JPH02200187A - チトクロームＰ―４５０ＨＦＬａ蛋白質、そのＤＮＡ配列およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は胎児肝及び婦人科悪性腫瘍に特異的に発現して
いるチトクロームＰ　−４５０ｈｕｍａｎｆｅｔａｌ目
ｖｅｒｓ　（以下Ｐ−４５０ＨＦＬａと略す）の遺伝子
及び当該遺伝子により産生したＰ−４５０ＨＦＬａに関
する。

〈従来技術とその問題点〉 チトクロームＰ−４５０はステロイド、脂肪酸、プロス
タグランジン、ビタミンＤ、など広範な生体内物質の代
謝、また、生体に進入する薬物や癌原物質等の生体外物
質の解毒化及び活性化作用を示す多機能酵素として一般
によく知られている。

チトクロームＰ−４５０に関しては種々の動物種におい
て幅広く研究が行われているが、特に担癌とチトクロー
ムＰ−４５０量の変動との相関は−１）ラットにＶｌａ
ｌｋｅｒ　ｃａｒｃｉｎｏｓａｒｃｏｍａ２５６　を皮
下移植すると肝ミクロソームＰ−４５０量や薬物代謝酵
素活性が移植部の成長にともなって減少する［ジャパニ
ーズ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー　Ｊａｐ、
　　Ｊ。

Ｐｈａｒｍａｃ、　１８　＠　　２２４頁　１９６８年
］、２）肝に移植した癌組織のすぐ周辺の正常組織では
Ｐ−４５０量が増加している、３）原発性肝癌は肝の正
常部位のＰ−４５０量を減少させないが、転移肝癌はＰ
−４５０量を減少させる［肝・胆・膵　１５巻　９３１
頁　１９８７年］等の報告があるが、必ずしも一定の傾
向を示していない。

本発明者等は、ヒト胎児にＰ−４５０が存在することを
５本酵素を部分精製することにより直接証明した［バイ
オケミカルファーマコロジー　　Ｂｌｏｃｈｅｓ、　　
Ｐｈａｒｍａｃ、　　２８　　巻　７９３　　頁１９７
９年］。

次いで本酵素を電気泳動的に均一にまで精製し、Ｐ−４
５０ＨＦＬａと命名した［アーカイブス　オブ　バイオ
ケミストリー　アンド　バイオフィジックス　Ａｒｃｈ
、　Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　Ｂｌｏｐｈｙｓ。

２４１　　＠　　２７５　　頁　１９８５年］。　　ま
た、Ｐ−４５０ＨＦＬａの精製標品のＮ末端アミノ酸配
列の一部を下記のように決定した。

ｘ　　　　ｘ　　　　ｘ　　　ＩＬＥＰＲＯ＾ＳＮ　　
ＬＥＤ　　ＡＬＡ　　ＶＡＬ　　ＧＬＵＭＥＴ　　ＡＬ
Ａ　　ＬＥＤ　　ＩＬＥ　　ＰＲＯＡＳＰ　　ＬＥｔｌ
　　ＡＬＡ　　ＭＥＴ　　ＧＬＩＩ表Ｉ　　Ｐ−４５０
ＨＦＬａとＰ−４５ＯＮＰのＮ末端アミノ酸配列の比較
（肝・胆・膵　１５壱　９３４　頁１９８７年） ただし、Ｘは特定し得なかったアミノ酸の存在を示す。

Ｐ−４５０ＨＦＬａのＮ末端アミノ酸配列は、グ、エン
ゲリッヒ（Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ）のＰ−４５０ｓｒの
それと似ていたが、異なっていた。

ヒト胎児肝由来であ°るＰ−４５０）ＩＦＬａは胎児肝
に主として局在し［バイオケミカル・アンド・バイオフ
ィジカル・、リサーチ・コミユニケーシヨンズ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

ＣｏｍＩＩｕｎ、　１３１巻　１１５４頁　１９８５年
］、デヒドロエピアンドロステロン３−硫酸エステルの
１６α水酸化活性をはじめ種々の活性を示すが、婦人科
悪性腫瘍、特に卵巣癌、子宮内膜癌ではその発現が著し
く増大し　ていた　［肝胆・膵　１５巻　９３１頁　１
９８７　　年］。

従ってＰ−４５０ＨＦＬａは癌診断のための腫瘍マーカ
ーとしての有用性が推定されていたが、Ｐ−４５０ＨＦ
Ｌａが胎児肝由来であることから、その取得には胎児肝
の数量的な限界、及び倫理面での困難性を抱えていた。

　そのため、Ｐ−４５０ＨＦＬａの組換えＤＮＡ技術を
用いた大量製造が渇望されていた。　また胎児肝より精
製したＰ−４５０ＨＦＬａを抗原として作製した抗Ｐ−
４５０ＨＦＬａ抗体は、類似構造を有するチトクローム
ｐ−４５０ｓｒと交叉反応性が認められ［肝・胆・膵　
１５＠　　９３１頁１９８７年］、Ｐ−４５０ＨＦＬａ
の特異的な抗体を作製するためにもＰ−４５０ＨＦＬａ
のアミノ酸配列の解明が望まれていた。

〈発明が解決しようとする課題〉 本発明の目的は、ヒト胎児計時異的Ｐ−４５０ＨＦＬａ
蛋白質の遺伝子及び遺伝子組換え技術により産生される
ヒト由来の他の蛋白質を実質的に含有しないＰ−４５０
ＨＦＬａ蛋白質を提供することにある。

く課題を解決するための手段〉 本発明者らはＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白質をコードする遺
伝子を単離し、当該遺伝子の塩基配列を決定し、それに
基づきＰ−４５０ＨＦＬａのアミノ酸配列を決定し、本
発明を完成した。

すなわち本発明＆よ、ヒト由来の他の蛋白質を実質的に
含有しないことを特徴とするチトクロームＰ−４５０Ｈ
ＦＬａ蛋白質を提供する。

ここで、組換え宿主細胞によって産生されるのが好まし
い。

本発明は、 Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｔｙｒ Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ ｐｒｏ　７ｈｒ　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｇ１３１ Ｍｅ、ｔ　Ｌｅｕ　Ａｌａ Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ 八ｌａ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｐ Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ ＾ｒｇ＾ｒｇ　Ｇｌｕ Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｖａｉ 下記式［Ｉ］ Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ Ｌｅｕ　Ｌｅｕ＾１ａ Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　ａｔｙ Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ ＩＩｅＴｙｒ　Ａｓｐ １１ｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ ＾ｓｒ＋　Ａｒｇ　Ａｒｇ Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ Ｈｌｓ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ ａｔｙ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｐｒ。

１ｕ Ｐｒ。

Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒ。

Ｖａｌ Ｇｌｙ １ｙ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｐｈｅ １ｅ Ａｒｇ Ｔｈｒ １１、ａ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒ。

Ａｓｎ Ｔｈｒ ＾「ｇ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ １ｅ Ｓｅｒ １ｅ Ａｓｎ Ｐｒ。

Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ １ｅ ）Ｉｔｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｐｒ。

１ｅ Ｓｅｒ Ｐｒ。

１ｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒ。

Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ １ｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｒ。

Ａｒｇ Ｓｅｒ ｌ５ Ｐｒ。

Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｕ ＾「ｇ Ｇｌｕ ＩＩｓ Ｐｈｅ Ｐｈｅ ＩＩｓ Ｌｅｕ ＾「ｇ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ ＩＩｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ ＩＩｓ １ｕ Ｐｒ。

Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ １ｕ Ｐｒ。

Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｒ。

ｌ５ Ｐｒ。

Ｔｙｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ １ｅ １ｅ Ｃｙｓ １ｅ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｔｈｒ ５ｐ Ｐｒ。

Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ ）ＩＩｓ Ａｓｐ ＩＩｓ Ａｌａ Ｔｙｒ １ｅ Ｖａｌ ｈｒ ｙｒ ＾ｓｐ ｈｅ ｙｓ ｈｅ ｓｎ ｙｓ Ｐｒ。

ｈｅ １ｅ ｈｅ ｌｕ ｒｇ ｅｒ ｙｓ Ｇｌ口 ｌｕ Ｉｅ ｉｎ ａｌ ｓｐ ｅｔ Ｐｒ。

ｙｓ １ｅ Ｐｒ。

ｙｓ ｈｅ ｅｕ ｈｒ ｅｕ ｌｙ ａｌ ｉｎ ＾１ａ ｅｒ ｈｒ ｙｒ ｌｎ ｅｕ ｈｒ ａｌ νａｌ ｙｓ Ｐｒ。

ｌｎ ｅｕ ａｌ ｈｒ ａｌ ｈｒ ＾ｒｇ ｓｐ ｓｎ ａｕ Ｉｅ ｈｒ ｌｕ ｙｓ Ｐｒ。

ａｌ ａｌ ｌａ ＾ｓｐ ｙｓ Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　Ｖａｔ　　Ｖａｌ　　Ｍｅｔ　　
ＩＩｓ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ｔｙｒ　　ＶａｌＬｅ
ｕ　　Ｈｌｓ　　Ｈｌｓ　　Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙ
ｓ　　Ｔｙｒ　　Ｔｒｐ　　Ｔｈｒ　　ＧｌｕＰｒｏ　
　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　
　Ｇｌｕ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｅ　　５ｅｒＬｙｓ　　Ｌ
ｙｓ　　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ｉ
ｌｅ　　Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　ＴｙｒＩＩｓ　　Ｔｙｒ
　　Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｙ　　Ｓａｒ
　　Ｇｌｙ　　Ｐｒｏ　　＾「８Ａｓｎ　　Ｃｙｓ　　
ＩＩｓ　　Ｇｌｙ　　Ｍｅｔ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｅ　　
Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｌ＾ｓｎ　　Ｍｅｔ　　Ｌｙ
ｓ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　Ａｒ
ｇ　　Ｖａｌ　　ＬｅｕＧｌｎ　　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ　
　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｃｙｓ　
　Ｌｙｓ　　ＧｌｕＴｈｒ　　Ｇｉｎ　　ｌｉｅ　　Ｐ
ｒｏ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　Ｐ
ｈｅ　　ＧｌｙＧｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ
　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　ＩＩｓ
　　ＶａｌＬｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　ａｔｕ　　
Ｓｅｒ　　Ａｒｇ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　
ＶａｌＳｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　・・・・・・　
［Ｉ　］で表わされるアミノ酸配列の一部あるいは全部
を含むことを特徴とするチトクロームＰ−４５０ＨＦＬ
ａ蛋白質を提供する。

また、本発明は、チトクロームＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白
質をコードすることを特徴とする新規ＤＮＡ配列を提供
する。

遺伝暗号の縮重に基づき少なくとも１個の塩基が置換さ
れている又は置換されていない次式［１１］： ％式％ ： ］ 含むことを特徴 る。

ざらにチトクロームＰ−４ 質をコードするＤＮＡ配列ま で表わされるＤＮＡ配列の 相補的なＤＮＡ配列を提供す また、チトクロームＰ−４ Ａ配列の一部あるいは全部を とするＤＮＡ配列を提供す Ａ丁Ｇ　　ＡＴＴ　　ＣＣＡ　　ＡＧＣＴＡＴ　　ＧＴ
丁ＣＣＡ　　ＡＡＧ　　ＴＡＧ　　ＴＧＧ　　ＡＣＡ　
　ＧＡＧＣＴＣＣＣＴ　　Ｇ＾＾　ＡＧＣＴＴＣＡＧＴ
ＧＡＣ＾＾ＣＡＴＡ　　ＧＡＴ　　ＣＣＴ　　ＴＡＣＴ
ＴＴ　　ＧＧＡ　　ＡＧＴ　　ＧＧＡ　　ＣＣＣＡＧＡ
＾ＴＧ　　ＡＧＧ　　丁ＴＴ　　ＧＣＴ　　ＣＴＣＧＴ
ＧＧＣＴ　　ＣＴＡ　　ＧＴＣＡＧＡ　　ＧＴＣＣＴ丁
ＴＴＣ＾＾＾　ＣＣＴ　　ＴＧＴ　　＾＾Ａ　　ＧＡＡ
ＣＴＧ　　＾＾＾　ＴＴＡ　　ＣＧＣＴＴＴ　　ＧＧ＾
＾ＧＡ　　ＧＡ＾　＾ＡＡ　　ＣＣＣＡＴＴ　　ＧＴＴ
ＴＣＡ　　ＡＧＧ　　ＧＡＴ　　ＧＡＧ　　ＡＣＣＧＴ
＾５０ＨＦＬａ蛋白 たは上記［１■］式 部あるいは全部と る。

５０ＨＦＬａ蛋白 質をコードしているＤＮＡ配列を組換え宿主細胞に於い
て発現させることを特徴とするチトクロームＰ−４５０
ＨＦＬａ蛋白質の製造方法を提供する。

以下、本発明の詳細な説明する。

天然のＰ−４５０ＨＦＬａは医学的事情により摘出され
た胎児、あるいは死産児の肝より得ることができる。　
摘出された肝は直ちに液体窒素中で凍結され、さらに使
用直前まで一８０℃で凍結保存される。

Ｐ−４５０ＨＦＬａの特製方法は以下の通りである。　
胎児肝を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ７，２
５，１，１５％ＫＣＩ。

１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　　ＤＴＴ及び０．４ｍＭ
フェニルメチルスルホニルフルオライド含有）でホモジ
ナイズし、１０５，０００　ｘ　ｇで１時間遠心し、Ｐ
−４５０ＨＦＬａ含有画分を沈澱として得る。　この沈
澱を洗浄後再度遠心分離し、コール酸を含むリン酸カリ
ウム緩衝溶液にて可溶化し、ω−アミノオクチルセファ
ローズ４Ｂカラムクロマトグラフイーを行う、　次いで
活性画分を透析し、さらにＦ　Ｐ　ＬＣ（Ｍｏｎｏ　Ｓ
またはヒドロキシアパタイトカラム）で精製する。　　
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＯＳ−ＰＡＧＥ）によって、単一バンドを示す
画分をＰＭ３０メンブランフィルタ−で濃縮することに
より、Ｐ−４５０！（Ｆ　Ｌ　ａを得ることができる。

また抗Ｐ−４５０ＨＦＬａ抗体は上記方法によって精製
したＰ−４５０ＨＦＬａを既知の方法でウサギ等の適当
な動物に感作することにより得ることができる。

胎児肝からの全ＲＮＡの抽出は一般的なグアニジンチオ
シアネート法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅａｐ、　　２５４巻　９３３５頁　１９７９年］
により行う。　胎児肝をグアニジンチオシアネート処理
し、ＣｓＣ１密度勾配遠心を行うことによって全ＲＮＡ
を得た後、オリゴ（ｄＴ）−セルロースや、ポリローセ
ファロース等を用いたアフィニティーカラムクロマトグ
ラフィー　あるいはバッチ法によりポリ（Ａ”　　）Ｒ
ＮＡ（ｍＲＮＡ）を得ることができる。　　ま　たｍＲ
ＮＡの調製は一般的な他の方法、例えばバナジウム複合
体等を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界
面活性剤処理、フェノール処理を行ってもよい。　得ら
れたポリ（Ａ”　）ＲＮＡはｆＱｍＭ）リスー塩酸緩ｆ
？溶液（ｐＨ７，５，１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ及び０．２
％ＳＤＳ含有）中で５−２５％のショ糖密度勾配遠心法
により分画を行う。

Ｐ−４５０ＨＦＬａ蛋白質のｍ　ＲＮ　Ａ含有画分を決
定するには、各ｍＲＮＡ画分を１ｎｖｌｔｒｏでタンパ
ク質に翻訳させ、生理活性を調べるか、あるいは抗Ｐ−
４５０ＨＦＬａ抗体を用いてそのタンパク質を同定する
等の方法で実施できる。

ｍＲＮＡのＩｎ　　ｖｌｔｒｏでの翻訳は［３Ｓｓｌメ
゛チオニン存在下、ウサギ網状赤血球ライゼート無細胞
系で実施される。　これ以外にもアプリカッメガエルの
卵母細胞にｍＲＮＡを注入して翻訳するか、あるいは小
麦胚芽系を利用した翻訳であってもよい、　翻訳生成物
と先に述べた方法で作製した抗Ｐ−４５，０ＨＦＬａ抗
体とを結合させ、免疫沈澱−法等により、目的とするｍ
ＲＮＡ画分を確認する。

前述のごとき方法で得たｍＲＮＡを鋳型にして一般的な
方法を用いて２木鎮ｃ　ＤＮＡの合成、ベクターへのク
ローニング、さらに大腸菌等の形質転換によりｃＤＮＡ
ライブラリーを得ることができる。　例えばｍＲＮＡか
らの２木鎮ｃ　ＤＮＡの合成は、逆転写酵素及びＤＮＡ
ポリメラーゼｌを用いた既知の方法により実施できる。

　合成した２木鎮ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡはＥｃｏＲＩメチラー
ゼでメチル化し、ＥｃｏＲＩリンカ−を結合させ、適当
なベクターにクローニングするか、あるいはｄＣテーリ
ングした２本ｔｉｃＤＮＡをｄＧテーリングした適当な
ベクターにクローニングする。　ここで用いるベクター
は、ｐＢＲ３２２等のようなプラスミド型ベクターや、
λｇｔｌｏ、λｇｔｌ　１のようなファージベクターが
好ましい。

ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは発現ベクター
を用いた場合、ヤングとデービスの方法【プロシーデイ
ンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンス・オブ・ニーニスニー　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、＾ｃａｄ、　Ｓｃ１．　ｌｌ５Ａ８０巻　１１９４頁
　１９８３年］に従い発現させ、抗Ｐ−４５０ＨＦＬａ
抗体でスクリーニングすることができる。　免疫複合体
の検出は市販のヤギ抗ウサギＩｇＧと、ペルオキシダー
ゼ結合ウサギＩｇＧを用いることにより実施される。

陽性クローンの同定はこの他、当該蛋白質のアミノ酸配
列をもとに合成したオリゴヌクレオチドプローブを用い
たコロニーあるいはブラークハイプリダイゼーシｉン法
を用いてもよい。

陽性クローンのｃＤＮＡインサートをアガロースゲル電
気泳動で解析し、得られたｃＤＮＡ断片がＰ−４５０Ｈ
ＦＬａ蛋白質の全長をコードしていない場合にはこのｃ
ＤＮＡ断片なニックトランスレーション法により放射標
識して、プローブを作製し、ｃＤＮＡライブラリーを再
度スクリーニングする。　その際、このプローブを用い
てノーザンブロッティングによりＰ−４５０ＨＦＬａを
コードするｍＲＮＡを豊富に含有するｍＲＮＡ画分を決
定しその画分を用い再度ｃＤＮＡライブラリーを作製し
、これをスクリーニングしてもよい。

得られたｃＤＮＡをファージベクターＭ１３ｍｐシリー
ズにサブクローニングし、１末鎖ｃＤＮＡをとりだし、
ジデオキシチェーンターミネーション法により塩基配列
（ＤＮＡ配列）を決定する。

決定されたＤＮＡ配列は、下記［１１］式のものが例示
される。

ＡＴＣＧＡＴ　　ＣＴＣＡＴＣＣＣＡ　　ＡＡＣＴＴＧ
　　ＧＣＣＧＴＧ　　Ｇへへ＾ＣＣＴＧＧ　　ＣＴＴ　
　ＧＴＣＣＴＧ　　ＧＣＴ　　ＧＴＣＡＧＯＣＴＧ　　
礁Ｔ＾ＣＴＣＣＴＣＴＡＴ　ＣＴＡ　ＴＡＴ　ＧＧ＾＾
ＣＣＣＧＴ　ＡＣＡ　ＣＡＴＧＧＡ　ＣＴＴ　ＴＴＴ　
ＡＡＧ＾＾Ｇ　ＣＴＴ　ＧＧ＾＾ＴＴ　ＣＣＡ　ＧＧＧ
ＣＣＣＡＣＡ　ＣＣＴ　ＣＴＧ　ＣＣＴ　ＴＴＴ　ＴＴ
Ｇ　ＧＧＡ　ＡＡＴ　ＧＣＴＴＴＧ　　ＴＣＣＴＴＣ ＧＡＣＡＴＧ　　Ｇ＾＾ ＧＴＣＴＧＧ　　ＧＧＴ 八ＴＧ　　ＣＴＧ　　ＧＣＴ ＡＡＡ　　ＡＣＡ　　ＧＴＧ ＧＴＣＴＴＣＡＣＡ ＧＴＧ　　ＧＧＡ　　ＴＴＴ ＧＣＴ　　ＧＡＧ　　ＧＡＴ ＴＣＡ　　ＴＴＧ　　ＣＴＧ ＡＡＡ　　ＣＴＣＡＡＧ ＣＡＧ　　ＴＡＴ　　ＧＧＡ ＡＧＧ　　ＣＧＧ　　ＣＡＡ ＡＣＣＴＴＧ　　ＡＡＡ ＡＴＧ　　ＧＡＴ　　ＧＴＧ ＧＴＧ　　ＡＧＣＡＴＣ ＧＡＣＣＣＣＴＴＴ Ｔ丁Ａ　　ＡＧＡ　　ＴＴＴ ＣＴＣＴＣＡ　ＡＴＡ ＣＣＡ　ＡＴＴ　　ＣＴＴ ＴＴＴ　　ＣＣＡ　　ＡＧＡ ＣＧＴ　　ＡＡＧ　　ＧＧＣ ＴＧＴ　　ＴＡＴ　　＾＾＾ ＡＴＴ　　ＴＡＴ　　ＧＡＣ ＡＴＣＡＣＡ　　ＧＡＴ ＣＴＡ　　ＧＴＧ　　ＡＡＡ ＡＡＣＣＧＧ　　ＡＧＧ ＡＴＣＡＡＡ　ＡＡＴ Ｇ＾＾　Ｇ＾＾　ＴＧＧ ＴＣＴ　　ＣＣＡ　　ＡＣＡ ＧＡＧ　　ＡＴＧ　　ＧＴＣ ＧＡＴ　　ＧＴＧ　　ＴＴＧ ＧＣＡ　　ＧＡＧ　　ＡＣＡ ＧＡＧ　　ＧＴＣＴＴＴ ＡＴＣＡＣＴ　　ＡＧＯ ＧＡＣＴＣＴ　　ＣＴＣ ＧＴＧ　　Ｇ＾＾　ＡＡＣ ＡＡＴ　　ＣＣＡ　　ＴＴ＾ ＡＡＡ　ＧＴＣＣＴＴ Ｇ＾＾　ＧＣＡ　　ＴＴ＾ ＡＡＡ　　ＧＴＴ　　ＡＴＡ ＴＡＴ　　ＴＧＧ　　ＡＣＧ ＡＡＧ　　ＴＡＴ　　ＡＣＡ ＴＧＴ　　ＣＡＡ　　ＣＡＧ ＣＣＣＧＡＣＡＴＧ Ｇ＾＾　ＴＧＴ　　ＴＡＴ ＣＣＴ　　ＴＴＣＧＧＧ ＧＣＣＡＴＣＴＣＴ ＡＡＣＡＧＡ　　ＡＴＡ ＴＴＣＡＣＣＡＧＣ にＣＣＴ　　ＡＴＣＡＴＴ ＧＴＧ　　ＡＣＡ　ＡＡＴ ＧＧＣＡＡＧ　　ＣＣＴ ＧＧＧ　　ＧＣＣＴＡＣ ＡＣＡ　　ＴＣＡ　　ＴＴＴ ＡＡＣＡＡＴ　　ＣＣＡ ＡＣＣＡＡＧ　ＡＡＧ ＧＡＴ　　ＣＣＡ　　ＴＴＣ ＣＣＡ　　ＴＴＣＣＴＴ ＡＡＴ　　ＡＴＣＡＣ′ｃ ＡＣＴ　　ＴＴＴ　　ＣＴＡ ＣＴＴ ＡＡＡ ＣＣＴ ＡＴＣ 丁ＣＴ ＣＣＡ ＡＴＡ ＣＣＡ ＣＧＡ ＣＣＣ ＧＴＣ ＧＴＣ ＡＣＣ ＣＧＡ ＣＡＡ ＣＴＴ ＣＴＴ ＡＣＣ ＧＴＣ ＡＣＡ ＡＡＡ　ＴＣＴ　　ＣＴＡ ＣＴＣＡＡＡ　　ＧＡＧ ＴＴＣＣＴＴ　　ＣＡＧ ＴＣＡ　ＡＡＡ　６＾Ｃ ＴＣＴ　　ＧＡＴ　　ＣＴＧ ＡＴＣＴＴＴ　　ＡＴＴ ＡＣＣＡＧＴ　　ＧＴＴ ＣＴＧ　　ＧＣＣＡＣＴ ＧＴＧ　　ＣＡＧ　　ＡＡＧ ＡＡＴ　　ＡＡＧ　　ＣＣＡ ＣＴＡ　　ＧＡＧ　　ＴＴＧ ＾＾ＴＧ＾＾　ＡＣＡ ＡＴＧ　　ＡＧＡ　　ＣＴＴ ＧＴＴ　　Ｇ＾＾　ＡＴＣ ＧＧＧ　　ＧＴＧ　　ＧＴＧ ＣＴＴ　　ＣＡＴ　　にＣＡＴ ＣＣＴ　　ＧＡＧ　　ＡＡＧ ＾＾＾　ＡＡＧ　　ＡＡＣ ＡＴＡ　　ＴＡＧ　　ＡＣＡ ＡＡＣＴＧＣＡＴＴ ＡＡＡ　ＣＡＧ　　ＡＴＡ ＡＣＡ　　ＣＡＡ　ＡＡＧ ＣＴＧ　　ＡＴＧ　　ＡＴＴ ＴＣＴ　　ＧＡＣＡＣＣ ＧＡＧ　　ＣＴＣＡＴＧ ＴＴＴ　　ＧＣＴ　　ＧＧＣ ＣＴＣＴＣＣＴＴＣ ＣＡＣＣＣＴ　　ＧＡＴ ＣＡＡ　ＡＴＴ　　ＧＡＴ ＣＣＡ　　ＣＣＣＡＣＣ ＧＡＧ　　ＴＡＴ　　ＣＴＴ ＣＴＣＡＧＡ　　ＴＴ＾ ＧＡＧ　　ＡＧＧ　　ＧＴＣ ＡＡＴ　　ＧＧＧ　　ＡＴＧ ＧＴＧ　　ＡＴＧ　　ＡＴＴ ＧＡＣＣＧＡ　　ＡＡＧ ＴＴＣＣＴＣＣＣＴ ＡＡＧ　　ＧＡＣＡＡＣ ＣＣＣＴＴＴ　　ＣＧＡ ＧＧＣＡＴＧ　　八６Ｇ ＾＾＾　Ｇ＾＾　ＧＧＴ ＣＡＣＣＧＡ　　ＧＴＧ ＧＡＣＴＣＴ　　ＣＡＧ ＣＡＣ＾＾＾　ＧＣＴ ＧＣＣＣＡＡ　　ＴＣＡ ＴＡＴ　　Ｇ＾＾　ＡＣＣ ＡＴＴ　　ＡＴＡ　　ＴＡＴ ＧＴＣＣＡＧ　　ＣＡＧ ＡＣＡ　　ＧＴＴ　　ＴＴ＾ ＴＡＴ　　ＧＡＴ　　ＡＣＴ ＧＡＣＡＴＧ　　ＧＴＧ ＴＴＣＣＣＡ　　ＧＴＴ ＴＧＣＡＡＡ　　ＡＡＡ 丁ＴＴ　　ＡＴＴ　　ＣＣ（： （：ＣＡ　　ＡＧＣＴＡＴ 丁＾ＣＴＧＧ　　ＡＣＡ Ｇ＾＾　ＡＣＧ　　ＴＴＣ ＡＴＡ　　ＧＡＴ　　ＣＣＴ ＡＣＴ　　ＣＧＡ　ＣＣＣ ＴＴＴ　　ＧＣＴ　　ＣＴＣ ＡＣＣ ＣＡＴ ＡＡＴ ＧＴＣ ＡＴＴ ＡＣＣ ＣＡＡ ＡＡＡ ＣＣＣ ＧＴＣ ＧＴＣ ＣＣＴ ＣＡＴ ＾＾＾ ＣＴＴ ＧＡＣ ＡＣＴ ＴＡＣ ＡＧＡ ＴＧ ＾＾ＣＡＴＧ　　＾＾＾　ＣＴＴ　　ＧＣＴ　　ＣＴＡ
　　ＧＴＩＩ：　　ＡＧＡ　　ＧＴＣＣＴＴＣＡＧ　＾
＾ＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣ＾＾八　ＣにＴ　　ＴＧＴ　　
ＡＡＡ　　ＧＡ＾＾ＣＡ　　ＣＡＧ　　ＡＴＣＣＣＣＣ
ＴＧ　　ＡＡＡ　　ＴＴＡ　　ＣＧＣＴＴＴ　　ＧＧＡ
ＧＧＡ　　ＣＴＴ　　ＣＴＴ　　ＣＴＡ　　ＡＣＡ　　
ＧＡＡ　　ＡＡＡ　　ＣＣＣＡＴＴ　　ＧＴＴＣＴＡ　
　八ＡＧ　　ＧＣＴ　　ＧＡＧ　　ＴＣＡ　　ＡＧＧ　
　ＧＡＴ　　ＧＡＧ　　ＡＣＣＧＴ八へへＴ　　ＧＧＡ
　　ＧＣＣＴＧＡ　　−・−・・−［Ｈ］本発明のＤＮ
Ａ配列は、上記［１１１式で表わされるＤＮＡ配列の一
部であってもよいし、全部であってもよい、　また、上
記［１１］式で示されるＤＮＡ配列を一部に含むもので
あってもよい。

本発明のＤＮＡ配列は、前述のようにｍＲＮＡを鋳型に
合成してもよいし、有機合成化学的に合成してもよい。

遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産される蛋白質の
アミノ酸配列を変えることなくその遺伝子のＤＮＡ配列
の少なくとも１つの塩基を他の種類の塩基に置換するこ
とができる。

従って、本発明のＤＮＡ配列はまた、遺伝暗号の縮重に
基づく置換によって変化された塩基配列を含有すること
も可能である。　こ　の場合、置換により得られたＤＮ
Ａ配列から演絆されるアミノ酸配列は後に式［１］で示
すアミノ酸配列と一致する。

本発明によれば、上記ＤＮＡと相補的なＤＮＡもまた提
供される。　本発明によれば、上記ＤＮＡとそれに相補
的なＤＮＡが互いに相補的に結合して２本ｉ１　Ｄ　Ｎ
　Ａを形成していてもよい。

上記［ＩＩ　］式で示されるＤＮＡ配列から推定される
アミノ酸配列は下記［Ｉ］式で示される。

Ｍｅｔ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　　Ｐｒｏ　　
Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ｖａｌ　　ＧｌｕＴｈ
ｒ　　Ｔｒｐ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ａｌ
ａ　　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｌａｕ　　１ｉｅＬｅｕ　
　Ｌｅｕ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｙ　
　Ｔｈｒ　　Ａｒｇ　　Ｔｈｒ　　ＨｌｓＧｌｙ　　Ｌ
ｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｇ
ｌｙ　　Ｉｌｅ　　Ｐｒｏ　　ＧｌｙＰｒｏ　Ｔｈｒ　
Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａ
ｓｎ　ＡｌａＬｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　　Ａｒｇ　
　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｔｙｒ　　Ｔｒｐ　　Ｔｈｒ　
　Ｐｈｅ＾ｓｐ　　Ｍｅｔ　　Ｇｌｕ　　Ｃｙｓ　　Ｔ
ｙｒ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｔｙｒ　　Ａｒｇ　　Ｌ
ｙｓＶａｌ　　Ｔｒｐ　　Ｇｌｙ　　ｆｉｇ　　Ｔｙｒ
　　Ａｓｐ　　Ｃｙｓ　　Ｇｉｎ　　Ｇｉｎ　　Ｐｒ。

Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｖａｌ Ｖａｌ　　Ｐｈｅ　　丁ｈｒ Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｐ Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ ＬＶＳ　　Ｌａｕ　　Ｌｙｓ Ｇｌｎ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｙ Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｕ Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ Ｍｅｔ　　Ａｓｐ　　Ｖａｌ Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈａ Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｅ Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　ｌ１ｅ Ｐｒｏ　　Ｉｌｅ　　Ｌａｕ Ｐｈｅ　　Ｐｒｏ　　Ａｒｇ Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｔ Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　ＧＩｎ １１ｅ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　Ｌｙｓ Ａｓｎ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ Ｍｅｔ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｎ Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｔｒｐ Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ Ｇｌｕ　　Ｍｅｔ　　Ｖａｌ Ａｇ３　　Ｖａｔ　　Ｌｅｕ Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ Ｉｓ　　Ｖａｔ　　Ｐｈｅ １１ｅ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ Ｖａｌ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ Ａｓｎ　　Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ Ｌｙｓ　　Ｖａｌ　　Ｐｈｅ Ｇｌｕ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ Ｌｙｓ　Ｖａｌ目ｅ Ｌｙｓ　　Ｇｌｎ　　ｌｌ５ Ｔｈｒ　　Ｇｉｎ　　Ｌｙｓ Ｌｅｕ　　Ｍｅｔ　　１ｉｅ Ｐｒｏ　　Ａｓｐ　　Ｍｅｔ Ｇｌｕ　　Ｃｙｓ　　Ｔｙｒ Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　ＧＩｙ Ａｌａ　　Ｉｌｅ　　５ｅｒ Ｌｙｓ　　Ａｒｇ　　ＩＩｅ Ｐｈｅ　　Ｔｈｒ　　５ｅｒ Ｐｒｏ　　Ｉｌｅ　　Ｔｉｅ Ｖａｌ　　Ａｒｇ　　Ａｓｎ Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　Ｔｙｒ Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ Ａｓｎ　　Ａｓｎ　　Ｐｒ。

Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ Ａｓｎ　　Ｉｌｅ　　Ｔｈｒ Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　ｅｉｙ Ｈｉｓ　　Ａｒｇ　　Ｖａｔ Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｇｉｎ １ｅ Ｓｅｒ Ｐｒ。

１ｅ Ａｒｇ ＧＩｙ Ａｌａ Ｌａｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ ｅｉｙ ＧＩｎ Ｌａｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　Ａｇ３ Ｓｅｒ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ １１ｅ　　Ｐｈｅ　　ｌｌ５ Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ Ｖａｌ　　Ｇｉｎ　　Ｌｙｓ Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ Ｌｅｕ　　Ｇｉｎ　　Ｌｅｕ Ａｓｎ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ Ｍｅｔ　　Ａｒｇ　　Ｌｅｕ Ｖａｌ　　Ｇｌｕ　　ＩＩｅ Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ Ｌｅｕ　　Ｈｉｓ　　Ｈｉｓ Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ ＬｙＳ　　ＩＪＳ　　Ａｓｎ １１ｅ　　Ｔｙｒ　　Ｔｈｒ Ａｓｎ　　Ｃｙｓ　　ｆｌｅ Ａｓｎ　　Ｍｅｔ　　Ｌｙｓ Ｇｉｎ　　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ Ｔｈｒ　　Ｇｌｎ　　ｌｌ５ Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｍｅｔ Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ Ｈｉｓ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｐ Ｇｌｕ　　Ｉｌｅ　　Ａｓｐ Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ Ｇｌｕ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　Ｌｅｕ Ｇｌｕ　　Ａｒｇ　　Ｖａｌ Ａｓｎ　　Ｇｌｙ　　Ｍｅｔ Ｖａｌ　　Ｍｅｔ　　Ｉｌａ Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｙ Ｇｌｙ　　Ｍｅｔ　　Ａｒｇ Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ Ｈｉｓ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ Ａｌａ　　Ｇｉｎ　　５ｅｒ Ｔｙｒ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ １１ｅ　　Ｉｌｅ　　Ｔｙｒ Ｖａｌ　　Ｇｉｎ　　Ｇｉｎ Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ Ｔｙｒ　　Ａｓｐ　　Ｔｈｒ Ａｓｐ　　Ｍｅｔ　　Ｖａｔ Ｐｈｅ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ Ｃｙｓ　　Ｌｙｓ　　１ｙｓ Ｐｈｅ　　Ｉｌｅ　　Ｐｒ。

Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ｔｙｒ Ｔｙｒ　　Ｔｒｐ　　Ｔｈｒ Ｇｌｕ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｅ ＩＩｓ　　Ａｓｐ　　Ｐｒ。

Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｐｒ。

Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ Ｖａｌ　　Ａｒｇ　　Ｖａｌ Ｐｒｏ　　Ｃｙｓ　　Ｌｙｓ Ｌａｕ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｅ Ｌａｕ １ｅ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｒ。

Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ ＾「８ Ｖａｌ Ｌａｕ Ｇｌｕ ＩＶ Ｇｌｙ　　Ｌａｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　
Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　ｌｉｅ　　ＶａｌＬｅ
ｕ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ａｒ
ｇ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　ＶａｌＳｅｒ　
　Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　＝　・・・　［Ｉ　］本発明の
チトクロームＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白質は、上記［Ｉ］
式で表わされるアミノ酸配列の一部であってもよいし、
全部であってもよいし、上記［Ｉ］式のアミノ酸配列を
一部に含むものであってもよい、　また、本発明のチト
クロームＰ−４５０１（ＦＬａ蛋白蛋白質Ｎ末端にＭｅ
ｔを含むものであってもよいし、Ｍｅｔを含まないもの
でもよい。

自然の変異によりまたは人工的変異により、主たる活性
に変化を与えることなく、ＤＮＡの構造及びそれから演
絆されるペプチドの構造の一部を変異せしめることが可
能である。　従って本発明のチトクロームＰ−４５０Ｈ
ＦＬａ蛋白質は前述のすべてのアミノ酸配列の相同変異
体に相当する構造を有する配列を含有することも可能で
ある。

本発明のＤＮＡ配列を複製可能な発現ベクターに連結し
て複製可能な組換え体ＤＮＡを得、この複製可能な組換
え体ＤＮＡで微生物または細胞を形質転換させて形質転
換体を形成せしめ、この形質転換体も当該微生物または
細胞の親細胞から選別し、この形質転換体を培養して、
当該形質転換体に該ＤＮＡ配列を発現させてチトクロー
ムＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白質を産生せしめ、この蛋白質
を培養した形質転換体から単離することによってヒト由
来の他の蛋白質を実質的に含有しないチトクロームＰ−
４５０ＨＦＬａ蛋白質を得ることができる。

このように組換え宿主細胞によって得られるチトクロー
ムＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白質は、大量製造が可能であり
、ヒト由来の他の蛋白質を実質的に含有しないのでＰ−
４５０ＨＦＬａの特異的な抗体を作製することができる
。

〈実施例〉 本発明を以下の実施例により具体的に示すが、本発明は
これらによって何等限定されるものではない。

（実施例１） ヒト胎児肝ホモジネートからのＰ−４５０ＨＦＬａの精
製 上田らの方法［アーカイブス・オブ・バイオケミストリ
ー・アンドｉバイオフィジックス＾ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２４１巻　２７５頁１９
８５年］に従い、以下の通り実施した。Ｐｉ製に使用し
た緩衝溶液の組成を次に示した。リン酸カリウム濃度は
、その都度示した。

バッフｙ−Ａ：１．１５％ＫＣＩ％　１ｍＭＤＴＴ、１
ｍＭ　　ＥＤＴＡ及び０．４ｍＭフェニルメチルスルホ
ニルフルオライド（ＰＭＳＦ）含有リン酸カリウムｍ衝
溶液（ｐＨ７，２バッファーＣ：２０％グリセロール、
１ｍＭＤＴＴ、１　ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．４ｍＭＰＭ
ＳＦ及び０．６％コール酸ナトリウム含有リす酸カリウ
ム＆ｌ衝溶液（ＰＨ７，２５）バッファーＣ：２０％グ
リセロール、０．　１ｍＭ　　ＤＴＴ及び０．２％エマ
ルゲン９１３含有リン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ６，５
）バッファーＣ：２０％グリセロール、０．１ｍＭ　　
ＤＴＴ及び０．２％エマルゲン９１３含有リン酸カリウ
ム緩衝溶液（ｐＨ７，４）−８０℃で凍結保存されてい
た２０〜２８週齢死産胎児の肝１０〜１５ｇを、使用時
に１０ｍＭバッフｙ−Ａｌ　００〜１５０ｍｊ！と共に
ホモジナイズした。　　１０５，０００　ｘ　ｇで１時
間遠心し、残置に同種バッファー２００〜３００ｍＩＬ
を再度加え、ホモジナイズ後、１０５．０００　ｘ　ｇ
で３０分間遠心した。　次いで残置を１００ｍＭバッフ
ァーＢ５００〜４５０ｍｊ！でホモジナイズし、１０５
，０００　Ｘ　ｇで１時間遠心した。　その上清を１０
０ｍＭバッファーＢで平衡化しておいたω−アミノオク
チルセファローズ４Ｂカラムにかけた。　　　１００ｍ
ＭバッファーＢでカラムを洗浄後、１００ｍＭリン酸カ
リウムバッファー（ｐＨ７，２５，２０％グリセロール
、１ｍＭ　　ＤＴＴ、０．１％コール酸ナトリウム及び
０．５％エマルゲン９１３含有）でＰ−４５０ＨＦＬａ
含有画分を溶出した。　この画分を２０％グリセロール
、０．２ｍＭ　　ＤＴＴ及び０．２％エマルゲン９１３
を含む１０ｍＭリン酸カリウムｍ衝溶液（ｐＨ６，５）
で透析した。

次いでＦＰＬＣシステムを用い、約１ｍｇ量の蛋白質を
１０ｍＭバッファーＣで平衡化されたＭｏｎｏ　　Ｓカ
ラムにかけ、１０ｍＭバッファーＣ５ｍＡでカラム洗浄
後、１０ｍＭバッファーＣを用いて作製されたＯ−３０
０ｍ０−３Ｏ０直線濃度勾配溶液（総量１５ｍＪ２、流
速１　ｍ１１１分）で溶出した。　　Ｐ−４５０ＨＦＬ
ａは４０５ｎｍの吸収でモニターした。　各両分の一部
を５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析後、Ｐ−４５０ＨＦＬａを含
む両分をプールした。

プールした画分１０ｔｎＪ２を直接１０ｍＭバッファ一
りで平衡化しておいたヒドロキシアパタイトカラム（９
Ｘ３０ｍｍ）にかけた、カラムは１０ｍＭバッファーＤ
ｚｏｍｎ（流速１ｍ１／分）で洗浄し、さらに５０ｍＭ
バッファ　−Ｄ　５　ｍ　Ｉｔで洗浄した。　　Ｐ−４
５０ＨＦＬａを５０−３００ｍＭリン酸カリウム溶液の
直線濃度勾配溶液（総量３０ｍＩｔ、流速１ｍａｔ／分
）で溶出した。５ＤＳ−ＰＡＧＥと４０５ｎｍの吸収で
Ｐ−４５０ＨＦＬａの存在を確認した後、ＰＨ３０メン
ブランフィルタ−を用いて濃縮した。

以上の方法により、ヒト胎児肝ホモジネートよりＰ−４
５０ＨＦＬａを単一に精製し、精製標品は５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥで分子量５１，０００を示した。

（実施例２） 抗Ｐ−４５０ＨＦＬａ抗体の作製 抗Ｐ−４５０ＨＦＬａ抗体は鎌滝らの方法［モレキュラ
ー・ファーマコロジー　Ｍｏｌ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　　１２巻　９２１頁　１９７６
年］に従い、実施例１で精製したＰ−４５０ＨＦＬａを
用いて抗血清として得た。

ニューシーラントラビット１羽に、１日目と８日目には
後足爪間と４カ所の筋肉中に、約０．１ｍｇの精製Ｐ−
４５０ＨＦＬａをフロイントの完全アジュバントと共に
注射し、さらに２１１日目はＰ−４５０ＨＦＬａを生理
食塩水に溶解し静注した。　その後８日目に耳より採血
し、常法に従って血清を分離した。　これを抗血清とし
て使用した。

（実施例３） ヒト胎児肝全ｍＲＮＡの抽出 全ＲＮＡの抽出はレイモンドらの方法 ［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー　
　Ｊ、　ＢＩｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　　２５４巻　９３３
５頁１９７９年］に従い実施した。　すなわち、まず−
８０℃で凍結保存された胎児肝約２ｇを２２ｍｌ１の４
Ｍグアニジンチオシアネート溶液（ＰＨ７，０，２５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム及び０．１Ｍβ−メルカプトエタ
ノール含有）中でポリトロン（キネマチイカ社）を用い
てホモジナイズし、２０℃、１２．０００ｘ　ｇ　テ１
０分間遠心した。　滅菌済みの遠心用チューブに５ｍＩ
Ｌの５．７Ｍ　　ＣｓＣ１溶液（ｐＨ７，０゜０．１Ｍ
　　ＥＤＴＡ含有）を分注し、その上に先の遠心後の上
清約２０ｍ１を重層した。

２０℃、８０．０００ｘ　ｇで２０時間遠心後、上層を
ピペットで静かに除き、遠心チューブをすばやく逆にし
てティッシュベーパー上に立て、しばらく放置した。　
沈澱に１０ｍＡの滅菌純水を加え、５５℃で数分間よく
混合し、ＲＮＡベレットを溶解した。　この溶液に１／
１ｏ量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５，２）と、２
．５倍量のエタノールを加えＲＮＡを沈澱させ、−２０
℃で一晩放置し、全ＲＮＡを得た。

全ＲＮＡの乾燥重量は１７．０ｍｇであった。

続いて全ＲＮＡよりアビブらの方法［プロシーデインゲ
ス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンス・オブ・二一エスニー　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、υＳＡ　６９巻＋４０８頁　１９７２
年〕に従い、オリゴｄＴセルロースカラムを用い、ｍＲ
ＮＡを分離した。　すなわち、オリゴｄＴセルロース樹
脂１ｇを２０ｍＭ）リス−塩酸緩衝溶液（ＰＨ７，５，
１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．５Ｍ　　ＮａＣ１及び０．１
％ＳＯＳ含有）に懸濁し、４ｍＪｌ容量のカラムをつく
り、カラムを同溶液で洗浄した。

上記ＲＮＡ３４０ＡｂＳ、２ｓｏ単位を０．５Ｍ　　Ｎ
ａＣ１及び０．１％ＳＤＳ含有ＴＥ溶液（１０ｍＭ　ト
！Ｊスー塩ａｌｌａｔ＊ｔ＆、　（ｐＨ７，５）及び１
ｍＭ　　ＥＤＴＡ）５０ｍＪＺに溶解し、熱変性後、カ
ラムに吸着させた。　吸着後のカラムを、同溶液で洗浄
した後、１０ｍｌ１゜のＴＥ温溶液０．０５％ＳＤＳ含
有）でポリ（Ａ”　）ＲＮＡを溶出した。　　１ｍＭの
３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）と２．５倍量のエタ
ノールを加え、ポリ（Ａ’　）ＲＮＡを沈澱させた。　
以上の操作により乾燥重量１．０ｍｇのポリ（Ａ”　）
ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）を得た。

得られたポリ（Ａ”　）ＲＮＡをさらにショ糖密度勾配
遠心法に従って分画した。　ショ糖溶液はＴＥ温溶液１
０ｍＭ　　ＥＤＴＡ及び０．２％ＳＤＳ含有）に５％あ
るいは２５％になるようショ糖を加えて調製した。　こ
の２種のショｌ！溶液を混合することにより５−２５％
のショ糖密度勾配を遠心用チューブに作り、ポリ（Ａ”
　）ＲＮＡ５００μｇを２００μｕの滅菌純水に溶解し
、６５℃、５分間加熱後急冷したものを重層した。　１
１０．０００　Ｘ　ｇで１５時間遠心した後、０．４ｍ
ｊ２ずつ分画し、エタノール沈澱によりｍＲＮＡを回収
した。　各画分に含まれるポリ（Ａ”　）ＲＮＡのサイ
ズはｒ、ＲＮＡを指標として決定した。

（実施例４） Ｐ−４５０ＨＦＬａ　　ｍＲＮＡ含有画分の決定 実施例３に従フて得られたｍＲＮＡを蛋白質に翻訳し、
これを実施例２で得られた抗Ｐ−４５０ＨＦＬａ血清で
スクリーニングした。

ｍＲＮＡ（各画分の１／２０量のｍＲＮＡ）の翻訳はウ
サギ網状赤血球ライゼート無細胞系（２５μＣｆ［”Ｓ
］メチオニン存在下）を用いて実施した。　反応操作は
、アマジャム社のプロトコール（全容量２５μｍ、３０
℃、９０分間反応）に従った。

翻訳後、反応液の１μｍを用い、１０％トリクロロ酢酸
不溶性画分に取り込まれた［ｆｆ１ｌｓ］の放射活性を
測定し、残りの反応液は抗Ｐ−４５０ＨＦＬａ血清によ
る免疫沈降反応に用いた。　すなわち、残りの反応液に
１０％５ＤＳ２５μａを加え、純水にて２５０μｍとし
、５分間煮沸後、１ｍＪｌの希釈溶液（１９０ｍＭ　　
ＮａＣ１，５０ｍＭ）−リス−塩酸（ｐＨ７，５）、６
ｍＭ　　ＥＤＴＡ及び２，５％トリトンｘ−１００）及
び抗Ｐ−４５０ＨＦＬａ血清２μｋを加え、室温で一晩
インキエベートした。

反応後１０，０ＯＯＸ　ｇで５分間遠心し、上清に純水
で膨潤させたプロティンＡ−セファロースを１０μｍ加
え、室温で２時間インキュベートした。　インキュベー
ション後、遠心によりプロティン−Ａセファロース樹脂
を沈め、１ｍ１の洗浄液（１５０ｍＭ　　ＮａＣ１，１
０ｍＭ）−リス−塩酸（ｐＨ７，５）、５ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡ。

０、　　　１　　　％　　ト　　リ　　ト　　ン　　Ｘ
−１００及　び　０　　、　　０　５　％５ＤＳ）で４
回洗浄した。　続いて２５μ℃の溶出液（６％ＳＯ３％
　０．２Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７，５）、５ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ及び２％ショ糖）を加え、５分間煮沸し、溶出液
中の放射活性を液体シンチレーシコンカウンターで測定
し、目的のｍＲＮＡ画分を決定した。

（実施例５） λファージｃＤＮＡライブラリーの構築実施例４により
決定されたＰ−４５０ＨＦＬａのｍＲＮＡを含む画分を
用いてガプラーとホフマンの方法［ジーン　Ｇｅｎｅ　
　２５巻　２６３頁１９８３年］に従いｃ　ＤＮＡを合
成した。

（１）１本ｉｉ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの合成熱変性させた約
１８μｓのｍＲＮＡを含む溶液２０μｌに１００ｍＭ水
酸化メチル水銀１μｍを加え、室温で１０分間放置した
後、７００ｍＭβ−メルカプトエタノール２μｋ及びリ
ボヌクレアーゼインヒビター１μｊ２（４０単位）を加
え、さらに室温で５分間放置した。

続いて以下の組成からなる溶液５０μｍを調製し、４２
℃、９０分間反応させ、１本ｉ、ｉ　ｃ　ＤＮＡを合成
した。　反応溶液中には２００μｇ／　ｍ　１オリゴ（
ｄＴ）＋ｓ、１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８，３）、
４０ｍＭ　　にＣ１，１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２、各２ｍ
Ｍ　　ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ　（４
μＣｉ［”Ｐ］ｄＣＴＰ）及び８００車位／ｍｆＬの逆
転写酵素を含む。　この反応溶液に終濃度２０ｍＭにな
るようＥＤＴＡを加え、反応を停止させた。

反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、２Ｍ酢酸
アンモニウム及びエタノールで高分子核酸を沈澱させた
。　放射活性の取り込みより計算すると、１末鎖ｃ　Ｄ
　Ｎ　Ａの合成量は、１．４７μｇであった。

（２）２末娘ｃＤＮＡの合成 （１）で得られた１末鎖ｃＤＮＡ全量を２０μｍの滅菌
純水に溶かした後、下記組成となるように反応液を調製
した。　すなわち、２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５
）、４ｍＭＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭ　　（ＮＨ４）２　５
０４１００ｍＭ　　ＫＣＩ、０．１５ｍＭβ−ＮＡＤ、
５０μｇ／ｍｆＬ　ＢＳＡ、各１ｍＭｄＡＴＰ％　ｄＧ
ＴＰ％　ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ（１０μＣｉ　［”Ｐ］　
ｄＣＴＰ）、８．５単位／ｍｌＬ　　Ｅ、ｃｏｌｌ　　
ＲＮａｓｅ　Ｈ，２３０単位／ｍｆＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ及び１０単位／　ｍ　ｆＬＥ、ｃｏｌｉ　　Ｄ　Ｎ　
Ａリガーゼである（総量１００μｆ）、　　１２℃で６
０分間、さらに　２５℃で６０分間反応し、終濃度２０
ｍＭになるようＥＤＴＡを加え反応を停止させた。　こ
の溶液を２回フェノール−クロロホルム処理した後、２
Ｍ酢酸アンモニウム及びエタノールで沈澱させ、未反応
の基質を除去した。　放射活性の取り込みより計算する
と、合成された２本ｌｉ　ｃ　ＤＮＡは１．８７μｇで
あった。

（３）Ｅ、ｃｏＲＩメチル化及びＥｃｏＲＩリンカ−の
付加 （２）で合成した２末鎖ｃＤＮＡ１．８７μｇをＴＥ温
溶液ｐＨ８，ｏ）２５μｍに溶解し、下記組成となるよ
うに調製した。　すなわち、５ｍＭ　　ＥＤＴＡ、２０
０μｇ／ｍｌ！ＢＳＡ、１００μＭＳ−アデノシルメチ
オニン及び２，０００車位／　ｍ　１１のＥｃｏＲＩメ
チラーゼである（総量５０μｊ２）、　　３７℃で３０
分間反応し、常法通りフェノール−クロロホルム抽出及
びエタノール沈澱した。

次に、得られたｃＤＮＡを滅菌純水に溶かし、１００ｍ
Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８，０）、１０ｍＭ　　ＭｇＣ１
ｚ、１ｍＭ　　ｄＮＴＰｓ（ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣ）
、０．５ｍＭ　　ＤＴＴ、２００μｇ／ｍＪ２　　ＢＳ
Ａ及び３００単位／ｍλ　Ｔ４　　ＤＮＡポリメラーゼ
となるように調製し、３７℃、３０分間インキエベート
した。　次いでライゲーションキット（宝酒造社）を用
いて１．５μｇのリン酸化ＥｃｏＲＩリンカ−と１６℃
で一晩反応させ、ＥｃｏＲＩリンカ−を付加した。　反
応後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈澱
を行った。

リンカ−付加ｃＤＮＡは５０μｍの反応溶液（５０ｍＭ
　　　　　　ＮａＣ１，１００ｍＭ　　　ト　　リ　　
ス　−　塩酸（ｐＨ７，５）、７ｍＭ　　ＭｇＣｌ２，
７ｍＭβ−メルかブトエタノール及び８００単位／ｍＩ
ＬのＥｃｏＲＩ含有）中で３７℃、４時間反応し、Ｅｃ
ｏＲＩ消化した。　フェノール−クロロホルム抽出、エ
タノール沈澱し、セファローズＣＬ−４Ｂでゲル濾過し
、５００ｂｐ以上の両分を集め、エタノール沈澱した。

　最終的に４５０ｎＨのリンカ−付加ｃＤＮＡを回収し
た。

（４）ｃＤＮＡのベクターへの導入 ＥｃｏＲＩで消化したλｇｔｌｌｌ　　μ　ｇに、２末
鎖ｃＤＮＡ５０ｎｇを加え、５０ｍＭ　　ＴＥ温溶液ｐ
Ｈ７，４１０ｍＭＭ　ｇ　Ｃ１ｘ　、１０　ｍ　Ｍ　　
Ｄ　Ｔ　Ｔ　、　　１　ｍ　Ｍ　　Ａ　ＴＰ、１００μ
ｇ／ｍ４２　　ＢＳＡ及び７５０単位Ｔ４リガーゼ含有
）１０μｍを加え、１６℃、６時間反応した。

（５）　ｉｎ　　ｖｉｔｒｏパッケージング（４）で得
られた組換えファージＤＮＡをインビトロパッケージン
グキット（プロメガ社）を用いて、プロメガ社の指示書
に従いパッケージングした。　すなわち、組換えファー
ジＤＮＡ溶液７．５μλを３７．５μｍのパッケージン
グエキストラクトに加え、２２℃、２時間インキュベー
トした。　同溶液に３７５μｍの希釈液（０，１Ｍ　　
ＮａＣ！、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８，０）及び１
０ｍＭＭｇ５Ｏ４）、さらにクロロホルム２０μｍを加
えて、４℃にて保存した。

（実施例６） 抗体によるＰ−４５０ＨＦＬａのｃ　ＤＮＡライブラリ
ーのスクリーニング ヤングとデービスの方法［プロシーデインゲス・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ
・ニーニスニーＰｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８０巻　
１１９４頁　１９８３年］を改良して以下の通り実施し
た。

（１）ファージプラークの形成 大腸菌Ｙｌ　０９０の一夜培養液（液体培地：１０ｇ／
Ｉｌトリプトン、５ｇ／Ｊ２酵母エキス、５ｇ／ＩＬ　
　ＮａＣ１２，５ｇ／ｌ１ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０及び２
ｇ／Ｉｔマルトース）３００μｍに実施例５で調製した
ファージ組換え体１０μｍを混合し、３７℃、２０分間
試験管中で感染させた。　次に寒天培地（１０ｇ　　／
　Ｊｌ　　ト　　リ　　ブ　　ト　　ン　、　　　５　
　　ｇ　　　／　　１２　　　　　　Ｎ　　　ａ　　　
Ｃ１。

２　、　５　ｇ　／　Ｉ　　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７　Ｈ
２０及び１５ｇ／ｕ寒天、滅菌処理後アンピシリン１０
０ｍｇ添加）上に上記混合物を、軟寒天培地（１０ｇ／
ｊ！トリプトン、５ｇ／ＪＩＮ　ａ　Ｃ１２、５８／　
Ｉｔ　　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４７Ｈ２０及び７ｇ／１１寒天
）７．５ｍｊ２と共に注ぎ込み、固化させた。　このプ
レートを４２℃、３．５時間インキュベートした後、１
０ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（Ｉ　ＰＴＧ）をしみこませたニトロセルロースフィル
ターを寒天上にのせ、さらに３７℃、３．５時間インキ
ュベートし、ファージプラークを形成させた。　以上の
操作により３ｘ１０５個のプラークが得られた。

（２）抗体によるスクリーニング （１）でインキュベートしたプレートを４℃で３０分間
放置し、発現融合蛋白を吸着したニトロセルロースフィ
ルターを剥した。　こ　のフィルターを３％ＢＳＡを含
むＴＳｉＳｉ液溶液０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５）
及び１５０ｍＭ　　ＮａＣ１）５０ｍｕで室温にて１時
間処理した。　次にフィルターを２〜３枚ずつビニール
バックに移し、−次抗体として抗Ｐ−４５０ＨＦＬａ抗
血清２０μｍを含むＴＳＵ衝溶液５ｍＪＺを入れ、室温
にて１時間処理した。　その後フィルターをＴＳＭ衝溶
液溶液回（各５分間ずつ）洗浄し未反応の抗体を除去し
た。　次にフィルターを新しいビニールバッグに０し、
二次抗体としてヤギ抗ウサギＩｇＧ（０、６ｍ　ｇ　／
　ｍ　Ｉｌ）　１０　μｊ２を、さらに三次抗体として
ペルオキシダーゼ結合ウサギＩｇＧ（１，５ｍｇ／ｍＡ
）１０μｍを加え各々−次抗体の際と同様にインキュベ
ートした。　フィルターを洗浄後、ＴＳｉ衝溶液溶液ｍ
ＩＬに酵素基質としてＨ２Ｏ２１０μｌを、発色指標と
して３．３°−ジアミノベンジジン４塩酸塩６ｍｇを添
加し、これにフィルターを数分間浸して発色させ、抗血
清と反応した陽性クローン２個を得た。

（３）プラークの精製 （２）で得られた陽性クローンのプラークを含む軟寒天
をパスツールピペットを用いて採取し、クロロホルムを
少量含むＳＭ培地（５，８ｇ／Ｉｔ　　ＮａＣ１，２ｇ
／Ｉｔ　　Ｍ　ｇ　Ｓ　０４７Ｈ，０，５０ｍＭ）リス
−塩酸（ｐＨ７，５）及び０．０１％ゼラチン）１ｍｍ
に懸濁した。　この懸濁液を４℃で３０分間放置し、フ
ァージを拡散させた。　次にこのファージ懸濁液を５Ｍ
培地で適宜希釈して（１）に準じファージプラークを形
成させ、（２）の方法でスクリーニングを繰り返し、単
一な陽性クローンを得た。　最終的に陽性プラークを５
Ｍ培地に懸濁し、精製ファージとした。

（実施例７） 陽性クローンの解析 大腸菌Ｙｌ　０８８の一夜培養液（液体培地：Ｙｌ　０
９０と同一組成の）１ｍｌｌに、実施例６の（３）で得
られたファージ懸濁液５０μｍを混合し、３７℃、２０
分間感染させた。　次いでＴ培地（ｌＯｇ／ＪＺトリプ
トン、２．５ｇ／ｉ　ＮａＣ１及び２　、　５　ｇ　／
　ｆｌ、　　Ｍ　ｇ　Ｓ　０４Ｈ，Ｏ）２５ｍｆを加え
、３７℃で４〜５時間振とう培養し、宿主菌を溶菌させ
た。　溶菌液を４℃、３．００Ｏｒ　ｐ　ｍで１０分間
遠心し、上清を別のチューブに穆した。　　この上清に
ＤＥＡＥ−ＬＢ懸濁液（ＤＥ５２：ＬＢ培地＝１：２、
ＬＢ培地：１０ｇ／Ａトリプトン、５ｇ／ＩＬ酵母エキ
ス及び５ｇ／ＩＬ　　ＮａＣ１）１０ｍｕを加えて静か
に転倒しながら混合し、４℃、３，０００　ｒ　ｐ　ｍ
　　で１０分間遠心した。

上清を別のチューブに移し、１／１０量の３Ｍ酢酸ナト
リウム、３１５量のインプロパツールを加えて混合し、
−２０℃で１．５時間放置した。　４℃、３．００Ｏｒ
　ｐ　ｍで２０分間遠心し、上清を除去した。　沈澱を
ｒＥ（８液（ｐＨ８，０）２ｍｌｌに懸濁し、プロテイ
ナーゼに５０μｇと、ＳＤＳを終濃度０．５％になるよ
う加え、３７℃で３０分間インキュベートした。　透明
になった溶液をフェノール−クロロホルムで抽出したの
ち、２倍量のエタノールを加え、析出してきた糸状沈澱
物を４℃、３．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心して分離し
た。　沈　澱は、７０％エタノールで洗浄し、乾燥後、
４００μｍのＴＥ温溶液ｐＨＢ、Ｏ）に溶解した。　再
び同様にフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈
澱を２回繰り返し、最終的に沈澱物を２０μｍのＴＥ温
溶液ｐＨ８，０）にＢＳＡを１μｍ、Ｉｍｇ／ｍｊ２　
　ＲＮａｓｅＡを１μ℃、１０ｘＥｃｏＲＩｉｉ衝溶液
（０，５Ｍ　　　　　　ＮａＣ１，ＩＭ）−リ　　ス　
　−　塩　酸（ｐＨ７，５）、フＯｍＭ　　Ｍ　ｇ　Ｃ
１２及び７０ｍＭ　　β−メルカプトエタノール）を１
μｍ、ざらにＥｃｏＲＩを１単位加え反応液（全量１０
μＬ）にして、３７℃で１時間インキュベートした。

切断されたｃＤＮＡ断片のサイズをアガロースゲル電気
泳動で解析した。　最長のｃＤＮＡを含むクローンはλ
ＨＦＬＩ　Ｏであり、そのサイズは１．２ｋｂｐで、Ｐ
−４５０ＨＦＬａ遺伝子の全長はコードしていなかった
。

（実施例８） プローブの作製 得られた陽性クローンλＨＦＬＩ　Ｏに含まれるｃＤＮ
Ａ断片をニックトランスレーション法により放射標識し
、プローブを作製した。

ニックトランスレーションは市販のキット（日本ジーン
社）を用い、放射標識には［α−”Ｐ］　ｄＣＴＰ　（
３，０００Ｃｉ／ｍｍｏ　１　）を使用した。　方法は
キットに付随する指示書に従った。　得られたプローブ
の比活性は１０８〜１０”ｃｐｍ／μｇであった。

（実施例９） ノーザンプロット解析 Ｐ−４５０ＨＦＬａ蛋白質の全長をコードするｃＤＮＡ
を取得するため、実施例８で作製したプローブを使用し
て再びＰ−４５０ＨＦＬａｍＲＮＡのスクリーニングを
行った。　実施例３と同様にして調製されたｍＲＮＡ画
分の１／２０量を含む処理液（４０ｍＭ　　ＭＯＰＳ（
ｐＨ７，０）　　　１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ　
　ＥＤＴＡ、２．２Ｍホルムアルデヒド及び５０％ホル
ムアミド）２０μｍを５５℃で１５分間加熱し、ｍＲＮ
Ａを変性させた後、２μ℃の５０％グリセリン、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．４％ブロモフェノールブルー及び０．４
％キシレンシアツール混合液を加え、１５　Ｖ　／　ｃ
　ｍの定電圧で１％アガロースゲル電気泳動を行った。

　泳動後、ゲルを０．３Ｍクエン酸ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ７，０，３ＭＮａＣ１含有）に１時間浸し、同溶液に
浸しておいたニトロセルロースフィルターをゲルに重ね
ｍＲＮＡをトランスファーした。　　フ　ィ　ルターを
風乾後、８０℃で２時間処理し、ｍＲＮＡを固定した。

　ニトロセルロースフィルターを４５ｍＭクエン酸ナト
リウム溶液（０，４５Ｍ　　ＮａＣ１及び０．１％ＳＤ
Ｓ含有）に浸したのち、シーリングバッグへ穆しブレパ
イプリダイゼーション溶液（７５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム、０．７５Ｍ　　ＮａＣ１，５０ｍＭリン酸ナトリウ
ム（ｐＨ６，５）、５０％ホルムアミド、０．１％フィ
コール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ＢＳ
Ａ及び２５０μｇ／ｍＩＬ変性サケ精巣ＤＮＡ）中で４
２℃、４時間インキュベートした。　次いで上記のブレ
パイプリダイゼーション溶液に実施例８で調製したプロ
ーブＤＮＡ　（加熱変性させて１本鎖にしたもの）を３
，０００，０００　ｃ　ｐ　ｍ　／　ｍ　１１になるよ
うに加え４２℃で一晩パイプリダイゼーションを行った
。　フィルターをバッグから取り出し３０ｍＭクエン酸
ナトリウム溶液（０，３ＭＮａＣｌ及び０．１％ＳＤＳ
含有）で５５℃、３０分間のインキュベーションを２回
繰り返して非特異的に吸着したプローブＤＮＡを除去し
た。　フィルターを風乾し、オートラジオグラフィーを
実施し、Ｐ−４５０ＨＦＬａのｍＲＮＡを最も多量に含
む画分を決定した。

（実施例１０） プローブによるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング 実施例９で決定したＰ−４５０ＨＦＬａｍＲＮＡ画分を
用いて実施例５と同一方法でｃＤＮＡライブラリーを作
製した。　得られたファージ組換え体を大腸菌Ｙ１０９
０に感染させ、少量の軟寒天（組成は実施例６と同様）
と混合して寒天層上に広げて３７℃で一晩培養しプラー
クを形成した（１．５Ｘ１０’プラーク）。　寒天面よ
りニトロセルロースフィルターに移したファージを風乾
後、まず０．５ＭＮａＯＨ（１，５Ｍ　　ＮａＣ１含有
）に１分間浸し、次に０．５Ｍ）−リスー塩酸＆ｌ衝溶
液（ｐＨ８，０，１，５Ｍ　　ＮａＣ１含有）に５分間
浸して中和後、２ＸＳＳＰＥ溶液（１×５ＳＰＥ：０．
１８Ｍ　　ＮａＣ１，１０ｍＭＮ　ａ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４（
ｐ　Ｈ７−４）及び１ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄した。　再
び風乾し、乾燥器に入れ８０℃、２時間加熱処理し、Ｄ
ＮＡをフィルター上に固定した。

上記フィルターを０．１％ＢＳＡ、０．１％フィコール
４００．０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ＳＤ
Ｓ及び１００μｇ／ｍｊ！熱変性サケ精巣ＤＮＡ含有５
ＸＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ　　ＮａＣ１及
び１５ｍＭクエン酸ナトリウム）に浸し、６０℃、４時
間ブレパイプリダイゼーションを行った。　さらに同溶
液に実施例８で得たプローブＤＮＡ　（約１０’ｃｐｍ
／ｍＪ２）及び１００μｓ／ｍｕ変性サケ精巣ＤＮＡを
添加した溶液にフィルターを浸し、６０℃で一晩ハイブ
リダイゼーションを行った。　フィルターを取り出し２
ＸＳＳＣ溶液（０，１％ＳＤＳ含有）で６０℃、３０分
間の洗浄を２回繰り返した。　乾燥後、オートラジオグ
ラフィーを行い陽性クローン２０個を得た。　これらを
実施例６の（３）に従って単一なりローンに精製した。

　陽性クローンを実施例フと同様に処理し、電気泳動に
より、挿入されたｃＤＮＡのサイズを解析した。　その
結果クローンλＨＦＬ３３が約２ｋｂｐのｃＤＮＡ（３
個のＥｃｏＲＩ断片に分かれた）を含むことが判明した
。

（実施例１１） Ｐ−４５０ＨＦＬａ遺伝子のサブクローニング 実施例７に従って得られたλＨＦＬ３３ｃＤＮＡ断片（
３個のＥｃｏＲＩ断片）を各々ゲルよりＤＥＡＥイオン
交換メンブレンに回収し、Ｔ旦−溶液（ＩＭ　　ＮａＣ
１含有）で溶出した後、フェノール−クロロホルム抽出
、エタノ−ル沈澱で回収した。　各ｃ　ＤＮＡ断片を１
０ｍＭ　　ＴＥ溶液５μｋに溶解し、プラスミドｐＵｃ
１８　（ＥｃｏＲＩで消化後、アルカリホスファターゼ
処理済み）に結合した。　この組換えプラスミドを大腸
菌ＪＭＩＯＩに感染させ、Ｘ−ｇａＩＬ３５μｓ／ｍＡ
を含むＬＢ寒天培地（１，５％寒天を含むＬＢ培地）に
まき、３７℃で一晩培養した。　得られた白色コロニー
を培地１．５ｍＩ！、に植え、３７℃、５時間様どう培
養した。　エッペンドルフチューブで１０．０００ｘ　
ｇ、５分間遠心し、ペレットを５ｍ　ｇ　／　ｍ　ｊ２
リゾチームを含む２５ｍＭ　　ＴＥ温溶液ｐＨ８，０，
５０ｍＭグルコース及び１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ含有）１
００μｍに懸濁させ、室温で５分間放置した。　続いて
２００μ２の０．２Ｎ　　ＮａＯＨ−１％ＳＤＳ溶液を
加え穏やかに混合し、水中で５分間放置した。　５Ｍ酢
酸−３Ｍカリウム溶液（ｐＨ５，２）を１５０μに加え
さらに水中で５分間放置した後、４℃　１０，０ＯＯＸ
　ｇで５分間遠心した。　上清をフェノール−クロロホ
ルムＩＡ埋後、エタノール沈澱した。　得られたプラス
ミドＤＮＡはＴＥ温溶液ｐＨ８，０）に溶解後、終濃度
２５　μｇ　／　ｍ　ＩｔのＲＮａｓｅＡで処理し、再
びフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈澱によ
り純粋なプラスミドＤＮＡ各々約３０μｇを得た。

（実施例１２） 制限酵素地図の作製と塩基配列の決定 まず実施例１１で精製されたプラスミドＤＮＡ（λＨＦ
　Ｌ　３３の３つのＥｃｏＲＩ断片をｐＵｃ１８にサブ
クローニングしたプラスミドをそのインサートのサイズ
に応じて小さい方からｐＨＦＬ３３ｓｓ、ｐＨＦＬ３３
ｓ　、ｐＨＦＬ３３ＩＬと命名した）及びλＨＦＬ３３
のインサー）−ｃＤＮＡを用いて制限酵素地図を作製し
た。　プラスミドＤＮＡ２μｇを用い、１μｍ（５〜１
５単位）の各種制限酵素で切断後、０．９％アガロース
ゲル電気泳動を行いバンド数と移動度によりｃＤＮＡ中
の制限酵素部位を確認し、制限酵素地図を作製した。　
λＨＦＬ３３のインサートｃＤＮＡの制限酵素地図を第
１図に示す。

次に制限酵素地図に従い、ＤＮＡを切断し、Ｍ１３ｍｐ
１８及びＭ１３ｍｐ１９にサブクローニングした。　サ
ブクローニングした断片ならびにシーフェンシングの方
向を第１図に示した。　　シーフェンシングはサンガー
らの方法［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ゛オ
ロジー　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１４３　巻１６
１頁　１９８０年］に従って以下の通り実施した。　す
なわちＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９の組換えプ
ラスミドで大腸菌ＪＭＩＯＩを形質転換し、Ｈ寒天培地
（１０ｇ／λバクトドリブトン、８ｇ／ｉ　　ＮａＣ１
及び１７ｇ／Ｉｔ寒天）上に軟寒天培地（１０ｇ　／　
１バクトドリプトン、８ｇ／１１　　ＮａＣ１及びＢｇ
／Ｉｔ寒天）２．５ｍｉ、１００ｍＭ　　ＩＰＴＧ　　
４０μｆｔ。

２％Ｘ−ｇａｉ４０μｆとともにまき、ファージプラー
クを得た。　半透明プラークを取り、ＪＭＩＯＩの一夜
培養液を１７Ｚｏｏ量含む２ＸＴＹ培地１．５ｍｊ！に
懸濁し、ファージを増殖させた。　５時間後、遠心によ
り菌体をのぞき、上清に２０％ポリエチレングリコール
（２，５Ｍ　　ＮａＣ１含有）を加え室温で１５分間放
置し、ファージを抽出した。　遠心によりポリエチレン
グリコール除去後、ＴＥ溶液１００μｍに溶解しフェノ
ール処理した。　遠心後、水層に３Ｍ酢酸ナトリウム、
エタノールを添加し、１木Ｑｆ４　Ｄ　Ｎ　Ａを沈澱さ
せた。　減圧乾燥後３０μｍのＴＥ温溶液懸濁し、氷上
に放置した。

この１本＆１ｌＤＮＡ７μｍ（約５μｇ）Ｍ１３プライ
マー１μｍ（約１．５ｎｇ）、フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ
）反応液１．５ｔｌｌｌ及び１００ｍＭｈリスー塩酸緩
衝溶液（ｐＨ８，０，５０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２含有）２
．５μＡを混合することによりアニール化反応を行いブ
ライマー鋳型複合体を形成した。　アニール後、この反
応液に１μｍのフレノウ（にｌｅｎｏｗ）フラグメント
（１単位）　と［”Ｓｌ　ｄＡＴＰａＳ（１０Ｃｉ／ｍ
ｊ２、比放射活性は＞５ｏｏｃｉ／ｍｍｏｌ）１．５μ
ｍを加えた。　ここから２．５μ℃ずつ４本のチューブ
に分取し、各々を８０μＭｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴ
ＴＰ／８μＭｄｄＮＴＰ混合溶液２μでに添加し、３７
℃、１５分間インキュベートした。

０．５ｍＭｄＮＴＰ溶液を２μ℃加え、さらに３７℃、
１５分間チエイス反応を行った。　次いで停止溶液（９
５％脱イオンホルムアミド、２５ｍＭ　　ＥＤＴＡ　（
ｐＨ８，０）、０．１％ブロモフェノールブルー及び０
．１％キシレンシアツール）４μｍを加え反応を停止し
た。

電気泳動を行い、オートラジオグラフィーによって塩基
配列を決定した。　その結果と、塩基配列がコードする
アミノ酸配列を第２図に示した。　クローンλＨＦＬ３
３のインサートｃＤＮＡは１９７１ｂｐからなり、コー
ディング領域は１５０９ｂｐであり、５０３アミノ酸残
基をコードすることが判明した。

〈発明の効果〉 本発明者らは、上述のごとくヒト胎児肝に特異的に発現
しているＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白質の遺伝子配列及びそ
れに基づく当該蛋白質のアミノ酸配列を明らかにした。

　当該遺伝子は婦人科悪性腫瘍等のＤＮＡ診断に用い得
る。　また当該遺伝子を用いて遺伝子組換え法により本
発明のアミノ酸配列を有する蛋白質の大量入手が可能で
ある。　さらに本発明のアミノ酸配列の全部、または一
部を用いＰ−４５０ＨＦＬａに特異的な抗体の作製及び
当該抗体を用いた診断が可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図はＰ−４５０ＨＦＬａ　　ｃＤＮＡの制限酵素地
図及びシーフェンシングの方向を示す図である。 第２図はＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白質遺伝子の塩基配列及
びそれに基づくアミノ酸配列を示す図である。 Ｆ 工 その 工 （その ＣＴＣ ＡＴＧ　　ＧＡＴ　　ＣＴＣ＾丁ＣＣＣＡ　　ＡＡＣＴ
ＴＧ　　ＧＣＣＧＴＧ　　ＧＡＡＭｅｔ　　Ａｓｐ　　
Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　　Ｐｒｏ　　＾ｓｎ　　Ｌａｕ　　
＾ｌａ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｕ＾ＣＣＴＧＧ　　Ｃ７丁　
ＣＴＣＣＴＧ　　ＧＣＴ　　ＧＴＣＡＧＣＣＴＧ　　Ａ
Ｔ＾Ｔｈｒ　　丁ｒｐ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ
　　＾ｌａ　　ＶａＪ　　Ｓｅｔ　　Ｌｅｕ　　１ｉｅ
ＣＴＣＣＴＣＴＡＴ　　ＣＴＡ　　ＴＡＴ　　ＧＧＡ　
　ＡＣＣＣＧＴ　　ＡＣＡ　　Ｃ＾丁Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ
　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ
　　＾ｒｇ　　丁ｈｒ　　Ｈ４ｓ＾５ｐ Ｐｒ。 ｈｅ ＶａＪ Ｇｌｕ ＾ｓｎ Ｔｈｒ ｙ５ Ｌｙｓ ｅＬＩ 工 その 工 その ＣＴＧ　　ＧＣＣＡＣＴ　　ＣＡＣＣＧＴ　ＧＡＴ　　
ＧＴＣＣＡＧ　　ＣＡＧ　　ＡへＡＬｅｕ　　＾ｌａ　
　Ｔｈｒ　　Ｈ５ｓ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｐ　　Ｖａｌ　
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ＡＴ　　ＡＣＡ　　Ｇ丁ＴＴ丁＾　ＣＣＣＶａｌ　　Ｇ
ｉｎ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　ｌｉｅ　　Ａｓｐ　　Ｔ
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＾　＾Ｇ丁　ＧＧＡ　　ＣＣＣ　　ＡＧ＾１１ｅ　　Ｔ
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Ｇ＾＾Ｇｌｎ　　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ　　Ｓａｒ　　Ｐｈ
ｅ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｃｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌ
ｕ＾ＣＡ　　ＣＡＧ　　ＡＴＣ　　ＣＣＣ　　ＣＴＧ　
　＾＾Ａ　　ＴＴＡ　　ＣＧＣ　　ＴＴＴ　　ＧＧ＾丁
ｈｒ　　Ｇｌｎ　　ＩＩｅ　Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙ
ｓ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　Ｐｈａ　　ＧｌｙＧＧＡ　
　ＣＴＴ　　ＣＴ丁　ＣＴＡ　　ＡＣＡ　　Ｇ＾＾　＾
＾＾　ＣＣＣ　＾丁Ｔ　　ＧＴＴＧｌｙ　　Ｌｅｕ　　
Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　丁ｈｒ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　
Ｐｒｏ　　Ｉｌｅ　　ＶａｌＣＴ八　＾＾Ｇ　　ＧＣＴ
　　ＧＡＧ　　丁Ｃ＾　＾ＧＧ　　ＧＡＴ　　ＧＡＧ　
　ＡＣＣ　　ＧＴ＾Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　Ｇ
ｌｕ　　Ｓｅｒ　　＾ｒｇ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｕ　　Ｔ
ｈｒ　　Ｖａｌ＾ＧＴ　　ＧＧＡ　　ＧＣＣ　　ＴＧ＾
丁ＴＴＣＣＣ丁＾＾ＧＧＡＣＴ丁Ｃ丁ＧＧ丁丁丁ＧＣ丁
Ｃ丁Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ａｌａ ＴＴ八＾Ｇ＾＾＾ＧＣＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧ＾＾ＣＡＣ
ＣＡＧＡＧＡＣＣＴＣ＾＾＾丁ＴＡＣＴＴＴＡＣ＾＾＾
ＴＡＧ＾＾ＣＣＣＴＧ＾＾＾ＴＧ＾＾ＧＡＣＧＧＧＣＴ
ＴＣＡＴＣＣ＾＾ＴＧＴＧＣＴＧＣＡＴ＾＾＾Ｔ＾＾Ｔ
ＣＡＧＧＧＡＴＴＣＴＧ丁＾ＣＧＴＧＣ＾丁ＴＧＴＧＣ
ＴＣ丁Ｃ丁ＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＡＴＡＧＡＧ丁Ｇ丁Ｔ
ＡＴＡＣＴＴＧＧＴ＾＾丁＾ＴＡＧ＾６ＦＩＯ−２（そ
の６） ＧＡＧＡＴＧＡＣＣ＾＾＾ＴＣＡＧＴＧＣＴＧＧＧＧ＾
＾ＧＴＡＧＡＴＴＴＧＧＣＴＴＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴＣ
ＡＴＡＧＧＡＣＴＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＣＡＧ
ＴＴＡＧＣＡＣＣ＾ＴＴ＾＾ＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣ
ＴＣ丁ＧＡＴ＾＾ＣＡＴＡＡＴＴ＾＾ＣＡＴＴＴＣ丁Ｃ
＾＾ＴＡＡＴＴＴＣ＾＾ＣＣＡＣＡＡ丁ＣＡＴＴ＾＾丁
＾＾＾＾＾丁ＡＧＧ＾＾丁ＴＡＴＴＴ丁６＾ＴＧＧＣＴ
ＣＴ＾＾ＣＡＧＴＧＡＣＡＴ丁ＴＡＴＡＴＣＡＴＧＴＧ
丁ＴＡＴＡＴＣＴＧＴ＾ＧＴＡＴＴＣＴ＾丁＾ＧＴＡＡ
ＧＣ丁丁丁Ａ丁＾ＴＴ＾＾ＧＣ＾＾＾丁Ｃ＾＾Ｔ＾＾＾
八＾ＣＣＴＣＴ丁ＴＡＣ＾ 手続ネ甫正書（自発）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト由来の他の蛋白質を実質的に含有しないこと
   を特徴とするチトクロームＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白質。
2. （２）組換え宿主細胞によって産生される請求項１記載
   のチトクロームＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白質。
3. （３）下記式［ I ］： 【遺伝子配列があります】 で表わされるアミノ酸配列の一部あるいは全部を含むこ
   とを特徴とするチトクロームＰ− ４Ｓ０ＨＦＬａ蛋白質。
4. （４）請求項１〜３のいずれかに記載のチトクロームＰ
   −４５０ＨＦＬａ蛋白質をコードすることを特徴とする
   新規ＤＮＡ配列。
5. （５）遺伝暗号の縮重に基づき少なくとも１個の塩基が
   置換されている又は置換されていない次式［II］： 【遺伝子配列があります】 ……［II］ で表わされるＤＮＡ配列の一部あるいは全部を含むこと
   を特徴とするＤＮＡ配列。
6. （６）請求項４または５に記載のＤＮＡ配列と相補的な
   ＤＮＡ配列。
7. （７）チトクロームＰ−４５０ＨＦＬａ蛋白質をコード
   しているＤＮＡ配列を組換え宿主細胞に於いて発現させ
   ることを特徴とするチトクロームＰ−４５０ＨＦＬａ蛋
   白質の製造方 法。