JPH02215399A - 核酸の検出法 - Google Patents
核酸の検出法Info
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- JPH02215399A JPH02215399A JP3567089A JP3567089A JPH02215399A JP H02215399 A JPH02215399 A JP H02215399A JP 3567089 A JP3567089 A JP 3567089A JP 3567089 A JP3567089 A JP 3567089A JP H02215399 A JPH02215399 A JP H02215399A
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- target dna
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- Saccharide Compounds (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（イ）産業上の利用分野
この発明は、核酸の検出法に関する。さらに詳しくは、
目的ＤＮＡの検出を簡便に行うことができ、例えば生体
内に存在しうる病因性遺伝子の検出や遺伝子学的研究等
に有用な検出法に関する。
目的ＤＮＡの検出を簡便に行うことができ、例えば生体
内に存在しうる病因性遺伝子の検出や遺伝子学的研究等
に有用な検出法に関する。
（ロ）従来の技術
特定のＤＮＡの検出のために、目的ＤＮＡと相補的な塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドを利用し、これに蛍
光物質、放射性同位体、酵素等による標識化を行ったい
わゆるオリゴヌクレオチドプローブを用いる方法が知ら
れている。
基配列を有するオリゴヌクレオチドを利用し、これに蛍
光物質、放射性同位体、酵素等による標識化を行ったい
わゆるオリゴヌクレオチドプローブを用いる方法が知ら
れている。
かかる従来のＤＮＡの検出法は、基本的に、検体や細胞
破砕液等のＤＮＡ含有試料をアルカリ処理や熱処理に付
して目的ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性する工程、この−
木繊ＤＮＡを、ナイロンやニドミセルロースメンブラン
等の支持体に固定化する工程、固定化された一本ｍｌＤ
ＮＡに上記したオリゴヌクレオチドプローブを作用させ
てハイブリダイゼーションを行う工程、及びハイブリダ
イゼーション後のメンプランを洗浄した後、固定化ＤＮ
Ａの標識部位の蛍光強度、放射活性、酸素活性等に基づ
いてＤＮＡを検出する工程から構成される。
破砕液等のＤＮＡ含有試料をアルカリ処理や熱処理に付
して目的ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性する工程、この−
木繊ＤＮＡを、ナイロンやニドミセルロースメンブラン
等の支持体に固定化する工程、固定化された一本ｍｌＤ
ＮＡに上記したオリゴヌクレオチドプローブを作用させ
てハイブリダイゼーションを行う工程、及びハイブリダ
イゼーション後のメンプランを洗浄した後、固定化ＤＮ
Ａの標識部位の蛍光強度、放射活性、酸素活性等に基づ
いてＤＮＡを検出する工程から構成される。
そして最近、微量の目的ＤＮＡの高感度検出手法として
、上記した固定化工程の前に、目的ＤＮＡの塩基配列の
一部と相捕的な塩基配列を有する短鎖（通常１０〜３０
ヌクレオチド）のオリゴヌクレオチドからなるＤＮＡプ
ライマーを結合させ、これにポリメラーゼの存在下でｄ
ＡＴＰ、ｄＧＴＰ。
、上記した固定化工程の前に、目的ＤＮＡの塩基配列の
一部と相捕的な塩基配列を有する短鎖（通常１０〜３０
ヌクレオチド）のオリゴヌクレオチドからなるＤＮＡプ
ライマーを結合させ、これにポリメラーゼの存在下でｄ
ＡＴＰ、ｄＧＴＰ。
ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰのようなヌクレオチド試薬を作用さ
せることにより目的ＤＮＡを複製し、これを必要に応じ
て繰り返すことで目的ＤＮＡを増幅し、増幅された目的
ＤＮＡについて再び一本鎖に変性して上記検出操作に付
す方法も提案されており、いわゆるＰ ＣＲ（ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によ
るＤＮＡ検出法として知られている。
せることにより目的ＤＮＡを複製し、これを必要に応じ
て繰り返すことで目的ＤＮＡを増幅し、増幅された目的
ＤＮＡについて再び一本鎖に変性して上記検出操作に付
す方法も提案されており、いわゆるＰ ＣＲ（ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によ
るＤＮＡ検出法として知られている。
（ハ）発明が解決しようとする課題
しかしながら、いずれにせよ上記従来の検出法において
は、支持体に一本ｌｌＤＮＡを固定する際に、熱処理や
紫外線照射処理を行う必要があり、専用の装置か必要に
なると共に、取扱いが煩雑で時間が掛かる不都合があっ
た。さらに、固定化後に、ハイブリダイゼーションが必
要になるため、固定化ＤＮＡを至適温度に保持する必要
かあり、上記と同様に専用の装置が必要であると共に、
取扱いが煩雑であった。
は、支持体に一本ｌｌＤＮＡを固定する際に、熱処理や
紫外線照射処理を行う必要があり、専用の装置か必要に
なると共に、取扱いが煩雑で時間が掛かる不都合があっ
た。さらに、固定化後に、ハイブリダイゼーションが必
要になるため、固定化ＤＮＡを至適温度に保持する必要
かあり、上記と同様に専用の装置が必要であると共に、
取扱いが煩雑であった。
この発明は、かかる状況下なされた乙のであり、目的Ｄ
ＮＡを簡便に検出でき、ことにハイブリダイゼーション
や従来のごとき支持体への固定化処理を行うことなくＤ
ＮＡ検出を行うことができろ検出法を提供しようとする
ものである。
ＮＡを簡便に検出でき、ことにハイブリダイゼーション
や従来のごとき支持体への固定化処理を行うことなくＤ
ＮＡ検出を行うことができろ検出法を提供しようとする
ものである。
（ニ）課題を解決するための手段
かくしてこの発明によれば、（ａ）目的ＤＮＡと一本１
１ＤＮＡに変性する工程、（ｂ）上記−木繊ＤＮＡに、
目的ＤＮＡの塩基配列の一部と相捕的な塩基配列を有す
る短鎖のオリゴヌクレオチドからなりかつジスルフィド
結合を介してＤＮＡ固定用官能基を有してなるＤＮＡプ
ライマーを結合させる工程、（ｃ）ＤＮＡプライマーが
結合した一本鎖ＤＮＡに、ポリメラーゼの存在下でヌク
レオチド試薬を作用させることによりＤＮＡ固定用官能
基で修飾された目的ＤＮＡの複製物を作製する工程、（
ｄ）複製された上記目的ＤＮＡを上記ＤＮＡ固定用官能
基と反応して結合しうる官能基を有する水不溶性担体に
水系媒体中で作用させて、該目的ＤＮＡを水不溶性担体
に固定する工程、（ｅ）上記ＤＮＡ固定水不溶性担体に
吸光性又は蛍光性のＤＮＡ染色剤を水系媒体中で作用さ
せて該ＤＮＡを染色する工程、（ｒ）染色されたＤＮＡ
の吸光度又は蛍光強度に基づいて目的ＤＮＡを検出する
工程、からなる核酸の検出法が提供される。
１ＤＮＡに変性する工程、（ｂ）上記−木繊ＤＮＡに、
目的ＤＮＡの塩基配列の一部と相捕的な塩基配列を有す
る短鎖のオリゴヌクレオチドからなりかつジスルフィド
結合を介してＤＮＡ固定用官能基を有してなるＤＮＡプ
ライマーを結合させる工程、（ｃ）ＤＮＡプライマーが
結合した一本鎖ＤＮＡに、ポリメラーゼの存在下でヌク
レオチド試薬を作用させることによりＤＮＡ固定用官能
基で修飾された目的ＤＮＡの複製物を作製する工程、（
ｄ）複製された上記目的ＤＮＡを上記ＤＮＡ固定用官能
基と反応して結合しうる官能基を有する水不溶性担体に
水系媒体中で作用させて、該目的ＤＮＡを水不溶性担体
に固定する工程、（ｅ）上記ＤＮＡ固定水不溶性担体に
吸光性又は蛍光性のＤＮＡ染色剤を水系媒体中で作用さ
せて該ＤＮＡを染色する工程、（ｒ）染色されたＤＮＡ
の吸光度又は蛍光強度に基づいて目的ＤＮＡを検出する
工程、からなる核酸の検出法が提供される。
この発明は、ＤＮＡ検出に際し、末端にジスルフィド結
合を介して固定用官能基を有するＤＮＡプライマーを用
いて目的ＤＮＡを複製する点を第１の特徴とする乙ので
ある。そして、複製された固定用官能基含有ＤＮＡを水
不溶性の担体に固定した状態で染色を行い、この染色さ
れたＤＮＡの吸光度又は蛍光度に基づいて目的ＤＮＡの
検出を行う点を第２の特徴とするものである。
合を介して固定用官能基を有するＤＮＡプライマーを用
いて目的ＤＮＡを複製する点を第１の特徴とする乙ので
ある。そして、複製された固定用官能基含有ＤＮＡを水
不溶性の担体に固定した状態で染色を行い、この染色さ
れたＤＮＡの吸光度又は蛍光度に基づいて目的ＤＮＡの
検出を行う点を第２の特徴とするものである。
（ｔ）ＮＡプライマー）
この発明で用いるＤＮＡプライマー（よ、目的ＤＮＡの
塩基配列の一部を相捕的な塩基配列を有する短鎖のオリ
ゴヌクレオチドに、ジスルフィド結合を介してＤＮＡ固
定用官能基を結合することにより作製することができる
。
塩基配列の一部を相捕的な塩基配列を有する短鎖のオリ
ゴヌクレオチドに、ジスルフィド結合を介してＤＮＡ固
定用官能基を結合することにより作製することができる
。
ここで短鎖のオリゴヌクレオチドとしては、ＰＣＲ法で
用いられるＤＮＡプライマーと同程度の長さ、通常ｌＯ
〜３０ヌクレオチド程度のもの、を用いるのが適してお
り、塩基配列は目的ＤＮＡの末端に対応させるのが適し
ている。
用いられるＤＮＡプライマーと同程度の長さ、通常ｌＯ
〜３０ヌクレオチド程度のもの、を用いるのが適してお
り、塩基配列は目的ＤＮＡの末端に対応させるのが適し
ている。
かかるオリゴヌクレオチドに上記Ｄ Ｎ Ａ固定用官能
基を導入するに当り、まずジスルフィド基による化学修
飾が行われる。この化学修飾は、オリゴヌクレオチドに
、ジスルフィド結合を有し両端に各々アミノ基を有する
シスタミンのようなジアミノ化合物を水系中で作用させ
ることにより行なうことができろ。ここで用いるジアミ
ノ化合物としては、下式（Ｉ）： ＨＪ （ＣＨｔ）−−３５−（ＣＨｔ）、、−ＮＨ＊
・・・・・・（１）（式中、ｍ、ｎは各々！〜１２の整
数を示す）で現されろ化合物又はその塩を用いるのが適
している。
基を導入するに当り、まずジスルフィド基による化学修
飾が行われる。この化学修飾は、オリゴヌクレオチドに
、ジスルフィド結合を有し両端に各々アミノ基を有する
シスタミンのようなジアミノ化合物を水系中で作用させ
ることにより行なうことができろ。ここで用いるジアミ
ノ化合物としては、下式（Ｉ）： ＨＪ （ＣＨｔ）−−３５−（ＣＨｔ）、、−ＮＨ＊
・・・・・・（１）（式中、ｍ、ｎは各々！〜１２の整
数を示す）で現されろ化合物又はその塩を用いるのが適
している。
この化学修飾において、このジアミノ化合物残基がオリ
ゴヌクレオチドに導入されるが、この導入位置は、オリ
ゴヌクレオチドの５′末端か核酸塩基のいずれかに選択
できる。
ゴヌクレオチドに導入されるが、この導入位置は、オリ
ゴヌクレオチドの５′末端か核酸塩基のいずれかに選択
できる。
５′末端への導入は、通常、オリゴヌクレオチドにポリ
ヌクレオチドキナーゼを水溶液中で作用させてその５′
末端の水酸基をリン酸基に変換し、次いで緩和な条件下
で、例えば、カルボジイミド系の縮合剤を用いて上記リ
ン酸基とジアミノ化合物を反応させる、いわゆるホスホ
ロアミデート法により行うことができる（Ｃｈｕ、Ｂ、
Ｆ、ｅｔａｌ、！ｆｕｅｌ。
ヌクレオチドキナーゼを水溶液中で作用させてその５′
末端の水酸基をリン酸基に変換し、次いで緩和な条件下
で、例えば、カルボジイミド系の縮合剤を用いて上記リ
ン酸基とジアミノ化合物を反応させる、いわゆるホスホ
ロアミデート法により行うことができる（Ｃｈｕ、Ｂ、
Ｆ、ｅｔａｌ、！ｆｕｅｌ。
Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、１ｌ（１９８３）６５１３）。か
かる反応により、５′末端のリン酸基のＯＨ基とジアミ
ノ化合物の一端のアミノ基との脱水縮合反応が生じて、
下式のように上記ジアミノ化合物残基がオリゴヌクレオ
チドに導入されることとなる。
かる反応により、５′末端のリン酸基のＯＨ基とジアミ
ノ化合物の一端のアミノ基との脱水縮合反応が生じて、
下式のように上記ジアミノ化合物残基がオリゴヌクレオ
チドに導入されることとなる。
Ｉ
蓄
一方、核酸塩基への導入は、よく知られたシトシンの４
位のアミノ基転位反応を利用することにより行うことが
できる。かかる反応によりオリゴヌクレオチドの核酸塩
基におけるオキシ基とジアミノ化合物の一端のアミノ基
との脱水縮合反応が生じて例えば下式のようにジアミノ
化合物残基がオリゴヌクレオチドに導入されることとな
る。
位のアミノ基転位反応を利用することにより行うことが
できる。かかる反応によりオリゴヌクレオチドの核酸塩
基におけるオキシ基とジアミノ化合物の一端のアミノ基
との脱水縮合反応が生じて例えば下式のようにジアミノ
化合物残基がオリゴヌクレオチドに導入されることとな
る。
二のようにして反応液中に得られた化学修飾オリゴヌク
レオチドは、通常、液体クロマトグラフィや電気泳動法
等により精製してＤＮＡ固定用官能基を結合する工程に
用いられる。
レオチドは、通常、液体クロマトグラフィや電気泳動法
等により精製してＤＮＡ固定用官能基を結合する工程に
用いられる。
ここでＤＮＡ固定用官能基の結合は、上記で得られた化
学修飾オリゴヌクレオチドを必要に応じて架橋剤を用い
て、後述する水不溶性担体の官能基と水系媒体中で容易
に反応して結合しうる他の官能基を有する化合物（ＤＮ
Ａ固定用化合物）と反応させることにより行うことがで
きる。このようなりＮＡ固定用化合物と水不溶性担体の
官能基との組合せとしては、例えばビオチン／アビジン
の組合せや、各種抗体／抗原の組合せが挙げられる。ビ
オチンを用いる場合には、アミノ基あるいはチオール基
と反応性を有するビオチン誘導体が適している。また、
ハプテン（抗原基）を用いる場合には、チオール基を有
するもの、あるいはアミノ基を有するものが適しており
、又はアミノ反応性基と反応性を有する架橋剤［例えば
、Ｎ−スクシンイミド−３−（２−ピリジルチオ）プロ
ピオネートやマレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド誘導体類］と組み合わせて用いろことができる。
学修飾オリゴヌクレオチドを必要に応じて架橋剤を用い
て、後述する水不溶性担体の官能基と水系媒体中で容易
に反応して結合しうる他の官能基を有する化合物（ＤＮ
Ａ固定用化合物）と反応させることにより行うことがで
きる。このようなりＮＡ固定用化合物と水不溶性担体の
官能基との組合せとしては、例えばビオチン／アビジン
の組合せや、各種抗体／抗原の組合せが挙げられる。ビ
オチンを用いる場合には、アミノ基あるいはチオール基
と反応性を有するビオチン誘導体が適している。また、
ハプテン（抗原基）を用いる場合には、チオール基を有
するもの、あるいはアミノ基を有するものが適しており
、又はアミノ反応性基と反応性を有する架橋剤［例えば
、Ｎ−スクシンイミド−３−（２−ピリジルチオ）プロ
ピオネートやマレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド誘導体類］と組み合わせて用いろことができる。
かかる結合反応は、通常上記ＤＮＡ固定用化合物を、必
要に応じて架橋剤と水系中で反応させた後、前述した化
学修飾オリゴヌクレオチドと水系中で反応させることに
より行うのが適している。
要に応じて架橋剤と水系中で反応させた後、前述した化
学修飾オリゴヌクレオチドと水系中で反応させることに
より行うのが適している。
いずれの反応も、緩和な条件下で混合することにより進
行させることができる。
行させることができる。
なお、架橋剤及びＤＮＡ固定用化合物の使用量は、化学
修飾オリゴヌクレオチドに対し、５〜２５当量とするの
が適している。
修飾オリゴヌクレオチドに対し、５〜２５当量とするの
が適している。
（ＤＮＡの複製）
このようにして得られたＤＮＡ固定用官能基を有するＤ
ＮＡプライマーを用いて一本ｍｊＤＮＡから目的ＤＮＡ
の複製が行われる。かかるＤＮＡプライマーは（＋）
（−）の二種類同時に用いることもできる。この複製の
手順、方法は、いわゆるＰＣＲ法における複製の手順と
同様にして行うことができる。すなわち水系媒体中でア
ルカリ処理又は加熱処理により目的ＤＮＡを一本＠ＤＮ
Ａに変性した後、上記ＤＮＡプライマーを添加して緩和
な温度下でアニーリングを行い、次いでポリメラーゼと
順次ヌクレオチド試薬（ｄＡＴＰ。
ＮＡプライマーを用いて一本ｍｊＤＮＡから目的ＤＮＡ
の複製が行われる。かかるＤＮＡプライマーは（＋）
（−）の二種類同時に用いることもできる。この複製の
手順、方法は、いわゆるＰＣＲ法における複製の手順と
同様にして行うことができる。すなわち水系媒体中でア
ルカリ処理又は加熱処理により目的ＤＮＡを一本＠ＤＮ
Ａに変性した後、上記ＤＮＡプライマーを添加して緩和
な温度下でアニーリングを行い、次いでポリメラーゼと
順次ヌクレオチド試薬（ｄＡＴＰ。
ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）を添加して一本１１Ｄ
ＮＡを鋳型として相補的なポリヌクレオチド順を成長さ
せることにより行うことができる。なお、目的ＤＮＡ自
体は、ＰＣＲ法で増幅されたものを用いてもよく、高感
度検出の点で増幅されたものを用いるのが好ましい。
ＮＡを鋳型として相補的なポリヌクレオチド順を成長さ
せることにより行うことができる。なお、目的ＤＮＡ自
体は、ＰＣＲ法で増幅されたものを用いてもよく、高感
度検出の点で増幅されたものを用いるのが好ましい。
（固定）
上記複製ＤＮＡを固定する担体としては、複製ＤＮＡに
おけるＤＮＡ固定用官能基を反応して結合しうる他の官
能基を有する水不溶性担体が用いられる。かかる担体の
材質としては、水系媒体中で分散しうる粒状体を用いる
のが適しており、例えばアクリルアミドゲル、セファロ
ースゲルのような有機ポリマーからなる粒状体、やシリ
カゲルのような無機物質からなる粒状体が挙げられる。
おけるＤＮＡ固定用官能基を反応して結合しうる他の官
能基を有する水不溶性担体が用いられる。かかる担体の
材質としては、水系媒体中で分散しうる粒状体を用いる
のが適しており、例えばアクリルアミドゲル、セファロ
ースゲルのような有機ポリマーからなる粒状体、やシリ
カゲルのような無機物質からなる粒状体が挙げられる。
また、上記池の官能基としては、前述したごとき、アビ
ジン残基や抗体を用いることができ、これらは公知の手
法により上記担体に化学固定、物理固定手法等により固
定した状態で用いることができる。
ジン残基や抗体を用いることができ、これらは公知の手
法により上記担体に化学固定、物理固定手法等により固
定した状態で用いることができる。
複製ＤＮＡの上記担体への固定は、緩和な温度下、水系
中でこれらを混合することにより迅速に行われ、とくに
熱処理や紫外線照射処理等を施す必要はない。
中でこれらを混合することにより迅速に行われ、とくに
熱処理や紫外線照射処理等を施す必要はない。
この固定化が行われた後、水洗により夾雑成分や未反応
成分を系から効率良く除去することができ、通常、この
水洗後に次の染色工程が行われる。
成分を系から効率良く除去することができ、通常、この
水洗後に次の染色工程が行われる。
（染色）
この発明でＤＮＡ染色剤とは、吸光性又は蛍光性を有し
かつ水性媒体中でＤＮＡ二本鎖内に迅速に取り込まれる
水溶性物質を意味し、とくに可視光での吸光性を有する
ものでなくてらよい。通常、高感度検出の点で蛍光性を
有するものを用いるのが適しており、この例としてはエ
チジウムブロマイド、アクリジンオレンジ等が挙げられ
る。
かつ水性媒体中でＤＮＡ二本鎖内に迅速に取り込まれる
水溶性物質を意味し、とくに可視光での吸光性を有する
ものでなくてらよい。通常、高感度検出の点で蛍光性を
有するものを用いるのが適しており、この例としてはエ
チジウムブロマイド、アクリジンオレンジ等が挙げられ
る。
かかる染色工程の後に、ＤＮＡの検出が行われるが、通
常、この検出の前に、洗浄が行われこれにより過剰の染
色剤が効率良く除去できる。
常、この検出の前に、洗浄が行われこれにより過剰の染
色剤が効率良く除去できる。
（ＤＮＡ検出）
検出は、染色されたＤ Ｎ Ａの吸光度又は蛍光測定に
基づいて光学的に行われる。この光学的検出は、染色さ
れたＤＮＡを固定した担体を、適当な支持体（例えば、
濾紙、ガラスフィルタ等）に担持させた状態で行うこと
もできるが、高感度検出の観点から、染色されたＤＮＡ
固定水不溶性担体に還元剤を水系媒体中で作用さけて固
定化されたＤＮＡのジスルフィド結合を開裂して上記水
不溶性担体から染色ＤＮＡを分離し、この分離された染
色ＤＮＡ含有水系媒体を光学的分析に付してその吸光度
又は蛍光度を測定するのが好ましい。この際用いる還元
剤としては、例えばジチオスレイトール、メルカプトエ
タノール、メルカプトエチルアミン等が挙げられる。
基づいて光学的に行われる。この光学的検出は、染色さ
れたＤＮＡを固定した担体を、適当な支持体（例えば、
濾紙、ガラスフィルタ等）に担持させた状態で行うこと
もできるが、高感度検出の観点から、染色されたＤＮＡ
固定水不溶性担体に還元剤を水系媒体中で作用さけて固
定化されたＤＮＡのジスルフィド結合を開裂して上記水
不溶性担体から染色ＤＮＡを分離し、この分離された染
色ＤＮＡ含有水系媒体を光学的分析に付してその吸光度
又は蛍光度を測定するのが好ましい。この際用いる還元
剤としては、例えばジチオスレイトール、メルカプトエ
タノール、メルカプトエチルアミン等が挙げられる。
（ホ）作用
水不溶性担体と特異的に結合しつるＤＮＡ固定用官能基
を有するＤＮＡプライマーを用いることにより、複製Ｄ
ＮＡを該担体に効率良く固定することができろ。そして
ＤＮＡの検出は染色法で行われるが、染色法されたＤ
Ｎ Ａが不溶性担体に固定されているため、水洗により
夾雑成分等と容易に分離することができろ。
を有するＤＮＡプライマーを用いることにより、複製Ｄ
ＮＡを該担体に効率良く固定することができろ。そして
ＤＮＡの検出は染色法で行われるが、染色法されたＤ
Ｎ Ａが不溶性担体に固定されているため、水洗により
夾雑成分等と容易に分離することができろ。
従って、従来のごとき支持体への煩雑な固定処理や熱処
理を行うことなくしかも煩雑なバイブリダイゼーシロン
を行うことなく、ＤＮＡの簡便な検出や高感度な検出が
可能となる。
理を行うことなくしかも煩雑なバイブリダイゼーシロン
を行うことなく、ＤＮＡの簡便な検出や高感度な検出が
可能となる。
（へ）実施例
１、オリゴヌクレオチドの化学修飾
（１）オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドとしては１、Ｍ１３ｍｐ８用のプラ
イマー（５’ −ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ
−３’及び５ ’ −ＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧ
ＡＧＣ−３”）を島津自動合成機Ｎ５−１で化学合成後
ＨＰＬＣ精製したものを用いた。このプライマーは、Ｍ
１３ｍｐ８ＲＦ−ＤＮＡ（目的ＤＮＡ）（＋）鎖あるい
は（−）＠に相補的な配列をもつ１７量体あるいは１８
量体である。
イマー（５’ −ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ
−３’及び５ ’ −ＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧ
ＡＧＣ−３”）を島津自動合成機Ｎ５−１で化学合成後
ＨＰＬＣ精製したものを用いた。このプライマーは、Ｍ
１３ｍｐ８ＲＦ−ＤＮＡ（目的ＤＮＡ）（＋）鎖あるい
は（−）＠に相補的な配列をもつ１７量体あるいは１８
量体である。
なお、鋳型としてＭＬ３１１）８ ＲＦ Ｉ Ｄ
Ｎ Ａブライマーとして上記した２種のプライマーを用
いてＰＣＢ反応を行うと約１２０量体の位置に相当する
電気泳動パターンが得られた。本結果は予想位置と一致
した。
Ｎ Ａブライマーとして上記した２種のプライマーを用
いてＰＣＢ反応を行うと約１２０量体の位置に相当する
電気泳動パターンが得られた。本結果は予想位置と一致
した。
（２）反応
■リン酸基の導入
上記オリゴヌクレオチドの溶？＆（５０Ｄ、３０Ｍｇ）
をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ３０ユニットで処理（
３７℃２．５時間）し、５′位へリン酸残基を導入した
。反応溶液をＳＥＰ ＰＡＫ Ｃ”カラムを用いて精
製し３峠の溶出液を得た。溶出液を振盪下真空濃縮した
。
をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ３０ユニットで処理（
３７℃２．５時間）し、５′位へリン酸残基を導入した
。反応溶液をＳＥＰ ＰＡＫ Ｃ”カラムを用いて精
製し３峠の溶出液を得た。溶出液を振盪下真空濃縮した
。
■シスタミン残基の導入
５′位リン酸化プローブ（ＩＯＤ）を、縮合剤としての
１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド（ＥＣＤＩ）（ＩＭ ｔｏμＱ）の存在下、ル
チジンバッファー（ｐＨ７，５，０，７５Ｍ、 ８８ｍ
１２）中で、シスタミン［ＨｔＮ−（Ｃｕｔ） ！−５
−３−（ＣＨＩ） Ｊｕｔ］の２塩酸塩（ＩＭ、２μＱ
）と室温で一昼夜反応させた。反応溶液はＨＰＬＣにて
目的ピークを回収し、娠とう下真空濃縮した。
１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド（ＥＣＤＩ）（ＩＭ ｔｏμＱ）の存在下、ル
チジンバッファー（ｐＨ７，５，０，７５Ｍ、 ８８ｍ
１２）中で、シスタミン［ＨｔＮ−（Ｃｕｔ） ！−５
−３−（ＣＨＩ） Ｊｕｔ］の２塩酸塩（ＩＭ、２μＱ
）と室温で一昼夜反応させた。反応溶液はＨＰＬＣにて
目的ピークを回収し、娠とう下真空濃縮した。
これにより下式に示す化学修飾（シスタミン導入）され
たオリゴヌクレオチドを得た。
たオリゴヌクレオチドを得た。
２、ＤＮＡ固定用官能基の導入
上記で得られたシスタミン導入オリゴヌクレオチド（０
，７００）をＰＲＳＬＧＯ村に溶解し撹拌下、２５倍当
量のビオチン−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドを添加して室温下２時間反応させること
により、下記のような５°−ビオチン化プライマーを合
成し、ＨＰＬＣあるいはゲル電気泳動で精製した。
，７００）をＰＲＳＬＧＯ村に溶解し撹拌下、２５倍当
量のビオチン−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドを添加して室温下２時間反応させること
により、下記のような５°−ビオチン化プライマーを合
成し、ＨＰＬＣあるいはゲル電気泳動で精製した。
（以下余白）
べ
／ ＼
３、目的ＤＮＡの複製
Ｍ１３ｍｐ ８ ＲＦ−ＤＮ Ａ １ ａｍｏｌ （Ｉ
Ｏ−”５ｏｌ）を目的ＤＮＡとして用い、上記で合成
した５゛−ビオチン化プライマー（５０μｍｏｌ ）及
び未修飾プライマー（５０μｍｏｌ） 、Ｔａｑポリメ
ラーゼ、ヌクレオチド試薬ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ％ｄＣＴ
Ｐ１ｄＧＴＰ、 ｄＴＴＰ）を加えて、これをＰＣＲ法
により４０回増幅した。これにより、５°−ビオチン化
プライマーがＰＣＲ反応で増巾した２本鎖ＤＮＡ断片に
結合されたことになる。
Ｏ−”５ｏｌ）を目的ＤＮＡとして用い、上記で合成
した５゛−ビオチン化プライマー（５０μｍｏｌ ）及
び未修飾プライマー（５０μｍｏｌ） 、Ｔａｑポリメ
ラーゼ、ヌクレオチド試薬ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ％ｄＣＴ
Ｐ１ｄＧＴＰ、 ｄＴＴＰ）を加えて、これをＰＣＲ法
により４０回増幅した。これにより、５°−ビオチン化
プライマーがＰＣＲ反応で増巾した２本鎖ＤＮＡ断片に
結合されたことになる。
４、水不溶性担体への固定
アビジンを直接架橋したアガロースビーズをｌｘ ｓｓ
ｃで２回洗浄したらのを、上記ビオチン修飾ＤＮＡ含有
水溶液中に添加した。ビオチンとアビジンの結合定数は
非常に大きいため上記ゲルの添加混合によりビオチン修
飾ＤＮＡが室温下で速やかに該ビーズ（水不溶性担体）
に固定されることとなる。
ｃで２回洗浄したらのを、上記ビオチン修飾ＤＮＡ含有
水溶液中に添加した。ビオチンとアビジンの結合定数は
非常に大きいため上記ゲルの添加混合によりビオチン修
飾ＤＮＡが室温下で速やかに該ビーズ（水不溶性担体）
に固定されることとなる。
５、ＤＮＡの染色
上記固定化の後、この固定化物をポアサイズ０．４５μ
−のフィルタで濾取し、バッファーで充分に洗浄するこ
とによって、未反応の一本鎖ＤＮＡ。
−のフィルタで濾取し、バッファーで充分に洗浄するこ
とによって、未反応の一本鎖ＤＮＡ。
プライマー、その池夾雑物を除去した。
次いで固定化物をアクリジンオレンジの水溶液に接触さ
せることにより、染色を行った。染色後に水で充分に洗
浄することにより、過剰のアクリジンオレンジを除去し
た。
せることにより、染色を行った。染色後に水で充分に洗
浄することにより、過剰のアクリジンオレンジを除去し
た。
６、ＤＮＡの検出
上記のようにしてフィルタ上に担持された染色化ＤＮＡ
固定物に、還元剤としてのメルカプトエチルアミン（０
，１Ｍ）を含むリン酸緩衝液を加え３７℃で９０分反応
させた。これにより染色化ＤＮＡ固定化物におけるジス
ルフィド結合が速やかに開裂し、染色化ＤＮＡが液相に
分散溶解し、水不溶性担体と分離された。
固定物に、還元剤としてのメルカプトエチルアミン（０
，１Ｍ）を含むリン酸緩衝液を加え３７℃で９０分反応
させた。これにより染色化ＤＮＡ固定化物におけるジス
ルフィド結合が速やかに開裂し、染色化ＤＮＡが液相に
分散溶解し、水不溶性担体と分離された。
このＤＮＡ含有水溶液について、蛍光光度計を用いてそ
の蛍光度（Ｅ ｘ ４９０ｎｍ）を測定したところ、５
３０ｎｍと６４０ｎ＠に明確な蛍光ピークが確認された
。そして、この両ピー・りの強度比は、５３０ｎｓ＞６
４０１１であり、アクリジンオレンジ水溶液自体の強度
比を逆転していることから、ＤＮＡの二本鎖中に捕り込
まれたアクリジンオレンジによるものであることも確認
された。
の蛍光度（Ｅ ｘ ４９０ｎｍ）を測定したところ、５
３０ｎｍと６４０ｎ＠に明確な蛍光ピークが確認された
。そして、この両ピー・りの強度比は、５３０ｎｓ＞６
４０１１であり、アクリジンオレンジ水溶液自体の強度
比を逆転していることから、ＤＮＡの二本鎖中に捕り込
まれたアクリジンオレンジによるものであることも確認
された。
一方、染色剤としてエチジウムブロマイドを用いた際に
は、Ｅ ｘ ３００ｎ−で５９０ｎｓの蛍光ピークが呈
されるが、この蛍光ピーク強度は、−本ＪｉＤＮＡに結
合したエチジウムブロマイド水溶液に比して増大化され
たものであり、二本鎖ＤＮＡの捕り込まれたエチジウム
ブロマイドによるものであることも確認された。
は、Ｅ ｘ ３００ｎ−で５９０ｎｓの蛍光ピークが呈
されるが、この蛍光ピーク強度は、−本ＪｉＤＮＡに結
合したエチジウムブロマイド水溶液に比して増大化され
たものであり、二本鎖ＤＮＡの捕り込まれたエチジウム
ブロマイドによるものであることも確認された。
（ト）考案の効果
この発明の核酸の検出法によれば、従来のごとき煩雑な
固定化処理やハイブリダイゼーシヨンを行うことなく、
簡便に目的Ｄ Ｎ Ａを検出することができ、しいては
自動化、装置化が容易となり、従来に比してより高感度
な検出も可能である。
固定化処理やハイブリダイゼーシヨンを行うことなく、
簡便に目的Ｄ Ｎ Ａを検出することができ、しいては
自動化、装置化が容易となり、従来に比してより高感度
な検出も可能である。
平成元年 ６月３０日
１、事件の表示
平成１年特許願第３５６７０号
２、発明の名称
核酸の検出法
３、補正をする者
事件との関係 特許出願人
住 所 京都市中京区西ノ京栗原町１番地名 称
（１９９）株式会社 島津製作所代表者 四へ蜂 實 ４、代理人 住所 〒５３０ 大阪市北区西天満５丁目１−３クォーター・ワンビル補
正の内容 １、明細書第４頁下から２行目の「目的ＤＮＡと」を「
目的ＤＮＡを」に訂正する。
（１９９）株式会社 島津製作所代表者 四へ蜂 實 ４、代理人 住所 〒５３０ 大阪市北区西天満５丁目１−３クォーター・ワンビル補
正の内容 １、明細書第４頁下から２行目の「目的ＤＮＡと」を「
目的ＤＮＡを」に訂正する。
２、同書第６頁第１５〜１６行目の「用いるのが適して
おり、塩基配列は目的ＤＮＡの末端に対応させるのが適
している。」を「用いるのが適している。」に訂正する
。
おり、塩基配列は目的ＤＮＡの末端に対応させるのが適
している。」を「用いるのが適している。」に訂正する
。
３、回書第１６頁の式の下３行目のｒ １００ｍ１２Ｊ
を「１００μｉ」に訂正する。
を「１００μｉ」に訂正する。
４、同書第１９頁下から４行目の「二本鎖ＤＮＡの」を
「二本鎖ＤＮＡに」に訂正する。
「二本鎖ＤＮＡに」に訂正する。
５、同書同頁の最下行の「（ト）考案の効果」を「（ト
）発明の効果」に訂正する。
）発明の効果」に訂正する。
６、補正の対象
特許請求の範囲
１． （ａ）目的ＤＮＡを一本１１ＤＮＡに変性する工
程、 （ｂ）上記−木繊ＤＮＡに、目的ＤＮＡの塩基配列の一
部と相捕的な塩基配列を育する短鎖のオリゴヌクレオチ
ドからなりかつジスルフィド結合を介してＤＮＡ固定用
官能基を有してなるＤＮＡプライマーを結合させる工程
、 （ｃ）ＤＮＡプライマーが結合した一本鎖ＤＮＡに、ポ
リメラーゼの存在下でヌクレオチド試薬を作用させるこ
とによりＤＮＡ固定用官能基で修飾された目的ＤＮＡの
複製物を作製する工程、（ｄ）複製された上記目的ＤＮ
Ａを上記ＤＮＡ固定用官能基と反応して結合しうる官能
基を有する水不溶性担体に水系媒体中で作用させて、該
目的ＤＮＡを水不溶性担体に固定する工程、（ｅ）上記
ＤＮＡ固定水不溶性担体に吸光性又は蛍光性のＤＮＡ染
色剤を水系媒体中で作用させて該ＤＮＡを染色する工程
、 （ｒ）染色されたＤＮＡの吸光度又は蛍光強度に基づい
て目的ＤＮＡを検出する工程、 からなる核酸の検出法。
程、 （ｂ）上記−木繊ＤＮＡに、目的ＤＮＡの塩基配列の一
部と相捕的な塩基配列を育する短鎖のオリゴヌクレオチ
ドからなりかつジスルフィド結合を介してＤＮＡ固定用
官能基を有してなるＤＮＡプライマーを結合させる工程
、 （ｃ）ＤＮＡプライマーが結合した一本鎖ＤＮＡに、ポ
リメラーゼの存在下でヌクレオチド試薬を作用させるこ
とによりＤＮＡ固定用官能基で修飾された目的ＤＮＡの
複製物を作製する工程、（ｄ）複製された上記目的ＤＮ
Ａを上記ＤＮＡ固定用官能基と反応して結合しうる官能
基を有する水不溶性担体に水系媒体中で作用させて、該
目的ＤＮＡを水不溶性担体に固定する工程、（ｅ）上記
ＤＮＡ固定水不溶性担体に吸光性又は蛍光性のＤＮＡ染
色剤を水系媒体中で作用させて該ＤＮＡを染色する工程
、 （ｒ）染色されたＤＮＡの吸光度又は蛍光強度に基づい
て目的ＤＮＡを検出する工程、 からなる核酸の検出法。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、（ａ）目的ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡに変性する工程、 （ｂ）上記一本鎖ＤＮＡに、目的ＤＮＡの塩基配列の一
部と相補的な塩基配列を有する短鎖のオリゴヌクレオチ
ドからなりかつジスルフィド結合を介してＤＮＡ固定用
官能基を有してなるＤＮＡプライマーを結合させる工程
、 （ｃ）ＤＮＡプライマーが結合した一本鎖ＤＮＡに、ポ
リメラーゼの存在下でヌクレオチド試薬を作用させるこ
とによりＤＮＡ固定用官能基で修飾された目的ＤＮＡの
複製物を作製する工程、（ｄ）複製された上記目的ＤＮ
Ａを上記ＤＮＡ固定用官能基と反応して結合しうる官能
基を有する水不溶性担体に水系媒体中で作用させて、該
目的ＤＮＡを水不溶性担体に固定する工程、 （ｅ）上記ＤＮＡ固定水不溶性担体に吸光性又は蛍光性
のＤＮＡ染色剤を水系媒体中で作用させて該ＤＮＡを染
色する工程、 （ｆ）染色されたＤＮＡの吸光度又は蛍光強度に基づい
て目的ＤＮＡを検出する工程、 からなる核酸の検出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3567089A JP2727625B2 (ja) | 1989-02-15 | 1989-02-15 | 核酸の検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3567089A JP2727625B2 (ja) | 1989-02-15 | 1989-02-15 | 核酸の検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02215399A true JPH02215399A (ja) | 1990-08-28 |
| JP2727625B2 JP2727625B2 (ja) | 1998-03-11 |
Family
ID=12448310
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3567089A Expired - Lifetime JP2727625B2 (ja) | 1989-02-15 | 1989-02-15 | 核酸の検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2727625B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998020020A3 (en) * | 1996-11-06 | 1998-10-22 | Sequenom Inc | High density immobilization of nucleic acids |
| US6133436A (en) * | 1996-11-06 | 2000-10-17 | Sequenom, Inc. | Beads bound to a solid support and to nucleic acids |
| US7232688B2 (en) | 1997-01-23 | 2007-06-19 | Sequenom, Inc. | Systems and methods for preparing and analyzing low volume analyte array elements |
| US9669376B2 (en) | 2000-10-30 | 2017-06-06 | Agena Bioscience, Inc. | Method and apparatus for delivery of submicroliter volumes onto a substrate |
-
1989
- 1989-02-15 JP JP3567089A patent/JP2727625B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998020020A3 (en) * | 1996-11-06 | 1998-10-22 | Sequenom Inc | High density immobilization of nucleic acids |
| US6133436A (en) * | 1996-11-06 | 2000-10-17 | Sequenom, Inc. | Beads bound to a solid support and to nucleic acids |
| EP1460083A1 (en) * | 1996-11-06 | 2004-09-22 | Sequenom, Inc. | High density immobilization of nucleic acids |
| USRE41005E1 (en) * | 1996-11-06 | 2009-11-24 | Sequenom, Inc. | Beads bound to a solid support and to nucleic acids |
| US7232688B2 (en) | 1997-01-23 | 2007-06-19 | Sequenom, Inc. | Systems and methods for preparing and analyzing low volume analyte array elements |
| US9669376B2 (en) | 2000-10-30 | 2017-06-06 | Agena Bioscience, Inc. | Method and apparatus for delivery of submicroliter volumes onto a substrate |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2727625B2 (ja) | 1998-03-11 |
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