JPH02215395A - チトクロームＰ―４５０ＨＦＬａ蛋白質、そのＤＮＡ配列およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は胎児肝及び婦人科悪性腫瘍に特異的に発現して
いるチトクロームＰ　−４５０ｈｕｍａｎｆｅｔａｌ　
１ｉｖｅｒｓ　（以下Ｐ−４５０ＨＦＬａと略す）の遺
伝子及び当該遺伝子により産生したＰ−４５０ＨＦＬａ
に間する。

〈従来技術とその問題点〉 チトクロームｐ−４５０はステロイド、脂肪酸、プロス
タグランジン、ビタミンＤ３など広範な生体内物質の代
謝、また、生体に進入する薬物や筋原物質等の生体外物
質の解毒化及び活性化作用を示す多機能酵素として一般
によく知られている。

チトクロームＰ−４５０に関しては種々の動物種におい
て幅広く研究が行われているが、特に担癌とチトクロー
ムＰ−４５０量の変動との相関は、１）ラットにＷａｌ
ｋｅｒ　ｃａｒｃｉｎｏｓａｒｃｏｍａ２５６　を皮下
移植すると肝ミクロソームＰ−４５０量や薬物代謝酵素
活性が移植価の成長にともなって減少する［ジャパニー
ズ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー　Ｊａｐ、Ｊ
。

Ｐｈａｒｍａｅ、　１８９　２２４頁　１９６８年］、
２）肝に移植した癌組織のすぐ周辺の正常組織ではＰ−
４５０量が増加している、３）原発性肝癌は肝の正常部
位のＰ−４５０量を減少させないが、転移肝癌はＰ−４
５０量を減少させる［肝・胆・膵　１５巻　９３１頁　
１９８７年］等の報告があるが、必ずしも一定の傾向を
示していない。

本発明者等は、ヒト胎児にＰ−４５０が存在することを
、本酵素を部分精製することにより直接証明した［バイ
オケミカルファーマコロジ−Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｐｈ
ａｒｓａｃ、　　２８　　巻　７９３　　頁１９７９年
］。

次いで本酵素を電気泳動的に均一にまで精製し、Ｐ−４
５０ＨＦＬａと命名した［アーカイブス　オブ　バイオ
ケミストリー　アンド　バイオフィジックス　＾ｒｃｈ
、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ。

２４１　巻　２７５　　頁　１９８５年］。　　また、
Ｐ−４５０ＨＦＬａの精製標品のＮ末端アミノ酸配列の
一部を下記のように決定した。

Ｐ−４５０ＨＦＬａ ｘ　　　　ｘ　　　　ｘ　　　ＩＬＥ　　ＰＲＯＡＳＮ
　　ＬＥＤ　　ＡＬＡ　　ＶＡＬ　　ＧＬＵＰ−４５０
ｓｒ ＭＥＴ　　ＡＬＡ　　ＬＥＤ　　ＩＬＥ　　ＰＲＯＡＳ
Ｐ　　ＬＥＵ　　ＡＬＡ　　ＭＥＴ　　ＧＬＵ表Ｉ　　
Ｐ−４５ＱＨＦＬａとＰ−４５ｒ）ｔｒのＮ末端アミノ
酸配列の比較（肝・胆・膵　１５巻　９３４　頁１９８
７年） ただし、Ｘは特定し得なかったアミノ酸の存在を示す。

Ｐ−４５０ＨＦＬａのＮ末端アミノ酸配列は、グエンゲ
リッヒ（Ｇｕｅｎｇｅｒｌｃｈ）のＰ−４５ＯＮＦのそ
れと似ていたが、異なっていた。

ヒト胎児肝由来であるＰ−４５０ＨＦＬａは胎児肝に主
として局在し［バイオケミカル・アンド・バイオフィジ
カル・リサーチ・コミユニケーシヨンズ　Ｂｌｏｃｈｅ
ｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｗ＊ｕｎ、　０１＄　　１１５４頁　１９８５年］
、デヒドロエピアンドロステロン３−硫酸エステルの１
６α水酸化活性をはじめ種々の活性を示すが、婦人科悪
性腫瘍、特に卵巣癌、子宮内膜癌ではその発現が著しく
増大し　ていた［肝・胆・膵　１５巻　９３１頁　１９
Ｂ７　　年］。

従ってＰ−４５０ＨＦＬａは癌診断のための腫瘍マーカ
ーとしての有用性が推定されていたが、Ｐ−４５０ＨＦ
Ｌａが胎児肝由来であることから、その取得には胎児肝
の数量的な限界、及び倫理面での困難性を抱えていた。

　そのため、Ｐ−４５０ＨＦＬａの組換えＤＮＡ技術を
用いた大量製造が渇望されていた。　また胎児肝より精
製したＰ−４５０ＨＦＬａを抗原として作製した抗Ｐ−
４５０ＨＦＬａ抗体は、類似構造を有するチトクローム
Ｐ−４５０Ｍｒと交叉反応性が認められ［肝・胆・膵　
１５巻　９３１頁１９８７年１、Ｐ−４５０ＨＦＬａの
特異的な抗体を作製するためにもＰ−４５０１（ＦＬａ
のアミノ酸配列の解明が望まれていた。

〈発明が解決しようとする課題〉 本発明の目的は、ヒト胎児肝特異的Ｐ−４５０ＨＦＬａ
蛋白質の遺伝子及び遺伝子組換え技術により産生される
ヒト由来の他の蛋白質を実質的に含有しないＰ−４５０
ＨＦＬａ蛋白質を提供することにある。

く課題を解決するための手段〉 本発明者らはＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白質をコードする遺
伝子を単離し、当該遺伝子の塩基配列を決定し、それに
基づきＰ−４５０ＨＦＬａのアミノ酸配列を決定し、本
発明を完成した。

すなわち本発明は、ヒト由来の他の蛋白質を実質的に含
有しないことを特徴とするチトクロームＰ−４５０）ｉ
ＦＬａ蛋白質を提供する。

ここで、組換え宿主細胞によって産生されるのが好まし
い。

本発明は、 Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｌａｕ Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ａｌａ Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ Ｓ６ｒｌｅｕ　Ｌｅｕ Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　ｓｉｙ Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｖａｌ 下記式［Ｉ］ ＩＩｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ ｌｉｅ　Ｔｙｒ＾５ｐ １１ｅ　　丁ｈｒ　　Ａｓｐ Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ Ｇｌｕ　Ｍａｔ　Ｖａｔ Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ Ｈｌｓ　Ｖａｔ　Ｉ’ｈｅ １１ｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ Ｌａｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌａｕ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｐｒ。

１ｕ Ｐｒ。

Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒ。

Ｖａｌ ｔｙ ＩＶ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｒｇ １ｅ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｇｉｎ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｐｈｅ １ｅ Ａｒｇ Ｔｈｒ １ｅ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌａｕ Ｔｈｒ Ｐｒ。

Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｉｎ Ｍａｔ Ｔｙｒ Ｓｅｒ ＩＩｓ Ｓｅｒ １ｅ Ａｓｎ Ｐｒ。

Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｉｌｅ １ｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｐｒ。

ＩＩｓ Ｓｅｒ Ｐｒ。

１ｅ Ａｒｇ １ｙ Ａｌａ Ｌａｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌａｕ Ｌａｕ Ｐｒ。

Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｌａｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌａｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｌａｕ Ａｓｎ 滅ａｔ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｒ。

＾「ｇ Ｓｅｒ Ｉｌｅ １’ｒ。

Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌａｕ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｉｎ Ｃｙｓ Ｇｉｎ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｌａｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｉｎ Ａｓｐ Ｌａｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌａｕ Ｔｈｒ Ｌａｕ ＩＩｓ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｌａｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｌａｕ ）＋１ｓ １ｕ Ｐｒ。

Ｇｌｎ Ｌａｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　　Ｔｈｒ Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ Ｖａｌ　　Ｐｈｅ　　Ｐｒ。

ＡＩＢ　　ｌｅｕ　　Ａｓｎ Ｖａｌ　　ｌｉｅ　　５ｅｒ Ｇｉｎ　　Ｉｌｅ　　Ｌｙｓ Ｇｉｎ　　Ｌｙｓ　　）ｌｉｓ Ｍｅｔ　　Ｉｌｅ　　Ａｓｐ Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｈｉｓ Ｌｅｕ　　Ｍｅｔ　　Ａｌａ Ａｌａ　　Ｇｌｙ　　Ｔｙｒ Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　　ｌｌ５ Ｐｒｏ　　Ａｓｐ　　Ｖａｌ １１＋１　　Ａｓｐ　　Ｔｈｒ Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　　丁ｙｒ Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ 八ｒｇ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ Ａｒｇ　　Ｖａｌ　　Ｃｙｓ Ｇｌｙ　　Ｍｅｔ　　Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｐｒ。

Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔ’ｈｅ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｉｎ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇｉｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｍａｔ Ｐｒ。

Ｃｙｓ １ｅ Ｐｒ。

Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｌａｕ Ｔｈｒ Ｌａｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｉｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｉｎ ｅｕ ｈｒ ａｔ ａｌ ｙｓ Ｐｒ。

ｌｎ ｅｕ ａｌ ｈｒ ａｌ ｈｒ ｒｇ ＾ｓｐ ｓｎ ｇｕ Ｉｓ ｈｒ ｌｕ ｙｓ Ｐｒ。

ａｌ ａｌ ｌａ ｓｐ ｙｓ Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ｍｅｔ　　
ｌｉｅ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ｔｙｒ　　ＶａｌＬｅ
ｕ　　Ｈｌｓ　　）ｌｌｓ　　Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ｌ
ｙｓ　　Ｔｙｒ　　Ｔｒｐ　　Ｔｈｒ　　ＧｌｕＰｒｏ
　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ
　　Ｇｌｕ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｅ　　５ｅｒＬｙｓ　　
Ｌｙｓ　　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　
ＩＩｓ　　Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ｔｙｒｌｌｅ　　Ｔｙ
ｒ　　Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｙ　　Ｓｅ
ｒ　　Ｇｌｙ　　Ｐｒｏ　　ＡｒｇＡｓｎ　　Ｃｙｓ　
　Ｉｌｅ　　Ｇｌｙ　　Ｍｅｔ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｅ　
　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　ＶａｌＡｓｎ　　Ｍｅｔ　　Ｌ
ｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　Ａ
ｒｇ　　Ｖａｌ　　ＬｅｕＧｉｎ　　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ
　　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｃｙｓ
　　Ｌｙｓ　　ＧｌｕＴｈｒ　　Ｇｉｎ　　ｌｉｅ　　
Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　
Ｐｈｅ　　ＧｌｙＧｌｙ　　Ｌ＋！ＩＩ　　Ｌｅｕ　　
Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　
Ｉｌｅ　　ＶａｌＬｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　Ｇｌ
ｕ　　Ｓｅｒ　　Ａｒｇ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈ
ｒ　　ＶａｌＳｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　・−−−
−−［Ｉ　］で表わされるアミノ酸配列の一部あるいは
全部を含むことを特徴とするチトクロームＰ４５０ＨＦ
Ｌａ蛋白質を提供する。

また、本発明は、チトクロームＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白
質をコードすることを特徴とする新規ＤＮＡ配列を提供
する。

遺伝暗号の縮重に基づき少なくとも１個の塩基が置換さ
れている又は置換されていない次式［１１］： ％式％ ］ で表わされるＤＮＡ配列の一部あるいは全部を含むこと
を特徴とするＤＮＡ配列を提供する。

ざらにチトクロームＰ−４５０）（ＦＬａ蛋白質をコー
ドするＤＮＡ配列または上記［ＩＩ　］式で表わされる
ＤＮＡ配列の一部あるいは全部と相補的なＤＮＡ配列を
提供する。

また、チトクロームＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白質をコード
しているＤＮＡ配列を組換え宿主細胞に於いて発現させ
ることを特徴とするチトクロームＰ−４５０ＨＦＬａ蛋
白質の製造方法を提供する。

以下、本発明の詳細な説明する。

天然のＰ−４５０ＨＦＬａは医学的事情により摘出され
た胎児、あるいは死産児の肝より得ることかできる。　
摘出された肝は直ちに液体窒素中で凍結され、さらに使
用直前まで一８０℃で凍結保存される。

Ｐ−４５０ＨＦＬａの精製方法は以下の通りである。　
胎児肝を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ７，２
５，１，１５％ＫＣＩ。

１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　　ＤＴＴ及び０．４ｍＭ
フェニルメチルスルホニルフルオライド含有）でホモジ
ナイズし、１０５．０００　ｘ　ｇで１時間遠心し、Ｐ
−４５０ＨＦＬａ含有画分を沈澱として得る。　この沈
澱を洗浄後再度遠心分離し、コール酸を含むリン酸カリ
ウムｍｉ溶液にて可溶化し、ω−アミノオクチルセファ
ローズ４Ｂカラムクロマトグラフイーを行う。　次いで
活性画分を透析し、さらにＦ　Ｐ　ＬＣ（Ｍｏｎｏ　Ｓ
またはヒドロキシアパタイトカラム）で精製する。　　
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、単一バンドを示す
両分をＰＭ３０メンブランフィルタ−で濃縮することに
より、Ｐ−４５０ＨＦＬａを得ることがでとる。

また抗Ｐ−４５０ＨＦＬａ抗体は上記方法によって精製
したＰ−４５０）ＩＦＬａを既知の方法でウサギ等の適
当な動物に感作することにより得ることができる。

胎児肝からの全Ｒ，Ｎ　Ａの抽出は一般的なグアニジン
チオシアネート法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー　Ｊ、Ｂｔｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　　２５４　％　　９３３５頁　１９７９年
］により行う。　胎児肝をグアニジンチオシアネート処
理し、ＣｓＣ１密度勾配遠心を行うことによって全ＲＮ
Ａを得た後、オリゴ（ｄＴ）−セルロースや、ポリロー
セファロース等を用いたアフィニティーカラムクロマト
グラフィー　あるいはバッチ法によりポリ（Ａ”　　）
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得ることができる。　ま　たｍＲ
ＮＡの調製は一般的な他の方法、例えばバナジウム複合
体等を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界
面活性剤処理、フェノール処理を行ってもよい、　得ら
れたポリ（Ａ”　）ＲＮＡは１０ｍＭトリス−塩酸ＩＩ
衝溶液（ｐＨ７，５，１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ及び０．２
％ＳＤＳ含有）中で５−２５％のショ糖密度勾配遠心法
により分画を行う。

Ｐ−４５ＱＨＦＬａ蛋白賞のｍＲＮＡ含有画分を決定す
るには、各ｍＲＮＡ画分を１ｎｖｌｔｒｏでタンパク買
に翻訳させ、生理活性を調べるか、あるいは抗Ｐ−４５
０ＨＦＬａ抗体を用いてそのタンパク買を同定する等の
方法で実施できる。

ｍＲＮＡの１ｎ　　ｖｌｔｒｏでの翻訳は［３ｓＳ］メ
チオニン存在下、ウサギ網状赤血球ライゼート無細胞系
で実施される。　これ以外にもアフリカッメガエルの卵
母細胞にｍＲＮＡを注入して翻訳するか、あるいは小麦
胚芽系を利用した翻訳であってもよい、　翻訳生成物と
先に述べた方法で作製した抗Ｐ−４５０ＨＦＬａ抗体と
を結合させ、免疫沈澱法等により、目的とするｍＲＮＡ
画分を確認する。

前述のごとき方法で得たｍＲＮＡを鋳型にして一般的な
方法を用いて２本願ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの合成、ベクターへ
のクローニング、さらに大腸菌等の形質転換によりｃ　
ＤＮＡライブラリーを得ることができる。　例えばｍＲ
ＮＡからの２本願ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの合成は、逆転写酵素
及びＤＮＡポリメラーゼ■を用いた既知の方法により実
施できる。　合成した２本ｉｌｌ　ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡはＥ
ｃｏＲＩメチラーゼでメチル化し、ＥｃｏＲＩリンカ−
を結合させ、適当なベクターに゛クローニングするか、
あるいはｄＣテーリングした２本鎖ＣＤＮＡをｄＧテー
リングした適当なベクターにクローニングする。　ここ
で用いるベクターは、ｐＢＲ３２２等のようなプラスミ
ド型ベクターや、λＩｔｔｏ、　λｇｔｌｌのようなフ
ァージベクターが好ましい。

ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは発現ベクター
を用いた場合、ヤングとデービスの方法［プロシーデイ
ンゲス・オブ・ザ・ナシ日ナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンス・オブ・ニーニスｊ−−Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８０巻　１１９４頁　
１９８３年］に従い発現させ、抗Ｐ−４５０ＨＦＬａ抗
体でスクリーニングすることができる。　免疫複合体の
検出は市販のヤギ抗ウサギＩｇＧと、ペルオキシダーゼ
結合ウサギＩｇＧを用いることにより実施される。

陽性クローンの同定はこの他、当該蛋白質のアミノ酸配
列をもとに合成したオリゴヌクレオチドプローブを用い
たコロニーあるいはブラークハイプリダイゼーシ日ン法
を用いてもよい。

陽性クローンのｃＤＮＡインサートをアガロースゲル電
気株動で解析し、得られたｃＤＮＡ断片がＰ−４５０Ｈ
ＦＬａ蛋白質の全長をコードしていない場合にはこのｃ
　ＤＮＡ断片なニックトランスレーション法により放射
標識して、プローブを作製し、ｃＤＮＡライブラリーを
再度スクリーニングする。　その際、このプローブを用
いてノーザンブロツティングによりＰ　−４５０ＨＦ　
Ｌ　ａをコードするｍＲＮＡを豊富に含有するｍＲＮＡ
画分を決定しその画分を用い再度ｃＤＮＡライブラリー
を作製し、これをスクリーニングしてもよい。

得られたｃＤＮＡをファージベクターＭ１Ｂｍｐシリー
ズにサブクローニングし、１末鎖ｃ　ＤＮＡをとりだし
、ジデオキシチェーンターミネーション法により塩基配
列（ＤＮＡ配列）を決定する。

決定されたＤＮＡ配列は、下記［ＩＩ　］式のものが例
示される。

ＡＴＣＧＡＴ　ＣＴＣＡＴＣＣＣＡ＾＾ＣＴτＧ　ＧＣ
ＣＧＴＧ　ＧＡＡ＾ＣＣＴＧＧ　ＣＴＴ　ＣＴＣＣＴＧ
　ＧＣＴ　ＧＴＣＡＧＣＣＴＧ　ＡＴＡＣＴＣＣＴＣＴ
ＡＴ　ＣＴＡ　ＴＡＴ　ＧＧＡ　ＡＣＣＣＧＴ　ＡＣＡ
　ＣＡＴＧＧＡ　ＣＴＴ　ＴＴＴ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　Ｃ
ＴＴ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＣＡ　ＧＧＧＣｌｏｔ；　Ａ
ＣＡ　ＣＣＴ　ＣＴＧ　ＣＣＴ　ＴＴＴ　ＴＴＧ　ＧＧ
Ａ　ＡＡＴ　ＧＣＴＴＴＧ　　ＴＣＣＴＴＣ ＧＡＣＡＴＧ　　ＧＡＡ ＧＴＣＴＧＧ　　ＧＧＴ ＡＴＣＣＴＧ　　ＧＣＴ ＡＡＡ　ＡＣＡ　　ＧＴＧ ＧＴＣＴＴ（：　　ＡＣＡ ＧＴＧ　　ＧＧＡ　　ＴＴＴ （ｉｃＴ　　ＧＡＧ　　ＧＡＴ ＴＣＡ　　ＴＴＧ　　ＣＴＧ ＾＾＾　ＣＴＣＡＡＧ ＣＡＧ　　ＴＡＴ　　ＧＧＡ ＡＧＧ　　ＣＧＧ　　ＧＡＡ ＡにＣＴＴＧ　　ＡＡＡ ＡＴＧ　　ＧＡＴ　　ＧＴＧ ＧＴＧ　　ＡＧＣＡＴＣ ＧＡＧ　　ＣＣＣＴＴＴ ＴＴＡ　ＡＣＡ　　ＴＴＴ ＣＴＣＴＣＡ　　ＡＴＡ ＣＣＡ　　ＡＴＴ　　ＣＴＴ ＴＴＴ　　ＣＣＡ　　ＡＣＡ ＣＧＴ　　ＡＡＧ　ＧＧＣ ＴＧＴ　　ＴＡＴ　　ＡＡＡ ＡＴＴ　　ＴＡＴ　　６ＡＣ ＡＴＣＡＣＡ　　ＧＡＴ ＣＴＡ　　ＧＴＧ　　＾＾＾ ＡＡＣＣＧＧ　　ＡＧＧ ＡＴＣＡＡＡ　　ＡＡＴ ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＴＧＧ ＴＣＴ　　ＣＣＡ　ＡＣＡ ＧＡＧ　　ＡＴＧ　　ＧＴＣ ＧＡＴ　　ＧＴＧ　　ＴＴＧ ＧＣＡ　　ＧＡＧ　　ＡＣＡ ＣＡＣＧＴＣＴＴＴ ＡＴＣＡＣＴ　　ＡＧＣ ＧＡＧ　　ＴＣＴ　　ＣＴＣ ＧＴＧ　　ＡＡＡ　ＡＡＣ ＡＡＴ　　ＣＣＡ　　ＴＴＡ ＡＡＡ　　ＧＴＣＴＴＴ ＧＡＡ　ＧＣＡ　　ＴＴＡ ＾＾＾　ＧＴＴ　　ＡＴＡ ＴＡＴ　　ＴＡＧ　　ＡＣＧ ＡＡＧ　　ＴＡＴ　　ＡＣＡ ＴＧＴ　　ＣＡＡ　　ＣＡＧ ＣＣＣＧＡＣＡＴＧ ＧＡＡ　ＴＣＴ　　ＴＡＴ ＣＣＴ　　ＴＴＣＧＧＧ ＧＣＣＡＴＣＴＣＴ ＡＡＧ　　ＡＧＡ　　ＡＴＡ ＴＴＣＡｃｅ　　ＡＧＣ ＣＣＴ　　ＡＴＣＡＴＴ ＧＴＧ　　ＡＣＡ　ＡＡＴ ＧＧＣＡＡＧ　　ＣＣＴ ＧＧＧ　　ＧＣＣＴＡＣ ＡＣＡ　　ＴＣＡ　　ＴＴＴ ＡＡＧ　　ＡＡＴ　　ＣＣＡ ＡＣＣＡＡＧ　　ＡＡＧ ＧＡＴ　　（：ＣＡ　　ＴＴＣ ＣＣＡ　　ＴＴＣＣＴＴ ＡＡＴ　　ＡＴＣＡＣＴ ＡＧＴ　　ＴＴＴ　　ＣＴＡ ＣＴＴ ＡＡＡ ＧＣＴ ＡＴＣ ＴＣＴ ＣＣＡ ＡＴＡ ＣＣＡ ＣＧＡ ＡＣＣ ＧＴＣ ＧＴＣ ＡＣＣ ＣＧＡ ＡＡＡ ＣＴＴ ＣＴＴ ＡＣＣ ＧＴＣ ＡＣＡ ＡＡＡ　　７０丁　ＣＴＡ ＣＴＣＡＡＡ　ＧＡＧ ＴＴＣＣＴＴ　　ＧＡＧ ＴＣＡ　＾＾＾　ＧＡＣ ＴＣＴ　　ＧＡＴ　　ＣＴＧ ＡＴＣＴＴＴ　　ＡＴＴ ＡＣＣＡＧＴ　　ＧＴＴ ＣＴＧ　　ＧＣＣＡＣＴ ＧＴＧ　　ＣＡＧ　　ＡＡＧ ＡＡＴ　　ＡＡＧ　　ＧＣＡ ＣＴＡ　　ＣＡＧ　　ＴＴＧ ＡＡＴ　　ＧＡＡ　ＡＣＡ ＡＴＧ　　ＡＧＡ　　ＣＴＴ ＧＴＴ　　ＧＡＡ　　ＡＴＣ ＧＧＧ　　ＧＴＧ　　ＧＴＧ ＣＴＴ　　ＣＡＴ　　ＣＡＴ ＣＣＴ　　ＧＡＧ　　ＡＡＧ ＾＾＾　ＡＡＧ　　ＡＡＣ ＡＴＡ　　ＴＡＣＡＣＡ ＡＡＣＴＧＣＡＴＴ ＡＡＡ　　ＣＡＧ　　ＡＴＡ ＡＣＡ　　ＣＡＡ　　ＡＡＧ ＣＴＧ　　ＡＴＧ　　ＡＴＴ ＴＣＴ　　ＧＡＧ　　ＡＣＣ ＧＡＧ　　ＣＴ［：　　ＡＴＧ ＴＴＴ　　ＧＣＴ　　ＧＧＣ ＣＴＣＴＣＣＴＴＣ ＣＡＣＣＣＴ　　ＧＡＴ ＧＡＡ　　ＡＴＴ　　ＧＡＴ ＣＣＡ　　ＣＣＣＡＣＣ ＧＡＧ　　ＴＡＴ　　ＣＴＴ ＣＴＣＡＧＡ　　ＴＴＡ ＧＡＧ　　ＡＧＧ　　ＧＴＣ ＡＡＴ　　ＧＧＧ　　ＡＴＧ ＧＴＧ　　ＡＴＧ　　ＡＴＴ ＧＡＣＣＣＡ　　ＡＡＧ ＴＴＣＣＴＣＣＣＴ ＡＡＧ　　ＧＡＣＡＡＣ ＣＣＣＴＴＴ　　ＣＧＡ ＧＧＣＡＴＧ　　ＡＧＧ ＡＡＡ　　ＧＡＡ　　（ｉＧＴ ＣＡＣＣＧＡ　　ＧＴＧ ＧＡＣＴＣＴ　　（：ＡＧ ＣＡＣＡＡＡ　　ＧＣＴ ＧＣＣＣＡＡ　ＴＣＡ ＴＡＴ　　ＧＡＡ　ＡＣＣ ＡＴＴ　　ＡＴＡ　　ＴＡＴ ＧＴＣＧＡＧ　　ＧＡＧ ＡＣＡ　　ＧＴＴ　　ＴＴＡ ＴＡＴ　　ＧＡＴ　　ＡＣＴ ＧＡＣＡＴＧ　　ＧＴＧ ＴＴＣＣＣＡ　　ＧＴＴ ＴＧＣＡＡＡ　＾＾＾ ＴＴＴ　　ＡＴＴ　　ＣＣＣ ＣＣＡ　　ＡＧＣＴＡＴ ＴＡＣＴＧＧ　　ＡＣＡ ＡＡＡ　ＡＣＧ　　ＴＴＣ ＡＴＡ　　ＧＡＴ　　ＣＣＴ ＡＣＴ　　ＧＧＡ　　ＣＣＣ ＴＴＴ　　ＧＣＴ　　ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＴ ＡＡＴ ＧＴＣ ＡＴＴ ＡＣＣ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＣＣ ＧＴＣ ＧＴＣ ＧＣＴ ＧＡＴ ＾＾＾ ＣＴＴ ＧＡＣ ＡＣＴ ＴＡＣ ＡＣＡ ＴＧ ＡＡＣＡＴＧ　　＾＾＾　ＣＴＴ　　ＧＣＴ　　ＣＴＡ
　　ＧＴＣＡＧＡ　　ＧＴＣＣＴＴＣＡＧ　　ＡＡＣＴ
ＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＡ　　ＣＣＴ　　ＴＧＴ　　ＡＡ
Ａ　　ＧＡ＾＾ＧＡ　　ＣＡＧ　　ＡＴＣＣＣＣＣＴＧ
　　ＡＡＡ　ＴＴＡ　　ＣＧＣＴＴＴ　　ＧＧＡＧＧＡ
　　ＣＴＴ　　ＣＴＴ　　ＣＴＡ　ＡＧＡ　　ＧＡＡ　
　ＡＡＡ　　ＣＣＣＡＴＴ　　ＧＴＴＣＴ＾　＾＾Ｇ　
　ＧＣＴ　　ＧＡＧ　　ＴＣＡ　　ＡＧＧ　　ＧＡＴ　
　ＧＡＧ　　ＡＣＣＣＴＡＡＧＴ　　ＧＧＡ　　ＧＣＣ
ＴＧＡ　　−−−−−−［ＩＩ　］本発明のＤＮＡ配列
は、上記［［１１式で表わされるＤＮＡ配列の一部であ
ってもよいし、全部であってもよい、　また、上記［１
１１式で示されるＤＮＡ配列を一部に含むものであって
もよい。

本発明のＤＮＡ配列は、前述のようにｍＲＮＡを鋳型に
合成してもよいし、有機合成化学的に合成してもよい。

遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産される蛋白質の
アミノ酸配列を変えることなくその遺伝子のＤＮＡ配列
の少なくとも１つの塩基を他の種類の塩基に置換するこ
とができる。

従りて、本発明のＤＮＡ配列はまた、遺伝暗号の縮重に
基づく置換によって変化された塩基配列を含有すること
も可能である。　こ　の場合、置換により得られたＤＮ
Ａ配列から演絆されるアミノ酸配列は後に式［Ｉ］で示
すアミノ酸配列と一致する。

本発明によれば、上記ＤＮＡと相補的なＤＮＡもまた提
供される。　本発明によれば、上記ＤＮＡとそれに相補
的なＤＮＡが互いに相補的に結合して２本１ｉＤＮＡを
形成していてもよい。

上記［ＩＩ　］式で示されるＤＮＡ配列から推定される
アミノ酸配列は下記ＣＩ］式で示される。

Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　ＩＩｓ　Ｐｒｏ＾ｓｎ　Ｌｅ
ｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　ＧｌｕＴｈｒ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　
Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　１
ｉｅＬｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　丁ｙｒ
　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ　　Ａｒｇ　　Ｔｈｒ　　）Ｉｔ
ｓＧｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　
Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　ＧｌｙＰｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒ
ｏ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ
　ＡｌａＬｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇ
ｌｙ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　ＰｈｅＡｓｐ　Ｍａｔ
　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　
Ａｒｇ　ＬｙｓＶａｌ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｔｙ
ｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｐｒ。

Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｖａｌ Ｖａｌ　　Ｐｈｅ　　Ｔｈｒ Ｖａｔ　　Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ ＡＬａ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｐ Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ Ｇｉｎ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｙ Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｕ Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ Ｍｅｔ　　Ａｓｐ　　Ｖａｌ Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｅ Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　ｌ１ｅ Ｐｒｏ　　ＩＩｓ　　Ｌｅｕ Ｐｈｅ　　Ｐｒｏ　　Ａｒｇ Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｎ １１ｅ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　Ｌｙｓ Ａｓｎ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ Ｍｅｔ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｎ Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｔｒｐ Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ Ｇｌｕ　　Ｍｅｔ　　Ｖａｌ Ａｓｐ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ ＡＬａ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ Ｈｉｓ　　Ｖａｌ　　Ｐｈｅ Ｉｔｓ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ Ｖａｌ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ Ａｓｎ　　Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ Ｌｙｓ　　Ｖａｌ　　Ｐｈｅ Ｇｌｕ　　ＡＬａ　　Ｌａｕ Ｌｙｓ　　Ｖａｌ　　ｌｌ５ Ｌｙｓ　　Ｇｉｎ　　Ｔｉｅ Ｔｈｒ　　Ｇｉｎ　　Ｌｙｓ Ｌｅｕ　　Ｍｅｔ　　ｌ１ｅ Ｐｒｏ　　Ａｓｐ　　Ｍｅｔ Ｇｌｕ　　Ｃｙｓ　　Ｔｙｒ Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　ＧＩＹ ＡＬａ　　Ｉｌｅ　　５ｅｒ Ｌｙｓ　　Ａｒｇ　　ｌ１ｅ Ｐｈｅ　　Ｔｈｒ　　５ｅｒ Ｐｒｏ　　Ｉｌｅ　　ｌ１ｅ Ｖａｌ　　Ａｒｇ　　Ａｓｎ ａｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　Ｔｙｒ Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ Ａｓｎ　　Ａｓｎ　　Ｐｒ。

Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ Ａｓｎ　　Ｉｌｅ　　Ｔｈｒ Ｓｅｒ　　Ｐｈａ　　Ｌｅｕ Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ Ｈｌｓ　　Ａｒｇ　　Ｖａｌ Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｇｉｎ １ｅ Ｓｅｒ Ｐｒ。

ＩＩｓ Ａｒｇ ＡＬａ Ｌａｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ １ｙ Ｇｌｎ Ｌａｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｒｇ ＾Ｓ９ ５ｎ Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ Ｓｅｒ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ １１ａ　　Ｐｈａ　　ｌ１ｅ Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ Ｖａｌ　　Ｇｌｎ　　Ｌｙｓ Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ Ｌｅｉｉ　　Ｇｌｎ　　Ｌｅｕ Ａｓｎ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ Ｍｅｔ　　Ａｒｇ　　Ｌｅｕ Ｖａｌ　　Ｇｌｕ　　ｌ１ｅ Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ Ｌｅｕ　　Ｈｌｓ　　Ｈｌｓ Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｎ １１ｅ　　Ｔｙｒ　　Ｔｈｒ Ａｓｎ　　Ｃｙｓ　　Ｉｌｅ Ａｓｎ　　Ｍｅｔ　　Ｌｙｓ Ｇｉｎ　　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ Ｔｈｒ　　Ｇｉｎ　　ｌ１ｅ Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｍｅｔ Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ Ｈｆｓ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｐ Ｇｌｕ　　ＩＩｓ　　Ａｓｐ Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ Ｇｌｕ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　Ｌｅｕ Ｇｌｕ　　Ａｒｇ　　Ｖａｌ Ａｓｎ　　Ｇ＋、ｙ　　Ｍｅｔ Ｖａｌ　　Ｍｅｔ　　ｌ１ｅ Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｙ Ｇｌｙ　　Ｍｅｔ　　＾「ｇ Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ ）ＩＩｓ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ Ａｌａ　　Ｇｉｎ　　５ｅｒ Ｔｙｒ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ １１ｅ　　Ｉｌｅ　　Ｔｙｒ Ｖａｌ　　Ｇｉｎ　　Ｇｌｎ Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ Ｔｙｒ　　Ａｓｐ　　Ｔｈｒ Ａｓｐ　　Ｍｅｔ　　Ｖａｌ Ｐｈｅ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ Ｃｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ Ｐｈｅ　　Ｉｌｅ　　Ｐｒ。

Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ｔｙｒ Ｔｙｒ　　Ｔｒｐ　　Ｔｈｒ Ｇｌｕ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｅ １１ｅ　　Ａｓｐ　　Ｐｒ。

Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｐｒ。

Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ Ｖａｌ　　Ａｒｇ　　Ｖａｌ Ｐｒｏ　　Ｃｙｓ　　Ｌｙｓ Ｌａｕ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｅ １、　ｅ　ｕ １ｅ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｒ。

Ｖａｌ Ｖａｌ ＡＬａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌａｕ Ｇｌｕ ｌｙ Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　
Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　ｌｉｅ　　ＶａｔＬｅ
ｕ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ａｒ
ｇ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　ＶａｌＳｅｒ　
　Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　−・・・　［Ｉ　　］本発明の
チトクロームＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白質は、上記［１１
式で表わされるアミノ酸配列の一部であってもよいし、
全部であってもよいし、上記［１１式のアミノ酸配列を
一部に含むものであってもよい、　また、本発明のチト
クロームＰ　−４５０ＨＦ　Ｌ、　ａ蛋白質は、Ｎ末端
にＭｅｔを含むものであってもよいし、Ｍｅｔを含まな
いものでもよい。

自然の変異によりまたは人工的変異により、主たる活性
に変化を与えることなく、ＤＮＡの構造及びそれから演
鐸されるペプチドの構造の一部を変異せしめることが可
能である。　従って本発明のチトクロームｐ−４５０Ｈ
ＦＬａ蛋白質は前述のすべてのアミノ酸配列の相同変異
体に相当する構造を有する配列を含有することも可能で
ある。

本発明のＤＮＡ配列を複製可能な発現ベクターに連結し
て複製可能な組換え体ＤＮＡを得、この複製可能な組換
え体ＤＮＡで微生物または細胞を形質転換させて形質転
換体を形成せしめ、この形質転換体も当該機生物または
細胞の親細胞から選別し、この形質転換体を培養して、
当該形質転換体に該ＤＮＡ配列を発現させてチトクロー
ムＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白質を産生せしめ、この蛋白質
を培養した形質転換体から単離することによってヒト由
来の他の蛋白質を実質的に含有しないチトクロームｐ−
４５０ＨＦＬａ蛋白質を得ることができる。

このように組換え宿主細胞によって得られるチトクロー
ムＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白質は、大量製造が可能であり
、ヒト由来の他の蛋白質を実質的に含有しないのでＰ−
４５，０ＨＦＬａの特異的な抗体を作製することができ
る。

〈実施例〉 本発明を以下の実施例により具体的に示すが、本発明は
これらによって何等限定されるものではない。

（実施例１） ヒト胎児肝ホモジネートからのＰ−４５０ＨＦＬａの精
製 北国らの方法［アーカイブス・オブ・バイオケミストリ
ー・アンド・バイオフィジックスＡｒｃｈ、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、　２４１巻　２７５頁１９
８５年］に従い、以下の通り実施した。精製に使用した
緩衝溶液の組成を次に示した。リン酸カリウム濃度は、
その都度示した。

バッフｙ−Ａ：１．１５％ＫＣＩ、ｉｍＭＤＴＴ、１ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ及び０．４ｍＭフェニル、メチルスルホ
ニルフルオライド（ＰＭＳＦ）含有リン酸カリウムＭ衝
溶液（ｐＨ７，９２バッフｙ−Ｂ：２０％グリセロール
、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．４ｍＭＰＭ
Ｓ　Ｆ及び０．６％コール酸ナトリウム含有リン酸カリ
ウム緩衝溶液（ｐＨ７，２５）バッファーＣ：２０％グ
リセロール、０．１ｍＭ　　ＤＴＴ及び０．２％エマル
ゲン９１３含有リン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ６，５）
バッファーＣ：２０％グリセロール、０．１ｍＭ　　Ｄ
ＴＴ及び０．２％エマルゲン９１３含有リン酸カリウム
ｍ衝溶液（ｐＨ７，４）−８０℃で凍結保存されていた
２０〜２８週齢死産胎児の肝１０〜１５ｇを、使用時に
１０ｍＭバッフｙ−Ａ　１００〜１５０　ｍｌＬと共に
ホモジナイズした。　　１０５，０００　Ｘ　ｇで１時
間遠心し、残量に同種バッファー２００〜３００ｍＪ２
を再度加え、ホモジナイズ後、１０５．０００　ｘ　ｇ
で３０分間遠心した。　次いで残量を１００ｍＭバッフ
ァーＢ５００〜４５０　ｒｒ、　１１でホモジナイズし
、１０５．０００　ｘ　ｇで１時間遠心した。　その上
清を１００ｍＭバッファーＢで平衡化しておいたω−ア
ミノオクチルセフ１０−ズ４Ｂカラムにかけた。　　１
００ｍＭバッファーＢでカラムを洗浄後、１００ｍＭリ
ン酸カリウムバッファー（ｐＨ７，２５，２０％グリセ
ロール、１ｍＭ　　ＤＴＴ、０．１％コール酸ナトリウ
ム及び０．５％エマルゲン９１３含有）でＰ−４５０Ｈ
ＦＬａ含有画分を溶出した。　この画分を２０％グリセ
ロール、０．２ｍＭ　　ＤＴＴ及び０．２％エマルゲン
９１３を含む！ＯｍＭリン酸カリウム＆ｌ衝溶液（ｐＨ
６，５）で透析した。

次いでＦＰＬＣシステムを用い、約１ｍｇ量の蛋白質を
１０ｍＭバッファーＣで平衡化されたＭｏｎｏ　　Ｓカ
ラムにかけ、１０ｍＭバッファーＣ５ｍ℃でカラム洗浄
後、１０ｍＭバッファーＣを用いて作製されたＯ−３０
０ｍ０−３Ｏ０直線濃度勾配溶液（総量１５ｍｊ！、流
速１ｍ１／分）で溶出した。　　　Ｐ−４５０ＨＦＬａ
は４０５ｎｍの吸収でモニターした。　各画分の一部を
５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析後、Ｐ−４５０ＨＦＬａを含む
画分をプールした。

プールした画分１０ｍ１を直接１０ｍＭバッファ一りで
平衡化しておいたヒドロキシアパタイトカラム（９ｘ３
０ｍｍ）にかけた。カラムは１０ｍＭバッフｙ−Ｄ２０
ｍＪｌ（流速１　ｍｆＬ／分）で洗浄し、さらに５０ｍ
Ｍバッフｙ　−Ｄ　５　ｍ　ｆｔで洗浄した。　　　Ｐ
−４５０ＨＦＬａを５０−３００ｍＭリン酸カリウム溶
液の直線濃度勾配溶液（総量３０ｍｊ２、流速１ｍｆｔ
１分）で溶出した。５Ｏ３−ＰＡＧＥと４０５１ｒＨの
吸収でＰ−４５０ＨＦＬａの存在を確認した後、ＰＭ３
０メンブランフィルタ−を用いて濃縮した。

以上の方法により、ヒト胎児肝ホモジネートよりＰ−４
５０ＨＦＬａを単一に精製し、精製標品は５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥで分子量５１，０００を示した。

（実施例２） 抗Ｐ−４５０ＨＦＬａ抗体の作製 抗Ｐ−４５０ＨＦＬａ抗体は鎌滝らの方法［モＬ／ｊＦ
エラー・ファーマコロジー　Ｍｏｌ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　　１２巻　９２１頁　１９７６
年］に従い、実施例１で精製したｐ−４５０ＨＦＬａを
用いて抗血清として得た。

ニューシーラントラビット１羽に、１日目と８日目には
後足爪間と４カ所の筋肉中に、約０．１ｍｇの精製Ｐ−
４５０ＨＦＬａをフロイントの完全アジェパンドと共に
注射し、さらに２１日目にはＰ−４５０ＨＦＬａを生理
食塩水に溶解し静注した。　その後８日目に耳より採血
し、常法に従って血清を分離した。　これを抗血清とし
て使用した。

（実施例３） ヒト胎児肝全ｍＲＮＡの抽出 全ＲＮＡの抽出はレイモンドらの方法 ［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー　
　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　　２５４巻　９３３
５頁１９７９年］に従い実施した。　すなわち、まず−
ａＯ℃で凍結保存された胎児肝約２ｇを２２ｍｆｔの４
Ｍグアニジンチオシアネート溶液（ｐＨ７，０，２５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム及び０．１Ｍβ−メルカプトエタ
ノール含有）中でポリトロン（キネマチイカ社）を用い
てホモジナイズし、２０℃、１２，０ＯＯＸ　ｇで１０
分間遠心した。　滅菌済みの遠心用チューブに５ｍＡの
５．７Ｍ　　ＣｓＣ１溶液（ｐＨ７，０゜０９１Ｍ　　
ＥＤＴＡ含有）を分注し、その上に先の遠心後の上清的
２０ｍｊＺを重層した。

２０℃、８０，０ＯＯＸ　ｇで２０時間遠心後、上層を
ピペットで静かに除き、遠心チューブをすばやく逆にし
てティッシュペーパー上に立て、しばらく放置した。　
沈澱に１０ｍｆｔの滅菌純水を加え、５５℃で数分間よ
く混合し、ＲＮＡベレットを溶解した。　この溶液に１
／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５，２）と、
２．５倍量のエタノールを加えＲＮＡを沈澱させ、−２
０℃で一晩放置し、全ＲＮＡを得た。

全ＲＮＡの乾燥重量は１７．０ｍｇであった。

続いて全ＲＮＡよりアビブらの方法［ブロシーデインダ
ス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンス・オブ・二一二スニー　　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
　　＾ｃａｄ、Ｓｃ１．ＵＳＡ　　６９　４１４０８頁
　１９７２年］に従い、オリゴｄＴセルロースカラムを
用い、ｍＲＮＡを分離した。　すなわち、オリゴｄＴセ
ルロース樹脂１ｇを２０ｍＭトリス−塩酸緩衝溶液（ｐ
Ｈ７，５，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．５Ｍ　　ＮａＣ１
及び０．１％ＳＤＳ含有）に懸濁し、４ｍＡ容量のカラ
ムをつくり、カラムを同溶液で洗浄した。

上記ＲＮ　Ａ　３４０　Ａ　ｂ　Ｓ　、　ｔ　ｓ。単位
を０．５Ｍ　　ＮａＣ１及び０．１％ＳＤＳ含有ＴＥ溶
液（１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７，５）及び
１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）５０ｍｊ！に溶解し、熱変性後、
カラムに吸着させた。　吸着後のカラムを、同溶液で洗
浄した後、１０ｍｊ！のＴＥ温溶液０．０５％ＳＤＳ含
有）でポリ（Ａ”　）ＲＮＡを溶出した。　　　１ｍＪ
２の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）と２．５倍量の
エタノールを加え、ポリ（Ａ”　）ＲＮＡを沈澱させた
。　以上の操作により乾燥重量１．０ｍｇのポリ（Ａ”
　）ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）を得た。

得られたポリ（Ａ”　）ＲＮＡをさらにショ糖密度勾配
遠心法に従って分画した。　シミ糖溶液はＴＥ温溶液１
０ｍＭ　　ＥＤＴＡ及び０．２％ＳＤＳ含有）に５％あ
るいは２５％になるようシ饅糖を加えて調製した。　こ
の２種のシミ糖溶液を混合することにより５−２５％の
ショ糖密度勾配を遠心用チューブに作り、ポリ（Ａ”　
）ＲＮＡ５００μｇを２００μ℃の滅菌純水に溶解し、
６５℃、５分間加熱後急冷したものを重層した。　　１
１０，０００　ｘ　ｇで１５時間遠心した後、０．４ｍ
ｊ！ずつ分画し、エタノール沈澱によりｍＲＮＡを回収
した。　各画分に含まれるポリ（Ａ”　）ＲＮＡのサイ
ズはｒＲＮＡを指標として決定した。

（実施例４） Ｐ−４５０ＨＦＬａ　　ｍＲＮＡ含有画分の決定 実施例３に従って得られたｍＲＮＡを蛋白質に翻訳し、
これを実施例２で得られた抗Ｐ−４５０ＨＦＬａ血清で
スクリーニングした。

ｍＲＮＡ　（各画分の１／２０量のｍＲＮＡ）の翻訳は
ウサギ網状赤血球ライゼート無細胞系（２５μＣｉ［”
Ｓ］メチオニン存在下）を用いて実施した。　反応操作
は、アマジャム社のプロトコール（全容量２５μＬ、３
０℃、９０分間反応）に従った。

翻訳後、反応液の１μρを用い、１０％トリクロロ酢酸
不溶性画分に取り込まれた［３Ｓｓ］の放射活性を測定
し、残りの友°応液は抗Ｐ−４５０）ＩＦＬａ血清によ
る免疫沈降反応に用いた。　すなわち、残りの反応液に
１０％５ＤＳ２５μｍを加え、純水にて２５０μｍとし
、５分間煮沸後、１ｍｊ！の希釈溶液（１９０ｍＭ　　
ＮａＣ１１５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５）、６ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ及び２．５％トリトンｘ−ｔｏ−ｏ）及
び抗Ｐ−４５０ＨＦＬａ血清２μｍを加え、室温で一晩
インキエベートした。

反応後１０，０ＯＱＸ　ｇで５分間遠心し、上清に純水
で膨潤させたプロティンＡ−セファロースを１０μｍ加
え、室温で２時間インキエベートした。　インキエベー
ション後、遠心によりプロティン−Ａセファロース樹脂
を沈め、１ｍＡの洗浄液（１５０ｍＭ　　ＮａＣ１，１
０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５）、５ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ。

０　、　　１　　％　　ト　　リ　　ト　　ン　ｘ−ｔ
ｏｏ　　及　び　０　、　　０　５　％５ＤＳ）で４回
洗浄した。　続いて２５μｍの溶出液（６％ＳＤＳ％０
．２Ｍ）−リス−塩酸（ｐＨ７，５）、５ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡ及び２％ショ糖）を加え、５分間煮沸し、溶出液中
の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定し
、目的のｍＲＮＡ画分を決定した。

（実施例５） λファージｃＤＮＡライブラリーの構築実施例４により
決定されたＰ−４５０ＨＦＬａのｍＲＮＡを含む画分を
用いてガブラーとホフマンの方法［ジーン　Ｇｅｎｅ　
　２５巻　２６３頁１９８３年］に従いｃＤＮＡを合成
した。

（１）１本ｉｉ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆ）合成熱変性させ
た約１８μｓのｍＲＮＡを含む溶液２０μｍに１００ｍ
Ｍ水酸化メチル水銀１μｍを加え、室温で１ｏ分間放置
した後、７００ｍＭβ−メルカプトエタノール２μｌ及
びリボヌクレアーゼインヒビター１μｍ（４０単位）を
加え、さらに室温で５分間放置した。

続いて以下の組成からなる溶液５０μｍを調製し、４２
℃、９０分間反応させ、１本１ｃＤＮＡを合成した。　
反応溶液中には２００μｇ／　ｍ　ｊ２オリゴ（ｄＴ）
＋ｓ、１００ｍＭトリス−塩酸（ＰＨ８，３）、４０ｍ
Ｍ　　ＫＣＩ、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ、、各２ｍＭ　　
ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ　（４μＣ１
［”Ｐ］ｄＣＴＰ）及び８００車位／　ｍ　ｊ！の逆転
写酵素を含む。　この反応溶液に終濃度２０ｍＭになる
ようＥＤＴＡを加え、反応を停止させた。

反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、２Ｍ酢酸
アンモニウム及びエタノールで高分子核酸を沈澱させた
。　放射活性の取り込みより計算すると、１木鎮ｃ　Ｄ
　Ｎ　Ａの合成量は、１．４７μｇであった。

（２）２木鎮ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの合成 （１）で得られた１零ｌＩｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ全量を２０μ
ｍの滅菌純水に溶かした後、下記組成となるように反応
液を調製した。　すなわち、２０ｍＭトリス−塩酸（ｐ
Ｈ７，５）、４ｍＭＭｇＣ１２，１０！ＴＩＭ　　（Ｎ
Ｈ４）２Ｓ０４１００ｍＭ　　ＫＣｌ、、０．１５ｍＭ
β−ＮＡＤ、５０ｕｇ／ｍｆｌ　　ＢＳＡ、各１ｍＭｄ
ＡＴＰ、ｄＧＴＰ％　ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ（１０μＣｉ
　［”Ｐ］　ｄＣＴＰ）、８．５単位／ｍｆｔ　　Ｅ、
ｃｏｌｉ　　ＲＮａｓｅ　Ｈ，２３０車位／ｍｆＬＤＮ
ＡポリメラーゼＩ及び１０車位／　ｍ　ｆＬＥ、ｃｏｌ
ｉ　　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼである（総量ｉｏ。

μＵ）。　１２℃で６０分間、さらに　２５℃で６０分
間反応し、終濃度２０ｍＭになるようＥＤＴＡを加え反
応を停止させた。　この溶液を２回フェノール−クロロ
ホルム処理した後、２Ｍ酢酸アンモニウム及びエタノー
ルで沈澱させ、未反応の基質を除去した。　放射活性の
取り込みより計算すると、合成された２本１１　ｃ　Ｄ
ＮＡは１．８７μｇであった。

（３）ＥｃｏＲＩメチル化及びＥｃｏＲＩリンカ−の付
加 （２）で合成した２本ｖＡｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　１．８７μ
ｇをＴＥ温溶液ｐＨ８，０）２５９ｆｌに溶解し、下記
組成となるように調製した。　すなわち、５ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ、２００μｇ／ｍｊ２ＢＳＡ、１００μＭＳ−ア
デノシルメチオニン及び２，０００単位／　ｍ　ｊ２の
ＥｃｏＲＩメチラーゼである（総量５０μｉ）、　　３
７℃で３０分間反応し、常法通りフェノール−クロロホ
ルム抽出及びエタノール沈澱した。

次に、得られたｃ　ＤＮＡを滅菌純水に溶かし、１００
ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８，０）、１０ｍＭ　　ＭｇＣ
１ｚ、１ｍＭ　　ｄＮＴＰｓ（ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣ
）、０．５ｍＭ　　ＤＴＴ、２００μｇ／ｍｊ！　　Ｂ
ＳＡ及び３００単位／ｍｆｔ　Ｔ４　　ＤＮＡポリメラ
ーゼとなるように調製し、３７℃、３０分間インキエベ
ートした。　次いでライゲーションキット（宝酒造社）
を用いて１．５μｇのリン酸化ＥｃｏＲＩリンカ−と１
６℃で一晩反応させ、ＥｃｏＲＩリンカ−を付加した。

　反応後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール
沈澱を行った。

リンカ−付加ｃＤＮＡは５０μｍの反応溶液（５０ｍＭ
　　ＮａＣ１，１００ｍＭ）−リス−塩酸（ｐＨ７，５
）、　　７ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｃ１ｘ　、７　ｍＭβ−
メルカプトエタノール及び８００車位／ｍｉのＥｃｏＲ
Ｉ含有）中で３７℃、４時間反応し、ＥｃｏＲＩ消化し
た。　フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈澱
し、セファローズＣＬ−４Ｂでゲル濾過し、５００ｂｐ
以上の両分を集め、エタノール沈澱した。　最終的に４
５０ｎＨのリンカ−付加ｃＤＮＡを回収した。

（４）ｃＤＮＡのベクターへの導入 ＥｃｏＲＩで消化したえｇｔｌｌｌｕｇに、２本ｄ４　
ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　５０　ｎ　ｇを加え、５０ｍＭ　　Ｔ
Ｅ温溶液ｐＨ７，４１０ｍＭＭｇＣＩ２．１０ｍＭ　　
ＤＴＴ、１ｍＭ　　ＡＴＰ、１００μｓ／ｍｌ！　　Ｂ
ＳＡ及び７５０単位Ｔ４リガーゼ含有）１０μｍを加え
、１６℃、６時間反応した。

（５）　ｉｎ　　ｖｌｔｒｏパッケージング（４）で得
られた組換えファージＤＮＡをインビトロパッケージン
グキット（プロメガ社）を用いて、プロメガ社の指示書
に従いパッケージジグした。　すなわち、組換えファー
ジＤＮＡ溶液７．５μｍを３７．５Ｍ℃のパッケージン
グエキストラクトに加え、２２℃、２時間インキュベー
トした。　同溶液に３７５μぶの希釈液（０，１Ｍ　　
ＮａＣ１，１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８，ｏ）及び１
０ｍＭＭｇＳＯ４）、さらにクロロホルム２０μｍを加
えて、４℃にて保存した。

（実施例６） 抗体によるＰ−４５０）！ＦＬａのＣＤＮＡライブラリ
ーのスクリーニング ヤングとデービスの方法［プロシーデインゲス・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミ−・オプｅサイエンスΦオブ
舎ニーニスニーＰｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＩｓ＾　８０巻　
１１９４頁　１９８３年］を改良して以下の通り実施し
た。

（１）ファージプラークの形成 大腸菌Ｙｌ　０９０の一夜培養液（液体培地：１０ｇ／
ＩＬトリプトン、５ｇ／ｆＬ酵母エキス、５ｇ／ＩＬ　
　ＮａＣ１２，５ｇ／ＩｔＭｇＳＯ４７Ｈ２０及び２ｇ
／Ｉｔマルトース）３００μｍに実施例５で調製したフ
ァージ組換え体１０Ａｔｆを混合し、３７℃、２０分間
試験管中で感染させた。　次に寒天培地（１０ｇ／１１
　　　）−リ　　ブ　　ト　　ン　、　　　５　　　ｇ
　　／　　Ｉｔ　　　　　　Ｎ　　　ａ　　　Ｃ１。

２．５ｇ／ｉ　ＭｇＳＯ４７Ｈ２０及び１５ｇ／ｕ寒天
、滅菌処理後アンピシリン！００ｍｇ添加）上に上記混
合物を、軟寒天培地（１０ｇ／λトリプトン、５ｇ／ｌ
ＮａＣ１，２，５８／ＩＬ　Ｍｇ５０４７ＨｘＯ及び７
ｇ／４２ｇ天）７．５ｍｊ２と共に注ぎ込み、固化させ
た。　このプレートを４２℃、３．５時間インキュベー
トした後、１０ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トピラノシド（Ｉ　ＰＴＧ）をしみこませたニトロセル
ロースフィルターを寒天上にのせ、さらに３７℃、３．
５時間インキュベートし、ファージプラークを形成させ
た。　以上の操作により３×１０’個のプラークが得ら
れた。

（２）抗体によるスクリーニング （１）でインキュベートしたプレートを４℃で３０分間
放置し、発現融合蛋白を吸着したニトロセルロースフィ
ルターを剥した。　　こ　のフィルターを３％ＢＳＡを
含むＴＳＭ衝溶液（５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５
）及び１５０ｍＭ　　ＮａＣ１）５０ｒｎｆｔで室温に
て１時間処理した。　次にフィルターを２〜３枚ずつビ
ニールパックに移し、−次抗体として抗Ｐ−４５０１（
ＦＬａ抗血清２０ｕｆＬを含むＴＳ＆１１溶液５ｍｆｔ
を入れ、室温にて１時間処理した。　その後フィルター
をＴＳｌｉ＠溶液で３回（各５分間ずつ）洗浄し未反応
の抗体を除去した。　次にフィルターを新しいビニール
バッグに移し、二次抗体としてヤギ抗ウサギＩｇＧ（０
，６ｍｇ／ｍｕ）１０ｔｔｆｌを、さらに三次抗体とし
てペルオキシダーゼ結合ウサギＩｇＧ（１，５ｍｇ／ｍ
ＩＬ）１０μａｌを加え各々−次抗体の際と同様にイン
キュベートした。　フィルターを洗浄後、ＴＳＳ緩衝溶
液２５ｍ社酵、素基質として８２０２１０μｍを、発色
指標として３．３°−ジアミノベンジジン４塩酸塩６ｍ
ｇを添加し、これにフィルターを数分間浸して発色させ
、抗血清と反応した陽性クローン２個を得た。

（３）プラークの精製 （２）で得られた陽性クローンのプラークを含む軟寒天
をバスツールビベ、ットを用いて採取し、クロロホルム
を少量含む５Ｍ培地（５，８ｇ７１１　　ＮａＣｌ、　
２ｇ／ｆ１Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４７Ｈ２０，５０ｍＭトリス
−塩酸（ｐＨ７，５）及び０．０１％ゼラチン）１ｍ１
に懸濁した。　この懸濁液を４℃で３０分間放置し、フ
ァージを拡散させた。　次にこのファージ懸濁液をＳＭ
培地で適宜希釈して（１）に準じファージプラークを形
成させ、（２）の方法でスクリーニングを繰り返し、単
一な陽性クローンを得た。　最終的に陽性プラークをＳ
Ｍ培地に懸濁し、精製ファージとした。

（実施例７） 陽性クローンの解析 大腸菌Ｙ１０８８の一夜培養液（液体培地二Ｙｌ　０９
０と同一組成の）１ｍｊ！に、実施例６の（３）で得ら
れたファージ懸濁液５０μ℃を混合し、３７℃、２０分
間感染させた。　次いでＴ培地（１０ｇ／ｌ１）−リプ
トン、２．５ｇ／Ｊ２　　ＮａＣ１及び２　、５　ｇ　
／　Ｉ　　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４Ｈ２０）２５ｍｉを加え、
３７℃で４〜５時間振どう培養し、宿主菌を溶菌させた
。　溶菌液を４℃、３，０００　ｒ　ｐ　ｍで１０分間
遠心し、上滑を別のチューブに移した。　この上清にＤ
ＥＡＥ−ＬＢ懸濁液（ＤＥ５２：ＬＢ培地円１：２、Ｌ
Ｂ培地：１０ｇ／ｊ！トリプトン、５ｇ／Ｉｔ酵母エキ
ス及び５ｇ／Ｉｔ　　ＮａＣ１）１０ｍｌを加えて静か
に転倒しながら混合し、４℃、３．００Ｏｒ　ｐ　ｍ　
　で１０分間遠心した。

上清を別のチューブに移し、１／１０量の３Ｍ酢酸ナト
リウム、３１５量のイソプロパツールを加えて混合し、
−２０℃で１．５時間放置した。　４℃、３，０００　
ｒ　ｐ　ｍで２０分間遠心し、上清を除去した。　沈澱
をＴＥ温溶液ｐＨ８，０）２ｍｆｌに懸濁し、プロテイ
ナーゼに５０μｇと、ＳＤＳを終濃度０．５％になるよ
う加え、３７℃で３０分間インキュベートした。　透明
になワた溶液をフェノール−クロロホルムで抽出したの
ち、２倍量のエタノールを加え、析出してきた糸状沈澱
物を４℃、３．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心して分離し
た。　沈　澱は、７０％エタノールで洗浄し、乾燥後、
４００μｍのＴＥ温溶液ｐＨ８，０）に溶解した。　再
び同様にフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈
澱を２回繰り返し、最終的に沈澱物を２０μＬのＴＥ温
溶液ｐＨ８゜０）に溶解した。　この溶液１μぶに２　
ｍ　ｇ　／　ｍ　ＩｔＢＳＡを１μｍ、１ｍｇ／ｍｊ２
　　ＲＮａｓｅＡを１μｍ、１０ＸＥｃｏＲＩｌｉ衝溶
液（０，５Ｍ　　ＮａＣｌ、１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７
，５）、７０ｍＭ　　Ｍ　ｇ　Ｃ１ｚ及び７０ｍＭ　　
β−メルカプトエタノール）を１μｍ、さらにＥｃｏＲ
Ｉを１単位加え反応液（全量１０μｆｔ）にして、３７
℃で１時間インキエベートした。

切断されたｃ　ＤＮＡ断片のサイズをアガロースゲル電
気泳動で解析した。　最長のｃ　ＤＮＡを含むクローン
はλＨＦＬＩ　Ｏであり、そのサイズは１．２ｋｂｐで
、Ｐ−４５０ＨＦＬａ遺伝子の全長はコードしていなか
った。

（実施例８） プローブの作製 得られた陽性クローンλ１（ＦＬＩＯに含まれるｃＤＮ
Ａ断片をニックトランスレージミーン法により放射標識
し、プローブを作製した。

ニックトランスレーションは市販のキット（日本ジーン
社）を用い、放射標識には［α−”Ｐ］　ｄＣＴＰ　（
３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を使用した。　方法はキッ
トに付随する指示書に従った。　得られたプローブの比
活性は１０８〜１０’ｃｐｍ／μｇであった。

（実施例９） ノーザンプロット解析 Ｐ−４５０ＨＦＬａ蛋白質の全長をコードするｃＤＮＡ
を取得するため、実施例８で作製したプローブを使用し
て再びＰ−４５０ＨＦＬａｍＲＮＡのスクリーニングを
行った。　実施例３と同様にして調製されたｍＲＮＡ画
分の１／２０量を含む処理液（４０ｍＭ　　ＭＯＰＳ（
ｐＨ７，０）、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ、２．２Ｍホルムアルデヒド及び５０％ホルムア
ミド）２０Ａｔｕを５５℃で１５分間加熱し、ｍＲＮＡ
を変性させた後、２μｍの５０％グリセリン、１ｍＭＥ
ＤＴＡ、０．４％ブロモフェノールブルー及び０．４％
キシレンシアツール混合液を加え、！５Ｖ／ｃｍの定電
圧で１％アガロースゲル電気泳動を行った。　泳動後、
ゲルを０．３Ｍクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７，０，
３ＭＮａＣ１含有）に１時間浸し、同溶液に浸しておい
たニトロセルロースフィルターをゲルに重ねｍＲＮＡを
トランスファーした。　フ　ィ　ルターを風乾後、８０
℃で２時間処理し、ｍＲＮＡを固定した。　ニトロセル
ロースフィルターを４５ｍＭクエン酸ナトリウム溶液（
０，４５Ｍ　　ＮａＣ１及び０．１％ＳＤＳ含有）に浸
したのち、シーリングバッグへ移しブレパイプリダイゼ
ーション溶液（７５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．７５
Ｍ　　ＮａＣ１，５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，
５）、５０％ホルムアミド、０．１％フィコール、０．
１％ポリビニルピロリドン、０．１％ＢＳＡ及び２５０
μｇ／ｍＪＺ変性サケ精巣ＤＮＡ）’中で４２℃、４時
間インキエベートした。　次いで上記のブレパイプリダ
イゼーション溶液に実施例８で調製したプローブＤＮＡ
　（加熱変性させて１本鎖にしたもの）を３，０００，
０００　ｃ　ｐ　ｍ　／　ｍ　１になるように加え４２
℃で一晩パイプリダイゼーションを行った。　フィルタ
ーをバッグから取り出し３０ｍＭクエン酸ナトリウム溶
液（０，３ＭＮａＣ１及び０．１％ＳＤＳ含有）で５５
℃、３０分間のインキユベーションを２回繰り返して非
特異的に吸着したプローブＤＮＡを除去した。　フィル
ターを風乾し、オートラジオグラフィーを実施し、Ｐ−
４５０ＨＦＬａのｍＲＮＡを最も多量に含む両分を決定
した。

（実施例１０） プローブによるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング 実施例９で決定したＰ−４５０ＨＦＬａｍＲＮＡ画分を
用いて実施例５と同一方法でｃＤＮＡライブラリーを作
製した。　得られたファージ組換え体を大腸菌Ｙｌ　０
９０に感染させ、少量の軟寒天（組成は実施例６と同様
）と混合して寒天層上に広げて３７℃で一晩培養しプラ
ークを形成した（１．５Ｘ１０’プラーク）、　寒天面
よりニトロセルロースフィルターに移したファージを風
乾後、まず０．５ＭＮａＯＨ（１，５Ｍ　　ＮａＣｆ含
有）に１分間浸し、次に０．５Ｍトリス−塩酸緩衝溶液
（ｐＨ８，０，１，５Ｍ　　ＮａＣ１含有）に５分間浸
して中和後、２ＸＳＳＰＥ溶液（１×５ＳＰＥ：０．１
８Ｍ　　ＮａＣ１，１０ｍＭＮ　ａ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４（Ｐ
　Ｈ７，４）及び１ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄した。　再び
風乾し、乾燥器に入れ８０℃、２時間加熱処理し、ＤＮ
Ａをフィルター上に固定した。

上記フィルターを０．１％ＢＳＡ、０．１％フィコール
４００．０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ＳＤ
Ｓ及び１１００ｊｊ／ｍｉ熱変性サケ精巣ＤＮＡ含有５
ｘｓｓｃ溶液（１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ　　ＮａＣ１及
び１５ｆｎＭクエン酸ナトリウム）に浸し′、６０℃、
４時間ブレパイプリダイゼーシ日ンを行フた。　さらに
同溶液に実施例８で得たプローブＤＮＡ　（約１０’ｃ
ｐｍ／ｍｊり及び１００μｇ／ｍＪＺ変性サケ精巣ＤＮ
Ａを添加した溶液にフィルターを浸し、６０℃で一晩パ
イプリダイゼーションを行った。　　フィルターを取り
出し２ＸＳＳＣ溶液（０，１％ＳＤＳ含有）で６０℃、
３０分間の洗浄を２回繰り返した。　乾燥後、オートラ
ジオグラフィーを行い陽性クローン２０個を得た。　こ
れらを実施例６の（３）に従フて単一なりローンに精製
した。　陽性クローンを実施例フと同様に処理し、電気
泳動により、挿入されたｃＤＮＡのサイズを解析した。

　その結果クローンλＨＦＬ３３が約２ｋｂｐのｃＤＮ
Ａ（３個のＥｃｏＲＩ断片に分かれた）を含むことが判
明した。

上記クローンλＨＦＬ３３のファージＤＮＡから、Ｐ−
４５０ＨＦＬａｃＤＮＡの全長（約２ｋｂｐ）を含む約
４．２ｋｂＰのＰ、ｕＩＩ−に、ｎＩ断片をとり出し、
これをプラスミドｐＵＣ１８のＳ、、Ｉ−に、ｎＩ部位
にサブクローニングし、プラスミドｐＵＣ１８λＨＦＬ
３３を得た。　　このプラスミドで大腸菌ＪＭＩＯＩ株
を形質転換した組換え体Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＪＭ１０１　
　（ＰＵＣ１８λＨＦＬ３３）は、本発明者により工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託［受託番号微工研条
寄第２２８９号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２２８９）、寄託
臼　平成元年２月１５日］されている。

（実施例１１） Ｐ−４５０ＨＦＬａ遺伝子のサブクローニング 実施例７に従って得られたλＨＦＬ３３ｃＤＮＡ断片（
３個のＥｃｏＲＩ断片）を各々ゲルよりＤＥＡＥイオン
交換メンブレンに回収し、ＴＥ温溶液ｔＭ　　ＮａＣ１
含有）で溶出した後、フェノール−クロロホルム抽出、
エタノール沈澱で回収した。　各ｃＤＮＡ断片を１０ｍ
Ｍ　　ＴＥ溶液５μｍに溶解し、プラスミドｐＵｃ１８
　（ＥｃｏＲＩで、消化後、アルカリホスファターゼ処
理済み）に結合した。　この組換えプラスミドを大腸菌
ＪＭＩＯＩに感染させ、Ｘ−ｇａＪ２３５／Ｊｇ／ｍｌ
！を含むＬＢ寒天培地（１，５％寒天を含むＬＢ培地）
にまき、３７℃で一晩培養した。　得られた白色コロニ
ーを培地１．５ｍＡに植え、３７℃、５時間振どう培養
した。　エツペンドルフチューブで１０．０ＯＯＸ　ｇ
、５分間遠心し、ベレットを５ｍｇ　／　ｍ　１２リゾ
チームを含む２５ｍＭ　　ＴＥ温溶液ｐＨ８，０，５０
ｍＭグルコース及び１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ含有）１００
μＪ２に懸濁させ、室温で５分間放置した。　続いて２
００μｍの０．２Ｎ　　ＮａＯＨ−１％ＳＤＳ溶液を加
え穏やかに混合し、水中で５分間放置した。　　５Ｍ酢
酸−３Ｍカリウム溶液（ｐＨ５，２）を１５０μｍ加え
さらに水中で５分間放置した後、４℃　１０，０ＯＯＸ
　ｇで５分間遠心した。　上清をフェノール−クロロホ
ルム処理後、エタノール沈澱した。　得られたプラスミ
ドＤＮＡはＴＥ温溶液ｐＨ８，０）に溶解後、終濃度２
５　μｇ　／　ｍ　ｉのＲＮａｓｅＡで処理し、再びフ
ェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈澱により純
粋なプラスミドＤＮＡ各々約３０μｇを得た。

（実施例１２） 制限酵素地図の作製と塩基配列の決定 まず実施例１１で精製されたプラスミドＤＮＡ（λ）ｉ
ＦＬ３３の３つのＥｃｏＲＩ断片をｐＵＣ１８にサブク
ローニングしたプラスミドをそのインサートのサイズに
応じて小さい方からｐＨＦＬ３３ｓｓ、ｐＨＦＬ３３ｓ
　、ｐＨＦＬ３３Ｉｔと命名した）及びλＨＦＬ３３の
インサートｃＤＮＡを用いて制限酵素地図を作製した。

　プラスミドＤＮＡ２μｇを用い、１μＡ（５〜１５単
位）の各種制限酵素で切断後、０．９％アガロースゲル
電気泳動を行いバンド数と移動度によりｃＤＮＡ中の制
限酵素部位を確認し、制限酵素地図を作製した。　λＨ
ＦＬ３３のインサートｃＤＮＡの制限酵素地図を第１図
に示す。

次に制限酵素地図に従い、ＤＮＡを切断し、Ｍ１３ｍｐ
１８及びＭ１３ｍｐ１９にサブクローニングした。　サ
ブクローニングした断片ならびにシーフェンシングの方
向を第１図に示した。　シーフェンシングはサンガーら
の方法［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１４３巻　１６１頁
　１９８０年］に従って以下の通り実施した。　すなわ
ちＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９の組換えプラス
ミドで大腸菌ＪＭＩＯＩを形買転換し、Ｈ寒天培地（１
０ｇ／ｌバク、トドリブトン、８ｇ７１１　　ＮａＣ１
及び１７ｇ／ｌ寒天）上に軟寒天培地（１０ｇ／ｊ！バ
タトトリブトン、Ｂ１１／１１　　ＮａＣ１及び８　ｇ
／ｊＱ寒天）２．５ｍＡ、１００ｍＭ　　ＩＰＴＧ　　
４０μｌＬ、２％Ｘ−ｇａλ４０μｍとともにまき、フ
ァージプラークを得た。　半透明プラークを取り、ＪＭ
ＩＯＩの一夜培養液を１／１００量含む２ＸＴＹ培地１
．５ｍｌに懸濁し、ファージを増殖させた。　５時間後
、遠心により菌体をのぞき、上清に２０％ポリエチレン
グリコール（２，５Ｍ　　ＮａＣ１含有）を加え室温で
１５分間放置し、ファージを抽出した。　遠心によりポ
リエチレングリコール除去後、ＴＥ溶液１００μｍに溶
解しフェノール処理した。　遠心後、水層に３Ｍ酢酸ナ
トリウム、エタノールを添加し、１本ｆｉＤＮＡを沈澱
させた。　減圧乾燥後３０μｍのＴＥ温溶液懸濁し、氷
上に放置した。

この１本ｇＲＤＮＡ７ｕｊ２Ｃ約５．ｕｇ）、Ｍ１３ブ
ライマー１μｍ（約１．５ｎｇ）、クレノク（Ｋｆｅｎ
ｏｗ）反応液１．５μｊ２及び１００ｍＭトリス−塩酸
＆１衝溶液（ｐＨ８，０，５０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２含有
）２．５μＪ２を混合することによりアニール化反応を
行いブライマー鋳型複合体を形成した。　アニール後、
この反応液に１μｍのクレノク（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグ
メント（１単位）と［”Ｓ］　ｄＡＴＰａＳ（１０Ｃｉ
／ｒｎｊ！、比放射活性は＞ａｏｏｃｉ／ｍｍｏｌ）１
．５μ℃を加えた。　　ここから２．５μＬずつ４本の
チューブに分取し、各々を８０μＭｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
及びｄＴＴＰ／８μＭｄｄＮＴＰ混合溶液２μｍに添加
し、３７℃、１５分間インキエベートした。

０、．５ｍＭｄＮＴＰ溶液を２μｍ加え、さらに３７℃
、１５分間チエイス反応を行った。　次いで停止溶液（
９５％脱イオンホルムアミド、２５ｍＭ　　ＥＤＴＡ　
（ｐＨ８，０）、０．１％ブロモフェノールブルー及び
０．１％キシレンシアツール）４μｍを加え反応を停止
した。

電気泳動を行い、オートラジオグラフィーによって塩基
配列を決定した。　その結果と、塩基配列がコードする
アミノ酸配列を第２図に示した。　クローンλＨＦＬ３
３のインサートｃＤＮＡは１９，７１ｂｐからなり、コ
ーディング領域は１５０９ｂｐであり、５０３アミノ酸
残基をコードすることが判明した。

〈発明の効果〉 本発明者らは、上述のごとくヒト胎児針に特異的に発現
しているＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白質の遺伝子配列及びそ
れに基づく当該蛋白質のアミノ酸配列を明らかにした。

　当該遺伝子は婦人科悪性腫瘍等のＤＮＡ診断に用い得
る。　また当該遺伝子を用いて遺伝子組換え法により本
発明のアミノ酸配列を有する蛋白質の大量入手が可能で
ある。　さらに本発明のアミノ酸配列の全部、または一
部を用いＰ−４５０ＨＦＬａに特異的な抗体の作製及び
当該抗体を用いた診断が可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図はＰ−４５０ＨＦＬａ　　ｃＤＮＡの制限酵素他
国及びシーフェンシングの方向を示す図である。 第２図はＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白質遺伝子の塩基配列及
びそれに基づくアミノ酸配列を示す図である。 Ｆ ■ （その 工 （その２） ＧＴＣ ＧＴＣＴＴＣＡＣＡ　　ＡＡＣＣＧＧ　　ＡＧＧ　　Ｃ
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Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト由来の他の蛋白質を実質的に含有しないこと
   を特徴とするチトクロームＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白質。
2. （２）組換え宿主細胞によって産生される請求項１記載
   のチトクロームＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白質。
3. （３）下記式［ I ］： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ……［ I ］ で表わされるアミノ酸配列の一部あるいは全部を含むこ
   とを特徴とするチトクロームＰ− ４５０ＨＦＬａ蛋白質。
4. （４）請求項１〜３のいずれかに記載のチトクロームＰ
   −４５０ＨＦＬａ蛋白質をコードすることを特徴とする
   新規ＤＮＡ配列。
5. （５）遺伝暗号の縮重に基づき少なくとも１個の塩基が
   置換されている又は置換されていない次式［II］： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ……［II］ で表わされるＤＮＡ配列の一部あるいは全部を含むこと
   を特徴とするＤＮＡ配列。
6. （６）請求項４または５に記載のＤＮＡ配列と相補的な
   ＤＮＡ配列。
7. （７）チトクロームＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白質をコード
   しているＤＮＡ配列を組換え宿主細胞に於いて発現させ
   ることを特徴とするチトクロームＰ−４５０ＨＦＬａ蛋
   白質の製造方 法。