JPS6318704B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】

本発明は、新規な不溶性の抗原又は抗体に関す
る。 抗原抗体反応を利用して被検液中の抗原又は抗
体の量を測定する方法としては、大別して抗原
（又は抗原）に対する抗原（又は抗体）と標識抗
原（又は標識抗体）との競合反応を利用するもの
と、かかる競合反応を利用しないものがある。い
ずれの方法を採用したとしても、抗原抗体反応に
関与し、標識抗原（又は標識抗体）と未反応の標
識抗原（又は標識抗体）との分離操作が不可欠で
ある。例えば、競合反応を利用して被検液中の抗
原を定量測定する場合、反応して標識抗原−抗体
結合物となつた標識抗原と未反応の遊離の標識抗
原とを分離しなければならず、非競合反応の場合
も類似の分離操作が必要である。 そこで、上記のごとき分離を行う方法として、
抗原又は抗体を予め不溶性担体に固定化して不溶
性の抗原又は抗体としておいて分離を容易にする
方法（固相法）、凝集沈殿を生じさせて分離する
方法（二抗体法、塩析法、アルコール沈殿法）、
ゲルろ過を用いる方法などが知られているが、い
ずれも操作が煩雑であるとの欠点があり、より簡
便かつ効率よく分離を行い得る手段が求められて
いた。 ところで、近年、抗原抗体反応を利用する抗原
又は抗体の微量分析技術の進歩に伴つて、分光光
度計、光電子計数装置（フオトメータ）等の自動
分析機器の測定用セル内などで抗原抗体反応を直
接起させ、又は起させつつ測定を行うことができ
れば一層能率的で高精度の分析が実現し得るとし
て、しかるべき技術開発が要求されている。この
場合においても、前述した抗原−抗体結合物と非
結合物との分離操作は不可欠であるばかりか、以
前にも増してかかる分離操作を簡便・迅速に行い
得ることが望まれる。しかも、かかる測定技術の
目的は、抗原や抗原の微量分析にあるから、測定
感度の低下を招くことがあつてはならず、高感度
の抗原・抗体微量分析を実現し得るものでなけれ
ばならない。 本発明者らの研究の結果、自動分析機器の測定
用セル内など所要の機器表面に抗原又は抗体を固
定化し不溶性の抗原又は抗体としておけば、極め
て容易に分離操作を行うことができ、かつ抗原抗
体反応を直接に自動分析機器などに組込みたいと
の前記要求に応じ得るとの考えに到達した。 この考えは、原理的には固相法に属するもので
あるが、次に掲げる諸点が技術課題として残つ
た。 第１に、自動分析機器の測定用セル内などの所
要の機器表面は一様な形状をしていることが少な
く、しかも抗原又は抗体の固定化に必要な反応基
の導入が困難な場合が多い。 従来においても、試験管内に抗原又は抗体をコ
ートする方法が存在したが多くはポリスチレンチ
ユーブ等の内面に抗原又は抗体を物理的に吸着さ
せるものであつた。しかし、この方法では、どう
しても測定の際中あるいは長期の保存中に抗原又
は抗体が脱落してしまう恐れが大きくて測定の精
度に難がありとても高感度測定を望むことは無理
であつた。これに対し、抗原又は抗体を化学的な
共有結合で固相担体に結合させる方法として有機
ケイ素化合物でガラス表面を修飾し抗原又は抗体
を共有結合にて固定化する方法が知られていた
が、固定する固相担体がガラスに限られ、しかも
結合量が少ないとの欠点があつた。抗体又は抗原
の結合量が少ないということは、高感度分析を実
現する上で大きな障害であつた。従つて、任意の
形状、材料からなる基体表面に、抗原又は抗体を
安定にかつ多量に固定化した不溶性の抗原又は抗
体の開発が望まれる。 第２に、上記第１の問題が解決され、抗原又は
抗体が所要の基体表面上に安定して固定化された
としても抗原又は抗体の固定化面積が、従来多用
されてきたビーズ状担体に比較してかなり小さく
なり、ひいては測定感度の低下をもたらさないか
との懸念があつた。即ち、従来固相法に多用され
た来た不溶性の抗原又は抗体の担体は、アガロー
ス、デキストランゲル、マクロレテイキユラー型
ポリスチレン、多孔性ガラス等の材料から成る多
孔性ビーズであり、これらの形状、材料は抗原抗
体反応をより抗率よく行わしめるとの反応工学的
見地から定められ、抗原又は抗体を固定化すべき
面積がかなり大きかつたからである。 本発明は、かかる技術的問題点を解決しつつ前
述の要求を実現する不溶性の抗原又は抗体を開発
すべくなされたものである。 本発明の目的は、第１に任意の形状を有し、し
かも反応基の導入が困難である基体表面に安定し
て固定化された不溶性の抗原又は抗体並びにその
製造方法を提供することにあり、第２に該不溶性
の抗原又は抗体を用いる高感度で簡便な抗原又は
抗体の測定法を提供することにある。 本発明の不溶性の抗原又は抗体は、基体表面上
に設けられたポリビニルベンジルハライドの多価
アミン置換体皮膜及び前記皮膜に固定化された抗
原又は抗体から成ることを特徴とするものであ
る。 上記において、基体表面はいかなる形状を有し
ていてもよいし、そ材質にも特に制限はなく、ポ
リスチレン系樹脂、ポリアクリル系樹脂、ポリ塩
化ビニル系樹脂等の合成樹脂、ガラス、金属など
が挙げられる。 かかる本発明の不溶性の抗原又は抗体の製造
は、所要の基体表面上にポリビニルベンジルクロ
リド、ポリビニルベンジルブロミドなどのポリビ
ニルベンジルハライドの皮膜を形成し、次に多価
アミンを反応させてポリビニルベンジルハライ
ド・多価アミン置換体皮膜となし、次いで前記反
応により導入されたアミノ基と反応させて抗原又
は抗体を固定化することより行う。 ポリビニルベンジルハライドの皮膜は、ポリビ
ニルベンジルハライドをベンゼン、トルエン等の
揮発性溶媒を用いて溶液となし、この溶液を所要
の基体表面に塗布後乾燥することにより容易に形
成し得る。このとき、ポリビニルベンジルハライ
ド溶液の濃度は、１〜10w／ｖ％が好ましい。使
用する多価アミンとしては、ヘキサメチレンジア
ミン、エチレンジアミン等のジアミン、１，８−
ジアミノ−４−アミノメチルオクタン等のトリア
ミンなどが挙げられる。これら多価アミンの水溶
液に、前記ポリビニルベンジルハライド皮膜を基
体ごとに浸漬することによりポリビニルベンジル
ハライド・多価アミン置換体皮膜を得る。このと
き、多価アミン溶液の濃度は、30〜80％が好まし
く、浸漬条件は４℃〜37℃で2hr〜16hrが好まし
い。以上の処理により、ポリビニルベンジルハラ
イドのハロゲン原子の相当部分が多価アミンのア
ミノ基により置換された状態となり、皮膜上にア
ミノ基が導入される。 抗原又は抗体の固定化は、従来より不溶性の抗
原又は抗体の製法技術として公知である固相担体
への固定化法、即ちペプチド法、アルキル化法、
ジアゾ化法、架橋試薬による結合法等を利用すれ
ばよい。 例えばペプチド法としては、臭化シアンを使用
する方法、アミノ基をイソシアナートに変換後結
合する方法、ジシクロヘキシルカルボジイミドな
どの縮合試薬を用いる方法等があり、アルキル化
法としてはジクロロ−ｓ−トリアジニル基を導入
後結合する方法等があり、又架橋試薬を用いる方
法としてはグルタルアルデヒド、ヘキサメチレン
ジイソシアナートなどを用いる方法がある。 以上の説明から明らかなように、この製造方法
によれば、任意の形状を有し、しかも反応基の導
入が困難である基体表面であつても随意にかつ容
易に抗原又は抗体を固定化でき、不溶性の抗原又
は抗体とすることができる。 本発明の不溶性抗原又は抗体は、従来のビーズ
状不溶性抗原又は抗体に比較して、抗原抗体反応
結合物と未反応の抗原又は抗体との分離操作が極
めて簡便である。即ち、例えば従来のビーズ状の
不溶性抗体を用いて競合反応により被検液中の抗
原量を測定する場合、インキユベート後標識抗原
−不溶性抗体（ビーズ）と未反応の標識抗原とを
分離するには、これらの混合液に生理食塩水を加
えて遠心分離してビーズを沈降させ、上清中に残
つた未反応標識抗体を吸引除去する操作を数回繰
り返す必要があつた。これに対し、試験管内面に
形成した本発明の不溶性抗体を用いれば、インキ
ユベート後試験管内容物を他に移すのみで標識抗
原−不溶性抗体は試験管内壁に結合した状態で残
り、未反応標識抗原は他に移るので両者の分離は
極めて簡便である。また、本発明の不溶性の抗原
又は抗体は基体表面に安定して結合しており、従
来の物理的吸着により結合した場合のごとく測定
中に脱落することがないので高精度の測定に適す
る。固定化された抗原・抗体の量も多量であり、
特に次に示す測定法に供すれば十分に高感度で微
量の抗原・抗体の分析が可能である。 本発明の抗原又は抗体の測定法は、前記本発明
に係る不溶性の抗原又は抗体と、標識抗体又は標
識抗原とを用い被検液中の抗体又は抗原を測定す
ることを特徴とするものである。 上記本発明の測定法には、原理的には競合反応
を利用するものも利用しないものも含まれ、例え
ば固相法、二抗体法、ホモジニアス法、抗標識抗
体法等の公知の方法を応用することができる。 標識抗原又は標識抗体の標識剤としては、¹²⁵I，
¹³¹I，³H等の放射性同位元素、パーオキシダーゼ
等の酵素など公知の標識剤のほか本発明者が新規
に採用したヘミンを用いることができ、それぞれ
に応じた検出方法を採用すればよい。 かかる本発明の抗原又は抗体の測定法の中で
も、測定感度の上で最も優れ、好ましい態様とし
て次の三つの方法を挙げることができる。 ひとつは、標識剤として放射性同位元素を用い
るラジオイムノアツセイ法による場合であり、所
要の分離操作後シンチレーシヨンカウンターによ
り１〜100ng／mlの感度で被検液中の抗原又は抗
体の量を測定することができる。標識剤としてパ
ーオキシダーゼを用い、ルミノール−過酸化水素
（H₂O₂）系を基質とする発光反応を伴う化学発光
の強度をフオトメーターで測定するラジオイムノ
アツセイ法によれば、1ng／ml〜1μg／mlの感度
で被検液中の抗原又は抗体の量を測定することが
できる。更に、標識剤として前記パーオキシダー
ゼの代りにヘミンを用い、ルミノール−H₂O₂系
との反応により生ずる化学発光の強度をフオトメ
ーターで計測する方法（「化学発光免疫測定法」
と称する）であり、この方法によれば100ng／ml
〜10μg／mlの感度で被検液中の抗原又は抗体の
量を測定することができる。以上の本発明測定法
の好ましい態様により達成される測定感度は、従
来のビーズ状不溶性抗原又は抗体を用いた場合に
比較して何らそん色のない高いものである。即
ち、本発明の方法によれば、ビーズ状の不溶性の
抗原や抗体の如く分離操作が不便なものを使用せ
ずとも十分高い感度で被検液中の抗原又は抗体を
測定することができる。このように、本発明の抗
原又は抗体の測定法は、測定操作が簡便で、測定
感度も高く、極めて優れた抗原・抗体の微量分析
法であると言える。 前述の化学発光免疫測定法のごとく、抗原又は
抗体の標識剤としてヘミンを採用し、ルミノール
−H₂O₂系の発光反応を利用することは本発明者
らにより新規に開発された方法である。抗原抗体
反応において酵素を標識剤として使用することは
公知であるが、酵素は一般に巨大分子であるため
に抗原又は抗体の活性を阻害する場合もあつた。
そこで低分子でありながら触媒機能を有する物を
探索した結果、ヘミン（Mw＝652）がルミノー
ルの発光反応を触媒することに着目し前記の測定
法を開発するに至つたものである。ヘミンは化学
的により安定であるために、抗原又は抗体に標識
化することによる触媒活性の低下の恐れが酵素よ
りも少ない。又、標識抗原（又は抗体）の保存性
も向上し、更に低分子であるので抗原又は抗体に
より多量に結合させうるとの利点もある。標識剤
としてパーオキシダーゼ又はヘミンを用いる発光
法による酵素活性の測定は次のようにして行う。
測定しようとする標識抗原（又は抗体）に、
2mM〜62mMの濃度範囲でDMSO（ジメチルスル
ホオキサイド）に溶かしたルミノール溶液と、
5mM〜98mMの濃度範囲で0.1Mリン酸緩衝液PH
7.0に溶解した過酸化水素溶液とを混和して成る
溶液を作用させ、直ちにフオトメーターにより発
光を測定する。従つて、この発光反応は測定用セ
ル内にて直接行うことが好ましく、初めから不溶
性の抗原又は抗体を測定用セル内面に形成したも
のを使用するとなお好都合である。この意味にお
いて、本発明の不溶性の抗原又は抗体は機器の任
意の形状部分に随意に形成できるものであるから
かかる測定には特に便利である。 調製例 １ 抗ヒトβ₂−ミクログロブリン抗体の調製 ヒトβ₂−ミクログロブリンを１ml当り４mgにな
るように生理食塩水に溶かし、等量のコンプリー
ト・フロインド・アジユバンドと混合した後、体
重2.0〜2.5Kgの建康なウサギ４羽を用い、それぞ
れのウサギの５ケ所に0.2mlずつ筋肉内注射をし
た。さらに１週間ごとに３回、同様に注射を行な
つた後さらに２週間後に0.2％ヒトβ₂−ミクログ
ロブリン生理食塩水溶液１mlずつを各ウサギに静
脈注射した。最後の注射から３週間後に、ウサギ
のけい動脈から全採血を行ない、常法に従つて遠
心分離し、約200mlの血清を得た。この血清を56
℃で30分間インキユベイトし、これを抗血清とし
た。得られた抗血清は、抗原とオクタロニー法お
よび免疫電気泳動法によつて一本の沈降線を形成
することから単一抗体であることが確認された。 調製例 ２ 抗ヒトβ₂−ミクログロブリン抗体の精製 調製例１で得た抗血清に等量の飽和硫酸アンモ
ニウム溶液を加え、充分に混和して室温に30分間
放置し、生じた沈殿を遠心分離して分取し、0.5
飽和硫酸アンモニウム溶液で洗浄後、PBSに対
して透析した。次いで透析内液をセフアロース
4B・β₂−ミクログロブリン結合物のカラムに流
して抗ヒトβ₂−ミクログロブリン抗体を特異的に
結合させた。そしてカラムをよくPBSで洗浄し、
その後グリシン−塩酸緩衝液（PH2.8）を流し、
抗ヒトβ₂−ミクログロブリン抗体を溶出させた。
溶出液をただちにPBSに対して透析して精製抗
体を得た。 調製例 ３ 抗ヒトIgG抗体の調製 ヒトIgGを１ml当り４mgになるように生理食塩
水に溶かし、等量のコンプリート・フロインド・
アジユバンドと混合した後、体重2.0〜2.5Kgの健
康なウサギ４羽を用い、それぞれのウサギ５ケ所
に0.2mlずつ筋肉内注射をした。さらに１週間ご
とに３回、同様に注射を行なつた後さらに２週間
後に0.2％ヒトIgG生理食塩水溶液１mlずつを各ウ
サギに静脈注射した。最後の注射から３週間後
に、ウサギの頚動脈から全採血を行ない、常法に
従つて遠心分離し、約200mlの血清を得た。この
血清を56℃、30分間インキユベイトし、これを抗
血清とした。得られた抗血清は、抗原とオクタロ
ニー法および免疫電気泳動法によつて一本の沈降
線を形成することから単一抗体であることが確認
された。 調製例 ４ 抗ヒトIgG抗体の精製 調製例３で得た抗血清に等量の飽和硫酸アンモ
ニウム溶液を加え、充分に混和して室温に30分間
放置し、生じた沈殿を遠心分離して分取し、0.5
飽和硫酸アンモニウム溶液で洗浄後、PBSに対
して透析した。次いで透析内液をセフアロース
4B・ヒトIgG結合物のカラムに流して抗ヒトIgG
抗体を特異的に結合させた。そしてカラムをよく
PBSで洗浄し、その後グリシン−塩酸緩衝液
（PH2.8）を流し、抗ヒトIgG抗体を溶出させた。
溶出液をただちにPBSに対して透析して精製抗
体を得た。 調製例 ５ パーオキシダーゼ標識抗ヒトβ₂−ミクログロブ
リン精製抗体結合物の調製 パーオキシダーゼ（Horseradish（西洋ワサビ
由来）マイルス社製）10mg、抗ヒトβ₂−ミクログ
ロブリン精製抗体20mgをそれぞれ小試験管に入
れ、0.3M酢酸ソーダ溶液PH6.5、１mlでゆるやか
に溶かし込んだ。次いで0.2M過ヨウ素酸溶液0.1
mlを加え４℃で30分間撹拌しながら反応させた。
次に2Mエチレングリコール0.1mlを加え３〜4hr、
４℃中に静置した。反応液をPH9.5、0.01M炭酸
緩衝液に対して一夜（約15hr）透析した。透析
後、内液に水素化ホウ素ナトリウム５mgを加え、
還元処理を行ない、PBSに対して一夜透析した。
最後に予め0.05Mリン酸緩衝液で緩衝化されたセ
フアロース6Bカラムによつてゲルろ過を行い反
応結合物を得た。 調製例 ６ ヘミン標識ヒト血清アルブミン結合物の調製 １−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエ
チル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンサルフ
アネート（国産化学(株)製）10mgとヘミン５mgを、
DMSO1mlに溶解し、室温にて約10分間撹拌し
た。次に、これに、ヒト血清アルブミン30mgを２
mlの蒸留水に溶解して加え、室温にて６時間撹拌
した。その後、蒸留水を７ml加え、生じた沈殿を
3000rpmで遠心分離して除去した。上清を0.1M
リン酸緩衝液PH7.0、２に対して透析を行つた
後、沈殿を3000rpmで遠心分離して除き、ヘミン
標識ヒト血清アルブミンを得た。 実施例 １ 不溶性の抗原及び抗体の製造 (1) ポリビニルベンジルクロリド（米国アルドリ
ツチ社製）の５重量％トルエン溶液を、ポリ塩
化ビニル樹脂製基板（120×40×0.2mm）に塗布
後、室温にて乾燥させたポリビニルベンジルク
ロリドの皮膜を形成した（以下、PVB−基板
と称す）。以下、第１表に即して説明する。次
に前記のPVB−基板を１，８−ジアミノ−４
−アミノメチルオクタンの30〜40重量％水溶液
に浸漬し20℃又は40℃にてゆつくり反応せしめ
た後、基板を充分に水洗して未反応の１，８−
ジアミノ−４−アミノメチルオクタンを除去し
た。基板上の皮膜の塩素及び窒素を分析するこ
とにより、ポリビニルベンジルクロリド中の塩
素のアミノ基置換率は第１表に示すとおりであ
つた（以下、該基板をTA−PVB−基板と称
す）。

【表】 −アミノメチルオクタン
(2) 以下、第１表のｃ（アミノ基置換率84％）の
TA−PVB−基板を用いて更に処理を進めた。 TA−PVB−基板ｃを、10重量％グルタルア
ルデヒド水溶液に浸漬し、室温（25℃）下５時
間反応せしめた後、水洗により未反応のグルタ
ルアルデヒドを除去し、基板上のポリビニルベ
ンジルクロリド・トリアミン置換体皮膜をグル
タルアルデヒド結合物とした（以下、Gult−
TA−PVB−基板と称す）。 (3) このようにして調製したGlut−TA−PVB−
基板を３mm×13mmの寸法に切断し、それぞれ
を、第２表に実施例１−〜として示すよう
に ¹²⁵I−標識抗原又は ¹²⁵I−標識抗体を0.15M
リン酸緩衝液PH7.0，１ml当り１mg溶解した液
５mlに浸漬して反応させ、抗原又は抗体を
Glut−TA−PVB被膜上に固定化した。反応温
度、時間も第２表に示した。反応終了後、皮膜
及び基板を生理食塩水にて洗浄し、本発明の不
溶性の抗原又は抗体（以下、基板を含めて「抗
原プレート」又は「抗体プレート」と称す）を
得た。固定化抗原又は固定化抗体の量を被膜上
に残つている放射活性を測定することにより求
めた。結果も第２表に併せて示す。 なお、抗原及び抗体の ¹²⁵I−標識化はクロ
ラミンＴ法により行つたが、抗原・抗体の固定
化量を確認する目的で行つたものである。

【表】 ロブリン。
実施例 ２ 競合反応法によるβ₂−ミクログロブリンの定量
（検量線の作成）RIA 実施例−と同様にして、調製した抗ヒトβ₂
−ミクログロブリン抗体を不溶化した抗体プレー
トを３×13mmの大きさに切断し、１試料に一枚使
用した。 ¹²⁵I−標識β₂−ミクログロブリンは、M.
Osawaらの方法（前述）により調製したβ₂−ミ
クログロブリンをクロラミンＴ法により ¹²⁵Iを
標識し、セフアデツクスＧ−50カラムで精製した
ものを用いた。その比放射能は110μCi／μgであ
つた。 まずはじめに、10mmφ×70mmの試験管内に、次
の ● 0.5％BSA（牛血清アルブミン），0.02％ツイ
ーン20（界面活性剤）を含む0.1Mリン酸緩衝液
…0.8ml ● 標準β₂−ミクログロブリン溶液（10ng／ml
〜1000ng／mlの範囲） …0.1ml ● ¹²⁵I−標識β₂−ミクログロブリン溶液
…0.1ml （原液を1/800希釈したもの：4.6μg／ml〔蛋
白濃度で〕） ● 抗体プレート １枚 を入れ、37℃４時間インキユベート後、プレート
を0.5％BSAを含む生理食塩水にて３回、生理食
塩水にて３回洗浄した。 プレートの放射能をウエル型シンチレーシヨ
ン・カウンターで測定し、ゼロサンプル（標識β₂
−ミクログロブリンをまつたくいれていない場
合）に対する計数率比Ｂ／Boを計算し、第１図
の検量線を得た。 実施例 ３ サンドイツチ法によるヒトIgGの定量（検量線
の作成）EIA：発光法 １ 実施例１−の抗ヒトIgG抗体を不溶化した
抗体プレートを３×13mmの大きさに切断し、一
試料に一枚使用した。パーオキシダーゼ標識抗
体はマイルス社製の市販品を用いた。 試験管内に、１％BSAを含む0.1Mリン酸緩
衝液PH7.0、0.9ml、標準ヒトIgG抗原溶液
（10ng／ml〜100μg／ml）0.1ml、及び抗体プレ
ート１枚を入れ、37℃、２時間インキユベート
後、前記プレートを蒸留水にて３回、0.1Mリ
ン酸緩衝液PH7.0にて３回洗浄した。 次に、試験管内に、１％BSAを含む0.1Mリ
ン酸緩衝液PH7.0、0.9ml、パーオキシダーゼ標
識抗体溶液（原液の１／100希釈：10.4μg／ml
〔蛋白濃度〕）0.1ml、及び前記の処理を経た抗
体プレート１枚を入れ、37℃、２時間インキユ
ベートした後、前記プレートを蒸留水にて３
回、0.1Mリン酸緩衝液PH7.0にて３回洗浄し
た。このようにして得た不溶性抗体−抗原−パ
ーオキシダーゼ標識抗体結合物の酵素活性を次
のようにして測定した。 6φ×50mmの円筒形ガラスセル内にて0.1Mリ
ン酸緩衝液450μ、6.8mMルミノール（東京
化成(株)製）DMSO溶液25μ及び0.1Mリン酸緩
衝液に溶解した29.4mM過酸化水素溶液25μ
を混和し、ここに、前記のプレートを入れて、
セルをただちにフオトメーター（商品名；
CHEM GLOW，AMINCO社製）のセルボツ
クスに収納し発光反応に基づく発光の強度を計
測した。 発光の強度と標準ヒトIgG濃度との間に、第
２図に示す検量線を得た。 実施例 ４ サンドイツチ法によるヒトIgGの定量（検量線
作成）EIA：比色法 実施例１−と同様にしてて抗ヒトIgG抗体を
不溶化した抗体プレートを３×13mmの大きさに切
断し、一試料に一枚使用した。酵素標識抗体とし
てはマイルス社製の市販品を用いた。 試験管内に、１％BSAを含む0.1Mリン酸緩衝
液PH7.0、0.9ml、標準ヒトIgG抗原溶液（3μg／ml
〜1000μg／ml）0.1ml、及び抗体プレート１枚を
入れ、37℃、２時間インキユベート後、前記プレ
ートを蒸留水にて３回、0.1Mリン酸緩衝液PH7.0
にて３回洗浄した。 次に試験管内に、１％BSAを含む0.1Mリン酸
緩衝液PH7.0、0.9ml、酵素標識抗体溶液（原液の
１／100希釈：10.4μg／ml〔蛋白濃度〕）0.1ml、
及び前記の処理を経た抗体プレート１枚を入れ、
37℃、２時間インキユベートした後、前記プレー
トを蒸留水にて３回、0.1Mリン酸緩衝液PH7.0に
て３回洗浄した。 プレート上の酵素活性を比色法により次のよう
にして測定した。 試験管に、ｏ−ジアニジン−２塩酸付加塩0.01
％及び過酸化水素0.003％を含む0.01Mリン酸緩
衝液PH6.0、２mlを入れ、これに前記のプレート
を入れて25℃にて30分間反応させた。次に1N塩
酸0.5mlを加えて撹拌後、上清の400nmにおける
吸光度（OD）を分光光度計（Model24，日立製
作所(株)製））を用いて計測した。標準ヒトIgG濃
度との間に第３図に示した検量線が得られた。 実施例３のような発光法を用いないで比色法で
測定しても基本的に100ng／ml〜10μg／mlの範囲
でIgG抗原を測定することが出来ることが判明し
た。しかし、被測定抗原がβ₂・ミクログロブリン
のような微小な蛋白で微量の検出物質である場合
には感度不足で好ましくなく、発光法が望まし
い。 実施例 ５ 競合反応法による抗ヒトIgG抗体の定量（検量
線の作成）EIA：発光法 実施例１−と同様にして調製したヒトIgG抗
原を不溶化した抗原プレートを３×13mmの大きさ
に切断して用いた。パーオキシダーゼ標識抗ヒト
IgG抗体としては、マイルス社製の市販品を用い
た。 試験管に、１％BSAを含む0.1Mリン酸緩衝液
0.8ml標準抗ヒトIgG抗体溶液（200ng／ml〜
200μg／ml）0.1ml、酵素標識抗ヒトIgG抗体溶液
（原液の１／100：10.4μg／ml〔蛋白濃度〕）0.1
ml、及び抗原プレートを入れて、37℃にて２時間
インキユベートした後、プレートを蒸留水にて３
回、0.1Mリン酸緩衝液PH7.0にて３回洗浄し、プ
レート上の酵素活性を次のように発光法により測
定した。 6φ×50mmの円筒形ガラスセルに、0.1Mリン酸
緩衝液PH7.0、450μ、6.8mMルミノールDMSO
溶液25μ、及び0.1Mリン酸緩衝液に溶かした
29.4mM過酸化水素溶液25μを入れて混和し、
これに前記のプレートを入れて、セルを直ちにフ
オトメーター（商品名：CHEMGLOW，
AMINCO社製）のセルボツクスに収納し発光反
応に基づく発光の強度を計測した。発光の強度と
標準抗ヒトIgG抗体濃度と間に、第４図に示す検
量線を得た。 実施例 ６ サンドイツチ法によるヒトβ₂−ミクログロブリ
ンの定量（検量線の作成）EIA：発光法 実施例１−と同様にして調製した抗ヒトβ₂−
ミクログロブリン抗体を不溶化した抗体プレート
を３×13mmの大きさに切断して用いた。酵素標識
抗体は調製例５で精製したものを用いた。 試験管に、１％BSAを含む0.1Mリン酸緩衝液
PH7.0、0.9ml、標準ヒトβ₂−ミクログロブリン抗
原溶液（1ng／ml〜10000ng／ml）0.1ml、及び抗
体プレート１枚を入れ、37℃、２時間インキユベ
ートした後、プレートを蒸留水にて３回、0.1M
リン酸緩衝液PH7.0にて３回洗浄した。 次いで、試験管に１％BSAを含む0.1Mリン酸
緩衝液PH7.0、0.9ml、酵素標識抗体溶液（原液の
１／10希釈：87.1μg／ml〔蛋白濃度〕）0.1ml、及
び前記の処理を経たプレートを入れ、37℃にて２
時間インキユベートした後蒸留水にて３回、
0.1Mリン酸緩衝液PH7.0にて３回洗浄した。 得られたプレート上の酵素活性を発光法により
次のようにして測定した。 6φ×40mmの円筒形ガラスセルに、0.1Mリン酸
緩衝液PH7.0、450μ、6.8mMルミノールDMSO
溶液25μ、及び29.4mMのH₂O₂を含む0.1Mリン
酸緩衝液25μを入れて混和し、ここに前記のプ
レートを入れて直ちにフオトメーター（商品名
CHEM GLOW，AMINCO社製）のセルボツク
スに収納して発光反応に基づく発光の強度を計測
した。 発光の強度と標準ヒトβ₂−ミクログロブリン濃
度との間に、第５図に示す検量線を得た。 実施例 ７ 競合反応法による抗ヒトβ₂−ミクログロブリン
抗体の定量（検量線の作成）：RIA 実施例１−と同様にして調製した¹²⁵I非標識
β₂−ミクログロブリン抗原プレートを３×13mmの
大きさに切断し、１試料に一枚使用した。調製例
２より得た抗ヒトβ₂−ミクログロブリンをクロラ
ミンＴ法によつて ¹²⁵Iを標識しセフアデツクス
Ｇ−100カラムで精製したものを用いた。その比
放射能は108μCi／μgであつた。まずはじめに10φ
×70mmの試験管内に次の ● 0.5％BSA、0.02％ツイーン20を含む０・1M
リン酸緩衝液 0.8ml ● 標準抗ヒトβ₂・ミクログロブリン抗体溶液
（0.1Mリン酸緩衝液中）（30ng／ml〜7000ng／
ml） 0.1ml ● ¹²⁵I−標識抗ヒトβ₂・ミクログロブリン抗体
溶液（原液の1/500希釈：11.3μg／ml〔蛋白濃
度〕） 0.1ml ● 抗原プレート（実施例１−） １枚 を入れ37℃４時間インキユベイト後、プレートを
0.5％BSAを含む生理食塩水にて３回、生理食塩
水にて３回洗浄した。 プレートの放射能をウエル型シンチレーシヨン
カウンターで測定しゼロサンプルに対する計数率
比Ｂ／Boを計算し、第６図の検量線を得た。 実施例 ８ 競合反応法によるヒト血清アルブミンの定量
（検量線の作成）：化学発光免疫測定法 実施例１の方法に従つてウサギ抗ヒト血清アル
ブミン抗体（マイルス社製）を不溶化した抗体プ
レートを３×13mmの大きさに切断して用いた。試
験管に、１％BSAを含む0.1Mリン酸緩衝液PH
7.0、0.8ml、標準ヒト血清アルブミン（マイルス
社製）抗原溶液（溶媒：0.1Mリン酸緩衝液PH
7.0）（1μg／ml〜１mg／mlの範囲）を0.1ml、調製
例６で調製したヘミン標識ヒト血清アルブミン
（11.2μg／ml）を0.1ml、及び抗体プレート１枚を
入れ、37℃２時間インキユベートした後、プレー
トを蒸留水にて３回、0.1Mリン酸緩衝液PH7.0に
て３回洗浄した。得られたプレート上のヘミン量
を発光法により次のように測定した。6φ×40mm
の円筒形ガラスセルに、0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）450μ，68mMルミノールDMSO溶液25μ
及び294mMのH₂O₂を含む0.1Mリン酸緩衝液25μ
を入れて混和し、ここに前記のプレートを入れ
て直ちにフオトメーター（CHEM GLOW，
AMINCO社製）のセルボツクスに収納して発光
反応に基づく発光の強度を計測した。 発光の強度と標準ヒト血清アルブミン濃度との
間に第７図に示す検量線を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ラジオイムノアツセイ法（競合反
応）によるβ₂−ミクログロブリンの検量線〔実施
例２〕；第２図は、エンザイムイムノアツセイ法
（発光法、サンドイツチ法）によるヒトIgGの検
量線〔実施例３〕；第３図は、エンザイムイムノ
アツセイ法（比色法、サンドイツチ法）によるヒ
トIgGの検量線〔実施例４〕；第４図は、エンザ
イムイムノアツセイ法（発光法、競合反応法）に
よる抗ヒトIgG抗体の検量線〔実施例５〕；第５
図は、エンザイムイムノアツセイ法（発光法、サ
ンドイツチ法）によるヒトβ₂−ミクログロブリン
の検量線〔実施例６〕；第６図は、ラジオイムノ
アツセイ法（競合反応法）による抗ヒトβ₂−ミク
ログロブリン抗体の検量線〔実施例７〕；そして
第７図は、化学発光免疫測定法（競合反応法）に
よるヒト血清アルブミンの検量線〔実施例８〕を
それぞれ表す図面である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 基体表面上に設けられたポリビニルベンジル
   ハライドの多価アミン置換体皮膜及び前記皮膜に
   固定化された抗原又は抗体から成ることを特徴と
   する不溶性の抗原又は抗体。