JPH0221260A - アミノ基反応基の定量方法 - Google Patents
アミノ基反応基の定量方法Info
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- JPH0221260A JPH0221260A JP1599588A JP1599588A JPH0221260A JP H0221260 A JPH0221260 A JP H0221260A JP 1599588 A JP1599588 A JP 1599588A JP 1599588 A JP1599588 A JP 1599588A JP H0221260 A JPH0221260 A JP H0221260A
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- amino group
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- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
アフィニティークロマトグラフィーや免疫測定法等の生
化学的分野において、蛋白質を結合させた担体が利用さ
れている。このような蛋白質結合担体を調製するには蛋
白質のアミノ基を利用した化学的結合法を用いるのが一
般的であるが、担体の蛋白質結合量、即ち担体の有する
アミノ基反応基を定量することが得られた結果の解析等
に必要である。この作業はまた、蛋白質結合担体を調製
するにあたって好ましい蛋白質結合容量を有する担体の
選定のためにも必要である。
化学的分野において、蛋白質を結合させた担体が利用さ
れている。このような蛋白質結合担体を調製するには蛋
白質のアミノ基を利用した化学的結合法を用いるのが一
般的であるが、担体の蛋白質結合量、即ち担体の有する
アミノ基反応基を定量することが得られた結果の解析等
に必要である。この作業はまた、蛋白質結合担体を調製
するにあたって好ましい蛋白質結合容量を有する担体の
選定のためにも必要である。
本発明は前記の様な担体の有するアミノ基反応基の定量
方法に関するものである。
方法に関するものである。
（従来の技術）
従来、担体間のアミノ基反応基数を比較する方法として
、担体にこのアミノ基を介して蛋白質を結合させ、この
蛋白質を生理活性を測定する方法か知られている。
、担体にこのアミノ基を介して蛋白質を結合させ、この
蛋白質を生理活性を測定する方法か知られている。
（従来技術の問題点）
しかしながら、従来知られた方法では、結合させる蛋白
質として例えば酵素、抗体等の特殊な性質を有する蛋白
質を用いなければならず、例えば醇索を用いた場合には
、その酵素の触媒作用を受ける基質を添加して酵素活性
を測定した後、得られた値とその酵素量と活性を関連ず
ける標準曲線とを比較して、また例えば抗体を結合させ
た場合には、その抗体と抗原抗体を行う標識された抗原
等を添加した後、標識抗原を測定して行うが、この様な
測定操作は複雑であり、誤差を生じ易いと言う問題点が
ある。しかもこれらの方法では、担体のアミノ菖反応基
を定量することが出来ないと言う大きな問題点がある。
質として例えば酵素、抗体等の特殊な性質を有する蛋白
質を用いなければならず、例えば醇索を用いた場合には
、その酵素の触媒作用を受ける基質を添加して酵素活性
を測定した後、得られた値とその酵素量と活性を関連ず
ける標準曲線とを比較して、また例えば抗体を結合させ
た場合には、その抗体と抗原抗体を行う標識された抗原
等を添加した後、標識抗原を測定して行うが、この様な
測定操作は複雑であり、誤差を生じ易いと言う問題点が
ある。しかもこれらの方法では、担体のアミノ菖反応基
を定量することが出来ないと言う大きな問題点がある。
本発明者はこれら従来技術に見られる問題点を解決すべ
く鋭意研究を行った結果本発明を完成させた。即ち本発
明は、アミノ基反応基を有する担体にアミノ基を介して
ピリジルジスルフィド基を有する物質を結合させ、該物
質中のジスルフィド基を開裂させて得られる遊離メルカ
プトピリジンを測定することを特徴とするアミノ基反応
基の定量方法を提供するものであり、以下詳細に説明す
る。
く鋭意研究を行った結果本発明を完成させた。即ち本発
明は、アミノ基反応基を有する担体にアミノ基を介して
ピリジルジスルフィド基を有する物質を結合させ、該物
質中のジスルフィド基を開裂させて得られる遊離メルカ
プトピリジンを測定することを特徴とするアミノ基反応
基の定量方法を提供するものであり、以下詳細に説明す
る。
（問題点を解決するための手段）
本発明でアミノ基反応基とは、例えばＮ、Ｎ’−カルボ
ニルジイミダゾールによって活性化された０ＨＣＣＨ２
ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ−Ｎ−等アミノ基と化学結合可能な官
能基を意味する。担体とは、シリカ、ガラス等の無機物
質等、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブタジ
ェン、塩化ビニル等の重合体あるいはこれらの共重合し
た樹脂等を基材とした担体で、蛋白質をそのアミノ基を
利用して化学的に結合させるために例えば、Ｎ、Ｎ−カ
ルボニルジイミダゾール等により活性化される一級水酸
基、グルタルアルデヒド等により活性化されるアミノ基
等を導入されたものであれば良い。
ニルジイミダゾールによって活性化された０ＨＣＣＨ２
ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ−Ｎ−等アミノ基と化学結合可能な官
能基を意味する。担体とは、シリカ、ガラス等の無機物
質等、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブタジ
ェン、塩化ビニル等の重合体あるいはこれらの共重合し
た樹脂等を基材とした担体で、蛋白質をそのアミノ基を
利用して化学的に結合させるために例えば、Ｎ、Ｎ−カ
ルボニルジイミダゾール等により活性化される一級水酸
基、グルタルアルデヒド等により活性化されるアミノ基
等を導入されたものであれば良い。
本発明で使用するピリジルジスルフィド基を有する物質
としては、担体のアミノ基反応基と結合させるためのア
ミノ基を書９◆龜％１つ有し、かつ例えば２−ピリジル
ジスルフィド基、４−ピリジルジスルフィド基等を有す
る例えば２−アミノエチル−２−ピリジルジスルフィド
塩酸塩、２−アミノエチル−４−ピリジルジスルフィド
塩酸塩等が使用出来る。
としては、担体のアミノ基反応基と結合させるためのア
ミノ基を書９◆龜％１つ有し、かつ例えば２−ピリジル
ジスルフィド基、４−ピリジルジスルフィド基等を有す
る例えば２−アミノエチル−２−ピリジルジスルフィド
塩酸塩、２−アミノエチル−４−ピリジルジスルフィド
塩酸塩等が使用出来る。
前途の例えば−級水酸基、アミノ基等を活性化した担体
のアミノ基反応基とピリジルジスルフィド基を有する物
質のアミノ基反応基を結合させる操作に特別の制限はな
い。反応により生じた担体とピリジルジスルフィド基を
有する物質の結合体と担体に未結合の該物質を分離する
には、例えば遠心分離、′ａ過等の通常の生化学的手段
あるいは例えばバウンド／フリー洗浄分離等の免疫学的
洗浄分離法等を用いれば良い。
のアミノ基反応基とピリジルジスルフィド基を有する物
質のアミノ基反応基を結合させる操作に特別の制限はな
い。反応により生じた担体とピリジルジスルフィド基を
有する物質の結合体と担体に未結合の該物質を分離する
には、例えば遠心分離、′ａ過等の通常の生化学的手段
あるいは例えばバウンド／フリー洗浄分離等の免疫学的
洗浄分離法等を用いれば良い。
以上の操作で得られる担体に結合したピリジルジスルフ
ィド基を有する物質中のジスルフィド基を開裂させるた
めには、該結合体に例えばシスティン、グルタチオン、
ジヒドロリポ酸、ホモシスティン等のチオール基を有す
る化合物を反応させれば良く、この操作を行う時の反応
温度、反応時間等の条件は適宜決定すれば良い。この操
作によりピリジルジスルフィド基は開裂され、メルカプ
トピリジンが遊離する。遊離したメルカプトピリジンは
、例えばバイオケミカル ジャーナル １５１巻、４１
７頁、１９７５年等に示された様に３４３ｎｍでの吸光
度をｎ１定する方法等で測定して定量すれば良い。
ィド基を有する物質中のジスルフィド基を開裂させるた
めには、該結合体に例えばシスティン、グルタチオン、
ジヒドロリポ酸、ホモシスティン等のチオール基を有す
る化合物を反応させれば良く、この操作を行う時の反応
温度、反応時間等の条件は適宜決定すれば良い。この操
作によりピリジルジスルフィド基は開裂され、メルカプ
トピリジンが遊離する。遊離したメルカプトピリジンは
、例えばバイオケミカル ジャーナル １５１巻、４１
７頁、１９７５年等に示された様に３４３ｎｍでの吸光
度をｎ１定する方法等で測定して定量すれば良い。
（発明の効果）
本発明では、担体が有するアミノ基反応基を定量するこ
と、即ち担体中のアミノ基反応基数を知ることが可能で
ある。しかも本発明で、遊離されたメルカプトピリジン
量の測定は吸光度の測定等の比較的簡便な方法により可
能である。
と、即ち担体中のアミノ基反応基数を知ることが可能で
ある。しかも本発明で、遊離されたメルカプトピリジン
量の測定は吸光度の測定等の比較的簡便な方法により可
能である。
以上本発明により、担体の選定、あるいはアミノ基反応
基を介して蛋白質等を結合させた担体を用いて得られた
実験等の結果を容易に解析することが可能となる。
基を介して蛋白質等を結合させた担体を用いて得られた
実験等の結果を容易に解析することが可能となる。
（実施例）
以下本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
４種類の一級水酸基を有するエチレン製担体（直径１．
５ｍｍの球状）各１０００個に５０ｇＮ、Ｎ’−カルボ
ニルジイミダゾール及び３ｍｌの１００％アセトンを添
加し、２５Ｏｒｐｍで３０分間振盪した。担体をアセト
ン及び蒸溜水で洗浄した後、２５ｍｇの２−アミノエチ
ル−２−ピリジルジスルフィド塩酸塩と２．５ｍｌの５
０ｍＭホウ酸緩衡液（ｐＨ１３，５）を添加して、１２
Ｏｒｐｍで１８時間振盪して２−ピリジルジスルフィド
基を導入した。４種類の担体をそれぞれ１２個ずつ計り
取り、反応器に移し、０．５ｍＭシスティン塩酸塩を含
むＯ，ＬＭホウ酸緩衡液を加えて１２Ｏｒ ｐ ｍで２
時間振盪した後、３４３ｎｍでの吸光度を測定して遊離
２−メルカプトピリジンを定量した。２−メルカプトピ
リジン定量の結果と、その値より求めた担体１個当りの
アミノ基反応基数を表１に示す。尚、２−メルカプトピ
リジンのモル吸光係数は８．０８Ｘ１０３である。
５ｍｍの球状）各１０００個に５０ｇＮ、Ｎ’−カルボ
ニルジイミダゾール及び３ｍｌの１００％アセトンを添
加し、２５Ｏｒｐｍで３０分間振盪した。担体をアセト
ン及び蒸溜水で洗浄した後、２５ｍｇの２−アミノエチ
ル−２−ピリジルジスルフィド塩酸塩と２．５ｍｌの５
０ｍＭホウ酸緩衡液（ｐＨ１３，５）を添加して、１２
Ｏｒｐｍで１８時間振盪して２−ピリジルジスルフィド
基を導入した。４種類の担体をそれぞれ１２個ずつ計り
取り、反応器に移し、０．５ｍＭシスティン塩酸塩を含
むＯ，ＬＭホウ酸緩衡液を加えて１２Ｏｒ ｐ ｍで２
時間振盪した後、３４３ｎｍでの吸光度を測定して遊離
２−メルカプトピリジンを定量した。２−メルカプトピ
リジン定量の結果と、その値より求めた担体１個当りの
アミノ基反応基数を表１に示す。尚、２−メルカプトピ
リジンのモル吸光係数は８．０８Ｘ１０３である。
表１
Claims (1)
- （１）アミノ基反応基を有する担体にアミノ基を介して
ピリジルジスルフィド基を有する物質を結合させ、該物
質中のジスルフィド基を開裂させて得られる遊離メルカ
プトピリジンを測定することを特徴とするアミノ基反応
基の定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1599588A JPH0221260A (ja) | 1987-12-28 | 1988-01-28 | アミノ基反応基の定量方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32997787 | 1987-12-28 | ||
| JP62-329977 | 1987-12-28 | ||
| JP1599588A JPH0221260A (ja) | 1987-12-28 | 1988-01-28 | アミノ基反応基の定量方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0221260A true JPH0221260A (ja) | 1990-01-24 |
Family
ID=26352233
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1599588A Pending JPH0221260A (ja) | 1987-12-28 | 1988-01-28 | アミノ基反応基の定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0221260A (ja) |
-
1988
- 1988-01-28 JP JP1599588A patent/JPH0221260A/ja active Pending
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