JPH02215397A - トチバ人参の組織培養によるチクセツサポニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、トチバ人参から得られるカルスを組織培養す
ることによりチクセツサポニンを効率よく製造する方法
に関する。

（従来の技術） トチバ人参（Ｐａｎａｘ　　Ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　　Ｃ
，＾０Ｍｅｙｅｒ）は薬用人参の１種であり、その根お
よび茎を生薬「チクセツ人参」と称し、健胃、去痰、解
熱などの薬効があることが知られている。「チクセツ人
参」の薬効成分は主にサポニンであり、チクセツサポニ
ンＩｂ、　ＴＶ、　ｒＶａ、　Ｖ、　ｍなどが知られて
いる。このうち、チクセツサポニン■には抗ストレス性
潰瘍の作用があることが報告されている（薬学雑誌１０
７（２）　、　１３５−１３９（１９８７）　）。

チクセツサポニンは、現在はトチバ人参を栽培して得ら
れる「チクセツ人参」を原料として得られている。しか
し、トチバ人参は特定の地域（長野県、福島県、東北地
方など）でしか栽培されておらず９人手量に限りがある
。しかも、自然条件下の栽培であるため、季節、天候、
土壌の質などに左右され易い。さらに、根および茎を生
薬として使用できるようになるには、数年の栽培期間を
要する。このように、原料となるトチバ人参の栽培上の
制約のため、チクセツサポニンを安定して大量に得るこ
とができない。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の課題を解決するものであり。

その目的とするところは、トチバ人参からチクセツサポ
ニンを効率よく製造する方法を提供することにある。本
発明の他の目的は、季節、天候、土壌の質などの自然条
件に左右されずに、チクセツサポニンを安定して大量に
得る方法を提供することにある。本発明のさらに他の目
的は、トチバ人参の組織培養によりチクセツサポニンを
効率よく製造する方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明のチクセツサポニンの製造法は・、　　（ａ）　
　）チバ人参（Ｐａｎａｘ　　Ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　Ｃ
，八０Ｍｅｙｅｒ）の組織を培養してカルスを誘導する
工程；（ｂ）得られたカルスを窒素源としてＮＨ，＋お
よびＮ０ｓ−、そして炭素源としてシュークロースおよ
び／またはグルコースを含有する有機培地で培養する工
程；および（Ｃ）該カルスからチクセツサポニンを抽出
する工程；を包含し、そのことにより上記目的が達成さ
れる。

本発明方法によりチクセツサポニンを製造するには、ま
ず、トチバ人参の根、茎１葉１種子などの植物体を切り
とり、アルコールなどで滅菌して通常の植物の組織培養
法によりカルスを誘導する。

培養条件は何ら格別である必要はない。培地としては、
植物の組織培養に通常用いられるムラシゲ−スクーグの
培地、ホワイトの培地、リンスマイヤー−スクーグの培
地、ガウスレットの培地、ヘラ−の培地、ガンボーグの
培地およびこれらの改変培地などが用いられうる。特に
ムラシゲ−スクーグの培地が好適に用いられる。これに
、カルスの誘導をより促進させるために、必要に応じて
植物ホルモン（オーキシン類、サイトカイニン類など）
が添加される。オーキシン類には１例えば。

２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ　）　、
インドール酢酸（ＩＡＡ）　、インドール３−酪酸（Ｉ
ＢＡ）　。

ナフタレン酢酸（ＮＡＡ　）などがある。サイトカイニ
ン類には２例えば、カイネチン、ベンジルアデニン（Ｂ
＾）などがある。通常、オーキシン類は０．０１〜５ｐ
ｐｍの割合で、サイトカイニン類は０．１〜１０ｐｐｍ
の割合で培地中に添加される。通常、暗所で１５〜３５
℃にて培養を行うと、１０〜３０日後には組織切断面に
カルスが形成される。このカルスを適当な寒天培地など
の固体培地に移して適当な量にまで増殖させる。さらに
必要に応じて、このカルスを固体培地または液体培地に
移し培養を続ける。この培地も上記と同様の培地が用い
られ得、特にムラシゲ−スクーグの培地が好適に用いら
れる。培養は暗所で行うのが好ましく、培養温度は２０
〜２５℃が利用されつる。

このようにして得られるカルスを、特定の窒素源および
炭素源を含有する有機培地に移す。この培地には１次に
示す特定の窒素源および炭素源を含有する培地が用いら
れる。特定の窒素源および炭素源を含有すること以外は
９通常の組織培養に用いる培地で充分である。例えば、
上記カルスの誘導または増殖用の培地が用いられる。上
記窒素源としては、ＮＨ４ＮＯ３，（Ｎ）１４）２ＳＯ
，などのアンモニウム塩（解離してＮＨ，＋を生じる）
、およびＮａＮ口、。

に８０３などの硝酸塩（解離してＮＯ３−を生じる）が
用いられる。アンモニウム塩と硝酸塩とを組み合わせて
用いるのが好ましく、特にＮＨ４ＮＯ３とＫＮＯ，との
組合せが好適である。ＫＮＯ３は植物の生育に必要な金
属元素であるカリウム（に）を含有するため。

カルスの増殖にも効果的であると考えられる。これらの
窒素源の培地中の濃度は、アンモニウム塩はアンモニウ
ムイオン（ＮＨ，＋）として２．８〜５５，６ｍＭ　（
０，０５〜１．０ｇ／　ｌ　）　、好ましくは５．０〜
４１．１ｍＭ（０，０９〜０．７４ｇ　／１　）　、そ
して硝酸塩は硝酸イオン（Ｎ（１３−）として１１．３
〜８０．６ｍＭ　（０，７〜５．０ｇ／　１）　。

好ましくは１４．５〜６４．５ｍＭ　（０，９〜４．０
ｇ／　１　）である。

上記特定の炭素源としては、シュークロース。

およびグルコースが単独でまたは組み合わされて用いら
れる。これらの炭素源の培地中の濃度は。

シュークロースでは３〜７重量％、好ましくは３〜４重
量％であり、グルコースでは３〜５重量％である。上記
窒素源および炭素源の含有量が上記範囲を外れるとチク
セツサポニンの生産量が低下する。

上記培地には、カルスの増殖を目的として必要に応じて
オーキシン、サイトカイニンなどの植物ホルモンが添加
され得る。培養は、上記カルスの誘導および増殖と同様
に、２０〜２５℃の培養温度で暗所にて行うのが好まし
い。

このようにして培養されたカルスを通風乾燥など、適当
な条件下で乾燥させ、必要に応じて粉砕し、これに適当
な抽出溶媒を添加して抽出が行なわれる。例えば、５０
％エタノールを加えて２４時間。

室温で静置することによりチクセツサポニンを含有する
抽出液が得られる。抽出液を比較的穏和な条件下で蒸発
乾固することによりチクセツサポニンを含有するエキス
が得られる。このエキスは必要に応じて当業者に公知の
各種クロマトグラフィーに供することにより、精製サポ
ニンとされる。

エキス中のチクセツサポニンは１例えば、シリカゲル薄
層クロマトグラフィーにより確認され得る。

（実施例） 本発明を以下の実施例につき説明する。

実施例１ ムラシゲ−スクーグの培地にオーキシンとして２．４−
Ｄおよびカイネチンをそれぞれｔｐｐｍ、ならびに寒天
を０．９％となるように添加したカルス誘導用の寒天培
地を調製し、　１００ｍ１容量のエルレンマイヤーフラ
スコに５０ｍ１ずつ分注し、オートクレーブ滅菌した。

この寒天培地上に１次亜塩素酸ナトリウムで殺菌したト
チバ人参の根の小切片を無菌的に置床し、２５℃の暗所
にて４週間培養することによりカルスが誘導された。得
られたカルスを。

ムラシゲ−スクーグの培地にオーキシンとしてＩＢＡ２
　ｐｐｍおよびＢＡ　Ｏ，ｌｐｐｍ　、ならびに寒天０
．９％を添加した増殖用寒天培地に移植し、２５℃にて
４週間培養した。このカルスをさらに、上記増殖用培地
と同様の組成であるが寒天を含まない増殖用液体培地に
移し、２５℃にて２１日間培養を続けて増殖させた。

次いで、カルスにチクセツサポニンを生産させるために
、ムラシゲ−スクーグの培地に炭素源としてシュークロ
ース３重量％、ならびに窒素源として５．ＯｍＭ　Ｎ８
４ＮＯ−（アンモニウムイオンとして５．０ｍＭ（０，
０９ｇ／　］））およびにＮＯ０［硝酸イオンとして１
４．５ｍＭ（０，９ｇ　／　１）］を添加した有機培地
を調製した。

別に、　ＫＮＯ３の濃度を、それぞれ硝酸イオンとして
２１．０ｍＭ（１，３ｇ／ｌ）、　２９．ＯｍＭ（１，
８ｇ／ｌ）および６０．０ｍＭ（３，７ｇ／ｌ）とした
３種類の培地を調製した。各培地を１００ｍ１ずつ入れ
たフラスコをオートクレーブ滅菌した後、上記カルスを
フラスコあたり生重量４、Ｏｇずつ接種した。２５℃の
暗所にて３週間培養することにより、それぞれ生重量１
４ｇ、　１７ｇ、　１６ｇおよび１７ｇのカルスが得ら
れた。−このカルスを６０℃にて２４時間乾燥するとカ
ルス乾燥品が得られ、それぞれの乾燥重量は０．８９ｇ
、　０．１０ｇ、　０．９８　ｇおよび０．１ｇであっ
た。これは上記有機培地１１あたりに換算すると、それ
ぞれ乾燥重量８．９ｇ／ｌ　、　１０．１ｇ　／　１．
９．８８　／　ｌ右よび１０．　Ｏｇ　／　１となる。

培地のＮＯ３−濃度とカルス乾燥重量［培地１１当りの
乾燥重量（ｇ／ｌ）］との関係を第１図に黒丸印（・）
で示す。示す。第１図から９本発明の培地を用いて培養
を行うことによりカルスが良好に増殖することがわかる
。この乾燥カルスを５０％エタノールで抽出し、抽出液
を蒸発乾固した。これをメタノールに溶かして溶液とし
、　Ｓｅｐ　Ｐａｋ　　（Ｗａｔｅｒｓ社）で処理して
乾燥カルスＩｇあたりそれぞれ１９．０ｍｇ、　２１．
２ｍｇ、　２０．４ｍｇ右よび２２．１ｍｇのサポニン
画分を得た。次いでこの画分を、　ＣＨＣｌ３　：　Ｍ
ｅＯＨ：　Ｈ２０＝６５　：　３５　：　１０の上層を
展開溶媒として用いたシリカゲル薄層クロマトグラフィ
ーに供した。展開後の薄層プレートに１０％硫酸を噴霧
し、１０５℃にて１０分間加熱後、クロマトスキャナー
を用いて波長５２０ｎｍにおける吸収をスキャンするこ
とにより、チクセツサポニンが確認された（Ｃｈｅｍ、
　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｉ、。

１１．１５４６（１９６３）　）。

比較例１ 有機培地中の硝酸イオン濃度を９．７ｍＭ　　（０，６
ｇ／ｌ　）にしたことを除いては、実施例１に準じてカ
ルスの培養を行った。その結果を、実施例１の結果とと
もに第１図に黒画角印（■）で示す。第１図から、この
培地を用いるとカルスが乾燥物として４．１８／Ｉ　Ｌ
か得られず、硝酸イオンの濃度が低すぎるとカルスの増
殖が促進されないことがわかる。

実施例２ 実施例１のカルス誘導用寒天培地中のオーキシンのうち
２．４−ＤをＮＡＡに、そして、増殖用培地中のＢＡを
カイネチンに変え、さらに有機培地中の窒素源としての
アンモニウムイオン１度を４１．１ｍＭ（０，７４ｇ　
／Ｉ　）とし、硝酸イオンの濃度を１６．１ｍＲ１（１
，０ｇ／ｌ）　、　４０．３ｍＭ　（２，５ｇ／ｌ）　
、　５０．０ｍＭ　（３，Ｉｇ／ｌ）または６０．０ｍ
Ｍ　（３，７ｇ／　１）としたことを除イテハ。

実施例１と同様にしてトチバ人参のカルスを培養し、乾
燥カルスとした。この乾燥重量を測定した結果を、実施
例１の結果とともに第１図に白丸印（○）で示す。第１
図から、上記培地を用いて培養を行うことによりカルス
が良好に増殖することがわかる。これらのカルス乾燥物
１ｇあたりからそれぞれ１５ｍｇ、　１７Ｊｍｇ、　２
１．７ｍｇおよび２２．７ｍｇの粗サポニン画分が得ら
れ、実施例１と同様にしてチクセツサポニンの存在が確
認された。

比較例２ 有機培地中のアンモニウムイオン１度ヲ７２．２ｍＭ（
１，３ｇ／ｌ　）に、そして硝酸イオン濃度をそれぞれ
１６．１ｍＭ　（１，０ｇ／　１　）　、　４０ＪｍＭ
　（２，５ｇ／　Ｉ　）または５９．７ｍＭ　（３，７
ｇ／　１　）にしたことを除いては、実施例２に準じて
カルスの培養を行った。その結果を、実施例１．比較例
１および実施例２の結果とともに第１図に白玉角印（△
）示す。第１図から。

この培地を用いるとカルスが乾燥物として５．０ｇ／　
１しか得られず、アンモニウムイオンの濃度が高すぎる
とカルスの増殖が悪くなることがわかる。

比較例３ 有機培地中のアンモニウムイオンａ度をＯｍＭ（Ｏｇ／
ｌ）に、そして硝酸イオン濃度をそれぞれ４゜６８ｍＭ
　（０，２９ｇ　／１　）　、　９．３５ｍＭ　（０，
５８ｇ　／１　）　。

１９、４ｍＭ　（１，２０ｇ　／　１　）または３７．
６ｍＭ　（２，３３ｇ／　１）にしたことを除いては、
実施例２に準じてカルスの培養を行った。その結果を、
実施例１．比較例１、実施例２および比較例２の結果と
ともに第１図に黒三角印（ム）で示す。第１図から、こ
の培地を用いるとカルスが乾燥物として４．０ｇ／　１
以下しか得られず、アンモニウムイオンの濃度が低すぎ
るとカルスの増殖が悪くなることがわかる。

実施例３ 実施例１と同様のカルス誘導用培地および増殖用培地を
用いて、トチバ人参のカルスを培養した。

このカルスを、実施例１と同様の窒素源［アンモニウム
イオン５　ｍＭ（０，０９ｇ　／　１）および硝酸イオ
ン２０．９ｍＭ　（１，３ｇ／　ｉ）　］を含有し、炭
素源としては１％シュークロース、３％シュークロース
、５％シコークロース、７％シュークロース、１％グル
コース。

３％グルコースまたは５％グルコースを含有する７種類
の有機培地で（ムラシゲ−スクーグの改変培地）で培養
した。これらの培地で得られたカルスを実施例１と同様
にして乾燥カルスとし、乾燥重量を測定した。その結果
を第２図に白丸印（Ｏニジコークロース）および白玉角
印（△ニゲルコース）で示す。

さらに、これらのカルス乾燥物１ｇから実施例１と同様
にして得られる粗サポニンの量を第３図に白丸印（○：
ニジコークロースおよび白玉角印（△ニゲルコース）で
示す。第２図および第３図から、特定の窒素溝を含有し
、かつ炭素源として３〜７％シュークロースまたは３〜
５％グルコースを含有する有機培地を用いて培養を行う
ことによりカルスが良好に増殖し、同時にチクセツサポ
ニンが高効率で生産されることがわかる。

比較例４ 有機培地中の炭素源として１，３または５％フルクトー
スを用いたことを除いては、実施例３と同様にしてトチ
バ人参〇カルスを培養し、乾燥カルスとした。この乾燥
カルスの重量（ｇ／ｌ）を。

実施例３の結果とともに第２図に白画角印（ロ）で示す
。さらに、これらの乾燥カルス１ｇから実施例３と同様
にして得られる粗サポニンの量を。

実施例３の結果とともに第３図に白画角（ロ）で示す。

第２図および第３図から、有機培地中の炭素源としてフ
ルクトースを用いた場合には、シュークロースまたはグ
ルコースを用いた場合と比べてカルスおよびチクセツサ
ポニンの生産量が半分以下となり、生産性が悪くなるこ
とがわかる。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、トチバ人参から得られる
カルスを特定の培地を用いて組織培養することにより、
チクセツサポニンを効率よく製造する方法が提供される
。本発明方法によれば、季節、天候、土壌の質などの自
然条件に左右されずにチクセツサポニンを安定して、し
かも比較的短期間に大量に得ることができる。このよう
にして得られるチクセツサポニンは、医薬品原料、健康
食品添加物など広い分野に利用されつる。

【図面の簡単な説明】

第１図は１本発明方法で用いられる特定の有機培地のア
ンモニウムイオン濃度および硝酸イオン濃度を変化させ
たときの、トチバ人参のカルスの収量の変化を示すグラ
フ；第２図は、有機培地中の炭素源の種類および濃度を
変えたときのカルスの収量の変化を示すグラフ；そして
第３図は、有機培地中の炭素源の種類および濃度を変え
たときに得られるカルスから得られる粗サポニンの量の
変化を示すグラフである。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）トチバ人参（Ｐａｎａｘ　Ｊａｐｏｎｉｃｕ
   ｓ　Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）の組織を培養してカルスを誘
   導する工程；（ｂ）得られたカルスを窒素源としてＮＨ
   ＿４＾＋およびＮＯ＿３＾−、そして炭素源としてシュ
   ークロースおよび／またはグルコースを含有する有機培
   地で培養する工程；および （ｃ）該カルスからチクセツサポニンを抽出する工程； を包含するチクセツサポニンの製造法。 ２、前記培地のＮＨ＿４＾＋が２．８〜５５．６ｍＭ（
   ０．０５〜１．０ｇ／ｌ）の割合で、そしてＮＯ＿３＾
   −が１１．３〜８０．６ｍＭ（０．７〜５．０ｇ／ｌ）
   の割合で含有される特許請求の範囲第１項に記載の製造
   法。 ３、前記培地にシュークロースが３〜７重量％の割合で
   、および／またはグルコースが３〜５重量％の割合で含
   有される特許請求の範囲第１項に記載の製造法。