JPH0221263A - ビタミンｄ↓３類の免疫化学的測定用の抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はビタミン）類の免疫化学的測定用の抗体に関す
る。

更に詳細には本発明は２２位にカルボキシル基もしくは
そのエステル基を有する新規なビタミン坊誘導体と免疫
原性担体とからなる抗原を宿主動物に接種せしめて得ら
れるエンザイムイムノアッセイ又はラジオイムノアッセ
イ用の抗体に関する。

ビタミン）は生体内において、腎臓もしくは肝臓で代謝
されて２５−ヒドロキシビタミン）、１α。

２５−ジヒドロキシビタミン）、２４．２５−ジヒドロ
キシビタミン５等に変換されることが知られている。そ
してこれら２５−ヒドロキシビタミン）、１α、２５−
ジヒドロキシビタミン）などの代謝産物、あるいは１α
−ヒドロキシビタミン）、１α、２４−ジヒドロキシビ
タミンへなどの活性型ビタミン）化合物は骨粗鬆症、骨
軟化症などの治療薬として臨床的に用いられており、あ
るいはその開発が行なわれている。これら薬物の臨床用
量は通常著しく少なく、１回の投与量が数百ｎｇから数
十μｇの範囲である。

一方、一般に薬理作用は薬物の血清中濃度、あるいは組
織中濃度と相関関係を有しており、特にヒトにおける薬
物の血清中濃度の測定は臨床上極めて重要である。

従来、活性型ビタミン）化合物の定量法として、１α、
２５−ジヒドロキシビタミン）レセプターを用いたラジ
オレセプターアッセイ法が知られている（バイオケミス
トリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、　１３゜４０９
１　＋１９７４１゜このアッセイ法は実施するに際し多
くの手間を要し、且つ多量の血清が必要であり、その精
度も充分に満足しうるものでないという欠点を有してい
る。

他のアッセイ法として、特開昭５５−４７６５３号公報
には１α−ヒドロキシビタミンＤ３３−ヘミサクシネー
トあるいは１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３３−
へミサクシネートをハプテンとして用いるラジオイムノ
アッセイ法が開示されている。特開昭５３−８７３４４
号公報には、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３２
５−ヘミサクシネートをハプテンとして用いるラジオイ
ムノアッセイ法が記載されている。

これらのラジオイムノアッセイ法にあっては、そのアッ
セイ用の抗原は、ハプテンとキャリヤー蛋白とが該ハプ
テンの２５位のカルボキシル基又は３位の置換基中のカ
ルボキシル基を介して結合せしめられたものである。か
かる抗原の場合には、ハプテンとキャリアー蛋白との結
合部位はハプテンの２５位であるかあるいは１位の近傍
である。

−ｉに、アッセイ用の抗原の抗体（抗ハプテン抗体）は
キャリヤー蛋白の結合部位から離れたハブテン上の化学
構造をよく認識することが知られている。

従って上記の如き引例記載のハプテンを用いて得られる
抗ハプテン抗体は、ハプテンの２５位、１位あるいは２
４位の構造を認識する能力が低下する可能性がある。

かかるラジオイムノアッセイ法にあっては、２５位、１
α位あるいは２４位に水酸基を有する活性型ビタミン）
化合物の定量が必ずしも満足し得るように行なうことが
できない。

そこで本発明者は鋭意研究し、２２位にカルボキシル基
もしくはそのエステル基を有する新規なビタミン）誘導
体をハプテンとして用い、該ハプテンと免疫原性担体と
を共有結合せしめて得られる高分子化合物を免疫化学的
測定用抗体のための抗原とし、この抗原より得られる抗
体が、１α位、２４位、あるいは２５位に水酸基を有す
る活性型ビタミン）化合物の定量に好ましく適用される
エンザイムイムノアッセイあるいはラジオイムノアッセ
イ用の抗体として極めて有用であることを見出し本発明
に到達したものである。

しかして、本発明は下記式［Ｉ］ で表わされるビタミンＤ３誘導体と免疫原性担体とを、
該ビタミンＤ３誘導体のカルボキシル基もしくはアミノ
基を介して共有結合せしめてなる抗原を、宿主動物に接
種することによって誘発せしめた免疫化学的測定用の抗
体である。

本発明で、免疫化学的測定用抗体作製のための抗原及び
その抗体のハプテンとして用いられる化合物は上記式［
Ｉ］で表わされる化合物であり、２２位にカルボキシル
基もしくはそのエステル基を有するという特徴的構造を
有するものである。

上記式［Ｉ］において、Ｒ１は水素原子、又はカルボキ
シル基もしくはアミノ基を有する炭素数１〜６のアルキ
ル基を表わす。ここでカルボキシル基もしくはアミノ基
を有する炭素数１〜６のアルキル基としては、例えばカ
ルボキシメチル基、２−カルボキシエチル基、３−カル
ボキシプロピル基、４−カルボキシブチル基、５−カル
ボキシヘプチル基、６−カルボキシヘキシル基などのカ
ルボキシル基を有する炭素数１〜６のアルキル基；アミ
ノメチル基、２−アミノエチル基、３−アミノプロピル
基、４−アミノブチル基、５−アミノヘプチル基、６−
アミノヘキシル基などのアミノ基を有する炭素数１〜６
のアルキル基などが挙げられる。

これらのなかでＲ１は特に水素原子が好ましい。

上記式［Ｉ］において、Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４はそれぞれ独
立に水素原子又は水酸基を表わす。なかでも恐。

母がともに水酸基であるものが、特に２４．２５−ジヒ
ドロキシビタミン）なとの活性型ビタミン）のアッセイ
用のハプテンとして好ましい。

上記式［Ｉ］で表わされるビタミン）誘導体の具体例を
示せば以下のようなものがある。

（１）　２２−カルボキシ−２４，２５−ジヒドロキシ
コレカルシフェロール、 （２＋　２２−カルボキシ−１α、　２４．２５−トリ
ヒドロキシコレカルシフェロ−１し、 （３１２２−力Ｉレボキシー２５−ヒドロキシコレカル
シフェロール、 （４）　２２−カルボキシ−１α、２５−ジヒドロキシ
コレカルシフェロール、 （５）　２２−カルボキシ−１α、２４−ジヒドロキシ
コレカルシフェロール、 （６）　２２−カルボキシ−１α−ヒドロキシコレカル
シフェロール、 （７）　２２−　（２−力ｌレボキシエトキシ力ルボニ
ｌし）２４、２５−ジヒドロキシコレカフレジフェロ−
１し、（８）　２２−　＜２−カルボキシエトキシカル
ボニル−１α，　２４．２５　−トリヒドロキシコレカ
ルシフェロール、 （９）　２２−　（２−カルボキシエトキシカルボニル
１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール、 ＜１０＞２２−　（２−カルボキシエトキシカルボニル
−２５−ヒドロキシコレカルシフェロール、（１１）２
２−　＜２−カルボキシエトキシカルボニル）−　１α
−ヒドロキシコレカルシフェロール、＜１２＞２２−　
（２−アミノエトキシカルボニル）−２４２５−ジヒド
ロキシコレカルシフェロール（１３）２２−　（２−ア
ミンエトキシカルボニル）−１α，２５−ジヒドロキシ
コレカルシフェロール、＋１４＞２２−　（２−アミノ
エトキシカルボニル）α−ヒドロキシコレカルシフェロ
ール 本発明の上記した如きビタミン）誘導体は次のようにし
て製造される。すなわち下記式［ｎ］で表わされるコレ
スタ−５，７−ジエン誘導体を不活性有機媒体中で紫外
線照射し熱異性化し、次いで必要に応じて脱保護するこ
とによって製造される。

上記式［１］で表わされる原料化合物コレスタ−５，７
−ジエン誘導体は、対応するコレスト−５−エン誘導体
より、これをアリル位ブロム化、脱臭化水素化すること
によって製造される。

上記式［ＩＩ］において、Ｒｊ’は水素原子、炭素数１
〜６のアルキル基、カルボキシル基もしくはアミノ基を
有する炭素数１〜６のアルキル基、又は保護されたカル
ボキシル基もしくは保護されたアミノ基を有する炭素数
１〜６のアルキル基を表わす。

ここで炭素数１〜６のアルキル基としては例えば、メチ
ル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ｔ−ブチル基
、ヘプチル基、ヘキシル基などが挙げられる。カルボキ
シル基もしくはアミノ基を有する炭素数１〜６のアルキ
ル基としては、前述した上記式［Ｉ］のＲ１として例示
したものが同様に挙げられる。保護されたカルボキシル
基もしくは保護されたアミノ基を有する炭素数１〜６の
アルキル基としては次のものが挙げられる。すなわち上
記式［Ｉ］のＲ１として例示したカルボキシル基を有す
る炭素数１〜６のアルキル基において、そのカルボキシ
ル基がエステル結合を形成した基であり、例えばメトキ
シカルボニルメチル基、　エトキシカルボニルメチル基
、ブトキシカルボニルメチル基、２−メトキシカルボニ
ルエチル基、２−エトキシカルボニルエチル基、２−ブ
トキシカルボニルエチル基などである。保護されたアミ
ン基を有する炭素数１〜６のアルキル基としては、上記
式［Ｉ］のＲ１として例示しなアミノ基を有する炭素数
１〜６のアルキル基において、そのアミノ基がアミド結
合を形成した基であり、例えばアセチルアミノメチル基
、２−アセチルアミ、ｌエチル基、３−アセチルアミノ
ブチル基などである。

上記式［ＩＩ］においてＲ２’、Ｒ３’、Ｒ４’はそれ
ぞれ独立に水素原子、水酸基、又は保護された水酸基を
表わす。斑は水素原子又は保護基を表わす。

Ｒ２’　、　Ｒ３’　、　Ｒ４’が保護された水酸基あ
るいは穐が保護基を表わすときの保護基としては例えば
、アセチル基、プロパノイル基、ブタノイル基、ピバロ
イル基、ペンタノイル基、シクロヘキサノイル基、クロ
ロアセチル基、ブロモアセチル基、ベンゾイル基、ｐ−
ブロモベンゾイル基、ｐ−ニトロベンゾイル基、エチル
ベンゾイル基、トルイル基等の炭素数１・〜１２の脂肪
族もしくは芳香族カルボン酸残基もしくはそれらのニト
ロ、ハロゲン、アルコキシ置換誘導体；又はトリメチル
シリル基、ジメチル−ｔ−ブチルシリル基等のトリアル
キルシリル基；又は２−テトラヒドロピラニル基、２−
テトラヒドロフラニル基等の２−環状エーテル基等を挙
げることができる。これらの保護基のなかでも特にアセ
チル基、プロパノイル基、ブタノイル基、ピバロイル基
、ペンタノイル基、シクロヘキサノイル基、ベンゾイル
基などが好ましい。

このような上記式［ＩＩ］で表わされるコレスタ−５，
７−ジエン誘導体を不活性有機媒体中で紫外線照射、熱
異性化する。紫外線照射の際に用いられる紫外線として
は、約２００〜３６０ｎｍのもの、好ましくは２６０〜
３１０ｎｍのものが用いられる。

この紫外線照射反応は、不活性有機媒体中において行な
われる。かかる不活性有機媒体としては例えば、ヘキサ
ン、ヘプタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロル
ベンゼン、四塩化炭素の如き炭化水素もしくはハロゲン
化炭化水素；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、
ジオキサンの如きエーテル類；あるいはメタノール、エ
タノール、プロパツールの如きアルコール類が好適に用
いられる。

紫外線照射反応に対し、反応温度はあまり重要な意味は
持たないが、通常−２０℃〜１２０℃、特に１０℃〜５
０°Ｃで行なわれる。

かくして、上記式［Ｉ［］で表わされるコレスタ５．７
−ジエン誘導体の９．１０位炭素炭素結合の開裂が起り
相当するプレビタミン）誘導体に変換される。このプレ
ビタミン）誘導体は次いで熱エネルギーによって異性化
されてビタミン）誘導体になる。この異性化反応は、プ
レビタミン）誘導体とビタミン）誘導体との平衡反応で
あり、両者の平衡値は、反応温度によって異なるもので
ある。

本発明においては、異性化反応は２０〜１２０℃、好ま
しくは４０〜１００℃で行なわれる。また、この異性化
反応は、上記紫外線照射で用いられた不活性有機媒体中
でそのまま充分に進行する。

それ故、例えば、上記プレビタミン）誘導体を製造する
紫外線照射を例えば、４０℃で実施した場合等において
は、９，１０位炭素炭素結合の開裂の進行と同時に生成
したプレビタミン）誘導体が反応系中において徐々にビ
タミン）誘導体に異性化する反応が起ることになる。本
発明方法における熱エネルギーによる異性化反応とは、
上記したところから明らかな通り、必ずしも反応系の加
熱を意味するものではない。

かくして、上記式［Ｉ］で表わされるビタミン）誘導体
又はその水酸基、カルボキシル基もしくはアミノ基保護
誘導体が製造される。水酸基、カルボキシル基もしくは
アミノ基が保護されている場合には、上記異性化反応に
引きつづき、保護基を除去する必要がある。この脱保護
反応はそれ自体公知の反応であり、例えば保護基がアシ
ル基を形成している場合にはメタノール、エタノールの
如き低級脂肪族アルコールのアルカリ性溶液中で処理す
るかあるいはエーテル中ＬｉＡｌＨ４等の水素化金属で
処理すればよい。温度としては一１０℃〜５０℃でよい
。

保護基が水酸基の酸素原子と結合してエーテル基を形成
している場合は、還元的にあるいは酸又はアルカリと接
触せしめることにより、容易に除去することができる。

かくして、上記式［Ｉ］で表わされるビタミン膓誘導体
が得られる。

上記式［Ｉ］で表わされるビタミン）誘導体において、
Ｒ１がカルボキシル基もしくはアミノ基を有する炭素数
１〜６のアルキル基を表わす場合のビタミン）誘導体は
次の方法によっても得られる。

すなわち、上記式［Ｉ］においてＲ１が水素原子である
ビタミン）誘導体と、グリコール酸、乳酸、β−ヒドロ
キシプロピオン酸、リンゴ酸などのカルボキシル基を有
する炭素数１〜６のヒドロキシ酸あるいは２−ヒドロキ
シエチルアミン、３−ヒドロキシブチルアミンなどのア
ミノ基を有する炭素数１〜６のアミン化合物とエステル
化反応せしめることによっても製造することができる。

本発明の免疫化学的測定用抗体作製のための抗原は上記
式［Ｉ］のビタミン膓誘導体と免疫原性担体とを、該ビ
タミン）誘導体のカルボキシル基もしくはアミノ基を介
して共有結合せしめてなるものである。

ビタミン）誘導体と共有結合せしめて抗原を得るために
用いられる免疫原性担体としては、蛋白質、ポリペプチ
ド、糖タンパクなどが挙げられる。

かかる蛋白質としては牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒ
ト血清アルブミン、ヒトガンマグロブリン、メチル化し
たウシ血清アルブミン、家兎血清アルブミン、ウシガン
マグロブリン、ヘモシアニンなどが例示される。ポリペ
プチドとしては、ポリリジン、ポリ−６−リジン−ポリ
グルタミン酸共重合体などが例示される。糖タンパクと
しては、リポポリサッカライド、ファイコール、キーホ
ーリヘットヘモシアニンなどが例示される。なかでも蛋
白質が好ましく、特に牛血清アルブミン、ヒト血清アル
ブミンが好ましい。

かかる免疫原性担体と上記式［Ｉ］のビタミン）誘導体
との共有結合は、ビタミン）誘導体における２２位のカ
ルボキシル基あるいはアミノ基を介して直接的にあるい
は間接的に免疫原性担体の官能基との間で形成される。

免疫原性担体の官能基としては、例えばリジンのアミノ
基、アスパラギン酸あるいはグルタミン酸などのカルボ
キシル基もしくはアミノ基、チロシン残基中のフェノー
ル性水酸基、システィンのメルカプト基などが挙げられ
る。

共有結合せしめる方法としては、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミド、アルキルクロロフォルメートなどをビタミン
）誘導体のカルボキシル基又はアミノ基と反応せしめて
ビタミン）誘導体のカルボキシル基又はアミノ基を活性
化した後に結合する方法；１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノブロビル）−カルボキシイミドハイドロクロ
ライト、ジシクロヘキシｌシカｌレボジイミド、Ｎ−エ
チｌレー５−フェニルイソオキサゾリウム−３′−スル
ホナートなどの縮合剤を用いる方法；あるいはこれらの
両者の方法を併用する方法などが挙げられる。

なかでも、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどの活性化
剤と、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの縮合剤を
併用する方法が好ましい。

好適な実施態様の一例を示せば、例えば２２−カルボキ
シ−２４，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及びジシクロへキシルカ
ルボジイミドをテトラヒドロフラン中に溶解し、室温で
十数時間放置して２２−カルボキシ−２４，２５−ジヒ
ドロキシコレカルシフェロールのＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステルを生成せしめ、次いでこれとヒト血清
アルブミンとをリン酸緩衝液中で反応させる方法がある
。

免疫原性担体に結合せしめられるビタミン）誘導体の分
子の数は免疫原性担体１分子当り５〜２０個が好ましい
。特に５〜１０個が好ましい。

かくして得られる免疫化学的測定用抗体作製のための抗
原は、宿主動物に接種して抗体を誘発せしめて、抗体の
産生に用いられる。

宿主動物としては、例えば家兎、ラット、牛、羊などの
温血動物が挙げられる。かかる動物に接種するには非経
口的に投与する方法が採用され、例えば皮下または皮肉
に注射することによって行なわれる。

接種する際には通常フロイントコンプリートアジュバン
ト（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖ
ａｎｔ）を共に用いて行なわれる。

接種する方法としては、抗原を２００μｇ〜５００μｇ
の範囲で用い、これを皮下あるいは皮肉に注射し、４週
間毎に同一抗原を再注射し、その間１０日毎に血中抗体
価を測定しながら最も高い時点で全採血する。採血して
得た血液より血清を得てこれをそのまま抗体として用い
ることもできる。好ましくは硫安分画あるいはゲル濾過
法等の手段でＩｇＧ分画を得ることによって抗体を調整
することができる。

かくして得られるそれぞれの抗体は、１α位、２４位あ
るいは２５位に水酸基を有する活性型ビタミン）、例え
ば１α−ヒドロキシビタミン）、２５−ヒドロキシビタ
ミン）、１α、２５−ジヒドロキシビタミン）、２４．
２５−ジヒドロキシビタミン）などの化合物を認識する
ことができ、それ故エンザイムノアッセイあるいはラジ
オイムノアッセイ用の抗体として有用なものである。

かかる抗体は、エンザイムイムノアッセイ用に用いる場
合には、酵素標識抗原とともに測定用キットの試薬とし
て用いられる。

ここで言う酵素標識抗原としては、上記式［Ｉ］で表わ
されるビタミン）誘導体と酵素、例えばβＤ−ガラクト
シダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、リパーゼ、パーオキシデースなどの酵素、好ま
しくはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼなどの酵素とを共有結合せしめて得られるものが挙
げられる。

本発明の抗体をラジオイムノアッセイ用に用いる場合に
は、３Ｈ（トリチウム）、１４Ｃ（カーボン１４）など
で放射性標識した２４．２５−ジヒドロキシビタミン）
、２５−ヒドロキシビタミン）、１αヒドロキシビタミ
ン）、１α、２５−ジヒドロキシビタミン）とともに測
定用キットの試薬として用いられる。あるいは該抗体は
１２５■で放射性標識した１２’　Ｉ　−Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ　Ａとともに、サンドイツチ法といわれるラジオイム
ノアッセイ用の試薬として用いることができる。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。

参考例１ 成 ２２−メトキシカルボニル−３β、２４−ジアセトキシ
コレスト−５−エン−２５−オール４５０ｍｇを四塩化
炭素１０ｍ１に溶解した。得られた溶液にバス温９５°
Ｃで窒素雰囲気下、加熱攪拌しながら、１．３−ジブロ
ム−５，５−ジメチルヒダントイン１３７．７ｍｇを添
加した。添加後赤外線ランプを照射させながら激しく加
熱環流攪拌し、１５分間ブロム化反応させた。反応終了
後、反応液を濾過後濃縮することにより２２−メトキシ
カルボニル−３β、２４−アセトキシコレスト−５−エ
ン−２５−オールの７−ブロム体を含む濃縮残渣を得た
。

得られた残渣をキシレン１２ｍ１に溶解し、キシレ、／
７．５ｍｌ及びＳ−コリジン２．５ｍｌの混合溶液にバ
ス温１７０℃で加熱攪拌下、滴下した。滴下後、更に２
０分間加ｐ！！、攪拌させ反応を完了した。

反応終了後、適量の水で希釈し、酢酸エチルより抽出し
た。酢酸エチル抽出液をＩＮ−塩酸、炭酸水素ナトリウ
ム水溶液、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで
乾燥し、濾過後濃縮することにより２２−メトキシカル
ボニル−３β、２４−ジアセトキシコレスタ−５，７−
ノニン−２５−オールを含む濃縮残渣を得た。

得られた濃縮残渣をシリカゲル薄層クロマトグラフィー
に付す（溶媒ベンゼン−酢エチ系）ことにより２２−メ
トキシカルボニル−３β、２４−ジアセトキシコレスタ
−５，７−ノニン−２５−オール１５４ｍｇ　　（収率
３５％）を得た。このものの物性値は次の通りであった
。

ＵＶ＜λ魯！：’ｎｍ）　： ２９３、２８１．２７１．２６２　（ショルダー）高分
解能マススペクトル； Ｍ”　−ＡｃＯＨ，４９８ｊ３５８ （計算値Ｃ５１Ｈ４６０５＝４９８ｊ３４５）２２−メ
トキシカルボニル−３β、２４−ジアセトキシコレスタ
−５，７−ノニン−２５−オール１００ｍｇを脱酸素化
されたベンゼン６００ｍ１に溶解させた。

得られた溶液を５℃にコントロールしながら攪拌下７．
５分バイコールフィルターにより囲まれた２００ワツト
のハノビアランプを使って照射した。

この冷溶液を３０℃にコントロールしながら約１００ｍ
１に減圧濃縮しな。得られたベンゼン溶液を２時間半環
流下に加熱し反応を完りした。反応終了後、反応溶液を
３０℃にコントロールしながら減圧濃縮した。得られた
残渣を２％硫酸銀−アセトニトリル溶液で処理したシリ
カゲル薄層クロマトグラフィー（溶媒系：クロロホルム
−メタノール系）及びシリカゲル薄層クロマトグラフィ
ー（溶媒系：ベンゼンー酢エチ系）に付すことにより２
２−メトキシカルボニル−３β、２４−ジアセトキシ−
２５−ヒドロキシビタミンＤ３２５．５ｍｇを得な。こ
のものの物性値は次の通りであった。

ＵＶ　（ＥｔＯＨ；　ｎｍ）　　： λｍａｘ、　２６３　（ｅ　＝　１５５００）λｍｉｎ
、　２２８　（ε＝　８２００）ＭＳ（ｍ／ｅ）： ５５８　　（Ｍ”　）　、　４９８．２８１．２５３．
１５８．１１８高分解能マススペクトル： Ｍ”　５５８ｊ６６Ｑ （計算値Ｃ３３Ｈ５００７＝　５５８．３５５９）２２
−メトキシカルボニル−３β、２４−ジアセトキシ−２
５−ヒドロキシビタミンＤ３１４ｍｇをテトラヒドロフ
ラン２ｍｌに溶解し、１０％水酸化カリウム−メタノー
ル２ｍｌを加え、窒素雰囲気下６５℃で２時間半加熱攪
拌した。酢酸を０．２５ｍ１加え酢酸エチルより抽出し
た。飽和食塩水で洗浄後無水硫酸ナトリウムで乾燥しな
。濾過後、減圧上濃縮し得られた租生成物をシリカゲル
薄層クロマトグラフィー（溶媒系：ベンゼンー酢エチ系
）に付すことにより２２−カルボキシル−２４２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤ３９．８ｍｇを得た。このものの
物性値は次の通りであった。

ＵＶ　＜ＥｔＯＨ；　ｎｍ）　　： λｍａｘ、　２６３ａｍ　（ε＝　１５７００１λｍｉ
ｎ、　２２７．５βｍ　（ε＝　８３００）ＭＳ（ｍ／
ｅ）： ４４２　　（Ｍ”　−Ｈ２Ｏ）　。

４２４、４０６．　１３６．　１１８ 高分解能マススペクトル： Ｍ”−Ｈ２Ｏ４４２，３１１７ （計算値Ｃ２８Ｈ４２０２＝　４４２．３０８３１実施
例１ （ｉｌ　　２２−カルボキシ−２４，２５−ジヒドロキ
シコレカルシフェロールのＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルの製造 ２２−カルボキシ−２４，２５−ジヒドロキシコレカル
シフェロール＜１．ＯＸｌ０−’ｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド（１，５ＸＩＯ””ｍｏｌ）及びジ
シクロへキシルカルボジイミド＜ＤＣＣ，１，５Ｘ　１
０−’ｍｏｌ）の混合物をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ
、９００μｇ）に溶解し、暗所にて４℃で１２時間攪拌
した。生成したジシクロへキシルウレア沈殿物を遠心分
Ｈ（１０１００Ｏ０１０ｍ１ｎ）　Ｌ、次いで減圧下に
濃縮した。得られるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テルをＴＨＦ（２００μｆＪ）に溶解した。

（ｉｉｌ　　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと
Ｈ３Ａとの反応 ＴＨＦ（２００μ、Ｑ）に溶解せしめたＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，４，５００μｇ〉に溶解せしめなＨ８Ａ（５ｍｇ
）及びピリジン（１００μ、Ｑ）の混合物を４℃で１２
時間攪拌した。次いで得られた反応混合物にＴＨＦ（２
００μρ）を加え、冷却した５０％ＴＨＦ／水で１２時
間、更に冷水で４８時間透析した。

かくして２２−カルボキシ−２４，２５−ジヒドロキシ
コレカルシフェロール−Ｈ３Ａコンジュゲートを得た。

実施例２ ウサギを、２２−カルボキシ−２４，２５−ジヒドロキ
シコレカルシフェロール−Ｈ３，Ａコンジュゲートを抗
原とし、以下の如く免疫しその抗体を得た。

２２−カルボキシ−２４，２５−ジヒドロキシコレカル
シフェロール−Ｈ３Ａコンジュゲート（２００μｇ）を
生理食塩水（１００μ！Ｊ）に溶解し、これをフロイン
トコンプリートアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓＣｏｍ
ｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）ととも雄性ウサギに皮
肉注射し初回免疫した。次いで４．８そして１２週間後
に免疫し、免疫開始後約４ケ月の間にラジオイムノアッ
セイ又はエンザイムイムノアッセイに使用可能な抗血清
が得られた。

実施例３ （ｉ）′　以下の試薬を用いて、下記の方法により実施
例２で得られる抗体がビタミン）を認識し得るか否かを
調べた。

［試薬コ １２５■−ラベル化プロティンＡ　（８，３２ｎ　Ｃｉ
／Ｂプロティン）、 抗原ニスクシニル化−ビタミンＤ３−ＢＳＡ。

マイクロリッタープレート、 ＲＩＡ用緩衝液 Ａ緩衝液：０．０５Ｍリン酸緩衝液ＰＨ７，４，０，１
％ＮａＮｘ、 Ｂ緩衝液：０．０５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，４，１，０
％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、 Ｃ緩衝液：０．０５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，４，０，１
％トウイーン（Ｔｗｅｅｎｌ　２０．　０．１％Ｎ　ａ
　Ｎ　３ ［方法］ （Ａ）抗原（スクシニル化ビタミンＤ３−ＢＳＡ）をＡ
緩衝液に溶解し、濃度約２０μｇ／ｍｌプロティンとな
るようにした。

この原液を用いて得られる各種濃度の抗原溶液（Ａｎｔ
ｉｇｅｎ　ａｌｉｑｖｏｔ、　１００．ｃｚρ）、Ａ緩
衝液をウェル（ｗｅｌｌ）に入れ、１時間、３７℃でイ
ンキュベーションした。

（Ｂ）抗原溶液を除去し、Ｂ緩衝液（０，２ｍｌ＞を各
ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベーションした
。次いでＢ緩衝液を除去しＣ緩衝液で洗浄し、乾燥した
。

（Ｃ）抗体１００μｇを各ウェルに加え、４℃で１２時
間インキュベーションしな。次いで溶液を除去し、Ｃ緩
衝液で洗浄し乾燥した。

（Ｄ）１２５■−ラベル化プロティンＡの溶液（２５０
ｎｇ　／　ｍｌ　＞から調整される各種濃度の溶液＜１
１００Ｊ１〉を各ウェルに加えた。次いで室温で２２〜
２４時間インキュベーションした。

（Ｅ）各ウェルより溶液を除去し、ｃｌｌ液液洗浄し、
乾燥した後、ｒ−カウンターで放射能を測定した。

ｒ−カウンターの測定により、所定のカウント数を得た
ので、１２５Ｉ−プロティンＡはビタミン）−抗体コン
ジュゲートに結合しており、従って実施例２で得られる
２２−カルボキシ−２４，２５−ジヒドロキシコレカル
シフェロール−Ｈ３Ａから得られる抗体はビタミン）を
認識し得ることが確認された。

（ｉｉ）　　（ｉ）で用いた試薬を用い、被検化合物と
して１α、２５−ジヒドロキシビタミン）を用いて下記
の方法により　１２５Ｉ−プロティンＡによるラジオイ
ムノアッセイ用の検量線を作成した。

［方法］ （Ａｌ抗原くスクシニル化ビタミンＤ３−ＢＳＡ）をＡ
緩衝液に溶解し、この溶液より各種濃度の抗原溶液（１
００μｇ）、Ａ緩衝液をウェルに入れ、３７℃で１時間
インキュベーションした。

（Ｂｌ抗原溶液を除去し、Ｂ緩衝液＜０．２ｍ１）を加
え、３７°Ｃで１時間インキュベーションし、次いで溶
液を除去し、Ｃ緩衝液、Ａ緩衝液で洗浄後、乾燥した。

（Ｃ）　Ａ緩衝液に溶解した抗体く１００μρ）と１α
、２５−ジヒドロキシビタミン）溶液（１０μρ〉を各
ウェルに加え、４℃で１２時間インキュベーションした
。次いで溶液を除去し、Ｃ緩衝液、Ｂ緩衝液で洗浄し、
乾燥しな。

（Ｄ）　　１．２５■−ラベル化プロティンＡの溶液（
２５０ｎｇ　／　ｍｌ　＞から調整される各種濃度の溶
液（１００μｇ〉を各ウェルに加え、室温で２２〜２４
時間インキュベーションした。

（Ｅ）各ウェルより溶液を除去し、Ｃ緩衝液で洗浄し、
乾燥し、次いでｒ−カウンターで放射能を測定した。

上記方法によって、１α、２５−ジヒドロキシビタミン
）の濃度を種々変化させ、１α、２５−ジヒドロキシビ
タミン）を加えない場合のｒ　−カウンターのカウント
数に対する、１α、２５−ジヒドロキシビタミン）を加
えたときのカウント・数の割合（１２５■−比放射能（
Ｂ／Ｂｏ％））を求めて検量線を作成しな。この検量線
によれば、希釈率９６００倍の抗体、及び希釈率１０１
３倍の抗原を用いることによって、１０ｆ　−１ｐ　（
ｍｏｔ　／ウェル）の範囲のｌα、２５−ジヒドロキシ
ビタミン）の定量が好適に行なわれうろことが明らかに
された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記式［ I ］ ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでＲ＿１は水素原子、又はカルボキシル基もしくは
   アミノ基を有する炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ
   ＿２、Ｒ＿３、Ｒ＿４はそれぞれ独立に水素原子又は水
   酸基を表わす。 で表わされるビタミンＤ＿３誘導体と免疫原性担体とを
   、該ビタミンＤ＿３誘導体のカルボキシル基もしくはア
   ミノ基を介して共有結合せしめてなる抗原を、宿主動物
   に接種することによって誘発せしめた免疫化学的測定用
   の抗体。 ２、宿主動物がウサギである特許請求の範囲第１項記載
   の抗体。 ３、上記式［ I ］において、Ｒ＿１が水素原子である
   特許請求の範囲第１項又は第２項記載の抗体。 ４、上記式［ I ］において、Ｒ＿２、Ｒ＿３がともに
   水酸基である特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか
   １項記載の抗体。 ５、免疫原性担体が蛋白質である特許請求の範囲第１項
   〜第４項のいずれか１項記載の抗体。 ６、免疫原性担体が牛血清アルブミン（ＢＳＡ）又はヒ
   ト血清アルブミン（ＨＳＡ）である特許請求の範囲第５
   項記載の抗体。