴＬＶ−ｍエンベロープタンパク質ヲ分泌させるの
に用いられる発現プラスミドを示す模式図である。

本出願人らは、エイズ関連レトロウィルスからのウィル
ス性タンパク質を、直接、または変異型ポリペプチドと
して宿主細胞内で発現させることができ、さらに、その
様な組換えポリペプチドがエイズ関連レトロウィルスの
抗体と特異的に結合し得る、ということを証明した。そ
の様な変異型ポリペプチドにけ、ウィルス性ポリペプチ
ドと、１またはそれ以」―の第２のポリペプチドとの融
合ポリペプチド、並びに、ウィルス性ポリペプチドに欠
失、挿入、置換を生じたもの、および該ポリペプチドの
誘導体が含まれる。さらには、エイズ関連レトロウィル
スの予め決定されたポリペプチド配列のフラグメントを
含有しているポリペプチドであれば、直接発現されたも
のであれ、またはある変異を生じているポリペプチドで
あれ、エイズ関連レトロウィルスに対する抗体と反応す
ることが分った。これらの結果は、この様な組換えポリ
ペプチドを個人、供与血液並びに面液産物中のエイズを
検出するための診断薬として用いることができるという
ことを示している。

さらには、エイズ関連レトロウイルスによる感染に対す
る抵抗性を付与する中和抗体の産生を誘導するための免
疫原としてその様なポリペプチドを用いることができる
。

さらにまた、エイズ関連レトロウィルスによる感染をμ
ｍ］止し、あるいは、感染者の体内でその様なレトロウ
ィルスが播踵されるのを阻止し得る化合物を同定するた
めに、エイズ関連レトロウィルスの逆転写酵素を用いる
ことができる。

本発明の融合ポリペプチドは、エイズ関連ポリペプチド
配列と第２のポリペプチド配列とからなる。この第２の
ポリペプチド配列は、■）融合ポリペプチドの細菌性宿
主から、その細胞外環境、またはダラム陰性閑のペリプ
ラズムへの分泌を促進するため、２）融合ポリペプチド
と組換え宿主細胞の表面膜との機能的な親密性（アソシ
エーション）を容易にするため、あるいは・３）融合ポ
リペプチドの精製に利用し得るポリペプチド配列を与え
るために（例えば、Ｉ（Ｇ　Ｈに対して特異的な免疫吸
着剤を用いた分画法でＩ−Ｉ　Ｇ　Ｈ−エイズ融合ポリ
ペプチドを精製する場合）用いられるものである。個々
の適用例に応じて、エイズ関連レトロウィルスと融合ポ
リペプチドを形成させるのに用いる第２のポリペプチド
配列は、原核性起源または真核性起源のいずれであって
も良く、また、その位置はエイズ関連ポリペプチド配列
のアミノ末端、カルボキシ末端またはこれら両末端のい
ずれでも良く、さらにはエイズ関連ポリペプチド配列の
内部に挿入されていても良い。

融合ポリペプチドの分泌を促進するのに用いられる第２
のポリペプチド配列の例には、（１）単純性庖疹ウィル
ス性タンパク質のシグナル配列し係属中の米国方法出願
第５２７，９１７号（１９８３年８月３０日出願）に開
示］　；　（２）大腸菌アルカリ性ホスファターゼまた
は大腸菌エンテロトキシンＳＴ■のシグナル配列〔係属
中の米国方法出願第６５８．３４２号（１９８４年１０
月５日出Ｆ＄）および該出、願において引用されている
文献中で開示〕；並ひに（３）プレー〇Ｇｆ（（係属中
の米国方法出願率４８８，２３２号（１，９８４年８月
２５日出願）に開示〕、その他、高等な真核生物由来の
シグナル配列（例えばガンマ−インターフェロンのシグ
ナル配列等）が含まれる。

機能的な膜との親密性を容易ならしめる様な第２のポリ
ペプチド配列の例として、単純庖疹ウィルスのトランス
メンプラン（膜輸送）配列〔米国方法出願率５２７，９
１７号（１９８３年８月３０日出願）に開示〕がある。

エイズ感染のおそれのある人々の多くは、同時に大腸菌
その他の腸内細菌に対する抗体をも有しているので、こ
れらの抗体と虚偽免疫陽性反応を起こさない様な、第２
のポリペプチドを選択しなければならない。従って、腸
内細菌から得られたポリペプチド配列を第２のポリペプ
チドとして用いるのは、その様な配列が、プロセシング
の過程で除去されてしまうものであるが、さもなくば、
エイズ関連ウィルスによる感染に応答して産生される抗
体の存在を分析するために生物学的に採取した試料との
反応性が阻害されている配列〔例えば、組換え法により
、天然のタンパク質とはもはや交差反応し得ない様、細
菌性タンパク質のエピトープが修飾されて発現したもの
（下記の１．Ｅ融合物参照）〕である場合に限られる。

本発明の融合タンパク質をエイズ感染に対するワクチン
として用いる場合には、その様なワクチンを接種すべき
対象内に天然に存在しているポリペプチドに対する抗体
を産生じない様に、第２のポリペプチド配列を選択しな
ければならない。例えば、ヒト番こ用いるためのワクチ
ンの場合には、第２のポリペプチド配列はＨＧ　１１で
ないことが好ましい。しかしながら、その様なワクチン
には、原核性ポリペプチド配列または、好ましくは、酵
母および霊長類以外の真核性ポリペプチド配列が含まれ
ていても良い。

本発明では、具体的には、あるＩ−ＩＴＬＶ−１’）−
暗号ポリペプチドのクローニングおよび発現について開
示する。しかしながら、本発明は、その他のＨＴ　Ｌ　
Ｖ　−ｆｆｒポリペプチドのクローニングおよび発現を
も包含するものである。エイズおよびプレーエイズパテ
ント（ｐａｔｅｎｔｓ　）に対する抗体のための抗原決
定基を有するＨＴＬＶ−Ｉｆｆポリペプチドには、ｇ　
ｌ）　−１６０、ｇｐ−１，２０、ｇｐ−６５、ｇｐ−
４１、ｐ−６０／ｐ５５が含まれる。ｇｐ−１２０ポリ
ペプチドはｇｐ−６５およびｇ、、ｐ−４１の前駆体ポ
リペプチドの様に思われる。これらの特定のＨＴ　Ｌ　
Ｖ　−］’ｌ’Ｊポリペプチドは例示であって本発明の
範囲を限定することを意図したものではない。

さらに、本発明は各々、異なった抗原決定基を有する産
物のライブラリィであって、どの抗原決定基（類）がエ
イズまたはプレーエイズの検出に最適であるかを判定す
るのに用い得るライブラリィを生成させることをも含む
ものである。その様なライブラリィを、例えば、エイズ
に対して血清学」１陽性である健常人から得た血清に対
してどの抗原決定基が免疫学的な反応性を有するかを決
定するのに用いることができる。その様な血清に対する
試験の結果は陽性であるが、エイズ患者から得た血ａＩ
こ対する試験では陰性を示す様な抗原決定基が、中和抗
体の産生を誘導するためのワクチンとして第１に挙げら
れる候補物質である。さらには、その様な抗原決定基を
含む診断用産物（診断剤）を、中和抗体を有するが、エ
イズに関連した重篤な症状には進行しないと思われる人
々を同定するのにも用いることができる。

本発明はＨＴＬＶ−１［）こ関する研究に基づいてイル
カ、ＨＴＬＶ−［とＬＡＶまたはＡＲＶとは同様、また
は同一であるということを理解しておく必要がある。こ
の様な関係にあるので、これらのレトロウィルスから導
かれたポリペプチド産物もまた、本発明の範囲内に含ま
れる。従って、エイズ関連レトロウィルスという名称は
、ＨＴ　Ｌ　Ｖ−■、ＬＡＶ、ＡＲＶおよび／またはそ
の他のエイズまたはプレーエイズを引き起こし得るレト
ロウィルスを意味する。

本明細書中で用いられるエイズ関連レトロウィルスのポ
リペプチド配列は、全長に及ぶ天然のポリペプチド配列
、あるいは、ゲノム配列決定で導かれた、予め定められ
た配列のいずれかである。

天然に存在している（生じた）ポリペプチド配列とは、
ウィルスに感染した細胞内で形成されるポリペプチド、
またはその様な細胞の培養液中に見出されるポリペプチ
ドである。

エイズ関連レトロウィルスの変異型ポリペプチド配列に
は：（１）ウィルス性ポリペプチドまたはそのフラグメ
ントと第２のポリペプチドとの融合物（ＮおよびＣ末端
における融合物、並ひに挿入による融合物を含む）　；
　（２）ウィルス性ポリペプチドのＮ−末端、Ｃ−末端
または中間領域に欠失を生じたことにより生成されたエ
イズ関連レトロウィルスのポリペプチド配列のフラグメ
ント：（３）エイズ関連レトロウィルスのポリペプチド
配列に１またはそれ以上のアミノ酸の置換が生じている
もの；および（４）周知の方法で標識されるが、あるい
は例えば米国方法第３，７２０，７６０号　（文献目録
参照）ｉこ開示された方法に従って固相に結合されてい
る、標識され、あるいは結合されたウィルス性ポリペプ
チド配列の如き誘導体が含まれる。

る。

１第２のポリペプチド配列”とは、エイズ関連レトロウ
ィルスのポリペプチド配列またはそのフラグメントと融
合し、本発明の融合ポリペプチド配列を形成している配
列を指す。これら第２のポリペプチドは真核生物、非−
エイズ性ウィルス、または原核生物に由来するタンパク
質の全配列または部分配列のいずれでも良く、融合ポリ
ペプチドの分泌を促進するが、融合ポリペプチドと発現
宿主の表面膜との親密性を容易ならしめるが、あるいは
融合ポリペプチドの精製に役立つ、等の目的で用いられ
るものである。ワクチンとして用いる場合、融合ポリペ
プチドの第２のポリペプチドは、正常な状態において、
その様なワクチンの使用を意図している対象内に天然に
存在するポリペプチドと交差反応し得る抗体を誘導（惹
起）し得ない配列である。

“相補的な抗体”とは、対応する、天然に存在している
ウィルス性エピトープ、またはビリアン内にパッケージ
ングされない、エイズによってコードされているエピト
ープに対して惹起された抗体を指す。エイズ関連レトロ
ウィルスのＤＮＡ配列は、」ユ記の、本発明のポリペプ
チド配列および変異型ポリペプチド配列をコードしてい
る。

“生物学的に採取された（誘導された）試料”には、ヒ
トまたは動物対象から得られたあらゆる生物学的な液体
試料または組織試料であって、エイズ関連レトロウィル
スにさらされるが、または該ウィルスに感染することに
呼応して生産される相補的な抗体の存在を検出するため
の分析に適用される試料が含まれる。その様な試料は一
般に、血液、尿、精液、および唾液であるが、その様な
相補的な抗体またはエイズ関連レトロウィルスが見出さ
れるものであれば、あらゆる生物学的な物質を包含する
。

本発明の診断用産物（診断剤）およびワクチンを生産す
るためにＤＮＡ配列をクローニンクシ、発現させるには
、原核生物が好ましい。例えば、大腸菌に１．２株２９
４（ＡＴＣＣ漸３］４４６　）が特に有用である。その
他、大腸菌Ｂ、および大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ盃３
１５−３７）、並ひに大腸菌Ｃ６００およびＣ６００ｈ
ｆ　１、大腸菌Ｗ３１１０　（Ｆ−１λ−１原栄養株、
ＡＴＣＣＡ２７３２５）　　等の大腸菌株、枯草菌（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｕｓ　）の如きバチルス属
の菌株、並びにサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　）　またはセ
ラチア・マーセサンス（５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅ
ｓａｎｓ　）等の、他の腸内細菌類、並びに様々なシュ
ードモーナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）種の菌株を
含むその他の微生物株も用いることができる。原核生物
内で発現させた場合、本発明のポリペプチドは通常、Ｎ
−末端にメチオニンまたはホルミルメチオニンを含有し
ているが、グリコシル化はされていない。勿論、以上は
例示を意図するものであり、これらに制限されるもので
はな（）。

一般に、宿主細胞と適合し得る種から導かれた複製およ
びコントロール配列を含有しているプラスミドベクター
は、その様な宿主との関連において用いられる。通常、
ベクターは形質転換された細胞に表現型の選択性を与え
得るタンパク質をコードしている配列、および複製部位
を持っている。

例えば、大腸菌は通常、大腸菌種から得られるプラスミ
ドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換される（１８）
。プラスミドｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラ
サイクリン耐性に関する遺伝子を含有しており、これら
は形質転換された細胞を容易に同定し得る手段となる。

このｐＢＲ３２２プラスミド、あるいは微生物性プラス
ミドはまた、自身のタンパク質を発現するために、該微
生物によって使用され得るプロモーターを含有している
が、あるいは含有する様に改良されている必要がある。

組換えＤＮＡの組立てに最も一般的ζこ用いられるプロ
モーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）お
よびラクトースプロモーター系（１９−２１）、並びに
トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（２２，２３
）が含まれる。これらが最も普通に用いられているプロ
モーターであるが、その他の微生物系プロモーター類も
発見され、使用されており、それらのヌクレオチド配列
は詳しく公開されているので、当業者はそれらをプラス
ミドベクターと機能的（操作可能）にライゲート（連結
）することができる（２４）。既に開示された例では、
ｔｒｐ　　プロモーター（２２，２３，）を用いて本発
明の診断用産物およびワクチンを発現させている。

原核細胞に加えて、真核細胞もまた、エイズ関連ウィル
ス・ポリペプチド（特にエイズ関連レトロウィルスの逆
転写酵素を含む）を発現させるのに用いることができる
。真核性微生物の内、サツカロミセス・セレビシｘ　（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ　−ｖｉｓｉａ
ｅ　）または通常のパン酵母が最も一般的に用いられて
いるが、その他の多くの菌株も普通に用いることができ
る。サツカロミセス内で発現させるためには通常、例え
ば、プラスミドＹＲｐ７（２５〜２７）を使用する。こ
のプラスミドは既にｔｒｐｌ遺伝子を含有しており、こ
の遺伝子は、ＡＴＣＣ＆、４４０７６またはＰＥＰ４−
１（２８）の例の如く、トリプトファン中で増殖する能
力を欠く酵母の突然変異体を選ぶための選択マーカーと
なる。この酵母宿主細胞ゲノムはｔｒｐｌ障害を特徴と
しているので、トリプトファンの非存在下で増殖すると
いう事実により、形質転換体を検出し得るという有効な
環境が与えられる。

酵母ベクターの好適なプロモーター配列には、３−ホス
ホグリセレートキナーゼ（２９）あ、るいはエノラーゼ
、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲ
ナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベート・デカルボキシラ
ーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、クルコース−６−ホス
フェート・インメラーゼ、３−ホスホグリセレート・ム
ターゼ、ピルベート・キナーゼ、トリオースホスフェー
ト・インメラーゼ、ホスホグルコース・インメラーゼ、
およびグルコキナーゼ等のその他の解糖酵素類（３０、
３］、　）のプロモー外が含まれる。適当な発現プラス
ミドを組立てるには、これらの遺伝子に関連する終止配
列を、発現ベクター内の、発現させようとする所望の配
列の３′側にライゲートし、ｍ　ＲＮ　Ａ終末がポリア
デニル化される様にする。

その他、増殖条件によって転写がコントロールされると
いう利点をもさらに有するプロモーターとして、アルコ
ール・デヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ１酸ホ
スフアターゼ、窒素代謝に関連する減成酵素、前記グリ
セルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ
、およびマルトース並びにガラクトースの利用に関与す
る酵素類のプロモーター領域が含まれる。酵母適合性の
プロモーター、複製起源および終止配列を含有している
プラスミドベクターならば、全て適格性を有する。

エイズ関連レトロウィルスタンパク質の発現には、多核
生物の細胞培養を用いることもできる。

ＶＥＲＯおよびＨＥＬＡ細胞、チャイニーズハムスター
の卵巣（ＣＨＯ）セルライン、並びにｗ４３８、ＢＨＫ
、Ｉ　ＣＯ５７およびＭＤＣＫセルライン等の哺乳類ま
たはを推動物の細胞が特に重要である。その様な細胞の
ための発現ベクターには、通常、複製起源およびエイズ
関連レトロウィルスポリペプチドの暗号ＤＮＡの発現を
コントロールするためのプロモーターが、必ｆｉに応じ
て、哺乳類の選択マーカー、ＲＮＡスプライス部位、ポ
リアデニル化部位および転写終止配列と共に含有されて
いる。哺乳類宿主細胞を形質転換してエイズ関連ポリペ
プチドを発現させることのできるベクターは、ｒ）ｆ（
ＦＲ（デヒドロ葉酸還元酵素）をコードしている遺伝子
の如き選択マーカーと一緒に既知の方法で宿主細胞に導
入し、次いで形質転換体を濃度を次第に増加させた選択
用物質（例、メトトレキセート）にさらして増幅させる
（米国方法第４　、３９９　、２１６号参照）ことが好
ましい。

哺乳類細胞内で使用するための転写および翻訳コントロ
ール機能は、ウィルス性起源から常法通り得られる。一
般に用いられているプロモーターは、例えは、ポリオー
マ、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）および特にアデ
ノウィルス２から得られている。５Ｖ４Ｑウイルスのア
ーリイ（初期）およびレート（後期）プロモーター類は
、上記のアデノウィルスの主要な後期プロモーターと同
様に有用である。さらに、通常所望の遺伝子配列に伴な
っているプロモーターまたはコントロール配列も、その
様なコントロール配列が宿主細胞系に適合し得ることを
条件として用いることででき、また、しばしば好ましい
ことである。

複製起源は、アデノウィルスその他のウィルス性起源（
例えばポリオーマ、５ｖ４０、ＶＳＶ。

ＢＩＰＶ等）から得られる外来性の複製起源を含む様に
してベクターを組立てることにより、あるいは、そのベ
クターが宿主細胞の染色体に組込まれる場合には、宿主
細胞の染色体性複機ｉｓ＋こよって与えられる。

本発明のベクターが、エイズ関連ポリペプチド、および
Ｄ　ＨＦ　Ｒ酵素の様な同時形質転換、選択および増幅
に係る遺伝子、の両方をコードしているＤＮＡ配列を含
んでいる場合には、用いたＤＩ−（ＦＲタンパク質のタ
イプに応じて宿主を選択するのが適当である。野生型Ｄ
ＨＦＲタンパク質を用いる場合には、Ｄ　ＨＦ　Ｒ欠損
宿主細胞を選択するのが好ましく、そうすることにより
、ヒポキサンチン、グリシンおよびチミジンを欠く選択
用培地内で、満Ｆｉ＝　４７）いくトランスフェクショ
ンを選択するためのマーカーとしてＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ
暗号配列を用いることができる。

他方、ＭＴＸに対する結合親和性の低いＤＩ（ＦＲタン
パク質をコントロール配列として用いる場合には、Ｄ　
ＨＦ　Ｒ耐性細胞を用いる必要はない。何故ならば突然
変異体Ｄ　ＨＦ　Ｒはメト）１４七−ト耐性であるので
、宿主細胞自身がメトトレキセート感受性であるならば
、ＭＴＸ含有培地を選択の手段として用いることができ
るからである。

別法として、例えばネオマイシン耐性の如く、第２の薬
物選択マーカーを用いるならば、ＤＨＦＲ欠損でない宿
主細胞内で野生型ＤＩ（ＦＲ遺伝子を増幅のマーカーと
して用いることもできる。

後述する実施例においては、宿主細胞としてＣＨＯ細胞
を使用し、エイズ関連レトロウィルスの逆転写酵素をコ
ードしている発現ベクターを用いることとする。

後に詳しく述べる様に、本発明の診断用産物は、生きた
病原体に由来するこの産物の代替物（カウンターパート
）の代りに、類似のイムノアッセイに利用することがで
きる。この様な点から、市販の診断試験用キットには、
上記の診断用産物を、他の種々の免疫学的産物と一緒に
含有させることができる（但し、これらの内、少くとも
１個は相補的な抗体または抗原の検出のためにラベルさ
れている）。相補的な抗体、即ちＨＴＬＶ−１’［に対
する抗体と特異的に結合するのに充分な抗原決定基を有
しているＨＴＬＶ−［の特殊なタンパク質を分子クロー
ニングし、発現させることに関して、この系を説明して
きた。例示ポリペプチドをクローニングし、発現させる
」−で用いられる具体的な方法は、以後の実施例におい
て詳しく述べる。

血清、尿、または唾液の如き生物学的な液体、あるいは
皮膚標本等に含まれる未知量の抗原または抗体を定量す
る方法としては、数多くの方法が知られている。基本的
には、本発明においては、上記の如きタイプの、ある種
の分子クローンされた診断用試薬に置き換えて行うこと
を除き、その様な既知の方法を用いる。

従って、方法の詳細については従来の免疫学のテキスト
を参照することとし、方法そのものについては一般的な
記述に止めることとする。当業者ならば、本発明の新規
な診断用産物を従来の免疫学的な方法にどの様にして利
用するかについて、熟知しているであろう。

記述を簡単にするために、本明細書中では、一般的な用
語“診断用産物”または１診断剤”を、本発明の抗原機
能を有する産物を表すのに用いる。

１診断用産物”という語句は、エイズ関連レトロウイル
スによって惹起された相補的な抗体と特異的に結合し得
る１またはそれ以」−の抗原決定基を有する、エイズ関
連レトロウィルスの予め決定されたポリペプチド配列で
あると定義する。この診断用産物は、それを生産し得る
組換え宿主細胞内で形成される。このポリペプチド配列
は、該組換え細胞の表面膜に機能的に結びついているも
の、あるいは回収されて、宿主細胞の細胞膜を含まない
状態で用いられるもの、のいずれであっても良い。さら
に、この抗原性ポリペプチド配列は、第２のポリペプチ
ド配列と融合しているものであっても良い。

エイズ関連レトロウィルス、それを構成しているポリペ
プチド、並びに相補的な抗体の測定に用いる診断的方法
は通常の方法である。それらには、競合法、サンドイツ
チ法、および立体障害法が含まれる。最初の２方法にお
いては、相分離がこれらの方法を行う上でぜひ必要な工
程であるが、立体障害法は、単一の反応混合物系で行わ
れる。レトロウィルスまたはそのポリペプチドの測定法
と、レトロウィルスまたはウィルス性ポリペプチドと結
合する物質の測定法とは、測定すべき物質のサイズに応
じである方法が好ましいことがあるにしても、これらの
方法は本質的に同じである。従って、本明細書において
は、被検物質を、それが抗原または抗体のいずれである
かを問わすアナライト（被検体）と称し、このアナライ
トと結合するタンパク質を、それらが抗体、細胞表面受
容体または抗原のいずれであろうと結合パートナ−と呼
ぶこととする。

エイズ関連レトロウィルス、そのポリペプチド類、相補
的な抗体、あるいは細胞表面の受容体ζこ関する分析法
ではすへて、以下に示す試薬の１またはそれ以」−を用
いる：標識したアナライト類似体、固定化したアナライ
ト類似体、標識した結合パートナ−１固定化した結合パ
ートナ−および立体的な複合物（ステリック・コンジュ
ゲート）。

標識した試薬は”トレーサー”とも称される。

使用される標識にはアナライトとその結合パートナ−と
の結合を妨害しない限り、あらゆる検出可能な機能を利
用し得る。イムノアッセイに用いられる標識には、西洋
ワサビのペルオキシダーゼの如き酵素、１４Ｃおよび１
３１１の如き放射性同位元素、希土類のキレート類やフ
ルオレスセインの如き螢光間、並びにスピン標識等多く
のものが知られている。これらの標識とタンパク質また
はポリペプチドとを常法通り、共有結合的に結合させる
ことができる。その様な結合方法は、エイズ関連レトロ
ウィルス、ウィルス性ポリペプチド、相補的な抗体、並
びにレトロウィルス受容体などの、これら全てタンパク
質性物質について使用するのに適している。

ある種の測定法においては試薬の固定化が必要である。

固定化することにより、溶液中に遊離」７て残存してい
る全てのアナライトから、結合パートナ−を分離するこ
とができる。このことは、結合パートナ−またはアナラ
イト類似体の測定を開始する前に、これらを水不溶性の
マトリックスまたは表面に吸着させるか〔ベニッヒ（Ｂ
ｅｎｎ１ｃｈ　）ら、米国方法第３，７２０，７６０号
〕、または共有結合的にカップリングさせるか（例えば
、グルタルアルデヒド−交差結合の利用）、あるいは、
事後に、例えば免疫沈降法にかけてこれらパートナ−ま
たは類似体を不溶化する、などのいずれかの方法によっ
て達成される。

立体的なコンジュゲート類は、均一測定法（ホモジーニ
アス・アッセイ）のための立体障害法に於いて用いられ
る。これらのコンジュゲート類は、低分子量のハプテン
と小さいアナライトとを共有結合的に結合させることに
より、ハプテンζこ対する抗体が実質−１−１抗−アナ
ライトと同時には、このコンジュゲートと結合し得ない
様に合成されている。この測定法においては、被検試料
中に存在しているアナライトと抗−アナライトとか結合
すルノで、抗−ハブテンとコンジュゲートが結合し、そ
の結果、ハプテンが螢光団である場合には、螢光に変化
を来すこととなる。

その他、競合法やサンドイツチ法として知られている測
定法も営利的な診断薬産業界で同杼に確立され、広範に
利用されている。

競合測定法は、標識した類似体（“トレーサー”）と被
検試料中のアナライトとが、これらに共通の結合パート
ナ−上に存在する限られた数の結合部位に対して競合す
る能力に基つく方法である。通常、競合させる前、また
はさせた後に結合パートナ−を不溶化し、次いで、この
結合パートナ−と結合したトレー日ノ−−およびアナラ
イトを、結合していないトレーサーおよびアナライトか
ら分離する。

この分離は、デカント法（結合パートナ−が予め不溶化
されている場合）または遠心法（競合反応の後に結合パ
ートナ−を沈殿させる場合）によって行われる。被検試
料アナライトの量は、マーカー物質の測定量から求めら
れる結合したトレーサーの量と逆比例の関係にある。既
知量のアナライトに関する用量一応答曲線を調製し、こ
れと試験結果とを比較して被検試料中のエイズ関連レト
ロウィルス、ウィルス性ポリペプチド、または相補的な
抗体の量を定量的に求める。これらの不均一（ヘテロロ
ーガス）系測定法において、検出可能なマーカーとして
酵素を用いる系を、ＥＬｉＳＡ（イライザ）系と称する
。

もう一種の競合的な測定法は相分離を必要としナイ、均
一（ホモジーニアス）系測定法である。

この測定法では、酵素とアナライトとのコンジュゲート
を調製し、抗−アナライトとアナライトとが結合したと
き、抗−アナライトの存在によって酵素活性が変化する
様にする。この場合、エイズ関連レトロウィルスのポリ
ペプチドまたはその免疫学的に活性なフラグメントを、
ペルオキシダーゼの如き酵素に対し、三機能性の有機性
架橋構造を用いてコンジュゲートさせる。コンジュゲー
ト産物は、（Ｕ補的な抗体と一緒に使用され、この相補
的な抗体との結合によって酵素活性力州１害または増強
されることに基ついて選択される。この方法自体は、Ｅ
ＭＩＴという名称の下、広範囲に利用されている。

サンドイッチ測定法は、エイズ関連レトロウィルス、相
補的な抗体、あるいはレトロウィルスの細胞表面受容体
等のポリペプチド（即ち、高分子量の分子）の測定に、
特に有用である。連続的なサンドイツチ法においては、
固定化した結合パートナ−を用い、これに被検試料アナ
ライトを吸着させ、洗浄して被検試料を除き、次いで結
合したアナライトに標識した結合パートナ−を吸着させ
、次に、結合した物質と残りのトレーサーとを分ける。

結合したトレーサーの量は、被検試料アナライトの量と
直接的な比例関係にある。“同時”サンドインチ法では
、標識した結合パートナ−の添検 加削にへ試料を分離しな°゛・ 以上は、エイズ関連レトロウィルス、エイズ関連レトロ
ウィルスのポリペプチド、相補的な抗体並びにレトロウ
ィルスの細胞表面受容体の測定法の単なる例である。こ
れらのアナライトの測定のために、今日、または将来開
発される方法も本発明の範囲内に含まれることになる。

実施例の記載を簡単にするため、組換え法による組立て
に頻繁に現われ、良く知られている方法を短い熟語に略
して示す。

プラスミドは小文字のｐを先頭にし、そして／または大
文字および／または数字を続けることによって表わされ
る。本発明の出発物質であるプラスミドまたはＤＮＡの
起源は市販されているが、あるいは制限付で一般に入手
可能であり、あるいは公表された方法により、入手し得
るプラスミドまたはポリヌクレオチドから組立てること
ができる。更に、その他の同等なプラスミドも当業者に
は知られており、また、一般番こ、プラスミドは単に、
プレタンパク質およびそのコントロール配列のための、
あるいは中間体組立て物におけるそれらの要素のための
複製ビヒクルとして機能するだけであるから、その他の
同等のプラスミドは、通常の技術者にとって自明であろ
う。

ＤＮＡの“消化”とは、ＤＮＡを、該ＤＮＡのある位置
に対してのみ作用する酵素で触媒的に切断することを指
す。その様な酵素を制限酵素と称し、各酵素にとって特
異的な部位を制限部位（サイト）と称する。

本発明において用いられる様々な制限酵素は市販されて
おり、その反応条件、コファクター、およびその他必要
なものは、酵素の供給業者の指示に従って使用した。制
限酵素類は、一般に、各制限酵素が最初に得られた微生
物を表示する大文字、次いで他の文字、更に、通常、数
字からなる略号で表４つされる。一般に、約１μｇのプ
ラスミドまたはＤＮＡフラグメントを、約２０μｌの緩
衝液中で、約１単位の酵素と共に使用する。特定の制限
酵素について適当な緩衝液および基質の量は、製造業者
によって明示されている。通常、インキュベーション時
間は３７℃で約１時間とするが、供給者の指示に従って
変えてもよい。インキュベーションした後、フェノール
およびクロロホルムでタンパク質を抽出して除き、エタ
ノール沈殿により、水性のフラクションから、消化され
た核酸を回収する。制限酵素による消化の後、時たまで
あるが５′末端のホスフェートを細菌性アルカリホスフ
ァターゼで加水分解し、ライゲーション（下記）！こ際
してＤＮＡフラグメントの２つの制限的な開裂末端が”
閉環（サーキュライデイング）”したり、閉じたループ
を形成することにより、制限部位に他のＤＮＡフラグメ
ントを挿入し難くなるのを防止する。明示しない限り、
プラスミドの消化には、５′末端の脱りん酸反応は伴な
わないものとする。脱りん酸の方法および試薬は常法に
従う（３２）。

制限酵素による消化によって得られた特定のＤＮＡフラ
グメントの１回収”または“単離”とは、この消化物を
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて分離し、フラ
グメントの移動度を分子量既知のマーカーＤＮＡフラグ
メントのそれと比較して所望のフラグメントを同定し、
該フラグメントを含むデルの部分を取り除き、そのゲル
から通常電気溶離法によってＤＮＡを分離することを意
味する。この方法は一般的に知られている。

１ウエスタンプロツト法”とは、ポリペプチドの存在を
、標識した相補的な抗体との反応によって確認する方法
である。ポリペプチドをポ・リアクリルアミドゲル電気
泳動にかけて分離し、二・トロセルロース」―に電気泳
動的に移す。このニトロセルロースを、標識した相補的
な抗体と一緒にインキュベートし、結合しなかった抗体
を除いた後、残存している標識の位置を確認する。

１質転換”とは、ＤＮＡを生物内に導入することであっ
て、該ＤＮＡが染色体外成分として、あるいは染色体内
の組込み成分として複製可能な様に導入することを意味
する。特に明示しない限り、本発明において用いる方法
はＣａ　Ｃｌ　２形質転換法である（３３）。

０ライゲーシヨン（結合、連結）”とは、２個の二本鎖
核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成す
る工程を言う（３４）。特に明示しない限り、ライゲー
ションは既知の緩衝液と条件を使用し、略等モル量のラ
イゲートすべきＤＮＡ０．５μｇ当たりＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（“リガーゼ”）１０単位を用いて行う。

”埋め込み（フィル・イン）”とは、粘着末端化された
（突き出た）制限酵素フラグメントを修復することを意
味する。一般に、２〜１５μｇのＤＮＡを、５０ｍＭ　
　ＮＡＣＩ、１０ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）、ｌＱｍＭ
　　ＭｇＣＪ’　　　１ｍＭジチ第トレイトール中で、
２ＳＱｍＭづつの４種のデオキシヌクレオシド・トリホ
スフェート、および８単位のＤＮＡポリメラーゼ・クレ
ノー・フラグメントと一緒に、２４℃において３０分間
インキュベートする。フェノールおよびクロロホルムに
よる抽８月こよって反応を終止させ、エタノール沈殿に
付す。

形質転換体からＩ）ＮＡを”調製する”とは、プラスミ
ドＤＮＡを微生物培養物中から単離することを意味する
。明示しない限り、アルカリ性／ＳＤＳ法を採用した（
３４）。

ゞオリゴヌクレオチド”とは、短かい一本鎖または二本
鎖のポリデオキシヌクレオチドであって、既知の化学的
方法で合成され、次いでポリアクリルアミドゲル」−で
精製されたものである（３５）。

以下に示す実施例は本発明の本質をより完全に例示する
ため１・こ特に示したものであって、本発明の範囲を制
限することを意図するものではない。

実施例１ 本実施例ではプラスミドの構築および原核性発現宿主に
おける１］コＬ　Ｖ　−ＩＩＩ　のＰ−２４コアポリペ
プチドの発現について開示する。

Ａ、ウィルスの増殖およびウィルスＲＮＡの竿離Ｈ−１
’ＬＶ−ＩＩＩＢ／Ｉ（ｇ細胞（Ａ’Ｉ’ｃｃ　ＣＲＩ
−８５４，３）を、アーサーＣＤｒ、Ｌａｒｒｙ　Ａｒ
ｔｈｕｒ　、　７　レデリク・キャンサー・リサーチ・
ファシリティ−（Ｆｒｅ−ｄｅｒｉｃｋ　Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆａｃｉｌｉｔｙ）、７　レデリ
ク（Ｆｒｅｄ’ｅｒｉｃｋ）、メリーランド（ＭＤ）］
より入手した。培養物を、懸濁液中に保持し、５％Ｆ　
Ｂ　Ｓ、２ｍＭのし一グルタミンおよび１００μｇ／！
ｌのペニシリン−ストレプトマイシン混合物全補充した
ＲＰＭＩ　　１６４０に適合させた。容量１０で中に、
３×１０５生存細胞／　ｍｅの密度となる様に細胞を蒔
（播つき、蒔いてから約９６時間後、１Ｏ−１５Ｘ１０
５生存細胞／ｍｌ！の密度になったとき、培養物を収穫
した。

細胞を除去して清澄化した後、培養液を限外濾過によっ
て濃縮した。ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　　Ｌ８−
Ｍ限外２濾過器を使用し、ベックマンｓ　ｗ　−２７０
−ター中、２０チ〜６０係シヨ糖勾配中で、２７．００
Ｏｒｐｍで１６時間処理することにより、限外Ｐｉｆ４
濃縮物をバンド化してＨ’ｌ　ｒ−Ｖ　−ＩＩＩウィル
ス粒子を精製した。３０％〜４０％のショ糖フラクショ
ンを集め（プールし〕、’１’　Ｎ　Ｅ　［Ｉ　１０　
ｍａｔのトリス（ｐｌ’−１７，５）、０．ＩＭのＮａ
Ｃ，ｅ、１ｍＭのＥｌ）’１’Ａ：］で希釈し、ベック
マンのタイプ５０のローター中で超分画遠心してペレッ
ト化した。ウィルス粒子を、出発培地の約２０００倍の
濃度でＴＮＥに再懸濁した。これらの濃縮物は１　ｍｅ
当り２．５〜３．０　ｗＬｇのタンパクを含有していた
。

全ＲＮＡをＩ（ＴＬ　Ｖ　−ＩＩＩ　Ｂ／Ｈｇ細胞から
抽出した〔ベーガー等（１）ｅｒｇｅｒ、ｅｔ　ａｌ、
）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
　、↓炙、５１４３頁（１９７９）〕。

ポリＡを含有しているＲＮＡを、オリゴｄｌセルロース
上で分画して精製し〔アビブ等（Ａｖｉｖ。

ｅｔａｌ、）、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンス（米国′）（Ｐ、Ｎ、
Ａ、　Ｓ、Ｕ、Ｓ　、Ａ、　）１．、□、　５４６３頁
（１９７７）　］、ＣＩ）ＮＡの合成に使用した。

逆転写酵素で触媒されるｃＤＮｋ合成のために、ポＩＪ
ＡＲＮＡにオリゴｄ’Ｔを対合させてプライマーを作成
した［カポン等（Ｃａｐｏｎ　ｅｔ　ａｌ、）、ネイチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３０４．５０７頁（１９８３）
］。

ＤＮＡポリメラーゼＩによる第２のＤＮＡ鎖の合成は自
己プライム性であった。生成した二本鎖ＤＮＡをｓ　ｌ
ヌクレアーゼで処理することにより、生成した環（ルー
プ）にニックを入れ、−末鎖ヌクレオチドを除去した。

この平滑末端の二重鎖ＤＮＡを使用して１（ＴＬＶ−１
１１フアージライブラリー（ｐｈａｇｅ　１ｉｂｒａｒ
ｙ）を作成した。

上記の二重鎖ＤＮＡを、Ｔ　−４１Ｊガーゼを使って、
既知の技術（３５）で合成したＲ−１１Ｊンカー（３７
）に平滑末端ライゲーションした。このＲ−ｌ／ｃＤＮ
Ａを、シ遮Ｒ１消化したλＧ”［１０にライゲーション
して、開示（３７）のようなＨ’ｌ’Ｉ、Ｖ−ＩＩＩｃ
ＤＮＡライブラリーを作成した。

イン・サイチューハイブリダイゼーション（３２）を行
なうために、ファージライブラリー複製物をニトロセル
ロースに２回レプリカプレートし、そこにＤＮＡを固定
した。ｃＤＮＡライブラリーの作成に使用した、Ｉ−１
’１−　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩ感染■−細胞由来のポＩＪ　
Ａ陽性のＲＮＡから調製した、３２ｐ標識ｃ　１）Ｎ　
Ａで、−組のフィルターをハイブリダイゼーションした
。他の組のフィルターは、１（−Ｉ　Ｉ−Ｖ　−Ｉｎ非
感染の同一細胞系統（セルライン）由来の、３２Ｐ　標
識ｃｌ）ＮＡでハイブリダイゼーションした。

細菌性のｃＤＮＡクローン検出のために使用した方法（
３８）に類似する、分画ファージハイブリダイゼーショ
ン法によって多数のＨ−Ｉ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩ陽性クロ
ーンを同定することができた。

配列決定 上で同定したｃｌ）ＮＡファージライブラリー由来の［
−１■Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩクローンをＥｃｏＲＩ　　て消
化した。

このｃＤＮＡＤＮＡ全人体し、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）　　のＲＩ部位にサブクローンし、大腸菌
（Ｅ、ｃｏｌｉ）２９４　（ＡＴＣＣ３１４４６）中で
増殖させた。

この多数のサブクローンしたＲＩ挿人体をジデオキシ法
（３９）で配列決定し、第２ａ−２ｄ図に示すプロウィ
ルス性の配列を得た。

アミン末端配列決定 生存１（ＴＬＶ−ＩＩＩウィルス粒子を前記のようにし
て精製した。その構成成分であるタンパクを、ラエンメ
リ（Ｌａｅｍｍｅｌ　ｉ）緩衝液（４２〕を使用して１
２チポリアクリルアミドゲル上で分画した。ウィルスタ
ンパク約６００μｙづつを、還元柴件下、レーン（ｌａ
ｎｅ）毎に供給した（４１）。ゲルをクーマツシー（Ｃ
ｏｏｍａ　ｓ　ｓ　ｉ　ｅ　）ブルーで染色し、２４．
．０００ダルトンに相当する分子量を有するタンパクの
帯（バンド〕をゲルから切り出した。アミノ末端配列を
分析（４２）するためゲルからタンパクを電気溶出（４
１）させた。残基１６以外の、最初の１７アミン酸の配
列を第１図に示す。これに対応するＤＮＡ配列を、アミ
ノ酸配列の真下に示している。このＤＮＡ配列と第２図
のＨｌ　ＬＶ−ＩＩＩゲノムの配列との比較により、第
３図中ｐ７．１１　で示される、このペプチド配列を暗
号化しているＤＮＡ配列を含有する、１つの特定のクロ
ーンが啓示された。この約２．２ｋｂ（キロ塩基〕には
、前駆体ｇａｇ領域を含んでおり、かつ５′から３′に
向けて、Ｐ−１２、Ｐ−１５，２番目のＰ−１５タンパ
クであるＰ−２４、および３′、ｇａｇ領域にかけて約
３００の余分な塩基対を暗号化（コード）している。こ
の前駆体ｇａｇ領域のＤＮＡ配列およびこれに対応する
アミノ酸配列を第２図に示す。予想されるカルボキシ末
端のアミノ酸から３′側のＲ−１部位を含有する、２２
０アミノ酸からなるＰ−２４核（コア）タンパク領域の
部分的制限地図を、第３図のＰ−７，１１に示す。

、ｐ　７．１１のサブクローニング プラスミド７．１１をＦ、ｃｏ　Ｒ１で消化した。２゜
２重消化した。Ｒｓａｌ−ＰｓｔＩおよびＰｓ（Ｉ−Ｅ
ｃｏＲｌ　　配列を単離した。プラスミドｔｌｃ９（０
つを）県１１および旦（ｏ　Ｒ１で消化した。ｐ　［１
Ｃ９の大部分を含有する大きなフラグメントを単離し、
人すＩ−リ」■および片呈Ｉ　−ＥｃｏＲ１フラグメン
トとハイブリダイゼーションした。ＲｓａＩおよびｓｍ
ａＩ　　両平滑末端を１−４リガーゼでライゲーション
した。ｐＵｃｐ−２４と命名した。生成プラスミドを使
用して大腸菌２９４を形質転換した。

ｐＵｃｐ−２４の組み立てにおいては、Ｐ　−７，１１
のＲｓａＩ　部位を使用した。そうすることにより、最
初の１０個のＮ−末端アミノ酸がこの組み立てから除外
された。この１０個のアミノ酸を挿入するために合成オ
リゴヌクレオチドを組み立て擲５）。

コ（７）　３９−　ｍｅｒ　（量体）のＤＮＡ配列は、
式：で示される。このオリゴヌクレオチドの５′末端は
、絖いて行なうライゲーションのための合成シラ１（Ｔ
部位を含有している。両方の鎖をポリヌクレオチドキナ
ーゼでホスホリル化（りん酸化）した。

プラスミドｐ［］ｃ−２４をＢｌｍＨＩおよびΣＩＩで
消化した。このｐ　Ｕ　Ｃプラスミドの大部分およびＰ
−２４ＤＮＡ配列の３′末端を含有する大きなフラグメ
ントを単離した。プラスミド７．１１をＲｓａｌおよび
Σ円焦Ｉ　で消化した。ｐ−２４ＤＮＡ配列の５′か←
Ｓｐｈ　Ｉ部位までを含有するフラグメントを単離した
。このフラグメントおよび合成した３　９−　ｍｅｒを
、ｐＵｃ−２４から得た更旧−５ｐｈ　Ｉ　　フラグメ
ントとハイブリダイズした。３９−ｍｅｒおよびＲｓａ
　Ｉ　−５ｐｈ　Ｉフラグメント由来の平滑末端をＴ−
４１Ｊガーゼでライゲーションした。この、ｐ［ＪＣｐ
２４Ｉ−と命名したプラスミドを使用して大腸菌２９４
を形質転換した。

Ｃ０ｐ−２４コアタンパクおよび先端を切除したＰ−２
４コアタンパクの発現ベクター Ｐ−２４および先端を切除したＰ−２４発現ベクターの
組立て模式図を第４図に示す。

ｐＨＧｆ（−５ＲＣ−ｆ　ｓ　１−２の組み立てプラス
ミドｐ　ＳＲＣｅ　ｘ　１６　（４４）は、Ｐ　ＢＲ３
２２、およびＨＧ　ｉ（の最初の６９ヌクレオチドとＳ
ＲＣの６０．ＯＱＱＭｗのリンタンパク質を暗号化して
いるＤＮＡとの融合体（融合は大腸菌ｔｒｐプロモータ
ーの制御下で起こる〕を含有している。プラスミドがど
んなタンパクを暗号化していても、それは重要なことで
はない、むしろ、ｔｒｐプロモーターを含有していれば
、どんｆ、（ＰＢＲ３２２プラスミド誘導体で為っても
良い（４５）。

ｔｒｐプロモーター中のＥ（ｏＲＩ　　部位を破壊する
ため、プラスミドｐｓＲｃｅｘ１６をＥｃｏ□ＲＩで部
分消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ（Ｋｌ−ｅ
ｎｏｗ）フラグメントをイ吏用してふさぐ（うめる）一
方で、ＨＧ　Ｉ−Ｉフラグメントの開始部分にあるＥｃ
ｏＲＩ　　部位は残す。次いで生成したプラスミドｐＥ
ＡＲＩ　５Ｒ（ｌｅｅ　ｘ　ｌ　６を、プラスミドを開
裂するためにシュＲＩ　　で消化し、ＳＩヌクレアーゼ
で修飾して末端を平滑にし、次の構造： ５′ＰＡＡ且辞Ｍ］πＣＡＴ　３・ で示されるリンカ−（ＥＳ　ｌ−２Ｘ４６）にライゲー
ションする。このＦｓｌ−２リンカ−とのライゲーショ
ンにより、矢印で示したυ遮に■切断点に、上記構造式
において下線を施したＡＴＣの、直後にＥｃｏＲＩ部位
が阿生される。従って、以ｌで組み立てるｐ−２４／ｐ
−１５の最初のコドンの最初の塩基は、ベクターから供
給される。このプラスミドをｐＨＧＨ−５ＲＣ−Ｅ　ｓ
　ｌ　−２と称する。

完全な長さのＰ−２４発現ベクターの組み立てプラスミ
ドＵＣＰ２４Ｉ−をμｔｍＨ１１切断した。

この切断したフラグメントを、Ｑ、　５　ｍＭヌクレオ
チドトリホスフェートの存在下、ＤＮＡポリメラーゼＩ
のフレノウフラグメントで処理して、旦巴ＨＩ制限部位
をうめた。次いでこのフラグメントを月ｃｏＲＩで消化
した。Ｐ−２４およびＰ−１５（Ｐ−２４／Ｐ−１５）
　Ｉ）　Ｎ　Ａ配列を含有するフラグメントを単離した
。

プラスミドＨＧＨ−５ＲＣ−ｆ　ｓ　Ｉ−２をＥｃｏＲ
Ｉで切断し、前記のようにしてうめた。続いて、切断し
たプラスミドをＢａｍＨＩで消化した。ｔｒｐプロモー
ターおよびＡＴＧ開始コドンを含有するフラグメントを
単離した。このフラグメントを、馬−曵）ＩＩおよびシ
遣ｋＩ消化によって、消化ｐＢＲ３２２から得られたテ
トラサイクリン耐性を付与するフラグメント、およびＰ
ＵＣＰ２４１−から得られた平滑末端のへμ巴ＨＩ−Ｅ
ｃｏＲＩフラグメントとハイブリダイズした。平滑末端
同士をＴ−４１Ｊガーゼでライゲーションした。Ｐ２４
１）Ｅと称するこのプラスミドを使用して大腸菌２９４
を形質転換した。

形質転換体を、そのテトラサイクリン耐性により選別し
た。このプラスミドが発現することにより、完全な長さ
のＰ−２４コアタンパクおよびＰ−１５タンパクから成
るポリペプチドが産生されることが予想される。

Ｐ−２４７ラグメントの発現ベクターの組み立て プラスミドＰ−２４１）Ｅ　　は、Ｐ−２４コアタンパ
クのアミノ酸１７８−１７９を暗号化しているｌ）ＮＡ
配列の付近に位置するＨｉｎｄＩＩｌ制限部位を含有す
る。さらに、Ｐ−２４１）Ｅは、Ｐ−２４１）ＮＡＡ配
列３′に位置するｐＢＲ３２２由来のテトラサイタリフ
剛性遺伝子中に則国些−Ｉｎ部位を含有する。

μｌ１ｎｄＩＩＩでＰ−２４１）Ｅ　を消化し、次いで
アミノ酸１７９−２００およびＰ−１５タンパクを暗号
化しているフラグメントを除去し、Ｌｒｐ７”ロモータ
ーのコントロール下にある５’Ｐ−２４１）　ＮＡＡ配
列含有するフラグメントを再ライゲーションしてｐ−１
）Ｅ　−２４ａｌ−１１）　３と称するプラスミドを組
立てた。先端を切除したＰ−２４１）ＮＡＡ配列３′側
のｐ　ＢＮ２２２配列中にＴＡＡ停止コドンがあること
により、Ｐ−２４コアタンパクの最初の１７８アミノ酸
およびｐＢＲ３２２”）ＮＡＡ配列より暗号化されてい
る８個のアミノ酸残基が発現される。

実施例２ 本実施例では原核性宿主内において、１（Ｔ１．Ｖ　−
１１１のＰ−２４コアタンパク配列を、融合ポリペプチ
ドとして発現する、発現ベクターの、１１み立ておよび
クローニングについて開示する。

Ａ、ｐ−２４コアタンパクおよび先端を切断したＰ−２
４およびＰ−２４のフラグメントの混成ホリヘプチドを
発現するためのベクターの組立て模式図を第５図に示す
。

立て １　ラスミドＵＣｐ２４．Ｉ−を前記のように、す訓Ｈ
Ｉ　で切断し、平滑末端にし、ＥｃｏＲＩで消化した。

Ｐ−２４／ｐ−１５Ｄ　Ｎ　Ａ配列を含有するフラグメ
ントを単離した。

プラスミドＨＧＨ２０？−１（４，５）を４貼■および
Ｐｖｕ□ＩＩで消化した。Ｐｓ（Ｉ　　部位からＰｖｕ
□１１部位までの１（ＧＨ３’を暗号化する配列を単離
した。この配列は、Ｌμｍ部位から５′側のＩ）ＮＡＡ
配列および成熟ｆ（Ｇ　Ｈの最後の８個のアミノ酸残基
を除去されている。この２つのフラグメントを、テトラ
サイクリン耐性を伺与する遺伝子を含有するｐＢＲ３２
２由来のハｔｌ−Ｅ惺Ｒ１フラグメントに＃ハイブリダ
イズした。Ｔ−４１Ｊガーゼを使用してＰｖｕＩＩ部位
および平滑末端のＢａ卑Ｈ１部位をライゲーションした
後、ｐ　Ｉ−ＴＧ　Ｈｐ　２４−で Ａと称する得られたブラスミ整腸菌２９４を形質転換し
た。

プラスミドｐＨＧＩＩｐ２４　　Ａは、ｐＩ−（Ｇｌ（
３；’　Ｒの５′からＰ　ｖ　ｕ　−１１部位の間の成
熟ＨＧ　ｉ（アミノ酸残基を暗号化していない。このよ
うな残基を暗号化するｌ）　Ｎ　Ａ配列を、下記の方法
によりプラスミドに挿入した。

プラスミドＨＧ　Ｉ−Ｉ　３　ＩＲをへ１ユＩＩおよび
す１１で消化した。ｔａｃプロモーターおよびＢｇｌｌ
Ｉ部位までの成熟ＨＧ　Ｈを暗号化しているＨＧｆＩ５
′ＤＮＡ配列を含有するフラグメントを単離した。

プラスミドＩ−（Ｃ；ｔ４２．０７−１を屡ＩＩ　　お
よびＰＳＬＩ　　で消化した。ｆｌ　Ｇ　Ｈの一部およ
びＰ−２４の一部を含有するＢｇｌ　ＩＩ−Ｐｓｔ　Ｉ
　　フラグメントを単離した。同一のプラスミドをＰｓ
ｔＩおよびｓ±ａＩ　　で消化し、次いでＰ−１５およ
びＰ−２４の一部を含有するフラグメントを分離した。

この３種の単離したフラグメントをライゲーションして
ｐ　ｆ（ＧＨＰ　２４−Ｂを組立てた。このプラスミド
はｔａｃプロモーターの制御下で、Ｐ−２４コアタンパ
クおよびＰ−１５タンパクと融合した、１４Ｇ　ｆ（の
Ｃ末端の８アミノ酸が除去された、成熟ＨＧ　Ｈを発現
するためのｌ）　Ｎ　Ａ配列を含有する。

ｐ　ＨＧＨｐ　−２４ＢをＨｉｎｄＩＩＩＩ　　で消化
し、次いでライゲーションして、ｐ　２４１）　Ｅに対
して得たと同一の欠失が得られた。しかしこの生成した
配列は、Ｐ−２４の最初の１７８アミノ酸および発現プ
ラスミドの３′からｐ　−２４１）　Ｎ　Ａ配列までの
８個のアミノ酸残基番こ融合した、成熟ＨＧ　ｆ（の融
合ポリペプチド（９個のＣ末端アミノ酸が欠如した□□
□　ン　／ 〕を発現することが予想される。このプラスミドをｐ　
ＨＧ　Ｈｐ　−２４△１］Ｄ３と称する。

実施例　２ａ 本実施例は、ｇｐ４１エンベロープタンパクを暗号化す
るｃＤＮＡの単離、それを原核生物中で発現させるため
の修復、大腸菌でのｐ４１融合体の発現および発現した
融合体のインビトロでの再可溶化について開示する。

前記実施例ＩＡおよびＢに記載のようにして、ウィルス
性ｍ　ＲＮＡを単離し、このウィルス性ｍ　ＲＮＡから
ｃｌ）ＮＡを調製し、λＧＴＩＱファージにこのｃｌ）
ＮＡをクローン化した。ｃｌ）ＮＡクローンであるＨ９
ｃ、５３が、完全なｐ４１エンベロープ領域（ｂＰ７３
３６−８９９２、第２ｄ図９を暗号化するｃｌ）ＮＡを
含有していることを同定した。Ｈ９ｃ、５３を界２２−
■　　およびｌｌ１ｎｄＨＩで消・化し、プロウィルス
性ゲノムのヌクレオチド７４１７−７７２２に対応する
フラグメントＩを単離した。フラグメントＩは、ＶａＩ
ＧＩｎＡｌａＡｒｇ　で示されるアミノ酸残基およびＡ
ｓｎＴｙｒ−、ｒｂｒＳｅｒで示されるＣ−末端残基を
暗号化する。前記実施例ＩＢＩこ記載のようにして、フ
ラグメントＩを、ホスホリル化（りん酸化９した平滑末
端および５′ヒドロキシＥｃｏＲＩ末端を有する合成し
υＲＩアダプター（ＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＡσＣＴ
ＣＡＡＧＧの配列を有する）の過剰附にライゲーション
し、ＨｉｎｄＩＩｌで消化してライゲーションで生成し
たダイマーを切断することにより生成した３２６　　ｂ
ｐ　　Ｅｃｏ　ＲＩ−ＨＬ隻狭１１１７　ラグｌシトを
６％ポリアクリルアミドゲル上で単離した。

プラスミドｐＮＣＶ（５５ａ）を塾ユＲＩおヨヒＨｉｎ
ｄＩＩＩ　　で消化し、ベクターフラグメントを回収し
た。

３２６ｂｐフラグメントすなわちｇｐ４１をコードする
フラグメントをｐＮＣＶフラグメントにライゲーション
し、ライゲーション混合物を使用して大腸菌（Ａ、ＴＣ
Ｃ３１４４６）をテトラサイクリン而４性に形質転換し
た。テトラサイクリン耐性のプラスミド（ＰｔｒｐＬＥ
ｇｐ４１）を回収した。このプラスミドを第８Ａ図に示
す。ｔｒｐプロモーターの制御の下にあるこの読み枠（
オープン・リーディング・フレーム）は、大腸菌ｔｒｐ
Ｅ遺伝子生成物のアミノ末端とはヱに■アダプターによ
り暗号化したアミノ酸配列を伴うそのリーダーとが結合
した配列である１９０残基をアミノ末端に有し、かつ残
りのｐＢＲ３２２配列によって暗号化した１４残基をＣ
−末端に有するｇｐ４１融合体を暗号化する。この融合
は総計３０６残基を含有していた。

ｇ　ｌ）　４１融合体は、原核性ペプチドとｇｐ４］フ
ラグメントとのアミノおよびカルボキシ融合体であるが
、原核性配列のどちらかまたは両方を削除するが、また
は他の原核性、真核性または合成ポリペプチドで置換し
ても良いことは理解さ、れるであろう。アミノ末端融合
体としてよりむしろ、ｇＳ１フラクメントを暗号化する
ＤＮＡの直接発現を企みだ時の方が、細胞培養抽出物中
に免疫反応性物質を確認できなかった。この理由は不明
であるが、大腸菌中での未融合生成物の不安定性が関係
している可能性がある。従ってｇ　ｐ　４．１またはそ
のフラグメントは原核生物内でＮ−末端融合体として発
現させるべきである。そのような融合は、当然、大腸菌
のベリプラスミックまたは細胞外タンパク、たとえは特
にＳ　Ｔ　−ＩＩ熱安定性エンテロトキシンまたはアル
カリ性ホスファターゼの分泌リーダーとの融合体を包含
するだろう。この場合ｇ　ｐ　４．１は原核性配列を欠
いた成熟タンパクとして分泌されるだろう。信号ペプチ
ドと成熟ｇｐ４１フラグメントの融合体を暗号化するプ
ラスミドは、適当な両側面を持つ制限部位および必要な
らアダプターまたはリンカ−を使用して、ｔｒｐＬＥ−
アダプター配列の代りに既知の原核性シグナル配列を暗
号化する合成１）　Ｎ　Ａを、県１上Ｉ−Ｅｇｐ４１＋
こ挿入することにより容易に組み立てられる。残存する
全ての余分子、［ｌ）　Ｎ　Ａを、Ｍ１３ファージの欠
失突然変異誘発または他の通常の方法を使用して削除す
る。

特に疎水性残基に富む、ことにｇｐ４１の推定のトラン
スメンプラン領域内に含有される２８および２２アミノ
酸からなる２個の長い疎水性鎖である、アミノおよびカ
ルボキシ末端の近くの配列が包含されるのを避けるため
に、ｇｐ４１］）ＮＡの先端を切除して１０２残基のフ
ラグメントにした。

疎水性領域は、時には、大腸菌の生育に有害であること
が知られている（５６．５７）。残基２９−１３０に及
ぶ領域はｇｐ４１のアミノ末端に比べて相対的に、この
ような疎水性領域を含有していなかった。

しかし、哺乳動物細胞のような他の宿主細胞は、１万ま
たは両末端の疎水性領域を含有する無傷のｇｐ４１タン
パクまたはｇｐ４１フラグメントを発現させるのに適当
であることに注意が必要である。

大１１１％Ｊ’４　（ＡＴＣＣ：３１４４６　）をｐ　
ｔ　ｒ　Ｐｒ−Ｅｇｐ’ｌ　１　　で形質転換し、Ａ３
５ｏ値が６．６．９．１２．１７および２１になるまで
Ｍ９の最小培地で増殖させた。

全細胞性タンパクを１３％５Ｉ）Ｓポリアクリルアミド
ゲル」二電気泳動によって分離し、クーマツシーブルー
で染色した。結果を第８Ｂ図に示す。この図で、レーン
（ｌａｎｅｓ）ａ　−ｅは上記密度の高くなる順に対応
し、レーン１はｐＢＲ３２２で形質転換した対照からの
全細胞性タンパクを表わす（ｋは１０００ダルトンを表
わすつ。大腸菌の形質転換体は、予想した３０６アミノ
酸の大きさに一致する、見かけの分子量が３３，０００
ダルトンであるタンパク質を主として蓄積していた（Ｌ
Ｅｇｐ４１総細胞内細菌性タンパクの約１０重量％〕。

この組み換えＬＥｇｐ４１　を、υ」Ｉ−Ｅ−足口病ウ
イルスポリペプチド融合物について以前に開示された方
法（５５ａ）を用い、ゲル許過とイオン交換クロマトグ
ラフィーによって、タンパクを豊富にした屈折体から精
製した。特に、細胞を１０ｍＭトリス−ＨＣｅ、１ｍＭ
Ｅｉ）ＴＡ中で洗浄し、同緩衝液の４倍量中に再懸濁し
、超音波処理し、コーパル（Ｃｏｒｖａｌｌ）　　Ｇ　
Ｓ　Ａ　ｏ−ター中、５．００Ｏｒｐｍ　　で３０分間
遠心して屈折性の細胞体を集めた。粒子を、７Ｍグアニ
ジン塩酸塩、０，１％β−メルカプチオエタノール（Ｂ
Ｍ’Ｅ）で２回洗浄し、溶解した。生成した抽出物を、
ベックマンＴｉ５Ｑ　　ローター中で４時間、１９．０
０Ｏｒｐｍ　　で処理して清澄化した。高速上澄液をセ
ファクリルＳ−３００（５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３０
０，ファーマシアつカラムに通した。ＬＥｇｐ４１　　
を含有する包含容積からのフラクションを、Ｓ　Ｉ）　
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて同定し、
収集し、７．５Ｍ尿素、０゜１％ＢＭＨに対して充分に
透析した。この収集物を、１）ＥＡＥ−５２セルロー　
ス（Ｗｈ　ａ　ｔｍａ　ｎ　）　　上、７．５Ｍ尿素、
０．１％ＢＭＥ、１０ｍＭトリス−Ｉ（Ｃｚ（ｐＨ３，
５）でクロマトグラフィー処理した。

カラムから流出したＬＥｇｐ４１物質を集め、０．２１
ｎｇＳＡｎｇの濃度で、４Ｍ尿素、１０ｍＭトリス−１
’−ＴＣＰ（ｐｔＴ８．５　）　ヘ透析しｆｌ。コノ精
製り、　タＩ、Ｅｇｐ４１はＳ　ｌ）　Ｓ−ポリアクリ
ルアミドゲル上で、銀染色すると、９５ヂ１２ｊｔ均一
であった。ＬＥｇｐ４］はクリコシル化されなかった。

この精製操作は、ＬＥｇｐ４１　融合体を使って抗−Ａ
　ｌ　ｌ）　Ｓ抗体量を検定しようとする、患者の血清
を大腸菌のタンパクで予備吸着する必要を不要にした。

明らかに患者の血清中には、Ｌ　Ｅ部分に対する既存の
抗体はほとんど、または全くないが、少なくともＬＥｇ
ｐ４．１　　中におけると同じ立体配座をとっている該
抗体は存在しない。これは、ヒトが普通細菌性のタンパ
クにさらされているという事実があっても、Ｌ　Ｅのよ
うな細菌性タンパクと）Ｔ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩ　配
列との融合体を使用する免疫付与法によって、超免疫性
の応答が誘発される危険性は低いということをも暗示し
ている。ワクチンに使用するための原核性タンパク融合
体は、候補融合体と交叉反応する抗体の存在に関して正
常な個体から得たプール血清をスクリーニングすること
により、同定した。たとえば下記実施例２ｂに示すよう
な、ウェスタン・プロッティング（Ｗｅ　ｓ　＝ｔｅｒ
ｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）または放射性免疫検定のような
通常の方法を選別のために使用した。

実施例２ｂ 精製したＬＥｇｐ４］（実施例２ａ）を、記載（５８）
のように０．０５Ｍの炭酸ナトリウム（ｐＨ９，６）　
で、９６−ウェル（くぼみ〕の微量（力価〕検定プレー
トに塗付した。血清をＴＢＳで１：１００倍に希釈し、
塗付した微量検定くぼみ中、室温で１時間インキュベー
トした。ＴＢＳで３回洗浄した後、プレートを抗体−酵
素複合体（コンジュゲート〕（マウス　モノクロナル　
抗−ヒトＩｇＧ　　Ｆｃ　−西洋ワサビペルオキシダー
ゼ、トラベノールージエネンテク・ダイアグノスティッ
ク（Ｔｒ、ａｖｅｎｏｌ　−Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ　１）
ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）〕　と共に室温で２時間インキ
ュベートした。プレートをＴＢＳで再度洗浄し、３　、
３’、　５　、５’−テトラメチルベンジジンで顕色さ
せ、発色体を５９０　ｎｍのプレート・リーダ−（ダイ
ナチク、］）ｙｎａＬｅｃｈ）で測定した。負対照血清
の平均値の２倍以上の吸収値を有する試料を陽性として
評価した。

精製したＬＥｇｐ４］　　に対する有意の量の抗体を、
臨床上Ａ１１）Ｓと診断された１２７例の患者の血清中
１２５例（９８％）で検出した。対照的に、市販の全ウ
ィルスＥＬＩＳＡ試験材料を使用して予めＩｌｌ”　Ｌ
Ｖ　−ＩＩＩに対して血清陰性であることが分っている
３００例の無作為な血液化り者から得た血清は、切り捨
て吸収値（０１）５９０）０．１２　）を超えて■、Ｅ
ｇｐ４］　　と反応する例は全く見られなかった。

ＬＥｇｐ４４　　と反応しなかった２例のＡ　ｌ　ｌ）
　Ｓ患者の血清は、市販の全ウィルスｌ、ＩＳＡにより
反応しない唯２例のＡ　Ｉ　Ｉ）　Ｓ血清であった。こ
の血清の内１例はウェスタン・プロット法において全ウ
ィルスと反応したが、これは、Ｐ２４　　コア抗原との
反応に帰属し得る。もう１例のＬＥｇｐ４１　陰性のＡ
１１）Ｓ血清はウェスタン・プロット法においてウィル
スと反応しなかったが、この患者からウィルスを培養す
ることはできた。ＬＥｇｐ４１　　と１２５例の陽性Ａ
ＩＩ）Ｓ血清との反応は、３例だけで０　’Ｉ）５９０
値が〈０．４単位となったが、０．２１−１．６４０Ｄ
５９０単位の範囲内にあり、非常に敏感であった。この
ように、組み換えＬＥｇｐ４１は、ＡＩＤＳレトロウィ
ルス（ｒｅＬｒｏｖｉｒｕｓ月こ対する抗体の検出に優
れた特異性および感受性を示す。

同様に、精製ＬＥｇｐ４１ＥＬＩＳＡによって、ＡＴｔ
Ｃ（ＡＩＤＳ−関連コンプレックスつ患者および健康な
同性愛の男性の血清中に見出される抗体が検出された。

６９例のＡＲＣ患者の血清の内６０例（８６％）がＬＥ
ｇｐ４１　　と反応し、市販の全ウィルスＥＬＩＳＡと
実質的昏こ同一の結果を得た。９例の非反応性ＡＲＣ試
料の内、２例の血清はｐ２４のみに陽性であり、一方残
る７例の血清は、その内４例の患者からウィルスを回収
することはできたが全く非反応性であることが全ウィル
スを用いたウェスタン・プロット法により、明らかにさ
れた。

予想されるように、無症候性の同性愛の男性から得た血
清の小部分（２６／７５．３４％〕はＬ　Ｅ　ｇ　ｐ４
１ＥＬＩＳＡにおいて反応性であった。この群がらの２
６例のＬＦ、ｇｐ４］　ＥＬＩＳＡ陽性の血清は、市販
の全ウィルスＥＬＩＳＡで検出した２４例の陽性血清を
全部含み、かつ全ウィルスを使用するウェスタン・プロ
ット法で陽性であった。重要なことは、健康な同性愛者
の男性から得たＬＥｇｐ４１　血清陽性の試料のうち２
例が、市販の全ウィルスＥＬＩＳＡにおいて再現性ある
非反応性を示すことが判明したことである。

他の血清学的試験においては、虚偽の陽性反応を示すこ
とを特徴とする疾患〔全身性紅斑性狼瘤、リウマチ様関
節炎、人好性陽性単核症（ｍｏｎｏｍｕ−ｃｌｅｏｓｉ
ｓつまたはグツドパスチャー（Ｇｏｏｄｐａ　ｓ　ｔ　
−ｕｒり症候群〕を有する６人の患者から得た血清が、
ＬＥｇｐ４１　ＥＬＩＳＡ　＋こおいて、非特異的な反
応性を示すという証拠はなかった。さらに、特異性の試
験として、市販の全ウィルスＥ１、ｌ５ＡＩこおいてこ
れまで虚偽の陽性であった血清を、ＬＥｇ。

４１　ＥＬＩＳＡで試験した。市販の全ウィルスＥＬＩ
ＳＡで非再現性の陽性結果を示した５８の血清群は、Ｌ
Ｅｇｐ４］　　ＥＬＩＳＡにおいて反応しないことがわ
かった。さらに、市販のＥＬＩＳＡ試験において再現性
ある陽性の結果を示すが、より精密なウェスタン　プロ
ット検定では陰性を示す２５例の血清も、ＬＥｇｐ４１
　　ＥＬＩＳＡＩこおいて反応しなかった。

実施例３ 発現した組み換えポリペプチドのイムノアツセ実施例２
で示したプラスミドをそれぞれ含有する大腸菌２９４を
、始めにトリプトファンに富むＩ−ブロス中で培養した
。この培地はｔｒｐプロモーターを抑制する。Ｌブロス
培養物のＯ，Ｄが５５０ｎｍにおいて約０．５となった
後、トリプトファンを含有しないＭ−９培地に培養物を
移すことにより、組み換えポリペプチドの発現を誘起す
る。約１時間後、インドール酢酸を培地に加えて、約１
０μｇ／Ｉｅの最終濃度にし、さらに発現を誘起する。

さらに３７℃で５−６時間経過の後、細胞を遠心して集
め、溶解しく４７）、ウェスタン・プロット分析にかけ
る。

上で同定したプラスミドによって発現したポリペプチド
の免疫学的反応性を、トリトン処理したＩＩＴ　ＬＶ　
−ＩＩ　　レトロウィルスを接種し、続いて生きたＩＩ
　ＴＬ　Ｖ　−ＩＩＩ　　ウィルスで促進免疫（ブース
ター）したウサギの血清を用いて検定した。

インドール酢酸を追加したＭ−９培地で発現させ、Ｉ−
Ｔ　Ｔ　ｒ、Ｖ　−ＩＴＩ　ウサギ抗血清および１２５
Ｉて標識したプロティンＡ　（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ、）
　　と反応させた。Ｉ）　２４１）　ＥおよびＰ２４＋
）Ｅ△１（Ｄ３ポリペプチド、並ひにｐｌ’（ＧＨｐ　
２４　ＢおよびｐｌＩＧＨｐ　２４△…）３融合ポリペ
プチドのウェスタン・プロットを第６図に示す。Ｐ２４
Ｉ）Ｅポリペプチドに対する多数の免疫学的に反応性の
帯がレーン３に現われている。

約４４，０００ダルトンの分子量に対応する帯は、Ｐ−
２４およびＰ−１５を含有する発現タンパクに相当する
。意外なこと番こ、約２４，０００および１５゜０００
　の分子量の２つの二重線（ダブレット）も認められた
。これら二重線信号の原因は現在の所不明である。しか
し、天然番こ多シストロン性ｇａｇ領域で産生されるｇ
ａｇタンパクと一致する分子量のこれら二重線信号が検
出されたことは、この大腸菌株に、そのような前駆体ポ
リペプチド配列をプロセシングして、相補的な抗体によ
って検出され得る■ＩＴＩ、ｖ−■Ｉタンパクを産生さ
せることが可能であることを示している。ｐ　−２４，
ＤＥ」Ｄ３　　ポリペブタイドのウェスタン・プロット
を、第６図のレーン４に示す。ここでも、約２０，００
０ダルトンの分子量を有する二重線が認められる。Ｐ２
４１）Ｅに関して検出された４４．．０００ダルトンの
Ｐ−２４／ｐ−１５完全長さのＨＴ　Ｉ−Ｖ−ＩＩＩタ
ンパクおよび１５．０００ダルトンの二重線の欠如は、
上記のｐ２４ＤＥウェスタン・プロットの説明と一致す
る。

第６図の５および６レーンは、ｐＨＧＨｐ　２４　Ｂお
よびｐ　ＨＧ　ｌｉ　ｐ　２４△Ｈ１）３によって発現
した免疫学曲番こ反応性であるタンパクをそれぞれ含有
する。約６５．０００ダルトンの分子量を有するレーン
５の帯は、予想される、組立てられた構成ポリペプチド
に一致する。さらに、レーン６の帯は、予想した約４．
５，０００の分子量を有している。

ヒトＡＩＩ）Ｓ血清での検定 プラスミドＰ２４１）Ｅによって発現されたポリペプチ
ドを、ＡＩＩ）Ｓに苦しむ個体゛の血清との免疫学的反
応性に関して検定した。第７図にお（，１て、細片（ス
トリップ）３は、ヒトＡＩＩ）Ｓ血清および１２５Ｉ標
識プロテインＡで処理したＰ２４１）Ｅポリペプチドか
ら得られたウェスタン・プロットを表わす。約２４，０
００ダルトンの分子量を有する広がった帯が見られる。

細片２は、正常なヒト血清および１２５Ｎ標識プロテイ
ンＡで処理したｐ−２４ＤＥポリペプチドを含有する対
照である。細片１はサイズマーカーを含有する。この検
定は、本発明のポリペプチドを、ＡＩＩ）Ｓ関連レトロ
ウィルスによる暴露または感染に応答して作られる相補
的な抗体の検出に使用し得ることを示している。

ワクチン 本発明のワクチンは、前記の予め決定されたポリペプチ
ドおよび融合ポリペプチドについて考慮され、またこれ
らを含有している。次の実施例は、ＨＴＩ−Ｖ’−ＩＩ
Ｉ由来のＰ−２４ポリペプチド配列を含有するワクチン
の利用について開示するものである。しかし、ＡＩＩ）
Ｓ関連レトロウィルスのポリペプチド配列、特にレトロ
ウィルスゲノムのｅｎｖ領域によって暗号化されている
ポリペプチド配列ならば、どれを使用してもよい。

実施例４ マウスの免疫化 Ｐ２４ＤＥおよびＰ−２４ＤＥ△ＨＤ３　　に暗号化さ
れているポリペプチドを使用してＢＡＬＢ／Ｃマウスを
免疫化する。５０％の水性抗原および５０％の完全フロ
インドアジュバントから成る乳濁液（エマルジョン）２
００μｌ中に含有させた５−２５μｑのＰ−２４１）Ｅ
またはＰ−２４１）Ｅ△［−１１）３ポリペプチドで各
マウスを免疫化する。次のような多数の皮肉および皮下
部位（すなわち各後肢裏に２５μｌ、尻尾に５０μｌお
よび１００μｌを、背骨に沿った３−５の皮肉部位に分
配して与える９において各マウスを免疫化する。対照群
には、抗原を含有しない乳濁液を同様にして注射する。

−次免疫の４週間後に、不完全フロインドアジュバント
を用いて乳濁液を調製する以外は上記と同様にして、ポ
リペプチド５−２５μｇにより、マウスを促進免疫する
。促進免疫は、各マウスに、抗原を含む、または含まな
いエマルジョン２００μｌを、次の様に分配して、すな
わち尻尾に５０μで、および背骨に沿った皮肉部位に分
配して５０μｒ与えて行う。促進免疫の３週間後に、約
５００μｌの血液を尻尾出血により各マウスから採取す
る。この血液から得られた血清を、試験管内（インビト
ロ）での中和の研究に使用する。

インビトロでの中和研究 Ｐ−２４ＤＥまたはＰ−２４１）Ｅ△Ｈ１）３　　ポリ
ペプチドで免疫したマウスおよび対照群のマウスから得
た血清のＩ−ＴＴＬＶ　−ＩＩＩを中オロする能力を、
試験管内で試験する。連続的に希釈したマウスの血清（
２倍希釈、１：８から１　：　１６３８４まで）２５μ
ｌを、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ濃縮物１７５　ｔｉｅと共にダ
ルベツコ（１）ｕｌｂｅｃｃｏ）の改良イーグ／ｌ／　
（Ｅａｇｌり培地口で、３７℃において１時間インキュ
ベートする。インキュベーションの後、各希釈物を、９
６のくホミを有する組織培養プレートの各くぼみに入れ
た約４０．０００　ＨＵＴ−７３Ｔ−細胞（４８）　＋
コ適用−Ｊ−ル。

３−４日間インキュベーションした後、ウィルスの増殖
をＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ｎＩ　に対する免疫螢光検定仰）ま
たは逆転写酵素検定によって測定する。Ｉ−ＩＬＩＴ−
７８Ｔ−細胞ノＬＩＴ　Ｉ−Ｖ　−ＩＩＩ感染の欠如は
、ポリペプチドがマウス中でＩ−ＴＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩ
Ｉの中和抗体の産生を誘起したことを示している。

霊長動物での中和化抗体検定 マウス内で中和抗体を生じさせるポリペプチドを使用し
て、Ｉ（ＴＬＶ−ＩＩＩレトロウィルスに感染したとき
全身性のリンパ腺症を起こすことが知られているチンパ
ンジーを免疫する。実験群の各チンパンジーを、５０％
の水性抗原および５０％の完全フロインドアジュバント
から成る乳濁液２００μｌ中に含有させたポリペプチド
５０−１００μｇで免疫化する。各チンパンジーは下記
のように、多数の皮肉部位接種で免疫する。対照群には
抗原を含有しない乳濁液を注入する。４週間後に各群の
チンパンジーを、不完全フロインドアジュバントで調製
する外は上記と同様の乳濁液または抗原の乳濁液２００
μｌで促進免疫する。

促進免疫の５週間後、実験群および対照群のチンパンジ
ーを、種々のＩ（ＴＬＶ−ＩＩＩ濃縮物にチャレンジさ
せる。実験群のチンパンジーにおけるリンパ腺症の進行
を阻害するポリペプチドを、ＡＩＩ）Ｓ関連レトロウィ
ルスによる感染に抵抗する中和化抗体のヒトでの産生を
誘導し得るワクチンの候補とする。

完全フロインドアジュバントはヒトへの使用が許容され
ないので、ＩＩＴＬＶ＝ｌＩＩにチャレンジさせたチン
パンジーにおいてリンパ腺症を阻害すると同定された」
上記のポリペプチドを、ヒトでの使用に適する補助液（
アジュバントうで製剤化する。

このような製剤は、実験群のチンパンジーを免疫化する
ために使用する明ばん沈殿ポリペプチドコンプレックス
（２２）を含有していてもよい。対照群には補助液単独
をワクチン接種する。実験群においてリンパ腺症を阻害
する製剤は、ヒトワクチンとして使用してよい薬学的に
許容しうる賦形剤との混合物の形でポリペプチドを含有
する。

実施例５ ｐＨＧＨｐ−２４−ＢおよびｐＨＧＨｐ　２４△ＨＤ３
　　に暗号化されている構成ポリペプチドを、実施例４
で開示したと類似の方法で用い、Ｉ−ＩＴＬＶ−ＩＩＩ
レトロウィルスにチャレンジさせた免疫化チンパンジー
におけるリンパ腺症進行の欠如によって証明される、チ
ンパンジーにおけるＡＩＩ）Ｓ感染番こ対する耐性をど
の構成ポリペプチドが与えるかを決定する。しかし、こ
のような構成ポリペプチド内にＩＩＧＨポリヘプチド配
列を使用することは、このような構成ポリペプチドがヒ
ト対象内のｆ−Ｉ　Ｇ　ＩＩに対する自己免疫応答を誘
発することがあるので、ＡＩＤＳに関係したレトロウィ
ルスによる感染に対するヒトワクチンにおいては好まし
くない。従って、ヒトにおいてＡＩＤＳ関連レトロウィ
ルスによる感染に対する抗性を与えるための構成ポリペ
プチドのワクチンは、実質上、ヒト内に自然に存在して
いるポリペプチドに対する自己免疫応答を誘発すること
ができない２番目のポリペプチド配列との融合ポリペプ
チドとして発現された、ＡＩＩ）Ｓ関連レトロウィルス
の予め決定された配列またはそのフラグメントで構成さ
れているべきである。

Ａ　Ｉ　ｒ）　Ｓ関連ＲＮＡ依存性１）ＮＡポリメラー
ゼ（ＡＩＩ）Ｓ逆転写酵素９のポリペプチド配列を、そ
のような転写酵素の活性を抑制し、かつＡ　Ｉ　Ｄ　Ｓ
関連レトロウィルスによる感染、または感染した個体に
おける該レトロウィルスの播種を抑制する薬物として使
用し得る化合物を同定するための検定ζこ使用すること
が考えられる。ＡＩＩ）Ｓ逆転写酵素の抑制剤として知
られるスラミン（５３）について、次の実施例で明らか
にする。しかし、スラミンは、これをヒトに投与したと
き激しい臨床上の副作用（５３）を現わすので、他の転
写酵素抑制化合物を検定する予定である。そのような選
択的抑制剤の例はいくつかの研究室（５４）により明ら
かにされている。

実施例６ Ａ、ＡＩＩ）Ｓ逆転写酵素のクローニングおよび発現■
Ｔ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩのＡＩＩ）Ｓ関連レトロウィルス
逆転写酵素を暗号化しているウィルス性ゲノムのｆａ［
は、ヌクレオチド４６７４で終わる。そのＮ−末端は、
ヌクレオチド１６３９から約１８００にわたる領域内に
位置する。以下に述べる目的のためには、すべての任意
のアミノ末端を含んでいる、ｇａｇ領域（１６３９−１
７６９）内部こ位置するアミノ末端を選択することが好
ましい。ヌクレオチド１８００に近接した領域は、逆転
写酵素を発現する構築体の開始コドンとして有用な、多
数の適当ｆｊｍｅｔコドンを含有する。しかし本来位置
のｍｅｔコドンを選択することは重要でない。代りに、
外因性の、ベクターに担持されているＡＴＧコドンを、
部分的なエキソヌクレアーゼ消化物または逆転写酵素遺
伝子の５′領域のＭＩ３欠失突然変異体にライゲーショ
ンする。枠（フレーム〕内に正確に組み立てられた構築
物は、形質転換体細胞抽出物のＲＮＡを逆転写する能力
によって容易に同定される。

別法として、特定の宿主中で処理したような生体内（イ
ンビボ）で正常な逆転写酵素のＮ−末端を、感染細胞か
ら酵素を精製し、自体既知の方法に従ってアミノ末端を
配列決定し、アミノ末端のアミノ酸配列を暗号化するｃ
ＤＮＡヌクレオチド配列を同定することにより、決定す
る。好ましくは、図のＣＤＮＡをヌクレオチド１６４２
で切断すφｈ、！−ＩＩ、およびシ吐Ｉ　（５３６７）
で消化する。３７２５ｂｐフラグメントを回収する。シ
已ＩＩ　以外のＮ−末端切断部位は１７３８（以１ｅ　
Ｉ）および１７５４（Ａｌｕｌ）である。しかし、これ
らの酵素は、逆転写酵素遺伝子の内部の場所でも切断を
する。従って、完全長さの遺伝子を回収するためにはＤ
ｄ仝ＩまたはＡｌｕＩ　による部分的消化を行なう必要
がある。逆転写酵素遺伝子の遠位に位置するＳａｌ■以
外の他の切断部位はＳｔｕ　Ｉ　（４９８７にある）で
ある。

末端のライゲーション部位を有する逆転写酵素遺伝子を
コードしているＤＮＡを単離してから、このＤＮＡを複
製可能なベクターにライゲーション部位１１ ンする。ベクターは意図した宿主に依って選択するが、
これは、１）　Ｎ　Ａが単に複製されるべきが、または
酵素の発現のためにベクターを使用したいが、のいずれ
である力肩こよって変わる。通常、ベクターは細菌性複
製起源およびたとえばテトラサイクリン耐性の如く、抗
生物質性の選択遺伝子を含有する。これらの要素は、ｐ
ＢＲ３２２のような一般的に既知の多数のプラスミドか
ら得られる。

より高等な真核性細胞中で逆転写酵素を発現することが
好ましいので、ベクターはより高等な真核生物中で、遺
伝子の安定な複製のため、形質転換体の同定のため、遺
伝子の転写を促進するため、および転写したｍＲＮＡを
正しく終止させるために必要な要素をも含有する。これ
らの要素の・代表例として、それぞれ、ＳＶ４０複製起
源およびＴ抗原供給源〔コールド・スプリング・ハーバ
−・ラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉ（ａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒ　ｉｅｓ　）　から入
手することができる、ＣＯ５−１のような細胞系統中で
見い出される染色体への組み込み体により、供給される
）、マウスチミジンキナーセを暗号化する遺伝子、ＳＶ
４０の初期または後期プロモーターおよび肝炎Ｂの表向
抗原のポリアデニル化部位がある。そのようなベクター
は既知である、（たとえば引用文献ＥＰＡ７３゜６５６
．９２．１８２および９３，６１９　を参照）。

既知のベクターは、前記のようにして得られる逆転写酵
素１）　Ｎ　Ａを直接挿入するのに便利な制限部位を含
有していないかもしれない。このことは、新しい制限部
位の導入または粘着末端である制限末端を平滑末端に変
換する方法が自体既知であるため当業者にとっては障害
とはならないだろう。

たとえば、ＥＰＡ７３，６５６に示されているｐ　Ｈ５
９４中の肝炎表面抗原遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびり悪
ｔＩ　Ｉ消化で切開し、月ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩリ
ンカーヲｃ　１）ＮＡフラグメントのＢｇｌＩＩおよび
Ｓａｌ　Ｉ　部位にそれぞれライゲーションし、この修
飾されたｃｌ）ＮＡをｐｉ（５９４の消化によって得た
ベクターフラグメントにライゲーションする。次いでこ
の組み立て体をＥ　Ｐ　Ａ　７３，６５６に従って完全
なものにする。

逆転写酵素遺伝子を担っているベクターを、ＣＯ５−１
サル腎細胞系統（セルラインつまたはＣ１１Ｏ（チャイ
ニーズハムスター卵巣）細胞系統のような許容宿主にト
ランスフェクションする。他の安定な真核生物の細胞系
統を宿主として使用してもよいし、同様に適当な複製起
源およびプロモーターを付与する酵母菌および原核生物
〔酵母菌に対しては、ミクロン複製起源およびメタロチ
オ△ ネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）（７）プロ
モー１−の如きプロモー〉−５細菌に関しては、ｐＢＲ
３２２複製起源、およびＡ１１）Ｓ関連レトロウィルス
のｇａｇおよびエンベロープタンパクの原核生物ｉこお
ける発現に関連して本明細書中の別の箇所に記載したｔ
ｒｐのようなプロモーター〕を使用してもよい。

これに関して、ｇａｇおよびエンベロープポリペプチド
のような他のＡＩＤＳ関連レトロウィルスタンパクを、
酵母菌または鋪乳動物のいずれにせよ、通常のレトロウ
ィルスの宿主に対し、原核生物よりさらに近接した系統
発生的関係を有する真核生物細胞中で発現させることも
できる。

好ましくは、多量のｒｎ　ＲＮＡが蓄積するまでは細胞
に対するポリメラーゼのあらゆる毒性効果が最小となる
ように、誘導可能なプロモーターの制御下における組み
換え培養で逆転写酵素を合成する。

別法では、意図した宿主によって認識され、処理される
信号配列（例えば、より高等な真、植生物の場合には、
インターフェロン、インシュリ、ンノ如き分泌型ホルモ
ンまたはウィルス性表面抗原のための既知の分泌シグナ
ル配列が含まれる月と、酵素を暗号化する遺伝子をその
５′末端においてライゲーションする。

Ｂ、逆転写酵素阻害作用の検定 ＡＩＩ）Ｓの逆転写酵素を発現する細胞培養物を溶解し
、等量ずつ分割する。種々の量の被験化合物を、溶解物
の各分割液に加える。ポＩＪ　Ａのオリゴヌクレオチド
をオリゴｄＴプライマーおよび３２ｐ標識ＴＴＩ’と一
緒に各分割液に加える。３７℃でインキュベートした後
、酸沈殿計数量を測定する。

次いで、ＡＩＩ）Ｓの逆転写酵素を阻害するがヒ）　１
）ＮＡポリメラーゼを比較的阻害しない化合物を、さら
に試験管内の毒性および有効性検討のために選別する。

別法では、ＡＩ　ＤＳの逆転写酵素を、免疫親和力吸着
、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　）ゲル濾過、イ
オン交換クロマトグラフィーおよび未処理のポリアクリ
ルアミドゲル上での等電点電気泳動を含む、自体既知の
方法により発現宿主から回収する。次いで回収した逆転
写酵素を使用して、前記のように化合物を検定する。

実施例７　　Ｅ’ポリペプチドのクローニングおよび発
現 Ａ　Ｉ　Ｉ）　Ｓ　関連性レトロウィルスのＥ′ポリペ
プチドは、第２ｄ図中で１Ｅ′」として示される２０６
残基のポリペプチド、天然に存在するその対立遺伝子、
またはＡＩＤＳ関連性レトロウィルス番こ感染した細胞
中で産生されるＥ′ポリペプチドと結合し得る抗血清と
免疫学的な交差反応性を有する、そのアミノ酸配列変異
体として定義される。下記のＣ末端欠失誘導体に加えて
、該ペプチドの、１−ＩＴＬ　Ｖ　−Ｉｌｌまたはその
他のＡＩＤＳ関連性レトロウィルスに感染した患者から
の血清との免疫学的反応性を実質的に変化させない、そ
の他の欠失、挿入またはｆｆｆｉＪＪ誘導体も、本明細
書で用いる「Ｅ′ポリペプチド」または「Ｅ’蛋白質」
という語の範囲内部こ包含される。さらに別の欠失便異
体の例は、Ａｒｇ１９に至る最初の１９残基が欠失して
いるＥ′蛋白質である。−ドに述べるｔｒＬＥ融合は、
挿入変異体である。他の変異体は当業＠には明らかであ
ろう。これらは組換え合成法によって容易に製造でき、
または成る一定の欠失の場合は蛋白分解的加水分解によ
り製造できる。

本発明によれば、ＡＩＤＳ関連性レトロウィルスによっ
てコードされていないＡＩＤＳ関連性レトロウィルス感
染細胞由来の蛋白質を含まないよう、Ｅ′ポリペプチド
を組換え方法によって生成できる。このようなポリペプ
チドは、明らか番こＡＩＤＳ関連性レトロウィルスのビ
リオンとして存在しない。

ｃＤＮＡクローンＨ９，ｃ　５３はＥ′配列を含んでい
た。このＥ′配列を、ヌクレオチド８３７５で始まる配
列として第２ｄ図番こ示す。８３７５番のＡＴＧより下
流の読み取り枠中にある最初の停止コドンは、ヌクレオ
チド８９９３にあるＯＰ停止コドンである。この停止コ
ドンの直前のＣｙｓ残基が、恐らくこのＥ′ポリペプチ
ドのＣ末端であろう。しかしながら、このＣｙｓ残基よ
り上流にある他のＣ末端もまた本発明の範囲内にある。

Ｅ′ポリペプチドは、第２ｄ図に示す最後の約５０残基
の内の任意の残基をＣ末端とする配列を含み、好ましく
はリジンまたはアルギニン残基より下流で、かつこれに
隣接する残基をＣ末端とする配列がよい。

ｉｚｄ図のＩ礼′ポリペプチドとバクテリアのポリペプ
チドとの融合物を合成するための発現プラスミドを以Ｆ
ｉこ記載する。８９．ｃ５３　　の一部をＨａｅｌｌｌ
およびＸｈｏ）で消化し、Ｅ′残基１４〜３４をコード
している６２ｂｐフラグメントを回収・した（フラグメ
ント１）。別試料をＸｈｏＩおよび川ｎｄ１１１で消化
し、アミノ酸３５〜２０６をコードし、停止コドン、引
き続き非翻訳３′配列を含んでいる７１．９ｂｐフラグ
メントを回収した（フラグメント　２　）　。

ソノ５′末端１ｃＥｃｏＲＪ粘看末端を有し、ｌ−１ａ
　ｅ　ＩＩＩ’　ｉこより生成されたフラグメント１の
鈍端（平滑末端）へのライゲーションのための３′鈍端
で終わる、Ｅ′ポリペプチドの最初の１３残基をコード
している以下のような配列を有する合成オリコヌクレオ
チド（フラグメント３）を調製した（３５）。

ｐ　Ｎ　ＣＶ　（５５ａ　）を゛、いずれもｐ　Ｎ　Ｃ
Ｖ中の唯一のサイトであるＥｃｏＲ■およびＨｉｎｄｌ
ＩＩで消化し、ベクターフラグメントを回収した。この
ベクターフラグメントを同時にフラグメント１．２およ
び３番こライゲーションし、ライゲーンヨン混合物を大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）　２９４に導入し、抗生物質耐
性コロニーを同定した。プラスミドＤＮＡの調製番こよ
り、耐性コロニーからｐｔｒｐＬＥ−Ｅ’が得られた。

このプラスミドの構造を第９３図に示す。

ｐｔｒｐＬＥ　−Ｅ’　は、Ｃ末端において完全なＥ′
配列と融合したバクテリア（大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　
）由来の蛋、白質（Ｌ　Ｅ　）をコードしている連続的
（開放〆 ）読み取り枠（オープンリーディングフレーム）を含ん
でいる。

このプラスミドを、以下のようにＥ′蛋白質融合物（Ｌ
、Ｅ−Ｅ’）の製造に使用した。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　
１）２９４菌株にｐｔｒｐＬＥ−Ｅ’　を導入（トラン
スフオーム）し、テトラサイクリン５ｍｃｇ／ｍｅを含
むしく１１０） １３７唄ス（３２）中で一夜増殖させ、テトラサイクリ
ンを含むＭ９ブロス（３２）中に１：５０ｉこ希釈し、
そして５５０　ｎｍ　ｉこおける吸収が０．５となるま
で３７℃で増殖させた。誘導細胞培養物２５ｍ１Ｖから
総（全）細胞蛋白質を調製した。細胞を、０．０１Ｍ　
ト　リ　スーーＨＣｊイ（ｐ＋（７，５）、　０．００
１　Ｍ　Ｅ　ＤＴＡ、　０．０３Ｍメルカプトエタノー
ルおよび０．８％Ｓ　Ｉ）　Ｓの１／２５０谷川に１１
）鯉濁し、２分間煮沸し、冷アセトン３答ｉｔで沈殿さ
せた。Ｓ’１）Ｓ−ポリアクリルアミドケル負萄緩衝液
中で煮沸することにより、沈殿した蛋白質を再溶解した
（４０）。

非修飾１較′配列を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で直接発
現させる最初の試みは、この蛋白質の明らかな不安定性
の故に失敗した。しかしながら前述の方法は、Ｅ′ポリ
ペプチドの大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中での充分な発現を
もたらした。Ｌ　Ｅは、ＬｒｐｌＪ−グーの翻訳された
配列およびｔｒｐＥ遺伝子産物から誘導される１９０残
基の蛋白質であり（５５ｂ）、これはインビボで安定な
不溶性凝集体を形成し、大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）ｉこおける他の外来蛋白質の合成をうまく安
定化するのに使用されている（５５ｃ、５５ａ）。

ｐ　ｔｒｐＬＥ−Ｅ’からのＩ−Ｅ　−Ｅ’融合蛋白質
の発現は、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ｔｒｐプロモータ
ーおよびＬｒｐｌＪ−グーリボゾーム結合サイト（第１
３図）の支配下にある。ｐｔｒｐＬｌ鳳−Ｅ′により形
質転換された大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の培養を、ｔｒｐ
プロモーターを抑制解除するため、上記のようなトＩＩ
ブトファン個渇条件下に増殖させ、その蛋白質を１０％
５Ｏ８−ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動およびク
マンーブルーを用いる染色〔こよって分析した。第８ｂ
図番こ示すように、プラスミドｐｔｒｐＬＥ−Ｅ’を含
んでいる細胞は著量なＭｒ４１，０００の蛋白質を蓄積
しており（ｂ列）、これはＰＢＲ３２２ｉこよって形質
転換された大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の培養には存在しな
い（Ｃ列）。Ｍｒ４１，０００蛋白質は、予期サレる１
゜Ｅ−Ｅ’融合蛋白質の２つの重要な特徴を有している
。第１ｉこ、この蛋白質はＬ　Ｅに対する抗血清と血清
反応性であり、第２に、これは、サラ１コ２０６の付加
的なアミノ酸を含んでいる蛋白質に対して予想される大
きさｉｃ合致する、Ｉ−Ｅ　（＄　８１）図、３列）よ
り２２，０００大きいＭｒを有する。

Ａ　Ｉ　Ｉ）　Ｓレトロウィルスに暴蕗の後、ＬＦ、Ｅ
’かヒトの血清により認識される抗原サイトを示すか否
かを調べるために、ｐＬｒｐＬＥ−Ｅ’　により形質転
換された大腸菌（１’：、ｃｏｌｉ）から抽出した総細
胞蛋白質を、ウェスタン・プロット・アッセイにおける
抗原として使用した。個々の血清はます、大腸菌（Ｉｉ
、　ｃｏｌｉ　）蛋白質の＝Ｔ溶性抽出物（遮断抽出物
）によって予備吸着さぜたが、後にこれは不必要とわか
ったという事に留意されたい。

ウェスタン・プロット・アッセイにおいては、総細胞性
蛋白質を、ｐｔｒｐＬＥ−Ｅ’、（第８　ａ図）または
ｐｔｒｐＬＥ−ｇｐ４１　　（前述）により形質転換し
た大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ）の誇導培養から調製し、
前記のように５ＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル上
で電気泳動した。蛋白質を、記載（５５ｅ）のよウニニ
トロセルロース紙（ソート）に電気泳動的に移した。５
％正常ヤギ皿清およびｐ１３Ｒ３２２で形質転換した大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）からの蛋白質遮断抽出物５　ｍ
ｃｇ／　ｍｌを含むＴＢＳ緩衝液（０，０２５Ｎ４トリ
：ｚ、　−Ｆ（Ｃｌ（ｐＨ７，２）、０．１５　Ｍ　Ｎ
ａＣ１および０．０５％トウイーン２０）中で、１：２
００希釈の指示した血清と共に、個々のプロット紙片を
室温で一夜インキユベートした。遮断抽出物は、バクテ
リアを０．ＯＩＭ’）リス−１（Ｃβ（ｐＨ７，５）、
０．１５ＭＮａ（４１および０．５％ＮＰ４Ｑの中で超
音波処理し、１０，０ＯＯＸ、９で遠心分離して不溶性
残渣を除くことにより調製した。ｐＮＣＶ　　またはｐ
ｔｒｐＬＥ−Ｅ’で形質転換された大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ）から調製した総細胞蛋白質を、各々Ｌ　ＥまたはＬ
Ｅ　−Ｅ’蛋白質と血清との予備吸着に使用した。ＴＢ
Ｓ緩衝液中で入念に洗浄後、この紙片を、ビオチン化し
たヤギの抗ヒトまたは抗ウサギＴｇＧ（ベクター・ラポ
ズ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓ　）　）、アビジンを結合
とコンジュゲートさせた西洋ワサビペルオキシダーゼ（
マイルスーイエーダ（Ｍｉｌｅｓ　−Ｙｅｄａ　）　）
と共に順にインキユベートシ、そしてペルオキシダーゼ
の基質（ＴＢＳ中の４−クロロ−１−す７トールＱ、　
５　ｎｌｌ　／　ｍｅおよび過酸化水素０．１６％）で
展開させた。各インキュベーションの後、紙片をＴＢＳ
で入念に洗浄した。

３７％のＡ　Ｉ　Ｉ）　Ｓ患者（１７／４６　）、８１
％のＡＲＣ患考（２１／２６）、および３９％の健康な
同性愛男性（２９／７５　）からの被験血清は、ＬＥ−
Ｅ／イムノプロットとの明瞭な反応を呈し、一方、無作
為抽出した供血者からの３７の血清のいずれについても
反応は見出せなかった（下の表１）。ρｔｒｐＬ　Ｅ　
−Ｆ’の誘導体であるプラスミドｐｔｒｐＬＥ１７−Ｅ
′で形質転換した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）からの総細胞
蛋白質を抗原として用いたウェスタン・プロット実験に
おいて、同一の結果がこれらの血清の代表的集合につい
て得られた。これらの細胞は、Ｌ　Ｅ蛋白質の１〜１７
残基のみが存在しているという点でＬＥ−Ｅ／と異なる
融合蛋白質であるＩ−Ｅ　ｌ　７−Ｅ’ヲ発現Ｌ、Ａ　
Ｉ　Ｉ）　Ｓ−関連血清とＬＥ−Ｅ’ｉ合蛋白質との間
に検出される血清反応性は、Ｅ′配列にＮ゛随するエピ
トープに特異的であることを示している。

Ｆ−’　：　ＬＥ−Ｅ’　　ウェスタン・プロット・ア
ッセイにおける反応性、ｇｐ４１：ＬＥ−ｇｐ４１ウェ
スタン・プロット・アッセイにおりる反応性（上の実施
例参照）、ＷＪ３：全ウィルスのウェスタン・プロット
・アッセイにおける反応性、ＨＨＭ：健康な同性愛男性
、対照：無作為抽出供血者の試料。

”　コノ個体ハ１Ｉ−Ｔ’　Ｉ−Ｖ−１１１培養アツセ
イ°において陽性であった。

（］））３７の対照血清は全て市販の全ウィルスＥＬＩ
ＳＡ（アボット）において血清反応陰性であった。

異なるＡ　Ｉ　Ｉ）　Ｓ危険群におけるこのＬＥ−Ｅ’
およびｇｐ４１の血清反応性の比較から、２つの重要な
点が明らかである。第１に、Ｌ　Ｅ　−Ｅ　’　の血清
反応性は、ＡＩＤＳ患者においてはｇｐ４１の血清反応
性よりはるかに低い頻度で検出される（３７％対９６％
）が、ＡＲＣ患考（８１％対８５％）および健康な同性
愛男性（３９％対３２％）からの血清についてはほぼ同
じ頻度である。第２に、かなりの数の健康な同性愛男性
がＬＥ−Ｅ’　に対してｒ１１７） は血清反応陽性であるがｇｐ４１に対してはそうでなか
った（１１／７５）。Ｅ’Ｊこ対する抗体が、より少数
のＡＩＤＳおよびＡＦＬＣ患者（３／７２）　　と同様
に、統計学的に有意な数（１１／７５）の健康な同性愛
男性、即ちＡ　Ｉ　Ｉ）　ＳおよびＡＩｔＣに進展する
危険性の高い群において、ｅｎｖ抗原に対する抗体より
速やかに検出されるという事実は、特にＥ′の当該Ｍｒ
の蛋白質がビリオン構成成分として検出されていないた
めに全く予想外かつ驚くべきことであり、また、Ｅ′は
明らかな分泌リーダーを含まないため、当該蛋白質を血
清中に見出すことは予期されていなかった。ｅｎｖ抗原
に対する血清変換を、全ＨＴＬＶ−Ｊウィルス（５５ｅ
）または組換えＬＥ−ｇｐ４１　抗原（上記）のいずれ
かを利用するウェスタン・プロット法によってモニター
した。各アッセイ共に、臨床診断されたＡＩＤＳ患者か
らの血清の検出において〉９８％の信頼性を有する。

ここで調査した健康な同性愛男性の多くがウィルス抗原
と同様Ｅ′に対して血清反応陰性であり、したがって該
ウィルスに暴露されていないと思われるので、この試料
中のＥ′モｇｐ４１−の個体の実際の比率は、３１％（
１１／３５）もの高率になるかも知れない。これらの結
果は、ＩＩ　ＴＬ　Ｖ−和か無症状の血清反応陰性のヒ
トのリンパ球から分離できる（５５ｍ）という従来の所
見に関連し、Ａ　Ｉ　Ｉ）　Ｓレトロウィルス暴露に対
する初期の臨床診断およびスクリーニングのためのかな
り実際的な重要性を有するかも知れない。

ウィルス暴露を受けた無症候性の個体およびＡＲＣ思者
に見出された状況とは対照的に、Ａ　Ｉ　Ｉ）Ｓ患者に
おいて１尤′に対する抗体はｇｐ４　ｌ　ｅｎｖに対す
る抗体よりすっと低い頻度で検出される（３７％対９６
％）。Ａ　Ｉ　Ｉ）　Ｓ思考の同様な低頻度反応性のパ
ターンは、これまで、放射免疫沈降分析において、主要
な外皮蛋白質ｇｐ１２０ｅｎｖと比較した際の核（コア
）蛋白質ｐ２４ｇａｇ　について圧目されてきた（５５
ｎ）。この現家かＡ　Ｉ　ｆ）　Ｓに進展する特異な罹
患性を表わしているかとうかは確実でないが、この事が
、ウィルス外皮抗１県に対してよりもＥ′およびＰ２４
ｇａｇ　に対する抗体価の選択的減少または低い抗体価
を反映しているり能性がより高い。

Ｈ−ｒ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩ感染細胞におけるＥ′発現の
直接的証拠を得るために、Ｅ′に特異的な高力価抗血清
を、調製用Ｓ　ｆ）　Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により単離したＬＥ−Ｅ’でウサギを免疫処置する
ことによって調製した。Ｌ　Ｅ　−Ｅ’を含むゲル部分
（約１００ｍＣｇ）を削り取り、フロイント不完全アジ
ュバント中でホモジナイズし、２週間の間隔をおいて皮
■投与した。３５Ｓ−ンスティンで代謝的にラベルした
Ｈ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−Ｉ１１感染細胞の抽出液からＥ′−
関連蛋白質を免疫沈降させる能力について、このウサギ
血清をスクリーニングした。この目的ニｆ１、市販（７
）　Ｈ９／　Ｉ　Ｉ　Ｔ　Ｉ−Ｖ−］［Ｂ　（ルライ７
を使用した。何故なら本発明者等は、この細胞が、Ｅ′
翻訳産物をコードすることができる可能性のある１、　
７〜１．９　ｋｂｍＲＮＡ　　（〜１％のポリＡ＋ＲＮ
Ａ）を高レベルに産生ずることを、以前に観察していた
からである（５５ｅ）。４回抗原を注射した後に、２匹
のウサギから得た血清は、１９／ＨＴＬ　Ｖ　−Ｊｌ［
Ｂ細胞から５〜６種の別個のＭｒ２３，５００〜２８，
０００　の蛋白質を免疫沈降させることができた。同じ
動物から得た免疫前血清は、これらの蛋白質のいずれを
も免疫沈降させなかった。さらに、この免疫血清は非感
染Ｈ９細胞においてはこれらの蛋白質のいずれをも検出
しなかった。免疫血清によってｒ−１９／　ｔ（Ｔ　Ｌ
　Ｖ　−１１１１Ｂ細胞中に検出された蛋白質は、Ｍ　
ｒ　２８，０００．２５，５００および２５，０００の
主要な蛋白質ならびにＭ’ｒ　２６，５００および２３
，５００の少量の蛋白質を含んでいた。幾つかの実験に
おいては、Ｍｒ２３，５００の蛋白質は、区別できる２
種類に分けることが可能であった。

３人のＡ　Ｔ　Ｉ）　Ｓ患者および１人のＡ　ＲＣ患者
からのＬＥ−Ｅ’陽性血清は、ｉ（Ｔ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩ
Ｉ感染細胞から、対照供血考からの血清によっては沈降
しない〜Ｍｒ２８，０００および２５，０００（７）蛋
白質を免疫沈降させることができた。しかしながら、こ
れらの蛋白質の免役沈降は、Ｌ　Ｅ　−Ｅ’蛋白質によ
って一部提示されるに過ぎず、ＬＥ−Ｅ’　トＡ　Ｉ　
１）Ｓ　およびＡＲＣ血清が、組換え蛋白質によっては
提示さく１２１） れないＥ′抗原決定基を認識することを示唆している。

このウサギ抗血清はＡ　Ｉ　Ｉ）　Ｓ関連性レトロウィ
ルスのＥ′ポリペプチドと結合できる抗体を含んでいた
が、ＡＩＤＳ関連性レトロウィルスにヨリコードされる
他のいかなるポリペプチドと結合できる抗体をも含まず
、さらに、結合したＥ′ポリペプチドも含まなかった。

通常、固定化して分離を容易にする。例えば、抗血清ま
たは抗体を、ポリオレフィン、例えばポリスチレンの微
量定量プレート孔に、または抗ウサギＴｇＧ（例えばヤ
ギ）を予備吸容させであるマトリックスに結合または吸
着させる。

次に、このＥ′蛋白質を、哺乳類の組換え細胞培養中で
発現させた。本発明者等の出発プラスミドは、本発明者
等が簡単に入手できる成るプラスミドを使用する複雑な
方法によってｐＦＤｌｌ（Ｅ’Ｐ１１７．０６ＯＡ）か
ら得た。この方法は当業者の使用には好ましくない。代
わりに、出発プラスミドｐＦＤｌｌは、以下の方法によ
って取得するのが好ましい。ｐＦＩ）１，１４、その唯
一のＨｉｎｄｌｌ［サイトにおいてＨｉｎｄ　Ｊｌｌで
消化し、ベクターを回収する。

閂己夕１１： を有するアダプターをベクターフラグメントにライゲー
ションし、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　２９４に導入スル
。ｐｌ’１）ｌｉｄ　をアンピンリン耐性コロニーから
得る。ｐＦＩ）ｌｌへのアダプターのライゲーションに
より、このマウスＩ）　ＨＦ　Ｒ遺伝子のすぐ上流にＢ
ａｍ１４Ｉ　およびＣ１ａｌサイトが導入される。

ｐＦＤｌｌｄ　をＢａｍｆ−ＩＩ　およびＣ１ａｌで消
化し、ベクターフラグメントを単離する。

ｉｌｇＧ、５３をＢａｍ　ｌＩＩおよびＴａｑＩで？ｆ
４化し、ヌクレオチド８０５３の位置にある１３ａｍＨ
Ｉ　　サイトの■流のｅｎＶ遺伝子部分、Ｅ′暗暗号化
成域およびヌクレオチド２３２に至る非翻訳３′領域を
含んでいる、このヒトｂＰ　　フラグメント（フラグメ
ント４）を＃Ｌ離した。非翻訳３′領域は、３′の長い
末端の反復を含んでいた（ＬＴｋ）。ｐＦＤｌｌｄ　ベ
クターフラグメント（上記）をフラグメント４にライゲ
ーションし、大腸菌（Ｆ、、ｃｏｌｉ）　２９４をトラ
ンスフェクトした。ｐＳＶＥ、Ｅ’ＤＩ−ＩＦＲをアン
ピシリン耐性コロニーから得た。こうしてＥ′暗号化■
）ＮＡは５Ｖ４Ｑの初期プロモーターの転写制御下に置
かれ、一方ＬＴＲは、ｄｈｆｒ遺伝子の転写を進める（
　ｐｒｏｍｏｔ　ｉｎｇ　）配列と共に、Ｅ′遺伝子転
写物の開裂およびボリアテニル化のための配列を提供し
た。

ＣＩ（Ｏｄｈ　ｆｒ−Ｋ　Ｉ　ＤＵＸ−Ｂ　１１細胞（
５５ｆ）を、１０％牛脂児血清を含有するＩ）　Ｍ　Ｅ
　Ｍ培地で増殖させた。ｐＳＶＥ、Ｅ’ＤＨＦＲによる
トランスフェクションを、記載された（５５ｈ）リン酸
力ルンウム沈殿法によって実施した（５５ｇ）。ベクタ
ーに６時間暴露させた後、細胞にＰ　Ｂ　Ｓ中の２０％
グリセリン（ｖ／■）で衝撃を与え（５５ｉ）、非選択
培地で１−１／２日間増殖させた。次いで細胞を選択培
地（グリシノ、ヒポキサンチン、およびチミジンを欠き
、１０％の透析牛胎児血清を添加したＦ１２培地）中を
通過させ、２〜３日ごとに培地を供給した。個体数およ
そ３００の耐性コロニーが２週間後にひと固まりになっ
て形成した。最初のｄｈｆｒ（−コロニーの１つを免疫
沈降分析したところ、かろうじて検出可能なレベルのＥ
′を示した゛。この個体群を、メトトキセート（メトト
レキセート）中での発育について選択することによ・す
、さらニｐ　ＳＶＥ、Ｅ’ｌ’）ＩＩＦ’Ｒニー）　イ
ー（増幅させた（５３ｊ、５５ｋ）。オヨそ２×１０５
の細胞を１０　’Ｍのメトトキセートを含む選択培地を
入れた１−００ｍＴ）Ｉの皿に蒔き、培地を２日ことに
換えた。３週間後、この培地（Ｃ１−１０７Ｆ、’　１
００）ニ個体数およそ５ｏの耐性コロニーがひと固まり
になって現われ、Ｅ′蛋白質を以下のことく回収した。

細胞を遠心分離により果め、リン酸緩衝化食塩水（Ｐ　
Ｂ　Ｓ　）で沈子し、０．５％アプロチニンを含有する
ＲＩＰＡ緩衝液〔０，０５Ｍトリス−１−ＩＣ１（ｐＨ
７，５）　、０．１５ＭＮａＣｇ、１％トリトンＸ−１
，００，１，％デオキソコール酸およヒ’　ｏ、　ｉ％
ドデンル硫酸ナトリウム〕２ｍｅ中で溶解（溶菌）した
。抽出物を、免疫前ウサギ血清１０ｍｃに共に４℃で２
時間予備インキュベーンヨンし、パンソルビン（カルビ
オケム）５０ｍＣｌで２回澄明にし、ウサギ抗ＬＥ−Ｅ
’血清２ｍｃに共に４℃で一夜インキユベーションした
。免疫沈降物をパンソルビンｌ　Ｏｍｃに共に３０分間
インキユベーンヨンし、遠心分離によって集め、ペレッ
トをＲＩＰＡ緩衝液で２回、水で１回洗浄した。この免
疫沈降物を可溶化し、Ｅ′を限外濾過、電気泳動または
その他の常套の技術によってウサギ抗体から分離した。

商業的規模においては、抗体または抗血清を予め不溶化
し、Ｅ′をｐＨ３〜５の緩衝液を用いてこの固定化した
免疫吸着体から溶離する。

Ｉ　Ｘ　１０−７Ｍのメトトキセート（ＣＨＯ／Ｅ’。

１００）中に現われたコロニ一群は、Ｌ　Ｅ　−Ｅ’に
対するウサギ血清によって特異的に免疫沈降するが免疫
前ウサギ血清では免疫沈降しない２種のＥ′暗号化蛋白
質をかなりの量生成した。ＣＨＯ親細胞からは、免疫血
清でいずれの蛋白質も検出できなかった。さらに、Ｃｆ
（Ｏ／Ｅ’、１００細胞において検出された両Ｅ′関連
蛋白質の免疫沈降は、Ｌ　Ｅ　−Ｅ′蛋白質によって容
易に競合されたがＴ−Ｅ蛋白質によっては競合されず、
この事実は、当該反応がＥ′配列に特異的であることを
立証している。

直接的比較により、ＣＨＯ／Ｅ’、１００細胞で生成し
た２種のＥ′関連ポリペプチドは、Ｈ９／ＨＴＬ　Ｖ　
−１１目３細胞で観察されたＭｒ２８，０００および２
６．５００の蛋白質と同一の電気泳動上の移動性を有し
ていることがわかる。さらに、ＣＨＯ／Ｅ’。

１００　およびｒ（ｇ　／ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ細胞中の
これら２種の蛋白質の相対量は実質上相等しい。しかし
ながら、２８，０００および２６，５００　Ｈ９／ＨＴ
ｉ−Ｖ−］１［Ｂ細胞蛋白質が、ここで生成したＥ′関
連組換えポリペプチドと化学的に同一であるかどうかは
確かでない。パルス標識化試験は、ＣＨＯ細胞培養中の
いずれの蛋白質も他方の直接の前駆体ではなイコとを示
した。Ｍｒ２８，０００および’２６．５００１Ｌ′蛋
白質のおよそ８０〜９０％はトランスフェクトされたＣ
ＨＯ細胞の細胞質ゾル分画内に含まれていた。ＣＨＯ／
Ｅ’、１００培養からの細胞上清の免疫沈降は、分泌さ
れたＥ′蛋白質を示さなかった。

バクテリアを除去するため、ポリペプチドの溶液を０．
２２ミクロンのフィルターに通すことにより、この組換
えＥ′ポリペプチドを滅菌する。ポリペプチドを所望に
より例えばゲルｐ過によってさらに精製し、このポリペ
プチドを等張食塩水、Ｄ５Ｗ等のごとき製薬上許容し得
る担体中に製剤化することにより、このＰ液をワクチン
に調製する。

使用するＥ′蛋白質の量は、皮下注射、これに続く追加
免疫静脈注射の際に、対象に検出し得る量の抗Ｅ′を産
生きせるに充分な量とする。これは被験対象に必ず免疫
学的競合を起こさせることとなるであろうから、抗原の
用量頻度および投与経路は、診察を行なっている医師に
より、血清中の抗Ｅ／レベルのモニターを通して決定さ
れねばならない。

Ｅ′含有ワクチンは、所望により、ｇｐ４１のような従
来決定されているその他のＡ　１．　Ｉ）　Ｓ関連性レ
トロウィルスのポリペプチドを含有していてもよい。

これは、潜在的なＡＩ　ＤＳ関連性レトロウィルスの感
染に対する免疫応答の完壁な強化を確実にするのに役立
つであろう。

ウィルスの再生産および病原性におけるＥ′遺伝子蛋白
質の役割は、これらの研究により提起された、解答の出
ない重要な疑問点として残っている。

イムノプロットにより、Ｌ　Ｅ　−Ｅ’について血清反
応性の個体を検出することは容易にできるが、全ウィル
ス抗原については容易でないということは、Ｅ′がビリ
オン構成成分でないことを示唆するものであるが、また
、ウィルスの精製中にＥ′が失われたという説明も可能
である。ＡＩＤＳ関連性血清により免疫沈降する、ｆ−
（Ｔ　Ｌ　Ｖ　−１１［−感染０９細胞中のＭｒ　２５
，０００〜２８，０００の未確認蛋白質についての記載
（５５ｏ１５５ｎ、５５Ｐ）があり、これがＥ′蛋白質
に相当するのかも知れないが、同ポリペプチドはＨＴＬ
Ｖ−ＩＩＩビリオン調製物中には検出されなかった（５
５ｏ、５５Ｐ）。ＣＨＯ／　Ｅ’、　１００細胞におい
ては、殆んどの細胞内Ｅ′は核分画ではなく細胞質分画
に見出されており、この事は、Ｅ′が転写開始のような
核内でのできごとに関係しているのではないことを示唆
している。しかしながら、これらの研究は、感染細胞中
のＥ′の位置を正確には反映していない可能性があるた
め、予備的に考慮せねばならない。

転写のマツピング研究は、Ｅ′が感染細胞中で豊富に発
現されている蛋白質であるかも知れないことを示唆しテ
イル。ｎ　ｇ　７１−ＩＴ　ｔ、　ｖ　−ＩＩＩ　Ｂ　
細胞において合成されたウィルスＲＮＡのおよそ２０％
は、５′からｇａｇまでの配列を含んでいる２８９ｂｐ
のリーダー、ｅｎｖの上流に位置する中央のエクソン、
およびＥ′遺伝子を含んでいるゲノムの３′末端から１
，３ｋｂの配列から成る、スプライシング（スプライス
）された１、７〜ｌ、９ｋｂのサブゲノムＲＮＡの一団
を表わしている（５５ｅ）。ｐｏｌまたはＰ′饋域から
始まるさらに２つの短い非翻訳ＩＪ　−ダーのうちの一
方もまた存在するかも知れない。

２個のスプライソング受容サイト（ヌクレオチド５．３
５９位および５，５５８位）のいずれを利用するかによ
って、２６８　ｂｐまたは６９ｂｐ　　のとちらかの中
央エクソンが生成する（５５ｅ、５５Ｑ）。２６８ｈｐ
エクソンは６９　ｈｐエクソンには無い２個のＡＵＧト
ＩＪプレットを含んでおり、このうち一方がｔａｔ読み
取り枠の開始コドンとして働くと思われる（５５ｑ）。

６９　ｈｐの中央エクソンを含んでいる１、、　７〜１
．９　ｋ　ｂ　ｍＲＮＡ１ｆｉオイ”’Ｃハ、予想すし
たＥ′のＡＵＧ開始コドンに１個のＡＵＧトＩＪプレッ
トが先行しているが、にもかかわらす、上流のＡＵＧ）
リプレットが不都合なヌクレオチドと接しており（５５
ｒ）、かつＥ′ＡＵＧイニシエータ−より充分」二流の
枠内終了コドンかこれに続＜（５５Ｓ）ことから、本発
明者等は、該Ｅ’ＡＵＧ開始コドンを翻訳開始のために
有効に利用できると期待した。この−４二流のＡＵＧト
ＩＪプレットを含んでいるプラスミ）’（ｐｓＶＥ、Ｅ
’ＤＨＦＫ）　を用いてＣｆ（０細胞においてＥ′蛋白
質を効率良く発現させることができたことにより、本発
明者等の期待は確実なものとなった。４，３ｋｈのウィ
ルスｍ　ＲＮ　Ａ　クラスの中の２個の中央エクソンの
うちどちらを使用するか（５５ｅ）が、同様に、ｉａｔ
読み取り枠がｅｎｖ遺伝子に先行するか否かを決定する
。Ｅ′およびｅｎｖ蛋白質またはｔａｔ読み取り枠のい
ずれかをコードするｍ　ＲＮ　Ａを生産する機序が、特
異なスプライシングであるとすれば、それはＡＩＤＳレ
トロウィルスの再生産における決定的な調節現象を表わ
すことになろう。

Ｅ′ポリペプチドまたはこれに対する抗体は、十に概説
したように常套のアッセイ法で使用する。

被験対象の体液（血清、唾液、血漿、尿など）中のＥ′
ポリペプチドのアッセイのためには、「競合」型試験キ
ットは、好ましくは、ＬＥ−Ｅ’または上記Ｅ′のいず
れかの種類のようなＥ′ポリペプチドを標識化（酵素、
放射性同位体、螢光性の基、等）したもの、Ｅ′ポリペ
プチドと結合し得る抗体、そして所望により、インキュ
ベーションおよび洗浄緩衝液のごときその他の常套の試
薬を含むであろう。この試験キットは、選択的標識と一
緒に用いる自体既知の方法、例えばＥＬＩＳＡ、ラジオ
イムノアッセイまたは螢光分極を用いた方法のために、
使用する。同様に、常套の１サンドイツチ」アッセイも
また、被験対象試料中のＥ′ポリペプチドまたはその抗
体の存在を調べるのに有用である。Ｅ′蛋白質のアッセ
イはＡＩＤＳの診断としては珍しい。何故ならこのアッ
セイは、ＡＩＤＳビリオンの精製物には存在しないが、
このウィルスのゲノム番こよってコードされており、イ
ンビボにおけるウィルス感染および／または複製の過程
で宿主細胞により明らかに発現される蛋白質を調べるこ
とを目的とする、初めて知られた方法であるからである
。このような蛋白質の検出は１、ｅｎｖのごときビリオ
ン抗原の蓄積およびｉ（Ｔ　Ｌ　Ｖ・−］［−暗号化蛋
白質に対する宿主抗体の産生に先立つ、ウィルス感染の
最初の指標を構成すると信ぜられるため、好ましい診断
上のアプローチである。

標準的ハイブリダイゼーション・アッセイ、例えば各々
サザンまたはノーサン・アッセイを用いてＥ′蛋白質を
コードしているＤＮＡまたはＲＮＡについての体液のア
ッセイを行なうことも、やはり本発明の範囲内にある。

このようなアッセイに用いられるＤＮＡまたはＲＮＡは
、単に第２図のＥ′をコードしている配列とハイブリダ
イズできれはよく、Ｅ′蛋白質をコードしている必要は
ない。

こうした核酸は、オリゴヌクレオチドとして容易に合成
し、次いで第２図に示すＥ′ポリペプチド暗帰化ＤＮＡ
とハイブリダイズする能力についてスクリーニングする
ことができる。この診断用核酸は、放射性リン（１「）
等のごとき検出可能な尾部を用いて常法により標識する
。

実施例８　分泌型のＨＴ　Ｌ　Ｖ　−１［レトロウィル
ス・エンベロープタンパク質の哨乳類細胞内での組換え
合成 第ｔ　１　ａ図はウィルス性ゲノムと、該ウィルスの５
個の主な読み枠（メジャー・リーディング・フレーム）
それぞれの位置を示す図である。ｅｎｖ読み枠は本実施
例で用いるウィルス性エンベＯ−プをコードしている。

アミノ酸残基６１〜５３１をコードしているエンベロー
プフラグメントを分泌型（分泌された）エンベロープ・
タンパク質を発現させるために用いた。このフラグメン
トを、哨乳類細胞内で分泌させるのに必要な成分、並び
にこの組込まれた遺伝子を適切に発現させるのに必要な
成分を含有しているベクターにライゲートした。［５ｖ
４０起源（ｏｒｉ）Ｊは５Ｖ４Ｑウイルスの初期プロモ
ーター（ｒＥＪ）を含有しており、このプロモーターを
ＡＩＤＳレトロウィルスエンベロープ、またはジヒドロ
葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子のいずれかの転写を作
動するのに用いる。

転写の終止、およびメツセージ・ポリアデニル化は、Ｉ
３型肝炎ウィルスの表向抗原遺伝子（「Ｉ−Ｉ　ＥＶ　
ｓＡｇ　　ポリＡツクナル」）の３′−非翻訳領域から
尊かれたングナルを用いて達成される。大腸菌内での増
殖は、ｐＢＲ３２２の複製起源と、該プラスミドのアン
ピンリン耐性遺伝子（ｒＡＰＲＪ）との介在により、達
成される。最後に、ｄｈｆｒ遺伝子を欠くチャイニーズ
ハムスクレノ卵巣（ＣＨＯ）細胞をトランスフェクトし
、分泌させるために、選択マーカーとしてネズミのｄｈ
ｆｒ遺伝子を用いる。

一般に六手呵能な出発プラスミドからこのベクターを組
立てるために考えられた方法は、下記の如く、実際に用
いられている方法の改良法である。

ｐＥ３４８１−ＩＢＶ　Ｅ４００Ｄ２２　（ンモンセ７
（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ　）ら、１９８３［プロシーデイン
ダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイ
ｆ−７７、イズ（ＰｒｏＬ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、）ＵＳＡｊ　Ｂ□：　２４９５）をＨｐａ■て消
化し、線状プラスミドを回収した。これらＨｐａ■粘着
末端をＤＮＡポリメラーゼ■のクレノーフラグメントで
平滑末端化し、ベクターフラグメント■を回収した。暗
号配列：ＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＡＣＴＡＡＧ
ＴＡＡＧＡＴＣＴＡＧ　ヲ有スル、平滑末端化二本鎖停
止リンカ−をベクターフラグメント■にライゲートし、
得られたライゲーション混合物を用いて大腸菌２９４を
トランスフェクトした後、ＡｍＰｒコロニーからベクタ
ーを回収する。下線を施した配列は、３つの可能な読み
枠各々における停止コドンを表している。停止リンカ−
を介在させることにより、ｅｎｖタンパク質のＣ末端に
合成の９残基ポリペプチドが導入されること番こなる。

この停止リンカ−を付されたベクターをＸｂａｌ：で消
化してクレノーで平滑末端化し、ＥｃｏＲｌ：　で消化
することにより、５７０６ｂｐ　のベクターフラグメン
ト２を回収した。この消化により、肝炎Ｂ表面抗片の暗
号配列が除去される。

ＨＴＬ　Ｖ　−１１ルトロウイルスのｅｎｖ　ｃｌ）Ｎ
Ａを含有している」二記のクローンＨ９ｃ、５３をＨｈ
ａＩで消化してフレ／−で平滑末端化し、ＥｃｏＲＩ　
　消化すること番こより、ヌクレオチド５３２４［Ｅｃ
ｏＲＩ部位（サイト）］からヌクレオチド７３９４（ｅ
ｎＶアミノ酸５３１の１−１　ｈ　ａ　Ｉ部位）に及ぶ
フラグメント３を回収する。フラグメント３とベクター
フラグメント２とをライゲートシ、これで大腸菌をトラ
ンスフェクトシ、アンピシリン耐性コロニーからベクタ
ー４を回収した。

ベクター４をＮｄｅ　■で消化しくＮｄｅ■部位はｅｎ
ｖタンパク質のアミノ酸６１に対応する）、クレノーで
平滑末端化してＰｓｔＩで消化し、ベクターフラグメン
ト５を回収する。この工程によってＡｍＰｒ遺伝子内に
位置する１個のヌクレオチドからｅｎｖタンパク質の、
３′方向に向かって残基６１までに存在する配列が除去
され、その結果、レトロウィルス性ソゲナルと、ｅｎｖ
タンパク質の６１個のＮ末端残基とが除去されることに
なる。

ｐｇＤｔｒｕｎｃＤＨＦ’Ｒ（ＥＰ１３９，４１７Ａ）
をＰｓｔＩとＰｖｕ　［で消化し、Ａｍｐｒ遺伝子の３
′部分（前の工程においてベクター４から除去された配
列に対応する部分）、ＳＶ４０複製起源、２５残基のヘ
ルペスｇＤタンパク質シグナル、並ひにこの成熟ｇＤタ
ンパク質の最初の２５個のＮ−末端残基を含有している
１５１４＋）ｐの７ラグメント６を回収する。フラグメ
ント５と７ラグメント６とをライゲートし、得られたラ
イゲーション混合物を用いて大腸菌２９４を形質転換し
、ＡｍＰｒコロニーからｐＡＩＤｓｅｎｖＬｒＤＨＦＲ
を回収した。

当業番ならば、ｐ４１−ウィルス性タンパク質融合物の
発現のための上記ベクターに適宜改良を加え、単純性庖
疹ウィルス以外のウィルスのポリペプチドを発現させる
ことができるということが分る。例えば、肝炎表向抗原
との融合は、表面抗原の停止コドンの代りに、先端を切
断された、あるいは無傷のままの成熟ｐ４１タンパク質
をコードするＤＮＡを挿入するが、あるいは、逆に、出
発プラスミドとして例えばｐＦ、３４８ＨＢＶを用いる
ことにより、容易に達成し得る。適切な制限部位と合成
アダプターを選択することは当業者にとって通常の技術
範囲内のことである。

ヘルペスｇＤングナル以外のシグナル配列も同様に用い
られる。過当なシグナルには、自体既知の、分泌型真核
性（好ましくは非−霊長類性）ポリペプチド、または哺
乳類を宿主域とするウィルス類のシグナルが含まれる。

ンおよび選択 トランスフェクションの前日に、ＣＨＯＤＨＦＲ細胞を
全面生長させた１０ｃｔｉの皿（ｄｉｓｈ）　から得た
細胞を、Ｆ１２／ＤＭＥＭＣデルベッコ（Ｄｅｌｂｅｃ
ｃｏ’ｓ　）の改良イーグル培地〕、１０％ＦＢＳ（ウ
ソ胎児血清）七ＧＨＴ（グルタミン、ヒボキサンテン、
チミジン）モペンーストレップ（ｐｅｎｎ−ｓｔｒｅｐ
）抗生物質を入れた２枚の１Ｏｃ４の皿中で１：１０に
分割（スプリット）し、３７℃において１夜増殖させた
。

７５λ１０ｍＭ）リス、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、１０μ
ｙプラスミドＤＮＡ（モック（ｍｏｃｋ）トランスフェ
クションの場合にはＤＮＡを省略する）、６５λＣａ　
Ｃ（１２および０．６５ｍＪの２Ｘヘルペス緩衝液を室
温で注怠深く混合した後、培地を伴なったＣＨＯ細胞に
、直接注加した。細胞とＤＮＡを３７℃で３時間インキ
ュベートした。次いで培地を吸引し、ＣＨＯ細胞の単層
を２０％グリセリン−ＰＢｓ（２，５＋ｌＶ）で４５秒
間ショック処理した。皿にＦｌ　２１０μＬＭ７．８屑
Ｅをあふれさせ、吸引した後、Ｆ１２／ＤＭＥＭで置換
した。細胞を３７℃で２日間インキュベートした後、７
％ＸＤＺ。

ＦＢＳ（充分に透析したウシ胎児血清）およびペンース
トレツプ抗生物質を含んでいるＦ１２培地、によって１
＝２と１：１０に分割（スプリット）した。第４日日に
、細胞に（培地を）供給した。

７日日に、モックトランスフエクトに係る細胞は全て死
滅した。１：２分割に係る、トランスフェクトされたＣ
　ＨＯ細胞は全面生長を示した。それらを、Ｆ　１２／
ＤＭＥＭ１７％ＸＤＺ、５ＱｎＭＭＴＸ（メ７トレキセ
ート）〜ｌＯＯｎ１００ｎおよび２５０ｎＭ　ＭＴＸを
含有する３個の１０　ｃｍ２の皿中で１：３に分割（ス
プリット）シた。全面生長した単層がＭＴＸに適合して
しまうまで、４日毎に、皿に供給を行った。次いで、こ
・の単層を３５Ｓ−ｍｅＬＩＸＩ」で標識し、免疫沈降
法によって分泌型ｅｎｖ融合物を測定した。

選択培地中で１：１０に希釈した細胞は１０日１に５０
〜１００のコロニーを有していた。これらのコロニーを
集め、Ｆ１２／ＤＭＥＭ中で増殖させた。これらのクロ
ーンを、抗−ｅｎｖ抗血清を用いた放射性免疫沈降法に
よりスクリーンした。

ＭＴＸ濃度を漸増させた中で（５００，１０００および
３０００ｎＭ）　、ｅｎｖ融合物の最大の分泌が観察さ
れるまで陽性クローンを増幅させた。

疫沈降分析 全面生長した１０ｃ１ｎの皿を、メチオニンを欠くＲＰ
Ｍ１１６４０培地中、６６　ｐＣ／ｍの３５５メチオニ
ンにより、３７℃で４時間標識した。次いで、培地を集
め、アプロチニン（１５μＬ）を加えた。

遠心して細胞を除いた。上滑１　ｍｌを、１００μＬの
２．５　Ｍ　ＮａＣｌ、　２％Ｔｗｅｅｎ　　（）ウィ
ーン）８０．１１ｎｇ／ｍ１ＢｓＡに加えた。高力価ノ
ヒト抗−ＡＩＤＳ抗体２μＬを加え、室温で１時間イン
キュベートした。トランスフェクトしていないＣＨＯの
タンパク質すゼイト（溶菌液）をプレ（予備）−吸着さ
せておいたプロティンＡセファロースを加え（５０μＬ
）、得られた混合物を３７℃で３０分間インキユヘート
した。次いで、セファロース・ビーズを、ＰＢＳ、０．
２％デオキシコール酸、０．２％Ｔｗｅｅｎ２Ｑ中に入
れて遠心することにより、３回洗浄した。最後に水洗し
、次いで、セファロースビーズをＳＤＳ　　ＰＡＧＥ標
準試料緩衝液に再懸濁した。この試料を５分間煮沸して
遠心し、上清をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離
した。

次いで、このゲルを、エンライドン（Ｅｎｌｉｇｈｔｅ
ｎ　）３０によるオートラジオグラフィーにかけた。

大量のエンベロープを生産している細胞は、抗ＨＴ　Ｌ
　Ｖ　−Ｉｌｌレトロウィルス抗体抗体法って特異的に
免疫沈１祥される、〜１２０，０００Ｍｒのタンパク質
を合成した。このタンパク質は、プラスミドでトランス
フェクトされた細胞にのみ、認められた。

この抗原の細胞内型のものは、約１００，０００　　ダ
ルトンの大きさであり、それをパルス−チェース実験で
追跡すると、分泌されたタンパク質が１２，０００ダル
トンであることがつきとめられた。このタンパク質を抗
ＡＩＤＳレトロウィルスとインキユベートスれば、ウェ
スタンプロット上でも反応することか分った。

Ｄ、増幅された形質転換ＣＩ（０細胞の培養工程Ｂで得
た全曲生長に係る１　０　ｃｍ　　の皿１個をトリプシ
ンと一緒に培養して細胞を遊離させ、それを、小さいロ
ーラー（回転）ビン中に入れた５０ｍ１のＦ　１２　／
ＤＭＥＭ５０　：　５０培地ｗ　／　。

ＧＨＴ１低グルコース、マイナス（−）グリンンモ７％
ＸＤＺ　　ＰＢＳ中に移した。このビンに５秒間、ＣＯ
２を導入し、固く蓋を閉めた。このビンを３７℃で回転
させ、全面生長するまで（〜３日間）毎日、観察した。

培地をデカントし、ＰＢ８５０ｆｆｌＪで１回、細胞を
洗浄した後、ＥＤ’ｒＡ中のトリプシン５　ｍｌで３７
℃において５分間、トリプシン処理した。５ｍｇのＦｌ
　２／ＤＭＥＭ５０　：　５０モア％ＸＤＺ　　ＰＢＳ
中に細胞を懸濁し、得られた懸濁液を８５０Ｃｍ２のロ
ーラービン中に入れた。所望の数のビンが得られるまで
この工程を繰り返して行った。所望の数のビンが約８５
％の全面生長に達したならば、これらのビンの各４番こ
ｉ　ｏ　ｏ　ｍｅのＰＢＳと１２５肩ｇの血清不含Ｆ　
１２　／　ＤＭＥ　Ｍ３；１ｗ１０　Ｇｆ（Ｔ。

低グルコース、−グリシンを加え、その中で２回洗浄（
リンス）した。これらのビンを３７℃で３日間インキュ
ベートした。３日目に培地を除き、保持した。この工程
を２回繰返して行った。各ビンから集めた〜３７５ｍ１
の培地を２０００ｒｐｍ　　で５分間遠心し、ナトリウ
ム・アジドを加えてあらゆる汚染微生物の増殖を阻止し
た。

の精製 Ｅ、ｌ：９組換えＨＴ　Ｉ−Ｖ　　Ｉｌ［ポリペプチド
の単離のＡＩＩ）Ｓ関連コンプレックス（／’ＲＣ）を
有スると診断された患者の血清を、「ウェスタン」イム
ノプロット法番こかけ　ＨＴ　１．、　Ｖ　Ｉｌｌタン
パク質と反応性を示す抗体の存在を調べた。ｌ−１’Ｔ
　Ｌ　Ｖ　ｉｌ［エンベロープタンパク質について高力
価を示す個体の血漿を集め、プロティンＡ−セファロー
スＣＬ−４Ｂを業者〔ファーマシア・ファイン・ケミカ
ルス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ　）　　］の指示通りに用いたアフイニテイクロマ
トグラフイーにかけ、免疫グロブリンを精製した。この
精製法で得られた物質は、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（Ｉ’ＡＣＥ）にかけ、銀染色法で観察することに
よって純度約９０％であると判定された。次いで、この
梢ＩＭ（純化）免疫グロブリンを、業者（ファーマシア
・ファイン・ケミカルス）の指示に従ってＣＮ　Ｂ　ｒ
−活性化セファロース４Ｂを用い、このセファロース４
Ｂに共有結合的に結合させた。

融合物の精製 工程りの方法から得られた、血清を含まない細胞培養培
地を収穫し、０．４５ミクロンのナルゲン（Ｎａｌｇｅ
ｎ　）フィルターを通すことにより透明番こし、７　ミ
コ７　（Ａｍｉ　ｃｏｎ）　Ｙ　Ｍ　−Ｉ　Ｑ限外濾過
膜を用いて５０倍に濃縮した。この濃縮培地をりん酸緩
衝化食塩水（Ｐ　１３　Ｓ　）　　に対して透析し、上
記Ｅ。

■に述べた型のアフイニテイ力ラムに適用した。

濃縮した細胞培養培地を適用した後、カラム溶出液を２
８００ｍにおいて分光学的に監視し、溶出液中にこの波
長の光を吸収する物質が含まれなくなるまで、該カラム
を洗浄した。このアフイニテイ力うム番こ保持されてい
るタンパク質を、該カラムを０．１　Ｍ酢酸、０．５Ｍ
ＮａＣ，５溶離緩衝液で処理すること番こより、溶離し
た。カラムかから溶離された物質を分光学的に監視し、
即座番こ１Ｍトリス緩衝液で処理してｐＨを略中性（ｐ
Ｈ７〜８）に副部した。溶離したタンパク質をＰＢＳに
対して７１　析Ｌ　、Ａｍｉ　ｃｏｎ　Ｙ　Ｍ　−１０
メンプランを用いて限外濾過することにより、約５倍番
こ濃縮した。得られたタンパク質をＰＡＧＥにかけ、銀
染色法で観察し、「ウェスタン」イムノブロッティング
に［ｊ−すことにより、分析した。これらの分析に基づ
き、分泌された、先端の切断された組換えＩ−Ｉ　Ｔ　
Ｔ−Ｖ　ＩＴ［ｅｎｖ融合物は分子量約１３０　ｋｄ　
であり、調製物に応じて、カラムから溶離した総タンパ
ク質の５〜２５ｆｏであることが示された。

免疫化 免役処置あたり、３０〜５０μｇの総タンパク質（上記
の如くにして調製）でウサギを免疫した。

１次免疫は、Ｐ　１３　Ｓ　１　’ｍｅ中に入れたタン
パク質３０〜５０μｇを等容量の完全ソロインドアジュ
バントに乳化させ、以下の方法で注射して打った：後足
にＱ、　５　ｍｌｒづつ、および背骨に沿って５箇所に
０．２ｍｌ皮肉注射する。−次免役の１４〜２１日後に
、ウサギに促進免疫を行った。この促進免疫のための抗
原エマルジョンは、完全ソロインドアジュバントの代り
に不完全フロインドアジュパントヲ用いる外は、−次免
疫のためのそれと同様にして調製された。促進免疫にお
いては、各ウサギに、全量２罰の抗原を下記の如く分配
して与えた：両脇部にＱ、　５　ｍｌ！を筋注し、ｌ　
ｍｅを背骨に沿った５箇所に分けて皮肉注射する（各局
部にＱ、　２ｍ１つつ）。

各促進処置の１０〜１４日後、耳静脈または心臓穿刺に
より、動物から採血した。組換えＨＴ　Ｌ　Ｖ１１１エ
ンベロープタンパク質に対して惹起された抗体ヲ、組換
えｆ（ＴＴ−Ｖ］ｌ［１３０Ｋタンパク質を抗原とする
「ウェスタン」イムノプロット分析法で同定した。最初
の実験においては、２羽のウサギの内１羽が、１回の促
進免疫の後に組換えｉ（Ｔ　１．、。

Ｖ　Ｉ［タンパク質と反応性を有する抗体を形成してい
た。もう一方のウサギに抗−１−（Ｔ　Ｌ　Ｖ　ｎｆ抗
体の形成を誘導するためには、さらに促進免疫を行う必
要があった。

対照ウサギ、組換えエンベロープ抗原を接種されたウサ
ギ、正常な対照患者、または既知のレトロウィルス中和
抗体を得っている患者、のいずれかから得た様々な血清
を５６℃で３０分間熱的に不活化した。次いで、これら
の血清試料を、ｉｔ　ｐＭ　Ｉ　１．６４０．２０％ウ
シ胎児血？％ｔ　、ペンーストレツプ、Ｓよひ２μｊｑ
　／　ｍｅポリフレンを入れたウェル（くぼみ）の中で
、ウィルスと１＝１の割合で混合した。ウェルを４℃で
１時間インキ、ユベートした後、プレートを１５分間、
室温に戻し・た。次いで各ウェルに１×１０６のＨ９ヒ
トＴ細胞を加え、これらウェルをＣＯ２インキュベータ
ー中でインキュベートした。４日目に培養物を１＝１に
分割（スプリット）した。７または８日目番こ細胞を逆
転写酵素に関して測定すると共に、免疫螢光法にかけた
。免疫螢光法は、ＡＩＤＳレトロウィルス抗体を含んで
いることが分っているヒト抗血清を用い、固定細胞（ｆ
ｉｘｅｄ　ｃｅｌｌ　）について行った。

螢光性の細胞の占める割合（％）は、ウィルスに感染し
た細胞の割合（％）の目安となる。記述きれている如く
にして細胞上宿の逆転写酵素を測定した。逆転写酵素レ
ベルの減少は、ウィルスの中和を示唆している。ウィル
スにヒト対照の血清またはウサギ対照の血清を混合する
と、細胞の約７０〜８０％が螢光性であった。逆転写酵
素測定によると、約１．６　Ｘ　１０６ｃ　ｐｍ　が取
込まれていた。

組換えエンベロープ抗原をワクチン接種したウサギの血
清を分析すると、螢光性の細胞の割合は３５％であり、
逆転写酵素レベルは２８５，０００Ｃｐｍであった。こ
のウィルスを中和することが分っているヒト血清は螢光
性に関して０％、逆転写酵素に関して１０．００Ｏｒｐ
ｍを示した。これらの結果は、組換え抗原をワクチン接
種したウサギから得た抗血清が中和作用を有することを
示唆している。

以上は、特定の好ましい態様について述べたものであっ
て、本発明がこの様に限定されるべきでないということ
は、理解されるであろう。ここで開示した実施態様に様
々な修飾を施すことかでき、また、その様な修飾は本発
明の範囲内にあること・を意図しているということは、
当業者ならば理解できるであろう。

以下の引用文献中に列記し、上述の本文中に個々に番号
で挿入的に引用した引例は、参考のために本明細書中に
目゛記したものである。

１．エンツージ等（Ｅｍｔａｇｅ　ｅｔ　ａｌ、　）、
ネイチャー（ＮａＬｕｒｅ）　、２８３．１７１　頁（
１９８０）ｉデービス等（１’）ａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ
、）、プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナソヨナル・ア
カデミ−・オフ・サイエンス（米国）　［ｌ’ｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）〕、
７８．５３７６頁（１９８１）ｉウェイランド等（Ｗｅ
ｉｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、）、ネイｆ　ヤー（Ｎａｔｕ
ｒｅ　）、２９２．８５１頁（１９８１） ２、　カッパー等（Ｋｕｐｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ　、）、
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）、２８９．５５５頁（１
９８１）；フレイド等（Ｋｌｅｉｄ　ｅｔ　ａｌ、）、
サイ、Ｔ−７７，（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２１４．１１２
５頁（１９８１） ３　チャーネイ等（Ｃｈａｒｎａｙ　ｅｔ　ａｌ、　）
　、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、？、３３５頁（
１９７９）；バレンツエラ等（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ　
ｅｔ　ａｌ、）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２９８
．２４７頁（１９８２） ４、ローズ等（Ｒｏｓｅ　ｅｔ　ａｌ、）、プロン−デ
ィンゲス・オフ・ザ・ナンヨナル・アカデミ−・オフ・
サイエンス（ＰＮＡＳ）、７８．６６７０頁（１９８１
）５、イ：ｆ−ル）＜−）７等（Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ　
ｅｔ　ａＬ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２１９
．６１４頁（１９８３）６、バーレル等（Ｂｕｒｒｅｌ
ｌ、　Ｃｅｔ　ａｌ、　）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ
　）、２．９１．５０３−５０６頁（１９８１）　ｉ７
ツカイ等（Ｍａｃｋａｙ　ｅｔ　ａｌ、）　、プロシー
ディンゲス・オフ・ザ・ナンヨナル・アカデミ−・オフ
・サイエンス−（ＰＮＡＳ）、７８．４５１０−４５１
４頁（７、　ファウシ等（Ｆａｕｃｉ　Ａ、　ｅＬ　ａ
ｌ　、　）、アナルス・オフ壷インターナル・メデイス
ン（ＡｎｎａｌｓｏｆＩｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ　）、１００．９２頁（１９８４）８、　マルクス
（Ｍａｒｘ、　Ｊ、Ｌ、）、サイ：ｒ−７７，（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ）、２２４．４７５頁（１９８４） ９、　グループマン（Ｇｒｏｏｐｍａｎ、　Ｊ、　Ｅ、
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９８４）１０、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ、　Ｔ、　）
、バイオチク７ｏジー　（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
　）、６８２頁、８月（１９８４）１１、ガロ等（Ｇａ
ｌｌｏ、　Ｒ，Ｃ，ｅｔ　ａｌ　、　）、サイエンス（
Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ　）、７２４．５００頁（１９８４）
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Ｂａｒｒｅ　−８１ｎｏｕｓｓ　、　Ｆ　、ｅｉａｌ、
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・ニュー　７．　（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅｗｓ　）、１４頁、９月（１９
８４） １６、サーンカドハレン等（Ｓａｒｎｇａｄｈａｒｅｎ
、　Ｍ、Ｇ、ｅｔａｌ　、）、サイ、：ｃ　ｙ　ス（５
ｃｉｅｎｃｅ　）、２２４．５０６頁（１７、　　キッ
チン等（Ｋｉｔｃｈｅｎ、　Ｌ　、Ｗ、　ｅｔ　ａｌ　
、　）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）、３１２，３６
７頁（１９８４）１８、ポリバー等（Ｂｏｌ　１ｖａｒ
　ｅｔ　ａｌ　、　）、ジー７　（Ｇｅｎｅ）、２．９
５頁（１９７７） １９、チャンク等（Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ　、）、ネ
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）、２７５．６１５頁（１９
７８）２０、イタクラ等（ｉ　ｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａ
ｌ　、　）、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ　）、１９
８．１０５６頁（１９７７）２１、コ゛−デル等（Ｇｏ
ｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　）、不イ＋−ｔ’−（Ｎａ
ｔｕｒｅ　）、２８１．５４４頁（１９７９）２２、ゴ
ーデル等（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　）、ヌクレ
イツク・アンツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅｓ、）、８．４０５７頁（１９８０） ２３、ヨーロッパ方法出願、公開番号０３６７７６２４
、シーベンリスト等（Ｓ　１ｅｂｅｎｌ　ｉｓｔ　ｅｔ
　ａｌ　、）、セル（Ｃｅｌｌ）　、２０　、２６９頁
（１９８０）２５、ステインチコンブ等（Ｓｔｉｎｃｈ
ｃｏｍｂ　ｅｔ　ａｌ　、）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ　）、摩、３９頁（１９７９）２６、キンゲスマン等
（Ｋｉｎｇ、ｓｍａｎ　ｅＬ　ａｌ　、）　、ジーン（
Ｇｅｎｅ）、７．１４１頁（１９７９）２７、チェンバ
ー等（Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ　、）、ジーン
（Ｇｅｎｅ　）、１０．１５７頁（１９８０）２８、ジ
ョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）、ジエネテイツクス（Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ　）、８５．１２頁（１９７７）２９、　　ｌ
ニア　ツーｒ−７：／等（Ｈｉｔｚｅｍａｎ　ｅｔ　ａ
ｌ　、）、ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈｅｍ、　）、２５５．２０７３頁（
１９８０）３０．ヘス等（Ｈｅｓｓ　ｅｔ　ａｌ、）、
ジャーナル・オフφアドハンスドーエンザイムーレク（
Ｊ、　Ａｄｖ、ＥｎｚｙｍｅＲｅｇ、）、７．１４９頁
（１９６８）３１、ホラ７ド等（Ｈｏｌｌａｎｄ　ｅｔ
　ａｌ、　）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　）、↓ヱ、４９００頁（１９７８）３２．７
＝アテイス等（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ　
、）、モルキュシー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　）、コールド・スプリング・ハー
バ−・プレス・ニューヨーク（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、　Ｙ。

３３、−７７デル等（Ｍａｎｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ　、）
、ジャーナル・オフ・モルキュシー・バイオロジー（Ｊ
ｌＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、）、５３．１５４頁（１９７０） ３４、ロラン等（Ｒ，Ｌａｗｎ　ｅｔ　ａｌ　、）、ヌ
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【図面の簡単な説明】

第１図はＨＴＬＶ−ＩｌｌレトロウィルスのＰ−２４コ
アタンパク質のアミ／末端のアミノ酸配列、並びに該ア
ミノ酸配列から演絆的に推定されたＤＮＡ配列の模式図
、第２ａ〜２ｉｊ図はＨＴ　Ｉ−Ｖ　−１１［ゲノムの
ＤＮＡ配列、推定のポリペプチド配列および部分的な制
限地図を示す模式図、第２に図は一ンの組立て模式図、
第４図はρ−２４および先端を切断されたＰ−２４の発
現ベクターの模式図、第５図はＰ−２４構成ポリペプチ
ドおよび先端を切断されたＰ−２４構成ポリペプチドの
発現ベクターの組立て模式図、第６図はＰ−ＤＥ２４、
ｐＤＥ２４△ＨＤ３、ｐ　ｔｌ　Ｇ　Ｈｐ　−２４△Ｉ
３およびｐ　ＨＧ　Ｈｐ　−２４△ＨＤ３によって発現
されたポリペプチドのウェスタン・プロットにおける像
の模写図、第７図はｐ　Ｉ）　Ｅ　−２４＋こよって発
現されたポリペプチドのウェスタン・プロットにおける
像の模写図、％８ａ、９ａおよび１０ａ図はそれぞれ、
プラスミドｐｔｒｐＬＥ、ｇｐ４１、ｐｔｒｐＬＥ、Ｅ
’オヨｉＪ’　Ｐ　Ｓ　Ｖ　Ｅ　、Ｅ’　ＤＦ■Ｆ　Ｒ
（７）　ｉ造ヲ示ｔｍ式図、第８ｂ、９ｂおよび１０１
）図はそれぞれ、ｐｔｒｐＬＥ１ｇｐ４１　、ｐｔｒｐ
　ＬＥ、Ｅ’およびｐＳＶＥ、　ｈ：’　ＤＩ（ＦＲｉ
こよってコードされているタンパク質の合成を示すポリ
アクリルアミドゲル電気泳動の泳動パン タール模写した模写図、＄１１ａ図はＨＴＬＶ−１１１
ゲノムの、ｅｎｖタンパク質α周製に用いられる領域を
示す模式図、ｉ４ｉ　１　ｂ図はＨＴＬ　Ｖ　−Ｉｌｌ
エンベロープタンパク質を分泌させるための発現プラス
ミドの模式図である。 方法用１１Ｊ１人　　　　ジエネンテク、インコーポレ
イテッド代　理　人　　弁理士青白　葆（外１名）Ｆｉ
ｇ・ へ八− ｒＧ　ＧＴＡ　ＣＡＴ　　ＣＡＧ　ＧＣＣＢ。 ａｂｃｄｅｆ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、原核性生物の組換え培養または哺乳類の組換え培養
   によって生産された組成物であって、該組成物は、天然
   に存在している他のエイズ関連ポリペプチドを実質的に
   含んでいない、エイズ関連レトロウイルスの予め決定さ
   れたポリペプチド配列を含有しており、この予め決定さ
   れたポリペプチド配列は、相補的な抗体と特異的に結合
   し得る抗原決定基を少くとも１個含有していることを特
   徴とする組成物。 ２、該予め決定されたポリペプチド配列が、エイズ関連
   レトロウイルスのゲノムのｇａｇ領域によってコードさ
   れている配列である第１項に記載の組成物。 ３、該予め決定されたポリペプチド配列がｐ−２４由来
   のものである第１項に記載の組成物。 ４、該予め決定されたポリペプチド配列がエイズ関連レ
   トロウイルスのゲノムのｅｎｖ領域によってコードされ
   ている配列である第１項に記載の組成物。 ５、該予め決定されたポリペプチド配列がｇｐ−４１、
   ｇｐ−６５またはｇｐ−１２０由来のものである第１項
   に記載の組成物。 ６、通常はグリコシル化されている該エイズ関連レトロ
   ウイルスの予め決定されたポリペプチド配列が、グリコ
   シル化されていないものである第１項に記載の組成物。 ７、該予め決定されたポリペプチド配列がＮ末端にメチ
   オニンまたはホルミルメチオニンを含有しているもので
   ある第１項に記載の組成物。 ８、予め決定されたポリペプチド配列をコードしている
   ＤＮＡ配列を含有している原核性生物の、または哺乳類
   の組換え発現宿主から、該予め決定されたポリペプチド
   配列を単離する方法であって、単離された、予め決定さ
   れたポリペプチド配列が、相補的な抗体と結合し得る抗
   原決定基を少くとも１個含有していることを特徴とする
   方法。 ９、第８項に記載の方法によって生産されたポリペプチ
   ド産物。 １０、エイズ関連レトロウイルスの予め決定されたポリ
   ペプチド配列の予め決定されたフラグメントを含有して
   いる組成物であって、該フラグメントが相補的な抗体と
   特異的に結合し得る抗原決定基を少くとも１個含有して
   いることを特徴とする組成物。 １１、他のエイズ関連ウィルスのポリペプチドを実質的
   に含有していない第１０項に記載の組成物。 １２、該ポリペプチドフラグメントが、エイズ関連レト
   ロウイルスの予め決定されたポリペプチド配列のＮ−末
   端配列である第１０項に記載の組成物。 １３、該ポリペプチドフラグメントが、エイズ関連レト
   ロウイルスの予め決定されたポリペプチド配列のＣ末端
   配列である第１０項に記載の組成物。 １４、該ポリペプチドフラグメントがエイズ関連レトロ
   ウイルスの内部ポリペプチド配列である第１０項に記載
   の組成物。 １５、該ポリペプチドフラグメントが、エイズ関連レト
   ロウイルスのゲノムのｇａｇ領域によってコードされて
   いる配列に由来するものである第１０項に記載の組成物
   。 １６、該ポリペプチドフラグメントがｐ−２４由来のも
   のである第１０項に記載の組成物。 １７、該ポリペプチドフラグメントがエイズ関連レトロ
   ウイルスのゲノムのｅｎｖ領域によってコードされてい
   る配列由来のものである第１０項に記載の組成物。 １８、該ポリペプチドフラグメントがｇｐ−４１、ｇｐ
   −６５またはｇｐ−１２０由来のものである第１０項に
   記載の組成物。 １９、融合ポリペプチドであって： （ａ）相補的な抗体と特異的に結合し得る抗原決定基を
   少くとも１個有する、エイズ関連レトロウイルスの、予
   め決定された第１のポリペプチド配列；および、 （ｂ）該相補的な抗体の存在を分析するために生物学的
   に採取された試料中に通常存在している抗体と免疫学的
   な交差反応を行わない第２のポリペプチド配列、からな
   る融合ポリペプチド。 ２０、予め決定されたポリペプチド配列がエイズ関連レ
   トロウイルスのゲノムのｇａｇ領域によってコードされ
   ている配列に由来するものである第１９項に記載の融合
   ポリペプチド。 ２１、該予め決定されたポリペプチド配列がｐ−２４由
   来のものである第１９項に記載の融合ポリペプチド。 ２２、該予め決定されたポリペプチド配列がエイズ関連
   レトロウイルスのゲノムのｅｎｖ領域によってコードさ
   れている配列に由来するものである第１９項に記載の融
   合ポリペプチド。 ２３、該予め決定されたポリペプチド配列がｇｐ−４１
   、ｇｐ−６５またはｇｐ−１２０に由来するものである
   第１９項に記載の融合ポリペプチド。 ２４、第１のポリペプチド配列と第２のポリペプチド配
   列とが融合している第１９項に記載の融合ポリペプチド
   。 ２５、該融合がペプチド結合によるものである第２４項
   に記載の融合ポリペプチド。 ２６、第１のポリペプチド配列のアミノ末端が第２のポ
   リペプチド配列のカルボキシ末端に融合している第１９
   項に記載の融合ポリペプチド。 ２７、融合ポリペプチドであって： （ａ）エイズ関連レトロウイルスの予め決定された第１
   のポリペプチドのフラグメントであり、相補的な抗体と
   特異的に結合し得る抗原決定基を少くとも１個含有して
   いるフラグメント；および、（ｂ）該相補的な抗体の存
   在を分析するために生物学的に採取された試料中に通常
   存在している抗体と免疫学的な反応を行わない第２のポ
   リペプチド配列、からなる融合ポリペプチド。 ２８、該ポリペプチドフラグメントがエイズ関連レトロ
   ウイルスのゲノムの、ｇａｇ領域によってコードされて
   いる配列に由来するものである第２７項に記載の融合ポ
   リペプチド。 ２９、該ポリペプチドフラグメントがｐ−２４に由来す
   るものである第２７項に記載の融合ポリペプチド。 ３０、該ポリペプチドフラグメントがエイズ関連レトロ
   ウイルスのゲノムのｅｎｖ領域によってコードされてい
   るものである第２７項に記載の融合ポリペプチド。 ３１、該ポリペプチドフラグメントがｇｐ−２４、ｇｐ
   −４１、ｇｐ−６５またはｇｐ−１２０に由来するもの
   である第２７項に記載の融合ポリペプチド。 ３２、エイズ関連レトロウイルスに対する相補的な抗体
   と特異的に結合し得る抗原決定基を少くとも１個含有し
   ている、エイズ関連レトロウイルスの変異型ポリペプチ
   ド配列を含有している組成物。 ３３、該変異型ポリペプチドが、エイズ関連レトロウイ
   ルスのポリペプチド配列の融合、欠失または置換に係る
   ものである第３２項に記載の組成物。 ３４、該変異型ポリペプチド配列が、エイズ関連レトロ
   ウイルスのポリペプチド配列の標識された、または結合
   された、誘導体である第３２項に記載の組成物。 ３５、第１、１０または３２項に記載の組成物を含有す
   る診断剤。 ３６、第１９または２７項に記載の融合ポリペプチドを
   含有する診断剤。 ３７、固相に固定化された第１、１０または３２項に記
   載の組成物を含有する診断剤。 ３８、固相に固定化された第１９または２７項に記載の
   融合ポリペプチドを含有する診断剤。 ３９、検出可能なマーカーで標識された第１、１０また
   は３２項に記載の組成物を含有する診断剤。 ４０、検出可能なマーカーで標識された第１９または２
   ７項に記載の融合ポリペプチドを含有する診断剤。 ４１、第１、１０または３２項に記載の組成物を含有す
   るワクチンであって、該ポリペプチドが、エイズ関連レ
   トロウイルスによる感染に対する抵抗性を付与する中和
   抗体の産生を誘発し得るものであることを特徴とするワ
   クチン。 ４２、第１９または２７項に記載の融合ポリペプチドを
   含有するワクチンであって、 （ａ）該抗原決定基がエイズ関連レトロウイルスによる
   感染に対して抵抗性を付与する中和抗体の産生を誘発し
   得るものであり；かつ、 （ｂ）該第２のポリペプチドが、正常な状態においでは
   、該ワクチンの適用対象に天然に存在しているポリペプ
   チドと交差反応を行なう抗体を誘発しないものであるこ
   とを特徴とするワクチン。 ４３、薬学的に許容し得る賦形剤と混合された該ポリペ
   プチドを含有する第４１または４２項に記載のワクチン
   。 ４４、ヒト対象に抗体を惹起させるのに有効な用量レベ
   ルで第４１、４２または４３項に記載のワクチンを投与
   することからなる、エイズワクチンの接種方法。 ４５、第１０項または３２項に記載の組成物をコードし
   ているＤＮＡ配列であって、天然に存在している他のエ
   イズ関連ＤＮＡ配列を実質的に含有していないＤＮＡ配
   列。 ４６、第１９項または２７項に記載の融合物をコードし
   ているＤＮＡ配列であって、天然に存在している他のエ
   イズ関連ＤＮＡ配列を実質的に含有していないＤＮＡ配
   列。 ４７、第４５項に記載のＤＮＡ配列を含有している複製
   可能な原核性発現ベクターであって、該ベクターによっ
   て形質転換された原核性細胞内に含有された時、第１０
   項または３２項に記載の組成物を発現し得ることを特徴
   とするベクター。 ４８、第４６項に記載のＤＮＡ配列を含有している、複
   製可能な原核性発現ベクターであって、該ベクターによ
   って形質転換された原核性細胞内に含有された時、第１
   ９項または２７項に記載の融合ポリペプチドを発現し得
   ることを特徴とするベクター。 ４９、第４７項に記載の発現ベクターを含有している原
   核性細胞の培養物。 ５０、第４８項に記載の発現ベクターを含有している原
   核性細胞の培養物。 ５１、生物学的に採取された試料中に含有されている抗
   体の検出法であって： ａ）該試料を第３５、３６、３７、３８、３９または４
   ０項のいずれかに記載の診断剤と接触させて診断剤と該
   試料中の相補的な抗体とを結合させ；次いで、 ｂ）結合した、または結合していない診断剤を検出する
   ことからなる方法。 ５２、生物学的に採取された試料中に含有されている抗
   体の検出法であって： ａ）該試料を３５、３６、３７、３８、３９または４０
   項のいずれかに記載の診断剤と接触させて診断剤と該試
   料中の相補的な抗体とを結合させ；次いで、 ｂ）結合した、または結合していない相補的な抗体を検
   出することからなる方法。 ５３、他のエイズ関連レトロウイルス・タンパク質を実
   質的に含有していない、エイズ関連レトロウイルスの逆
   転写酵素。 ５４、該レトロウイルスがＨＴＬＶ−IIIである第５３
   項に記載の逆転転写酵素。 ５５、第５３または５４項に記載の逆転写酵素をコード
   しているＤＮＡ配列。 ５６、第５５項に記載のＤＮＡ配列を含有している複製
   可能な発現ベクターであって、形質転換された細胞内に
   含有された時第５３または５４項に記載の逆転写酵素を
   発現し得ることを特徴とするベクター。 ５７、第５６項に記載の発現ベクターを含有している真
   核細胞培養物。 ５８、細胞が哺乳類セルラインの細胞である第５７項に
   記載の培養物。 ５９、第５６項に記載の発現ベクターを含有している原
   核細胞培養物。 ６０、エイズ関連レトロウイルスの逆転写酵素を阻害す
   る化合物を同定するための測定法であって：ａ）第５７
   、５８または５９項に記載の細胞培養物を該逆転写酵素
   を阻害すると思われる化合物と反応させ；次いで、 ｂ）工程ａ）の反応混合物中の逆転写酵素の活性レベル
   を測定することからなる方法。 ６１、該細胞培養物を溶解させる第６０項に記載の測定
   法。 ６２、エイズ関連レトロウイルスの逆転写酵素を阻害す
   る化合物を同定するための測定法であって：ａ）第５３
   または５４項に記載の逆転写酵素を該逆転写酵素を阻害
   すると思われる化合物と反応させ；次いで、 ｂ）工程ａ）の反応混合物中の逆転写酵素の活性レベル
   を測定することからなる方法。 ６３、エイズ関連レトロウイルスのＥ′ポリペプチドを
   含有する組成物であって、該組成物が、エイズ関連レト
   ロウイルスによってコードされていないエイズ関連レト
   ロウイルス感染細胞由来のタンパク質を含有せず、また
   、感染性のエイズ関連レトロウイルスのビリオンを含ん
   でいないことを特徴とする組成物。 ６４、Ｅ′ポリペプチドのＳＤＳ　ＰＡＧＥによる相対
   的分子量が約２８，０００または約２６，５００である
   第６３項に記載の組成物。 ６５、Ｅ′ポリペプチドが第２ｄ図のＥ′ポリペプチド
   、または天然に存在しているそのアレルのアミノ酸配列
   を有している第６３項に記載の組成物。 ６６、第２ｄ図のＥ′ポリペプチドまたは天然に存在し
   ているそのアレル以外のものであるが、第２ｄ図のＥ′
   ポリペプチドまたは天然に存在しているそのアレルと免
   疫学的な交差反応を行い得るＥ′ポリペプチドを含有す
   る組成物。 ６７、ワクチンである第６３項に記載の組成物。 ６８、滅菌され、かつ薬学的に許容し得る賦形剤を含む
   と共に、動物に投与されたとき、Ｅ′ポリペプチドに対
   する抗体の形成を惹起するのに充分な量のＥ′ポリペプ
   チドを含有している第６３項に記載の組成物。 ６９、その他の予め決定されたエイズ関連レトロウイル
   ス性ポリペプチドの既知量を更に含有している第６３項
   に記載の組成物。 ７０、第１項または第６３項に記載の組成物を含有して
   いる、エイズ関連レトロウイルス感染の診断試験用のキ
   ット。 ７１、Ｅ′ポリペプチドが検出可能なグループによって
   標識されている第６３項に記載の組成物。 ７２、検出可能なグループが酵素、放射性同位元素また
   は螢光物質である第７１項に記載の組成物。 ７３、組成物がＥ′ポリペプチドと結合し得る固定化さ
   れた抗体を含んでおり、該抗体がＥ′ポリペプチドと分
   離した容器内に入っている、第７０項に記載の試験用キ
   ット。 ７４、エイズ関連レトロウイルス性Ｅ′ポリペプチドと
   結合し得る抗体であって、エイズ関連レトロウイルスが
   コードしている他のポリペプチドと結合し得る抗体を含
   まず、また、結合したＥ′ポリペプチドをも含有してい
   ない抗体。 ７５、固定化されている第７４項に記載の抗体。 ７６、ポリオレフィン、または第７５項に記載の抗体の
   不変領域と結合し得る抗体、に吸着させることによって
   固定化されている第７５項に記載の抗体。 ７７、被検対象のエイズ−関連レトロウイルス感染の存
   在を初期に決定する方法であって： （ａ）被検対象から試料を得；次いで、 （ｂ）被検試料中の、エイズ関連レトロウイルスのＲＮ
   Ａにコードされているポリペプチドであって、精製され
   たエイズ−関連レトロウイルス・ビリオンのポリペプチ
   ド成分以外のポリペプチドの存在を検出することからな
   る方法。 ７８、検出されたポリペプチドがＥ′ポリペプチドであ
   る第７７項に記載の方法。 ７９、エイズ−関連レトロウイルス・ビリオンの予め決
   定されたポリペプチド成分の存在をも追加して検出する
   ことを含む、第７７項に記載の方法。 ８０、エイズ−関連レトロウイルス性Ｅ′ポリペプチド
   をコードしている核酸であって、それを囲む、その他の
   完全なエイズ−関連レトロウイルス性ポリペプチドをコ
   ードしているプロウィルスの配列を含まない核酸。 ８１、第８０項に記載の核酸を含有している複製可能な
   ベクター。 ８２、検出可能な置換分によって標識されている第８０
   項に記載の核酸。