JPH02206601A - 抗トロンビン作用を有するオリゴサッカライドフラクションの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、抗トロンビン作用を有するオリゴサツカライ
ドフラクションの製造法ならびに該方法により得られる
抗トロンビン作用を有するオリゴサツカライドに関する
ものである。

従来技術 ヘパリンはグリコサミノグリカン族の多分酸ポリマーで
あり、各種供給源（ブタおよび牛粘膜および牛膝）から
得られる市販品は、１，５００〜３０，０００ダルトン
の分子量分布を持つポリサッカライド混合物を含む。Ｈ
，Ｂ、ナダー等、Ｂｉｏｃｈｅｍ　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、
Ｒｅｓ、Ｃ。

ｍ　ｍ　ｕ　ｎ　、　　５７．　４４８〜４９３　　（
１９７４）参照。

ヘパリンは凝固カスケードの各種賦活因子中の抗トロン
ビン■の抑制効果を増大させる抗凝固作用を示す。この
作用は、ヘパリンの分子量プロフィルにより影響される
。分子量が低下する抗−Ｘａ作用と抗トロンビン作用間
の比が増大することが立証されている。

Ｌ、アンダーソン等、Ｔｒｏｍｂｏｓ、Ｒｅｓ　、　９
　、　５７５〜５８３　　（１９７６）　、Ｔ　、　Ｗ
、バロークリフ等、同誌１２．２７〜３６　（１９７ｇ
）　、Ｄ　、　Ａ　。

レーン等、同誌１２．　２５７〜２７１　　（ｌＱ７８
）等により市販のヘパリンをセファデックス−〇　ウル
トロゲルＡｃ、４４の様なゲルに分割することにより平
均分子量が異なるフラクションが得られ、これらフラク
ションはＵＳＰ　　ＸＸＩ、ＢＰあるいはＡＰＴＴ等の
方法により抗凝固作用が異なり、抗トロンビン作用より
Ｘａ因子に対する作用が比較的大きいフラクションが得
られることが知られている。

またヘパリンと抗トロンビンを結合する活性部位に対応
する必須のペンタサツカライドシーフェンスも衆知であ
る。このシーフェンスをまだ含む５．０００ダルトン以
下のフラクション（１６〜ｌ♂モノサツカライド）は、
抗トロンビンおよびトロンビンとの同時結合には長さが
不充分で、従ってＸａ因子を中和するにすぎない。

凝固というよりは、血小板聚合の方により多く関係して
いるヘパリンの出血性危険性は、ヘパリンの低分子量フ
ラクションで低減せられる。Ｊ、ウェストウィック等、
ＴｒｏｍｂｏｓＲｅ　ｓ、　４２．４３５〜４４７　（
１９８６）　、Ｅ、　Ｗ、ザルラマン等、Ｊ、Ｃｌ１ｎ
、Ｉｎｖｅｓｔ廷、６４〜７３　（１９８０）では、抗
トロンビン■に対し強い親和力を持つ低分子量フラクシ
ョンが、抗トロンビン■に高い親和力を持つ高分子量ヘ
パリンフラクションより血小板との相互作用が少ないこ
とを報告している。Ｎ、Ｆ、ケート等、Ｔｒｏｍｂｏｓ
　　Ｒｅｓ、　３５．　６１３〜６２５（１９８４）で
は、低分子量ヘパリンの血小板機能に対する抑制効果の
低いことを示している。

Ｐ、Ｂ、オスチルガード等、ＴｒｏｍｂｏｓＲｅ　ｓ　
、　４５．　７３９　（１９８７）の研究では、動物で
の血栓の抑制を形成するに必要な低分子量ヘパリンの量
は、出血性危険性レベルより以下であることを示してい
る。従って、出血性危険性を低下し、ヘパリンの抗トロ
ンビン作用を保持させることは、非常に興味のあること
である。

この点に関し、ヘパリンを化学薬品あるいは酵素で崩壊
させる各種の方法が文献に記載されている。

これらの方法は、通常解重合として知られ、原料として
用いられるヘパリンより平均分子量が低く、且つ、その
ポリサッカライド構造を保持する両分をうろことを目的
としている。これらの方法のうち亜硝酸に基づく方法を
引用すると、この場合には２．５アンヒドロマンノース
からなる末端残基で特徴づけられる両分が得られる。（
Ｕ　Ｓ　Ｐ　４．４３８，２６１．Ｗ　Ｏ８２１０３６
２７：　Ｅ　Ｐ出願番号４８２３１　） 他の方法は、硫酸液中で解重合し、ついでクロロスルホ
ン酸混液で再硫酸化する方法（Ｋ。

Ｎａｇａｓａｋａ等、Ａｒｃｈｉｖ　　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、Ｂｉｏｐｈｙｓ　　　１５０，４５１（１９７２）フ
ランス特許出願２５３８４０４　）　、あるいは金属触
媒の存在下、過酸化物あるいは過酸で処理する方法（Ｗ
　Ｏ８６１０６７２９）　、あるいはヘパリンのアルキ
ルまたはアリルエステルをアルカリ性媒体中Ｂ−エリミ
ネーションにより不飽和末端基を持つ平均分子量２．０
００〜９．０００ダルトンのオリゴマーをうる方法であ
る。

この方法の収率は低く、最終製品が望ましからざる副成
物を除去する前に親液性ならしめられる場合には、分子
量の極めて近いフラクションを含むことになるため、分
子量分布域が拡大せられる。ヘバリナーゼを用い、酵素
的に解重合する方法（ＥＰ出願６４４５２：Ｂ　　Ｂｉ
ｏｌ。

Ｃｈ　ｅ　ｍ　、　　２５７．７３１０．　　（１９８
２）　）は、希釈液で実施され、収量が低い。

発明が解決しようとする問題点 本発明は、Ｘａ因子の抑制効果が高く、抗トロンビン作
用が高く、抗凝固作用の低い有用なオリゴサツカライド
フラクションを市販のヘパリンから工業用に製造する方
法を提供しようとするものである。

問題点を解決するための手段 本発明に従えば、上記目的が下記方法により達成せられ
る。

水性ヘパリン溶液を限外濾過し、３，０００ダルトン以
下のフラクションを除去する工程、食塩水溶液とジクロ
ロメタンを用い、ヘパリンと第４級アンモニウム塩のコ
ンプレックスをジクロロメタン相（ＳＩ）へ、また低ア
ニオン性ヘパリン画分を食塩水相（ＳＩＮ）へ相分離せ
しめる工程、ジクロロ、メタン相（ＳＩ）にベンジルク
ロライドを加え、ヘパリンコンプレックスのベンジルエ
ステルを形成せしめ、次いで有機塩基により解重合反応
を実施する工程、食塩水とジクロロメタンを用い、解重
合ベンジルヘパリンを食塩水相（ＳＩ［［）へ、また、
非解重合ヘパリンコンプレックスベンジルエステルをジ
クロロメタン相（ＳＩＶ）へ分離する相分離工程、およ
び前記食塩水相（Ｓｌｌｌｌ）中の解重合ベンジルヘパ
リンを脱ベンジル化し、次いで透析によりオリゴサツカ
ライドフラクションをうる工程からなる抗トロンビン作
用を有するオリゴサツカライドフラクションの製法。

本発明方法は下記の特徴を有する。

（ａ）最終製品に１０〜１６サツカライドあるいはそれ
以下の両分の存在を回避するなめに分子量３．０００ダ
ルトン以下のヘパリンフラクションが解重合されない様
に市販ヘパリンを限外濾過でまず分割する。抗トロンビ
ン（Ｉ［［＞を結合する特別なペンタサツカライドシー
フェンスの存在が必要であると言われているに関わらす
（Ｌｌ、ターンベルブ等、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅ
ｓ、　　１００．　３９３〜４１０　　（１９８２）　
。

Ｍ、べ千トウ　Ｎｏｕｖ、Ｒｅｖ、Ｆｒ、Ｈｅ　ｍ　ａ
　ｔ　ｏ　ｉ　　２６．　２２１〜２３１　　（１９Ｆ
ｉ４）　）、デカサ・ｖカライドあるいはペンタサツカ
ライド画分は、Ｖ／Ｃａ／′フォスフォリピッドコンプ
レックスの存在下にエイコサツカライドはどではないが
Ｘａ因子を抑制する。

（ｂ）中断せずに液相で連続操作を行うので、沈澱およ
び濾過につきもののロスが低減する。

（ｅ）解重合前にもし含まれていれば、抗トロンビン（
ＡＴＩ［Ｉ）に対する特異性が皆無、あるいは低い低ア
ニオン性ヘパリンフラクションを相分離で除去する。

Ｒ，Ｅ、バースト等、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ
　　Ａｃｔａ、４９ユ、５３９〜５４７゜（１９７７）
は、ポリアニオン性グリコサミノグリカンの第４級アン
モニウムカチオンとのコンプレックスをアルコール液相
と無機塩水性液とに分離することを研究した。

本発明においては分離が水性食塩溶液とジクロルメタン
溶液の間で行われ、ジクロルメタンは、ヘパリンのエス
テル化工程、解重合化工程および分子量分割工程に用い
られる。

（ｄ）　　５．ＯＱＯダルトン以下の規定分子量範囲、
およびあらかじめ選択された平均分子量を持つ製品を高
収率でうる目的で解重合が各種サイクルで行われる。

すでに述べた如く、ヘパリンのエステル化されたカルボ
キシルに塩基を作用させて、Ｂ−エリミネーションを行
うことは、解重合化学方法の一つである。今日までこれ
は水性あるいは有機相中で用いられ、エステルを分離し
、次にこのエステルに塩基を作用させることを一工程の
みで行ってきた。所望の平均分子量をうるため他の研究
者達は、エステル化グレードの制御、エリミネーション
時間および塩基濃度を研究してきた。

本発明までは、分子量８，０００ダルトン以上の分散液
が得られ、平均分子量３，０００〜５，０００ダルトン
のものが必要とされる場合には、最終製品に分子量が非
常に高いフラクションが含まれることになり、また解重
合の後でさらに分割工程が必要となり、従って収率が低
下する。

本発明方法は、市販ヘパリンの１〜ｌＯ％水性溶液（好
ましくは５％）に適用される。第１工程は、分子量３．
ＯＯＱダルトン以下のフラクションを除去するため、こ
の水性液を３．００ＯＮＨＷＬの中空ファイバーカート
リッジＨＩＯＰ３−２０２５ＡＭ　Ｉ　ＣＯＮで通じ、
限外濾過することからなる。第１ａ図は最初のヘパリン
の分子量分布曲線で、第１ｂ図は不透過分の、また第１
Ｃ図は透過分の分子量分布曲線である。

ヘパリンは有機溶媒に不溶性であるが、第４級アンモニ
ウムカチオン、例えばアリルアルキルアンモニウムとの
コンプレックスはある条件下においてジクロロメタンに
可溶性である。

こういっなコンプレックスは電解質の水性液とジクロロ
メタンとに分離され易く、この分離の効率は、使用され
る電解質とその濃度の関数であることがわかった。分離
はグリコサミノグリカンのアニオン特性に感受性があり
、従ってアニオン性の低いヘパリンフラクションの適切
な隔離を可能にする。

次に、ヘパリンの水性液からなる中空ファイバーカート
リッジを用いる限外濾過の否透過分に塩化ナトリウムが
０．１７Ｍの濃度まで加えられ、また処理溶液の５％に
相当する量のベンゼトニウムクロライド（Ｎ、Ｎ−ジメ
チル−Ｎ−［２−［２−［４−（１，１，３，３−テト
ラメチルブチルフェノキシ］エトキシ］ベンゼンーメタ
ンアニウムクロライド）７．５％ジクロロメタン溶液が
加えられ、塩化ナトリウム０．１７Ｍ水溶液と平衡せし
められる。ヘパリンの大部分はヘパリン−第４級アンモ
ニウムコンプレックスを作ってジクロロメタン（ＳＩ）
に通過し、アニオン性の低いフラクションが食塩水相（
ＳＩＩ）（硫酸：ウロン酸比は低度）に分離せられるこ
とが証明されている。

ヘパリン−第４級アンモニウムを含むジクロロメタン相
（ＳＩ）が分離せられると、この（ＳＩ）溶液にベンジ
ルクロライドを加えることにより（４〜８時間；２０〜
２５℃）ヘパリンのカルボン酸のベンジルエステルが得
られる。

このベンジル化コンプレックスにエステルを単離するこ
となく有機塩基、ベンジルトリメチルアンモニウムハイ
ドロキサイドが室温（２０〜２５℃）で加えられ、２〜
４時間反応せしめられる。この解重合反応はＩＮ塩酸の
添加により中断される。

解重合されたヘパリンフラクションは、あらかじめジク
ロロメタンで平衡化された０、０７Ｎ　−０，１２Ｎ塩
化ナトリウム水溶液とジクロロメタン液間の相分離によ
り否解重合物から分離せられる。

水性／食塩溶液（ＳＩ［［）中に含まれる解重合された
ペンジルヘバリネートは、ＩＮないし２Ｎ水酸化ナトリ
ウムで低温（０〜５℃）で１〜４時間処理することによ
り脱ベンジル化せられる。

第４級アンモニウムとコンプレックスされたペンジルヘ
バリネートを含むジクロロメタン溶液（ＳＩＶ）は、再
び有機塩基（ＨＢ）で処理される。

第４級アンモニウムコンプレックスの分解は、ジクロロ
メタン溶液と　１．２Ｍ塩化ナトリウム溶液間の相分離
により実施せられる。解重合されたベンジレートヘパリ
ンのすべてが食塩水性相（ＳＶ）に移ることが立証・さ
れている。

脱ベンジル化工程からの解重合ヘパリンの食塩水溶液が
１００ＯＮ　Ｍ　Ｗ膜での限外濾過により透析され、親
液性ならしめられる。

本発明の解重合法で得られるオリゴサツカライドはまた
透析の水性液からメタノール、エタノールあるいはアセ
トンの如き否水性溶液くそれらのナトリウム塩の形）で
の沈澱により単離することもできる。

本発明のオリゴサツカライドはまた常法によりリチウム
、カリウム、カルシウムあるいはマグネシウムで塩化す
ることもでき、この場合はプロトン型のカチオン交換樹
脂で対応するヘパノン酸を作り、次に所望の力千オンを
用いて塩化する。

本発明のオリゴサツカライドは、下記構造式％式％ 脱ベンジル化および透析の後、生成物をアルカリ過マン
ガン酸塩あるいはナトリウムボロハイドライドで処理す
るか否かにより、Ｂ−エリミネーションから得られるＣ
４とＣ５の間の二重結合は存在し、あるいは存在しない
。

Ｒ′は、水素原子または遊離または塩化された形態での
カルボキシ基を表す。Ｒ１は、水酸基または酸あるいは
塩の形でのサルフェート基である。Ｒ２は、酸あるいは
塩の形でのスルホネート基またはアセチル基を表す。Ｒ
３は、水酸基または酸あるいは塩の形でのサルフェート
基を表す。−〇−は、酸素橋を表し、Ｇはグルコサミン
鎖を、またＵは元のヘパリンのポリサッカライド構造に
おける存在に従い、ウロン酸鎖（グルクロン酸、Ｌ−イ
ズロン酸およびサルフェート化し一イズロン酸）である
。

本発明のオリゴサツカライドはナトリウム塩として下記
特性を有する。

ウロン酸含量　　　　　：２５〜４０％硫　　黄　　含
　　量　　　　　　　＝　１０〜１３％窒素含量　　＝
１．８〜２．５％ 平均分子量　：　３，０００〜７，０ＯＯＤ本発明方法
で得られる最終製品は平均分子量、並びにその範囲に応
じ次のように分類せられる。

平均分子量　：　１５Ｈ−３０ｎＯＤ　３００１１−５
ＱＯ１ＩＤ　５θ００−’１０００Ｄヴｆト１７　ＸＸ
Ｉで得られる 抗凝固作用 ＋　　１０−５０　　　　５０−７０　　　　７０−１
２０ヴイトロでの 抗液性作 用　　　　、　　　ＱＱ〜１６０　　　　　　９０〜１
８０　　　　　１２０〜１８０ヴイトロでの ＡＰＴＴ作用 ：１Ｏ−４０ ０−１１Ｑ 以下実施例により本発明を説明する。

実施例　１ 下記特徴を持つブタ粘膜に由来する市販のヘパリンを用
いた。

抗凝固作用ＵＳＰＸＸＩ （Ｓｔｄ、　ＷＨＯＩＶ）　　　　：　１８７　　ｏ、
ｄ、ｂ。

ウロン酸含量　　　　　　　　：　　３１．６　ｏ、ｄ
、ｂ硫　　黄　　含　　量　　　　　　　　　　　：　
　１１．８　　ｏ、ｄ、ｂ。

窒　　素　　含　　量　　　　　　　　　　　：　　　
２．ｌｏ、ｄ、ｂ。

平均分子量（第１．ａ図参照）：１７．θ００タルトン
ナトリウムヘパリン３００ｇを蒸留水１２ノに溶解した
。この溶液を膜ＡＭＩＣＯＮ　　Ｅ−１０Ｐ　３−２０
２５を通し限外濾過でもとの半容積量に濃縮し、同じ装
置で２倍容積の蒸留水を用い透析した。この後者操作か
ら得られる液に５９．７ｇの塩化ナトリウムとベンゼト
ニウムクロライドの７．５％ジクロロメタン溶液３００
ｍ１を加えた。

この溶液をベンゼトニウムクロライドの７．５％ジクロ
ロメタン溶液であらかじめ０．１７Ｍの塩化ナトリウム
水溶液で平衡化せしめた液６．５１で抽出した。これら
の相を抽出あるいは遠心分離で分離し、ジクロロメタン
相を攪拌器を付したジャケット付反応器に移し、純ベン
ジルクロライド３００１と共に２０〜２５℃でおだやか
に攪拌した。この攪拌は同温度で６時間継続し、その後
ベンジルトリメチルアンモニウムハイドロキサイド６０
ｍ１を加え、さらに３時間攪拌した。

次にＩＮ塩酸１０ｍ１を加え、この溶液を０．１Ｍ塩化
ナトリウム水溶液６１で抽出した。

この食塩溶液に２　Ｍ　−Ｎ　ａ　ＯＨ４００ｍ１を加
え、４℃で２時間攪拌し、ｌＮ−ＨＣｌで中和し、次に
１００ＯＤ分子量カットオフの膜を付した限外濾過器で
透析しな。

塩化ナトリウムＯ，ＩＮ溶液を用いての相分離からのジ
クロロメタン溶液を反応器に戻し、６０ｍ１のベンジル
トリメチルアンモニウムハイドロキサイドを加え２０〜
２５℃で３時間攪拌を続けた。

次にＩＮ−塩酸１０＋ａｌを加え２Ｍ塩化ナトリウム水
溶液６ｉで抽出した。ペンジルヘパリネートを含む食塩
水溶液に２　Ｍ　−Ｎ　ａ　ＯＨ４ＱＯａ＋Ｉを加え２
℃で２時間攪拌し、次に１Ｍ塩酸で中和しクロライドが
なくなるまで１００ＯＮ　Ｍ　Ｗカットオフの限外濾過
膜を用いて透析しな。

得られた液を親液性にした（Ｐ２）。

ＰｌとＰ２を混合した。生成物２５４ｇが得られ、それ
は下記特性を示した。

平均分子量　　　：　４７００ 重量平均分子量（ＭＷ）　　　　　：５６００数平均分
子量（ＭＮ）　　：３８００ 抗凝固作用（ＵＳＰＸＸＩ）　　　＋　　５３０／■抗
　　Ｘａ　　　作　　用　　　　　　　　　：　　１６
３　　Ｕ／＋ＴＩｇＡＰＴＴ作用（Ａ、ティエン等、Ｔ
ｈｒｏｍｂ。

Ｒｅｓ、　１１．１０７（１９４７）　）　　　　：　
４４　Ｕ／ｍｇポリディスバージョンＱ　＝　ＭＷ／Ｍ
Ｎ　：　１．４７（第２図参照） 実施例　２ 実施例１と同じナトリウムヘパリンを原料ヘパリンとし
て用いた。

ナトリウムヘパリン３００ｇを蒸留水１２ｉに溶かした
。この溶液をＡＭＩＣＯＮ　　Ｈ−１０Ｐ３２０２５Ｗ
Ａを用いた限外濾過でもとの容積の半分に濃縮し、同じ
装置を用いて２倍容積の蒸留水で透析し、６１の液を得
、これに５９．７ｇの塩化ナトリウムを加えた。抽出ま
たは遠心分離で相を分離し、ジクロロメタン相（ＳＩ）
を攪拌器付きジャケット付反応器に移した。純ベンジル
クロライド３００ｍ１を加え、２０〜２５℃でおだやか
に攪拌した。同温度で６時間攪拌を続け、次に６０１の
ベンジルトリメチルアンモニウム°を加え、同温度でさ
らに４時間攪拌を続けた。

次にＩＮ塩酸１０＋＋１を加え、０．０７Ｍ−ＮａＣ１
水溶液６ノで抽出した。この食塩水溶液に２Ｎ−Ｎ　ａ
　ＯＨ４００ｍ１を加え、４℃で２時間攪拌し、次いで
ＩＭ−ＨＣＩで中和し、１００ＯＮ　Ｍ　Ｗカットオフ
の限外濾過膜で透析した。

この生成物を親液性にしくＰｌ）、０．７Ｍ　−Ｎａｃ
ｌでの分離相から得られるジクロロメタン溶液を再循環
し、６０１のベンジルクロライドを加え、２０〜２５℃
で６時間おだやかに攪拌した。

次に１Ｍ塩酸２θ１を加え、この溶液を２Ｍ−ＮａＣｌ
水溶液６，７！で抽出した。ペンジルヘパリネートを含
む食塩水溶液に２Ｎ−ＮａＯＨ１００１を加え、４℃で
さらに２時間攪拌を続け、ＩＮ−ＨＣｌで中和し、１０
０ＯＮ　Ｍ　Ｗカットオフの限外濾過膜を用い、タロラ
イドがなくなるまで透析した。

この液を親液性になしくＰ２）、Ｐｌと混合し、下記特
性の生成物２２８ｇを得た。

平均分子量　　　：　２９００ 重量平均分子量（ＭＷ）　　　　　：３６００数平均分
子量（ＭＮ）　　：２３００ ポリデイスバージヨンＱ　＝　ＭＷ／ＭＮ　：　１．５
６抗凝固作用（ＵＳＰＸＸＩ）　　　：　　３０Ｕ／ｍ
ｇ抗Ｘａ作用　　　：　１５４　Ｕ／ｍｇＡＰＴＴ作用
　　　　　　　　　：１９Ｕ／ｍｇ（第３図参照） 実施例　３ 牛膝に由来する市販ヘパリンで下記特性を有するものを
原料として用いた。

抗凝固作用（ＵＳＰＸＸ　Ｉ　）　：　１６５　Ｕ／ｍ
ｇウロン酸含量　：　３３．２％ｏ、ｄ、ｂ。

硫　　黄　　含　　量　　　　　　　　　：　１２　％
ｏ、ｄ、ｂ。

窒素含量　　　＝２．４％ｏ、ｄ、ｂ。

比　旋光度（α）　ｏ　　　：　＋４４．７平均分子量
　　：　１６，０００ダルトンナトリウムヘパリン３０
０ｇを蒸留水１２ｉに溶かした。この溶液をＡＭＩＣＯ
Ｎ　　Ｈ−１０Ｐ３−２０２５膜を用いた限外濾過でも
との容積の半分に濃縮し、同じ装置を用いて２倍容積の
蒸留水で透析した。

この操作で得られた液にＮ　ａ　Ｃ１５９，７ｇとベン
ゼトニウムクロライドの７．５％液３００１を加えた。

この溶液（ＳＩ）をベンゼトニウムクロライドの７．５
％ジクロロメタン溶液であらかじめ０．１７Ｍ−ＮａＣ
１水溶液で平衡化させた液６．５１で抽出した。抽出ま
たは遠心分離で相を分離しな。

ジクロロメタン相を攪拌器を付したジャケット付反応器
に移し、純ベンジルクロライド３００１を２０〜２５℃
でおだやかに混合し、６時間攪拌を続けた。次に１．　
Ｎ−ＨＣ１１０ｍ１を加え、０．１２Ｎ−ＮａＣｆ水溶
液６Ｊ！で抽出した。

２　Ｎ　−Ｎ　ａ　ＯＨ４００ｍ１をこの食塩水溶液に
加え、４℃で２時間攪拌し、ＩＮ−ＭＣＩで中和し、１
００ＯＮ　Ｍ　Ｗカットオフの限外濾過膜で透析し、親
液性ならしめた（Ｐｌ）。

ペンジルヘバリネートを含む水性食塩液に２Ｎ−Ｎ　ａ
　ＯＨ１００＋ｎｌを加え、４℃で２時間おだやかに攪
拌した０次にこの溶液をＩＮ−ＭＣＩで中和し、ｌθ０
θＮＭＷカットオフ限外濾過膜でクロライドがなくなる
まで透析した。

得られた溶液を親液性ならしめた（Ｐ２）。

ＰｌとＰ２を混合し、下記特性の生成物２７３ｇを得た
。

平均分子量　　　：　５６００ 重量平均分子量（ＭＷ）　　　　　：６４５０数平均分
子量（ＭＮ）　　：４１００ ポリデイスバージヨンＱ　＝　ＭＷ／ＭＮ　：　１．５
７抗凝固作用（ＵＳＰＸＸＩ）−ニア３Ｕ／ｍｇ抗　　
Ｘａ　　　作　用　　　　　　　　　：　　１７１　　
Ｕ／ｍｇＡＰＴＴ作用　　　　　　　　　：６４Ｕ／ｌ
１ｇ本発明方法で得られるオリゴサツカライド混合物は
化学的並びに生理学的に下記特性を有する。

［分子量分布コ 移動相としてＮａＣ１を用い、ＴＳＫ２θ００およびＴ
　Ｓ　Ｋ　３０００カラムでの高圧液相クロマトグラフ
ィーで分子量分布を決定しな。溶質液プロファイルはＵ
Ｖ　（２０５ｎｍ）検出器を用いて検出した。

第５図は、（ａ）本発明方法、（ｂ）亜硝酸を用いる解
重合、（ｃ）分画なしでのＢ−エリミネーションで得ら
れた製品の分子量分布の比較図である。

第一の場合、ポリディスバージョンは低度で、（ｂ）と
（ｃ）の平均分子量は見かけ上接近しているが（４８０
０と５５００）　、高分子量の寄与は、（ａ）の場合よ
り（ｂ）および（ｃ）の方が大である。

従って、（ａ）においてはコファクター■とトロンビン
の相互作用を強化する７５００Ｄより高い分子量フラク
ションの寄与は最小限になっている。

セファローザＡＴＩ［［でのアフィニティクロマトグラ
フィーは、本発明で得られる化合物がＡＴ■に結合する
組成物を２７％以上含むことを示している。後者は、相
分離でまず処理することを選択し、アニオン密度の低い
フラクションを除去し、Ｏ−サルフェート、Ｎ−サルフ
ェート対カルボキシル基の含量比が低い特徴を持つ結果
である。

［凝固パラメーターの分析コ 分画しないヘパリンと本発明のオリゴサッカライドフラ
クヨンのうさぎおよび犬の血液を用いた”インビトロ”
処理での抗Ｘａ、抗１１ａ、ＴＴ、およびＡＰＴＴ ［Ｘａ因子の不活性化作用コ 動物：ニュージ−ランドうさぎ 性　：雄 処理：　５ｔｏ１．　ＷＨＯＩ　　低分子量ヘパリン（
インビトロ）分析：クロモゲン法　抗Ｘａ　　ＫＡＢＩ
　　コアナス１〜抗Ｘａ因子作用 （アブゾーバンス） 折物質の濃度 ０．２　０．４　０．６ ０．９４７０．９０８０．８６４ ０．９２１！　０．９０５０．１１８４０．９６２０Ｊ
９００．１１３８ １．０４７０．９９３０．９６０ ＋）、９７９　ｆｌ、９７５０．９３６０．９７３０．
９３４０．８９６ ０．０４５６０．０４６４０．０５０６０．０２０４０
．０２０８０．０２２６（Ｕ、／ｍ１） ０、ｇ　　　　１．０ ０、）１２５　　　Ｑ、７９４ ０．８６３　　０．８４２ ０．７８３　　　Ｑ、７２３ ０Ｊ９０　　０．８？２ ０．１１３７　　０．１１１？ ０．８４０　　０．８＋（１ ０，０４０３０，０５６４ ０，０１８００，０２５２ 動物　　　　分 Ｎ”　　　０．０ ３４８　　０．９８１ ２９６　　０．９３４ ３４２　　１．０３３ ３５０　　１．１０６ ３４９　　１．０４７ 平均　　１．０２０ Ｄ、Ｅ、　　　０．０６５６ Ｅ、Ｅ、Ｍ、　　０．０２９３ 回帰直線 Ａ＝１．０１８４ Ｂ＝−０，２１２４ ｒ＝−０，９９８０ 処？ｔ： Ｈ−ＢＰＭ−Ｂ　（インビトロ） （オリゴサツカライドフラクション １１．１０１　　Ｑ、２０８　０．３（１８０，２６１
０，４８２０，６９８ ０，２５１０，５９５０，８７３ ０，２３２０，４０２Ｑ、７９７ −０．０１２　０．２３２　０．３５５０．１６７　０
．３９１１　０．６０６０．１１８９　０．１４７８　
０．２５８９０．０５３２　０．０６６１　０．１１５
１１平均 口、Ｅ。

Ｅ、Ｅ、Ｍ。

回帰直線 Ａ＝−０，０２５９ ８＝１．０１２５ ｙ−＝Ｑ、ＱＱ２ｆ） 実施例２） Ｏｊ１２　０．４ｇ２ θ、８４０　１．０１１０ ０．９２０　１．５８８ ０．９５７　１．ｌ８８ ０．５５７　０．７６０ ０．７１７　１．０２０ Ｑ、２７５５　１１１．４２＋７ ０．１２３２　０．１８８６ 動物：ピーグル犬 性　：雄 処理：　Ｈ−ＢＰＭ−Ｂ　（インビトロ）（Ｓｔｄ、Ｗ
ＨＯＩ−ＬＭＷＨ） 抗Ｘａ因子作用 （アブゾーバンス） 動物　　分析物質の濃度 Ｎ”　　Ｑ、ＯＯ，２０，４０，６ ６ＨＬ６　　、＋４３０．９７７０．７１１００．６１
１４６ＨＱ３　．２０２１．０６３０．８２２０．７１
４６ＨＱ４　　．１７１　０．９１！６　０．７ＡＯ眠
６４６６ＧＫ４　．１６４　＋、０１５０．１１３Ｑ　
Ｏ，６７８６１１０４，２１９０，９６３０ＪＩ８０．
６４２平均　　、１８０　１．００１　０．１１０６　
０．６７３Ｄ、Ｅ、　　　　　０．口３０５　　０．Ｑ
３９６　　０．０２４１　　０．１）２９７Ｅ、Ｅ、Ｍ
、　０．０１３６０．（１１７７０，０１（Ｉｓ　０．
０１３３回帰直線 Ａ＝１．１３８４　　　　ｒ＝−０，９８９３Ｂ＝−０
，７１０９ （Ｕ／ｍｉ＞ ０．８　　　　１．０ ０．５６７　　０．４８９ （＋、５９７　　θ、４９３ ０．５４１　　０．４５０ ０．５８０　０．４す６ Ｑ、５４２　　　Ｑ、４３９ Ｑ、５６５　　０．４７３ ０．０２４３　　　ロ、０２６８ （１，（１１（１９（］、ＱＪ２ｉ） 処置： Ｈ−ＢＰＭ−Ｂ　（インビトロ） （オリゴサツカライドフラクション ０１７１　０．６２＋　　０．７５２ ０．３２１　０．５８３　０．７０７ ０．３３５　０．６０６　０．７３６ ０．３６２　　ｒｌ、５６１　０．．７２９０．２９５
　　ｆｔ、５８９　０．７ｉ１０ｊ３７　０．５９３　
０．７２７ ０．０３０１！　　０．０２０６　０．０＋８５０．０
１３８　　Ｑ、０Ｑ９２　　Ｑ、０ｆ）８３６）ＩＬ６ ＨＱ３ ＨＱ４ ＧＫ４ ＨＯ４ 平均 口、Ｅ。

Ｅ、ｇ、Ｍ。

回帰直線 Ａ＝０．２３５１　　　　ｒ　＝０．９Ｐ１３９Ｂ＝０
．７７７５ 実施例２） ０．１１７７　０．９７４ ０．９１２　０．９９１ ０．８７１　０．９６１ｔ ０．８８０　０．９６０ ０、Ｒ６００，９６３ ０，１１８００，９７＋ ０、Ｑ１９５　０．０！２３ ０．００８１　０．００５５ 犬およびうさぎプラズマで試験した抗Ｘａ因子作用は、
分画しないヘパリンとオリゴサツカライドフラクション
に対し、同じである。

第６図および第７図参照。

［Ｉ［ａ因子の抑制］ コアテスト　カビ　Ｓ、２２３８　　キットを用いて色
素分析を行った。

この分析に血小板が少なく、繊維素除去を行った血漿を
用いた。第８図は、分画しないヘパリン（Ｈ）と本発明
のオリゴサツカライドフラクション（Ｈ−Ｂ　Ｐ　Ｍ　
−Ｂ　）を用いて得られる結果を示している。

血漿中の同じ濃度でＨ−Ｂ　Ｐ　Ｍ　−Ｂでは、トロン
ビンの抑制がより低いことを示している。

第８図参照。

［トロンビン時間コ うさぎおよび犬の血漿を用い、該血漿がトロンビンを発
生するに要する時間〈トロンビン時間）を決定した。い
ずれの場合も分画しないヘパリンとオリコサ・Ｖカライ
ド（Ｈ−ＢＰＭ−Ｂ）では非常な差異が認められた。比
較のため２種類の市販解重合ヘパリン（Ｈ−ＢＰＭ−Ｃ
およびＨ−ＢＰＭ−３）をオリゴサツカライド（Ｈ−Ｂ
　Ｐ　Ｍ　−Ｂ　）と同時に分析した。

第９図および第１θ図参照。

動物：ニュージ−ランドうさぎ 性　：雄 トロンビン時間（秒〉　（平均値〉 処　置　　　分析した物質の濃度（Ｕ／ｍ１）０．０　
　０．２　　０．４　　０．６１８．０　　５４．４　
１３７ｊ　　＞２５０１８．０　　１７．２　　１９．
１　　１９．９１１１．０　　１７．５　　１９ｊ　　
　２０．９１８．０　　１９．１　　２２．４　　２３
．６統計的分析（相互作用のある２因子） 相対水準での処置群の間 Ｈ／Ｈ−ＢＰＭ−Ｂ ）１／）Ｉ−［ＩＰＭ−５ Ｈ／）Ｉ−１１ＰＭ−Ｃ １（−ＢＰＭ−Ｂ／ｌｌ−８１’Ｍ−８Ｈ−ＢＰＭ−８
／）ｌ−ＢＰＭ−Ｃ Ｈ−Ｂ［’Ｍ−３／Ｈ−ＢＰＭ−Ｃ ０，８ 〉２５０ ２眠７ ２３．２ ２６．４ Ｈ−ＢＰＭ−Ｂ Ｈ−１１ＰＭ−８ Ｈ−ＢＰＭ−Ｃ １、Ｑ ＞２５０ ２２．１ ２５．３ ３１．０ Ｐ＜０．００１ ｐ＜’０．０１１ｉ Ｐ＜０．００１ ｐ＜：０．００１ Ｓ Ｓ Ｓ 動物：ピーグル犬 性　：雄 Ｈ９，（ｌ　　１９．６　５２．５　１１６．ｍ＞２５
０　　＞２５０）１−ＢＰ〜Ｉ−［１９，’ｌｌ　　１
０．＋　　１０．５　１．０．７　　＋１．４　１１．
８Ｈ−１１ＰＭ−Ｓ　　９．９　　１０．２　　１０．
１１　　１１．９　　１２．７　　１３．８Ｈ−ｆｌＰ
ＴｈトＣＱ、９　　　１０．７　　　１１．８　　１３
．（１１４，５１６，６統計的分析（相互作用のある２
因子） 処置群の間、相対水準　　　　　　　　　　　ｐ＜０．
００１）１／Ｈ−ＢＰＭ−Ｂ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　ｐ＜Ｑ、００１１（／Ｈ−１’ＩＰ％トＳ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　ｐ＜０．００１Ｈ／Ｉｔ−ＢＰん１−ｃ　　　
　　　　　　　　　　　　　　ｐ＜＋）、００１Ｈ−Ｉ
ＩＰλＩ−Ｂ／トＩＩＰＭ−８ＮＳＨ−ＢＰＭ−Ｂ／Ｈ
−ＢＰＭ−ＣＮＳ Ｈ−ＢＰＭ−Ｓ／）Ｉ−ＲＰＭ−ＣＮｓ下記表は、各種
濃度のグリコサミノグリカンを含む血漿に各種濃度のト
ロンビンを加えたもののトロンビン時間を示す。

トロンビン時間（秒） （トロンビン＝６０．．／ｍｌ） コントロール ＳＵＨ ｔＪＨ ＳＵＨ フラキシパリン ＬＭＷＨ−Ｂ （２Ｈｇ／ｍ （ＩＢ／ｍ （Ｑ、５Ｈｇ／ｍ （４２Ｂ／ｍ （２Ｈｇ／ｍ ５．５ ３９．６ １１．４ ７．１ ５．５ ５．５ （トロンビン＝４Ｕ／ｍｌ） コントロール ＳＵＨ（２ｕｇ／ｍｌ） フラキシパリン＜２　ｕｇ／ｍｌ） ＬＭＷＨ−Ｂ　　（２ｕｇ／ｍ１） ６．４ ５９．５ ８．３ （トロンビン＝２Ｕ／ｍｌ） コントロール　　　　　　　　１１．２±０．１１フラ
キシパリン（４ｕｇ／＋Ｉ）　　９２．８±９．８μＭ
ＷＨ−Ｂ　　（４ｕｇ／ｍｌ）　　４０．３±４．２フ
ラキシバリン（２ｕｇ／ｍｌ）　　３３．４土　０．８
μＭＷＨ−Ｂ　　（２μｇ１０１）　　２２．８±　１
．０フラキシバリン（１ｕ≦／ａｔ）　　１６．６±０
．ＩＬＭＷＨ−Ｂ　　（１ｕｇ／ｍｌ）　　１４．９±
　０．２フラキシバリン（０，５μｇ／ｍ！＞　　１２
．８μＭＷＨ−Ｂ　　（０，５μｇ／ｍｌ）　　１２．
８ＳＵＨ：市販ヘパリン フラクション（登録商標名）：解重合市販ヘパリン ＬＭＷＨ−Ｂ　：本発明で得られたオリゴサツカライド 解重合ヘパリンでは、コントロールに比べ高濃度トロン
ビン血漿の場合、トロンビン時間はあまり変化がなかっ
た。しかしながら、分画しないヘパリンは顕著な増大を
示した。

低濃度のトロンビンを加え、ＬＭＷＨ−Ｈの濃度を増大
させた場合にはフラクションに比べかなりの差異があり
、このことはＬＭＷＨ−Ｂが出血の危険性の低いことを
示している。

［付活されたパーシャルトロンボ プラスチンタイム＜ＡＰＴＴ）コ 犬およびうさぎの低血小板血漿とベーリンガーマンハイ
ムのキットを用いた。

各種用量でのＨ−ＢＰＭ−ＢはＡＰＴＴを増大せず、非
分画ヘパリン（Ｈ）ではＡＰＴＴを増大した。

第１１図および第１２図参照。

動物：ピーグル犬 性　　：雄 処置 Ｈ−ＢＰＭ−Ｂ ＡＰＴＴ（秒）　（平均値） 分析物質の濃度（Ｕ／ｍ１） ０．０　０．２　０．４　０．６　０．８１５．３　１
ｇ、６　２５１　３２２　４０．２１５．３　１５ｊ　
　１６．１　１８．０　１？、６１．０ ５９．５ １８．４ 統計的分析く相互作用のある２因子） 処置群の間、相対水準　　　　　　ｐ＜０．００１Ｈ／
Ｈ−ＢＰＭ−Ｂ　　　　　　　　　　　　ｐ＜ｏ、ｏｏ
ｉＨ／Ｈ−！ＩＰＭ−５ｐ＜０．００１ 動物：ニュージ−ランドうさぎ 性　　：雄 ８　４７．４７１’１．４１５４．１２００．０２３２
．５　＞２５０Ｈ−ＢＰＭ−Ｂ４７．４５７．９５７．
１５７．７５９．９　６７．４相対水準での処置群の間
　　　　　ｐ＜０．００１）１／）！−ｔｌＰＭ−［１
ｐ＜：０．００１［血小板凝集に対する影響］ 多くの研究で、ヘパリンの出血効果は、血小板に対する
ヘパリンの作用により引き起こされることが判明してい
る。

ガルラマン等（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、賃、　６
４　（１９８０）　）は、ヘパリンと血小板の相互作用
に対する分子量の影響を研究した。

彼らは、高分子量フラクション（２０，０００）が、低
分子量フラクションより反応性が高いと結論づけな。

本研究においては、タイロード液にうさぎの血小板を懸
濁させたものを用いて、市販へ１＜リンとＨ−ＢＰＭ−
Ｈの抗凝集作用を調べた。

食塩水コントロールに比し、コラーゲン溶液（１００μ
ｇ／ｌ）で血小板凝集が誘発された。

この研究で、同じ用量では市販ヘパリン（）Ｉ）より本
発明のＨ−ＢＰＭ−Ｂの方が、血小板凝集に対する効果
がはるかに低く、従って出血の危険性が低いと結論づけ
られた。

第１３図参照。

［ラットでの抗トロンビン作用の評価］血栓の形成は、
大静脈の結紮により誘せられる。市販のヘパリンおよび
本発明のＨ−ＢＰＭ−Ｂを２００Ｕ　ａ　Ｘ　ａ　／　
ｋｇ、５０〜１００と２ＱＯＵ　ａＸ　ａ／ｋｇの用量
で皮下注射（ｓ、ｃ、）により投与し、両者をコントロ
ールと対比した。

その結果、同じ量を投与した場合は、本発明のＨ−ＢＰ
Ｍ−Ｂと市販ヘパリンは同等の活性を示した。しかしな
がら、本発明のＨ−ＢＰＭ−Ｂは市販のヘパリンに比し
、抗−Ｆ［ａ作用がはるかに低く、抗トロンビン作用は
同じでも、出血の危険性がはるかに低い結果を示しな。

［出血時間への影憂コ 全尾部切断法により、出血時間への影響を評価した。下
記に表示する如く、市販ヘパリンに比べ本発明のＨ−Ｂ
ＰＭ−Ｂは出血時間を極めて顕著に低減することを示し
ている。

処　　置　　　用量（ｔｌａＸａ／ｋｇ）出血時間（秒
〉コントロール　　　　　　　　　　３０９±２０市販
ヘパリン　　　　２４０　　　　　７６４±４０市販ヘ
パリン　　　　１００　　　　　６５９±４１Ｈ−Ｂ　
Ｐ　Ｍ　−Ｂ　　　　５０　　　　　３２７±２０Ｈ−
Ｂ　Ｐ　Ｍ　−Ｂ　　　　１００　　　　　３６１±４
０Ｈ−Ｂ　Ｐ　Ｍ　−Ｂ　　　　２４０　　　　　４４
６±３０［人血小板因子４ （ＰＦ４）に対する影響コ ＰＦ４は、血小板により放出される非分画ヘパリンの生
理学的インヒビターである。

うさぎを用いて標準的な非分画ヘパリン（Ｈ）と）（−
ＢＰＭ−Ｂであらかじめ処理した後、人ＰＦ４の消失を
研究した。

両者とも静脈注射で、まなＰＦ４（６０μｇ／驕）も同
じルートで投与した。非処置うさぎでは、インミュノリ
アクティブＰＦ４は、非常に急速に消失し、これに対し
、Ｈ及びＨ−ＢＰＭ−Ｂの存在ではこのプロセスがゆっ
くりであった。下記衣に見られる如＜、Ｈはとではない
が、Ｈ−ＢＰＭ−ＢはインビボでＰＦ４に対する親和力
が良好であった。

処置 食塩水 ）１−ＢＰＭ−９ １（−ＩＰＭ−Ｂ 用　　量　　　　　ＰＦ４のカイネティフク　　パラメ
ーター（ｍｇ／ｍｇ）　　　　Ｃｏ（ｎｇ／ｍｌ）　　
　ｔｌ／２（分）−Ｂ １２８．８ ３．４４　　　　　　１０５５．４ ０．８６　　　　　　　７７６．２ ０．８６　　　　　　　４５７．６ ３．４４　　　　　　　８３１．７ ［毒　性　研　究］ ＰＭ−Ｂの毒性を研究し、致死量５θ ２．１ １３．９ ７．２ ３．４ ５．６ （ＬＤ５Ｑ）を計算した。

Ｈ−ＢＰＭ−Ｂは静脈注射および皮下注射で投与された
。静脈注射投与の場合Ｈ−ＢＰＭ−Ｂは、ｌＱｍｌ／ｋ
ｇ体重を一回量で投与し、Ｌ　Ｄ　５０は３．３００ｍ
ｇ／’ｋｇであった。４，０００ｍｇ　／　ｋｇを投与
するとムコポリサッカライドの毒性のためＨ−ＢＰ　Ｍ
　−Ｂは、神経症状（全身ケイレン）を誘起した。皮下
注射でＨ−ＢＰＭ−Ｂを投与した場合、Ｌ　Ｄ　５０は
６，７００ｍｇ／ｋｇより大であった。

本発明で得られる生成物は、血栓症の予防及び治療に好
適である。また、Ｈ−ＢＰＭ−Ｂは、非分画ヘパリンに
比べ、利点／出血危険性の比が高い。

通常の用量０．５〜１．０　ｍｇ／ｋｇで投与した場合
、ＡＰＴＴおよびトロンビン時間（ＴＴ）への影響が少
ないことは、適応での生物学的コントロールを最小限な
らしめる。

本発明のＨ−ＢＰＭ−Ｂは、皮下注射及び静脈注射可能
なバイロゲンを含ま−・ない医薬品調整に適している。

また、胃液で溶けないカプセルとして経口投与すること
も可能である。

低分子量であるなめ静脈的あるいは、局所投与で除放性
のリポソーム被包に好適である。動物試験で皮下注射で
生物利用度を調べた場合、本発明のＨ−ＢＰＭ−Ｂは９
３％で非分画ヘパリンは４８〜６０％であった。

フランツデイヒユージョンセルで人皮を用い、”インヴ
イトロ”での試験で本発明Ｈ−ＢＰＭ−Ｂは、１００％
の活性分が通過することがわかった。

従ってこのものは、局所軟膏、クリームならびにその他
の経皮投与システム（例えば、オフルーシブパッチ、マ
イクロリザーバー等）に好適に調剤せられる。

さらに、Ｈ−ＢＰＭ−Ｂは、座薬および吸入剤に調整さ
れ、また、血栓溶解剤と組み合わせることができる。

【図面の簡単な説明】

添付図の第１ａ図は、市販ヘパリンの分子量分布曲線、
第ｉｂ図は、限外濾過不透過分の、また第１ｃ図は透過
分の分子量分布曲線；第２図は実施例１で得られた生成
物の、第３図は実施例２で得られた生成物の、また第４
図は実施例３で得られた生成物のそれぞれ分子量分布曲
線を示し；第５図の（ａ）は本発明方法、（ｂ）は亜硝
酸を用いる解重合、また（ｃ）は分画なしでのＢ−エリ
ミネーションで得られる製品のそれぞれ分子量分布曲線
であり：第６図および第７図は、うさぎおよび犬でのプ
ラズマを用い、試験した非分画ヘパリンと、本発明オリ
ゴサツカライドフラクション（Ｈ−ＢＰＭ−Ｂ）の抗Ｘ
ａ因子作用を示す図；第８図は、非分画ヘパリンと本発
明のオリゴサツカライドフラクションの濃度と［［ａ因
子抑制効果の関係を示す図；第９図および第１０図は、
うさぎおよび犬の血漿を用いた際の非分画ヘパリン（Ｈ
）と、本発明のオリゴサツカライド（Ｈ−ＢＰＭ−Ｂ）
と、市販の解重合ヘパリン（Ｈ−ＢＰＭ−Ｓ、Ｈ−ＢＰ
Ｍ−Ｃ）とのトロンビン時間の関係図；第１１図および
第１２図は、犬およびうさぎの低血小板血漿を用いた際
の非分画ヘパリン（Ｈ）と、本発明のオリゴサツカライ
ド（Ｈ−ＢＰＭ−Ｂ）との用量とＡＰＴＴの関係図；第
１３図は、市販ヘパリンと本発明オリゴサツカライドの
用量と、血小板凝集抑制作用との関係図である。 特許出願代理人

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）水性ヘパリン溶液を限外濾過し、３，０００ダル
   トン以下のフラクションを除去する工程、食塩水溶液と
   ジクロロメタンを用い、ヘパリンと第４級アンモニウム
   塩のコンプレックスをジクロロメタン相（Ｓ I ）へ、
   また低アニオン性ヘパリン画分を食塩水相（ＳII）へ相
   分離せしめる工程、ジクロロメタン相（Ｓ I ）にベン
   ジルクロライドを加え、ヘパリンコンプレックスのベン
   ジルエステルを形成せし め、次いで有機塩基により解重合反応を実施する工程、
   食塩水とジクロロメタンを用い、解重合ベンジルヘパリ
   ンを食塩水相（ＳIII）へ、また非解重合ヘパリンコン
   プレックスベンジルエステルをジクロロメタン相（ＳI
   V）へ分離する相分離工程、および前記食塩水相（ＳII
   I）中の解重合ベンジルヘパリンを脱ベンジル化し、次
   いで透析により、オリゴサッカライドフラクションをう
   る工程からなる抗トロンビン作用を有するオリゴサッカ
   ライドフラクションの製法。
2. （２）前記ジクロロメタン相（ＳIV）に、有機塩基を加
   え、解重合反応を実施した後、食塩水とジクロロメタン
   を用い、相分離を行い、解重合ベンジルヘパリンを、食
   塩水相（ＳＶ） に、また４級アンモニウムコンプレックスをジクロロメ
   タン相（ＳVI）に移行させ、次いで、（ＳＶ）を（ＳI
   II）に循環させる、請求項第１項記載の方法。