JPH02212500A - アポリポ蛋白質の分離及び濃縮方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は水溶液中に存在するリポ蛋白質を分離する方法
に間する。

〔従来の技術〕

血液中のリポ蛋白質のアテローム性動脈硬化症に対する
影響が知られている。血液コレステロールが高いとき、
即ちアテローム性動脈硬化症の危険が増しているとき、
通常は低密度のリポ蛋白質、ＬＤＬ、即ち悪いコレステ
ロールの増加がある。

高密度のリポ蛋白質（ＨＤ　Ｌ　）は血流から過剰のコ
レステロールを除去するようであり、従って良いコレス
テロールと呼ばれている。最近の研究は、ＨＤＬ、ＬＤ
Ｌの区別が十分に厳密でなく、幾つかの研究はＥｌｌｌ
ｌ在方テゴリーを使用している。

即ち、非常に低い密度のリポ蛋白質（９Ｖ　Ｌ　Ｄ　Ｌ
）、中間密度のリポ蛋白質（ＴＤＬ）なとである。

〔発明が解決しようとする課題〕

大事な点は、上記の大まかなサブ区分内でさえもアテロ
ーム性動脈硬化症の開始及び進行に対し、異なるリポ蛋
白質が異なる寄与をすることである。

従って、血流中の蛋白質を素速く同定することが有利で
ある。

現在、アポリポ蛋白質は密度勾配超遠心に続きリポ蛋白
質の脂質部分の有機溶媒抽出によって血液又は血漿から
単離される。この手順は通常は超遠心段階に要求される
長い時間り１２〜２４時間）並びに任意の一時期に於い
て処理できる試料の数によって通常は限れたものとなっ
ている。これらの制限の為、問題となっている蛋白質の
みがこの種の血液分析を受ける。

水溶液から蛋白質を分離することが望まれる他の場合も
存在する０例えばアポリポ蛋白質の製造又は他の脂質結
合蛋白質の製造を微生物学的方法で行うこと、又は他の
生物源からそれらを単離することは通常生じた蛋白質を
そこから回収しなければならない水性の発酵又は抽出媒
体を伴う。本発明はこの状況にも巧く適合される。

〔課題を解決する手段〕

本発明は血液等の水溶液からリポ蛋白質を急速にかつ効
率的に分離する方法を提供する。血液は先ず水性のペル
フルオロカーボン（Ｐ　Ｆ　Ｃ）エマルジョン、即ち燐
脂質乳化剤を含有しているＰＦＣ分散液と混合される。

リポ蛋白質はＰＦＣ粒の表面上で燐脂質の被膜に結合す
る。このエマルジョンを次に血液から分離し、エマルジ
ョン中のアポリポ蛋白質は既知の分析手順によって、Ｐ
ＦＣエマルジョンから蛋白質を予め分離することなしに
又は分離した後に同定される。このＰＦＣエマルジョン
分離技術は１時間未満で全ての分離がなされることを可
能とする。

上に述べたように本発明は水溶液全般に適用可能である
が本発明は血液又は血漿について記載する。なぜならこ
れが本発明の主要な応用であるからである。血漿という
用語は本明細書ではこれらが均等なものでない場合を除
いて上記両方の用語を包含するものであり、均等でない
場合はその差異を指摘する。

本発明で使用されるペルフルオロカーボンエマルジョン
は、この技術で良く知られた任意のものである。例えば
米国特許４，１０５，７９８及び３，９１１，１３８を
参照。これらは参照により本明細書に取込む。

エマルジョンは更に詳しく以下に記載される。

エマルジョン中のペルフルオロカーボンは一般にベルフ
ルオロシグロカーボン、即ち非環式又はアルキル側鎖を
含有するか含有しない炭素の環状化合物である。シクロ
ヘキサン又はナフタレン及びフェナンスレンのベルヒド
ロ誘導体のように、化合物は一環式、二環式又は多環式
であり得るが、通常は４つの環を越えないものであり、
好ましくは２〜３環である。血液代替物としての有効な
使用の為には、シクロカーボンは通常は９〜１２個の炭
素原子を有するが、本発明はエマルジョンをそのような
目的に使用するのではないので、この限定はそれほど臨
界的でない。ペルフルオロカーボンは少なくとも５０％
、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なく
とも９９％の水素原子がフッ素で置き換えられているこ
とを意味する。

上に記載した種類の典型的な化合物は、トリメチルシク
ロヘキサン、イソプロピルシクロヘキサン、テトラメチ
ルシクロヘキサン、１−メチル−４−イソプロピルシク
ロヘキサン、ｎ・ブチルシクロヘキサン、デカヒドロア
セナフテン、デカリン、メチル及びジメチルデカリン、
テトラデカヒドロフェナンスレン、ドデカヒドロフルオ
レン及びジイソプロピルシクロヘキサンのペルフルオロ
誘導体である。

好ましいシクロカーボンは非芳香族化性の多環式ペルフ
ルオロ化合物であって少なくとも一つの炭素原子を含有
する橋を通じて結合されている二つの橋頭炭素原子を有
するものである。「橋頭炭素原子」という用語は２又は
それ以上の環を有する環状化合物に於いて、３つの他の
炭素に結合している炭素原子を意味する。「非芳香族化
性」という用語は、その環の構造がその元の炭素炭素環
状結合の破壊なしに芳香族化することの出来ない多環式
ペルフルオロ化合物を意味する。これらの好ましい化合
物類は、芳香族化出来るペルフルオロデカリン及び池の
上に述べたものと区別される。

これらの好ましい化合物の例は、ビシクロノナン（例え
ばビシクロ［３，３，３１ノナン、２．６−シメチルビ
シクロ［３，３，１］ノナン又は３−メチルビシクロ［
３゜３．１］ノナン）、アダマンタン、メチル及びジメ
チルアダマンタン、エチルアダマンタン、テトラヒドロ
ジシクロペンタジェン、メチル及びジメチルビシクロオ
クタン、ビナン、カンファン、ｌ　、　４　、６゜９−
ジメタノデカリン、ビシクロ［４，３，２１ウンデカン
、ビシクロ［５，３，Ｏ］デカン等のＣ９〜Ｃ１□多環
式化合物のペルフルオロ誘導体又はこれらの混合物であ
る。これらは既知の手段によって造ることができる。こ
の好ましい種類の化合物は、米国特許４、ＩＯ２，７９
８に記載されている。

ある種の非環式ペルフルオロカーボンは医学的な用途に
使用されるか又は使用の為に評価され、最も顕著にはペ
ルフルオロトリブチルアミン、ペルフルオロオクタン、
１，１．２−　）リヒドコベルフルオロー１−デセン、
１，１，１．２．２−ペンタヒドロペルフルオロデカン
などである。

本発明で使用する乳化剤は燐脂質、好ましくはレシチン
であり、これは製薬上受入れられる市販品である。これ
は種々の医学製品中で乳化剤としてＦＤＡにより使用が
認められている。好ましくは燐脂質は卵黄燐脂質（ＥＹ
Ｐ）であり、そして便宜の為に本発明はこの物質で記載
がなされる。

ＰＦＣ乳化剤は一般に５〜５０容量％ＰＦＣを含有し、
好ましくは１０〜４０容量％を含有している。

ＰＦＣの粒径は一般に０　、２１を未満、好ましくは０
．１ミクロン未満である。これは乳化剤の生体内使用に
対しでてあり、使用の期間にエマルジョンが安定である
限り本方法に於いてそれほど臨界的でない。

燐脂質の量は一般に１〜１０重量／容量％、好ましくは
２〜５重量／容量％である。良く知られている様にこの
量は幾らかＰＦＣの量及びＰＦＣ粒の寸法に依存する。

ＰＦＣエマルジョン中で、表面活性剤はそれ自１ｇ分散
するものであり、蛋白質はＰＦＣ粒の表面にあり、残り
、即ち過剰は水相中にある。この過剰を除くことが望ま
しい。なぜならばこれはアポリポ蛋白質に対しＰＦＣ粒
上粒土るものと競走するからである。過剰に結合又は引
きつけられているアポリポ蛋白質はとれも本発明で含ま
れるその後の工程で捕獲されない。任意のそのような失
われたアポリポ蛋白質は本発明で使用する満足な定性分
析を排除するものではないが、定量分析に不利である。

過剰の表面活性剤は、エマルジョンの水相を回転で飛ば
すように遠心分離し、ＰＦＣの粒土に表面活性剤の蛋白
質を含有しているところの、残りのエマルジョンゲルを
新たな水相でもとし、そして次に過剰の表面活性剤が適
当に除去されるまでこの遠心分離ともどしの手順を繰返
すことによって除去することが出来る。この手ＩＩＩ　
！、を南アフリカ特許２５４４／８５．１９８５年１２
月２４日により詳しく記載されている。好ましくはエマ
ルジョン中の水相中の表面活性剤の量、即ち遠心分離で
除去することの出来る量はエマルジョン中の合計表面活
性剤の３５％未満、好ましくは＋５％未満、より好まし
くは１０重量％未満である。

エマルジョンは先ず試験されるべき動物血液と、抜出さ
れた血液試料と外部的に混合されるか、又は注射したの
ち血液／エマルジョン混合物を動物から抜出すかの何れ
かで混合される。

一般にエマルジョンの量は２５容量％のＰＦＣと２．５
腫ＩＩ／容量％のＥＹＰとを含有するエマルジョンが使
用され、そしてエマルジョン粒が０．２〜０．３ミクロ
ンであるときには、処理される血液の量の約２５容量％
であるべきである。リポ蛋白質はエマルジョン中のＰＦ
Ｃ粒を被覆しているＥＹＰに結合するので、エマルジョ
ン：血液比率はこれらの変数並びに使用するＰＦＣ等に
依存して変化する。

一般にすべての血液リポ蛋白質を除去するのが好ましく
、そしてこれが為されたか否かは残っている血液を分析
することによって容易に決定できる。

血液ｌエマルジョン混合物を次に処理して、ＰＦＣ粒を
分離するとリポ蛋白質を含有している。

これは５０００〜２００００ｇで５〜１０分間遠心する
ことによって最も容易に為される。これが終るとエマル
ジョンのゲルは遠心管の底にあって、血液が上にある。

エマルジョンはゲルである。なぜならばこのとき最初の
水の幾らかが血液層にあって、残りが緊密に結合した水
／ＥＹＰ／ＰＦＣ相の部分にあるからである。

血漿でなくて血ｉ夜が使用されるならば、この遠心分離
の後にエマルジョンゲルが赤いことが見出される。なぜ
ならばヘモグロビンはゲルのほうに回転によって入って
行くからである。最初に血液／エマルジョン混合物を濃
い（２〜３Ｍ）蔗糖溶液上に層にすることによってこれ
を防止することが出来る。この蔗糖溶液は遠心管中の血
液層にヘモグロビンを拘束し、そして遠心分離の終りに
遠心管はエマルジョンゲルの上にある蔗糖層の上に血液
層を含有している。

上に述べた最初の分離の間、リポ蛋白質の脂質部分は血
漿層の頂部に表面をなしている。従ってＰＦＣ粒上粒土
覆しているＥＹＰに結合するのはアポリポ蛋白質である
。

エマルジョンゲルは分離され、そして好ましくはその２
〜３倍容量の生理的食塩水で洗浄される。

これは蛋白質、そしてゲルの間隙内に捕獲された他の物
質を除去することを生じる。ゲル−ＮａＣ溶液混合物を
振とうし、そして前の様に遠心し、その後洗浄したゲル
を分離する。この洗浄段階で除去された蛋白質が、分離
がなされたリポ蛋白質でないことを注目する必要がある
。

次の段階はエマルジョンゲル、即ちフルオロカーボンか
らアポリポ蛋白質を分離することである。

これはゲルを市販の洗剤、例えばＣ５〜Ｃ２゜アルキル
スルホネート、例えばナトリウムドデシルスルホネー）
　（ＳＤＳ還元緩衝液）で洗浄又は混合することによっ
て容易に為される。この洗剤溶液は０．５〜１０重量／
容量％、好ましくは１〜５重量／容量％であるべきであ
る。好ましくはこれは洗剤中に蛋白質の溶解を行なうの
を速める為に５０〜９５℃の高温で行なうのが好ましい
、この目的の適当な別の洗剤は、ＮＰ−４０、市販され
ているオクチルフェノール−エチレンオキシド縮合物で
あり、この場合には低温、例えば２０℃を使用出来、低
い洗剤濃度、例えば０．０５重量／容量％が適している
。何れの洗剤についても、ゲルのダラム当り０．０００
１〜１．０、好ましくは０．００１〜１．０、より好ま
・しくは０１ＯＯ１〜０．Ｏｌリットルの洗剤溶液の容
量比が通常適している。蛋白質はＰＦＣ粒の表面にある
ので比較的少ない洗剤液が要求されるだけである。アポ
リポ蛋白質のＳＤＳ溶液を次にポリアクリルアミドゲル
電気泳動（一般に５ＤＳ−ＰＡＧＥとして知られている
）又は抗体技術によって分析する。これらの手順の何れ
もがこの目的に知られている。

実施例１ ２５０ｇの雄のスブラーグードウレイラットにＲＦＣエ
マルジョン２０１７にｇを注入した。このう・ントは約
２０１の血液を含有している。エマルジョンは２５重量
／容量％のペルフルオロメチルアダマンタン、２．４１
　ｍ　／容量％のＥＹＰ、残りの水を含有しており、平
均粒径０．２５±０．０３μを有していた。エマルジョ
ンを浸透圧３００ミリオスモルにＮａＣｌで調節した。

３時間後、０．５１の血液をラットから除去し、遠心管
中の２Ｍ蔗糖溶液１１上に層にした。次に１２０００８
で１０分間５℃で遠心分離した。遠心管の底のゲルをピ
ンチクリップで分離した。これは１５１Ｉｇの重さであ
った。これを１１の０．９重量％臨床用ＮａＣｌ溶漬中
に再懸濁し、振とうし、１２０００ｇで１０分間５℃で
再遠心分離し、その後１５１ＩＩｇのゲルを水相から分
離した０分離したゲルを９０℃で５〜ＩＯ分間２％ＳＤ
Ｓ還元緩衝液と混合した。この緩衝液は示された量の次
の成分と一緒にすることによって、そして７．７５ｆｆ
Ｉｇ／ｍｌのｒｌＴＴ　（ジチオスレイトール）を加え
ることによって造フた。

蒸留水 ０．５トリス−ＨＣｌ、ｐＨ６，８ ｉｏｘｃ重量ｌ容量）Ｓ　Ｄ　Ｓ ５．２容量 １．０容量 １．６容量 洗剤層を前の様に遠心分離し、ＳＯＳ及びアポリポ蛋白
質を含有している水性の上澄と蛋白質がない下層ゲル層
を生じる。分離は４５分かかる。５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び
抗体方法は次の蛋白質を同定した。蛋白質量はＳ　Ｄ　
Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅゲルを市販のデンシトメーターで
走査することにより定量した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ モル重量（１０００） ２８．０ １７．４ ６．６ ８．８ ８．８ ３４．０ アポリポ蛋白質 −ＩＩ −Ｉ Ｃ−■ Ｃ−可 抗　　　　　　　　　　　　体 見出された蛋白質 Ａ−１，Ａ−ＩＩ、Ｂ−１００，Ｂ・４８、Ｃ−■及び
Ｅ、二つのＢ蛋白質は５ＤＳ−ＰＡＧＥに対し、許され
る最大（２００，０００）以上の分子量を有する。Ｃ−
■及びＣ−■に利用できる抗体はない。

見出された上のアポリポ蛋白質は試験されたラット中の
ものであることが知られており、このことは試験の正確
さを実証している。

実施例２ 実施例１と同じ組成及び粒径のエマルジョン１０１を１
２０００８で＋５分間ｌＯ℃で遠心した。上澄みをすて
、エマルジョンゲル（３１）を燐酸緩衝された塩水溶液
（ｐＨ７，４）中に再懸濁した。この手順を更に２回繰
返して、はぼ水相表面活性剤の無い最終エマルジョンを
与えた。

次にスブラーグードウレイラットの血漿を１５００３で
１５分ｍ５℃で遠心し、存在し得る任意の沈殿を除去し
た。次に０．５ｍｌの上記エマルジョンの蛋白質を血漿
と一緒にし、エマルジョン：血漿の比、１．２．４及び
８：１を生じた。次に遠心分離の後、ゲルを分離し、再
懸濁し、振とうし、再遠心分離し、実施例１の上記の最
終ゲル分離を行なった。

実施例２では全血の代りに血漿を使用したので、実施例
１の蔗糖層を設ける段階は用いなかった。

分離したゲルを実施例１と同じ様に処理し、そして同じ
蛋白質が同定された。

実施例３〜５ 実施例１中で上に記載した手順を本質的に同じやり方で
ニューシーラント白兎、Ｃ３Ｊマウス、及びゼネリック
牛血漿で繰返した。結果は本質的に同じであった。これ
らの血液蛋白質及び実施例１の血液の相互反応性は人の
血液と非常に近いので人の血液に対するこの手順の応用
性は非常に保証されているもようである。

本発明に於いて、上記の手順に従って得られた上の抽出
効率を改良する幾つかの方法も見出した。

事実、本発明者はある種のアポリポ蛋白質の定量的な抽
出水準を達成する為にこれらの技術のｌ又はそれ以上を
しばしば用いることが出来る。

第１は少量の表面活性剤を血液に加えることであり、こ
れは蛋白質の他の血液成分との結合を弛めるようであり
、そして蛋白質をより抽出されやすくする。イオン性及
びノニオン性表面活性剤の両方を用いることが出来、例
えばＮＰ−４０（ポリオキシエチレンアルキルフェノー
ル）又はナトリウムデオキシコレートを用いることがで
きる。

通常少量、即ち０．０５〜１％（［１容量）しか必要で
ないが、しかし所望により５％迄を使用することが出来
る。

第２の技術はホスファチジン酸（１）又はリソ燐脂質（
■）の何れかをエマルジョンに加えることである。各々
のα又はβ異性体の何れかが適している。■を加えるこ
とは主としてアポリポ蛋白質Ａ−Ｉを抽出することを改
良する一方、■を加えることの主要な効果はアポリポ蛋
白質Ｂ　−１００を抽出することを改良することである
。

使用する場合、これらの物質は好ましくは燐脂質が加え
られるときに水相に添加することによってエマルジョン
に入れるのが好ましい。従って最終エマルジョンが回転
によって下げられそしてもどされて水相から過剰の脂質
を除去したとき、これらの物質はそれ自信脂質であるが
、これらも水相から除去される。

表１は既知の量のアポリポ蛋白質を含有する対照血清（
シグマコーポレーション）での実験並びに純粋なアポリ
ポ蛋白質での実験に於けるこれらの技術の利点を示して
いる。実験１〜６に於いて購入した血清は１の水当り２
５μｇの血清に水で希釈された。実験７〜１１に於いて
、純粋なり−１００を水１あたり１．２５７ｚｇに希釈
し、そして実験１２に於いて水１あたり１．３３μｇに
希釈した。ＰＦＣエマルジョンは実施例２で使用したの
と同しである。

エマルジョンに加えた■、■及びコレステロールの量は
重量／容量％であり、表に示した通りである。コレステ
ロールは単にその効果を決定する為に加えたが、結果は
利点が提供されないことを示している。使用された緩衝
液は示された通りであり、燐酸緩衝液は２５Ｉ１１モル
ｌリットルの水準であり、ＭＯＰＳ（モルホリノプロパ
ンスルホン酸）は１０．０閘モルｌリットルの水準であ
る。

実験１は本明細書に前に記載した基本的な燐脂質抽出が
Ａ−１及びＢ　−ｔｏｏの検出を可能とするが定量的な
抽出を与えないことを示している。実験２及び３はコレ
ステロールの効果の無いことを示している。

実験４．５及び６はＩの添加による、血清からのＡ−１
及びＢ−１００の改良された抽出を示している。最後の
カラムに於ける（＋）の記号は、実験１の結果よりもＡ
−１抽出のかなりの増加を示しているが、５０％未満が
結合している。実験５は抽出前に血清に加えられた０、
０２５重量／容量％のＮＰ−４０の追加的な利点を有し
ている。

実験７〜１１はＨの添加が純粋なり　−１００の水溶液
からのＢ−１００の抽出を改良することを示している。

実験１２は血清が用いられたときの同じ利点を示してい
る。また実験１０〜Ｉ２のエマルジョンは熱安定化され
なかったことに注意されるべきである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水溶液中に存在するリポ蛋白質を、そこから分離す
   る方法に於いて、上記溶液を燐脂質を含有する水中のペ
   ルフルオロカーボン粒子のエマルジョンと混合し、それ
   によって上記リポ蛋白質の蛋白質部分をペルフルオロカ
   ーボン粒の表面上の燐脂質に結合させ、そして上記水溶
   液から蛋白質含有ペルフルオロカーボンを分離すること
   からなる方法。 ２、上記分離されたペルフルオロカーボンを更に水性イ
   オン性又はノニオン性表面活性剤で処理し、そこから蛋
   白質を分離する特許請求の範囲第１項に記載の方法 ３、上記水溶液が血液である特許請求の範囲第１項に記
   載の方法。 ４、分離したペルフルオロカーボンを更に処理して、そ
   のなかの蛋白質を同定する特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。 ５、エマルジョンが更にリソ燐脂質又はホスファチジン
   酸を含んでいる特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ６、エマルジョンが更にリソ燐脂質を含んでいる特許請
   求の範囲第５項に記載の方法。 ７、エマルジョンが更にホスフアチジン酸を含んでいる
   特許請求の範囲第５項に記載の方法。 ８、上記エマルジョンの水相が上記エマルジョン中に３
   ５％未満の量の燐脂質を含有している特許請求の範囲第
   １、２、３、４又は５項に記載の方法。