JPH01252300A - 検体中の目的核酸の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 技術分野 本発明は、いわゆるハイブリダイゼーション法を用いな
いで特定の遺伝子の塩基配列を検出する方法に関する。

より詳細には、検出すべき核酸配列に相補的な少くとも
１種のプライマーを用いて、核酸配列に相補的なプライ
マーの伸長反応を行って得られる核酸配列、またはプラ
イマーの伸長生成物同士で形成された二本鎖部分を有す
る核酸配列を、固相担体に固定化した後、検出する方法
に関する。

先行技術 遺伝子の分子生物学の急速な進歩に伴い、特定の遺伝子
の塩基配列を検出することはきわめて重要なものとなっ
てきている。例えば、遺伝病の出生前診断、癌の分子レ
ベルでの診断あるいはウィルスのような病原体の検出に
おいて遺伝子の検出を行うことは重大な意義がある。

このような遺伝子の検出を行うには、−船釣にはハイブ
リダイゼーションと呼ばれる方法か使イつれる（Ｂ、Ｄ
、　）ｔａｍｅｓ　　およびＳ、Ｊ、　Ｈｉｇｇｉｎｓ
：Ｎｕｃｌｅｉｃ　　ａｃｉｄ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ、　ａ　ｐｒａｃｔ］ｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ、
　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８５　）　ｏ　この方法
は、標的配列と相補的な塩基配列をもつ単鎖あるいは二
本鎖を放射性あるいは非放射性の標識物質で標識し、そ
ののち標的配列との相補性を利用して結合させて、すな
わちハイブリダイズさせて、標的配列を検出する方法で
ある。この場合、−船釣には、標的物質を担体に固定す
るドツトハイブリダイゼーション法ＣＤＮＡ、　４．３
２７−３３１．　（Ｉ９８５）　）あるいはサザンハイ
プリダイゼーション法［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣＩｏｎｉ
ｎｇ、ｐ３８２．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ４ｎｇＩｌａｒｂ
ｏｒ　（Ｉ９８２）　］等か行われる。しかしなから、
これらの方法は煩雑で手間かかかり、機械化の努力もさ
れているにもかかイっらず、未だに多数の試料をルーチ
ン作業として分析することは不可能である。これらの問
題を解消するためにプローブを担体に固定するハイブリ
ダイゼーション法か工夫されているか〔例えば、Ｔ、Ｒ
Ｇｉｎｇｅｒａｓら　Ｎｕｃｌｅｊｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅ５１５、５３７３−５３９０）　、このような液相−
固相間のハイブリダイゼーションには限界かあり、感度
等の点で実際に応用できる方法とはなり得ていない。

これらの液相−固相間のハイブリダイゼーションの欠点
を克服するためにサンドイッチ型の液相一液相ハイブリ
ダイゼーションが工夫されている〔例えば、Ａｎｎ−Ｃ
ｈｒｉｓｔｉｎｅ　５ｙｖａｅｎｅｎら１、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｃｓ、１４．５０３７−５０４８
　（Ｉ９８Ｇ）、特開昭６２−２２９０６８号公報〕。

しかしながら、これらの方法も、プローブを大過剰に使
う事から来る高いハックグラウンドや感度の点で、満足
のいくものとはなり得ていない。

また、感度を向上させるために、特定の核酸配列を増幅
する方法か開発されているか（特開昭６２−２８１号公
報）、この方法においてもハイブリダイゼーションの操
作は必要であって、煩雑さを減じることになっていない
。

〔発明の概要〕

要旨 本発明は、上記問題点を解決し、特定の塩基配列を容品
にしかも感度よく検出する方法を与えることを目的とし
、検出すべき核酸配列に相補的な少くとも１種のプライ
マーを用いて、該核酸配列に相補的なプライマーの伸長
反応を行って得られる核酸配列、またはプライマーの伸
長生成物同士で形成された、二本鎖部分を有する核酸配
列を、固相担体に固定化した後、検出する方法を提供す
ることによってこの問題を解決しようとするものである
。

従って、本発明による、検体中の少くとも一つの目的核
酸の検出方法は、下記の工程（イ）〜（ワ）を実施する
こと（ただし、工程（ハ）〜（ヌ）は、該目的核酸が存
在するものとして実施するものとする）、を特徴とする
ものである。

（イ）少くとも一つの目的核酸（以下、核酸（Ｉ）とい
う）存在の有無を検知しようとする検体を用意すること
。

（ロ）核酸（Ｉ）と相補的で、該核酸よりは短いが該核
酸と特異的にハイブリダイズするのに充分な長さの一本
鎖核酸（以下、核酸（ＩＩ）という）を用意すること。

（ハ）該検体中において、核酸（Ｉ）を、これが−水銀
のものであればそのままで、これが二本鎖のものであれ
ば一本鎖にしてからその少なくとも一方について、核酸
（ＩＩ）とハイブリダイズさせ、この核酸（ＩＩ）をプ
ライマーとしてそこへ単位核酸を付加させることによっ
て鎖長を伸長させて、生成合成核酸鎖と核酸（Ｉ）との
二本鎖核酸を形成させること。

（ニ）必要に応じて、該検体中において、上記二本鎖核
酸から該合成核酸鎖を遊離させること。

（ホ）必要に応じて、核酸（Ｉ）か二本鎖のものであっ
たときに６鎖について工程（ロ）、（ハ）および（ニ）
を実施して得られる二種の核酸鎖を、該検体中において
、その生得的な相補性を利用して相互にハイブリダイズ
させること。

（へ）必要に応じて、工程（イ）〜（ハ）または（イ）
〜（ホ）を実施して得られる二本鎖核酸について、これ
を−水銀にした後、その少くとも一方について、核酸（
ＩＩ）とハイブリダイズさせ、そこへ単位核酸を付加さ
せることによって鎖長を伸長させて二本鎖核酸を形成さ
せるか、あるいはこの二本鎖核酸の形成工程を核酸（Ｉ
）の６鎖について実施して得られる二本鎖核酸から該合
成核酸鎖を遊離させた後、核酸（Ｉ）の６鎖とハイブリ
ダイズしていた合成核酸鎖同志を、該検体中において、
その生得的な相補性を利用して相互にハイブリダイズさ
せて二本鎖核酸を形成させること。

（ト）必要に応じて、該検体中において、上記二本鎖核
酸から該合成核酸鎖を遊離させること。

（チ）必要に応じて、（へ）を実施した後、最終的に得
られる二本鎖核酸について、これを一本鎖にして、その
少くとも一方について、核酸（ＩＩ）とハイブリダイズ
させ、そこへ単位核酸を付加させることによって鎖長を
伸長させて二本鎖核酸を形成させるか、あるいはこの二
本鎖核酸の形成工程を核酸（Ｉ）の６鎖（ンついて実施
して得られる二本鎖核酸から該合成核酸鎖を遊離させた
後、核酸（Ｉ）の６鎖とハイブリダイズしていた合成核
酸鎖同志を、該検体中において、その生得的な相補性を
利用して相互にハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成
させることから成る工程を、１回行うかまたは複数回に
わたって順次段階的に繰り返して行なうこと。

（す）必要に応じて、該検体中において、上記二本鎖核
酸から該合成核酸鎖を遊離させること。

（ヌ）工程（ハ）、（ホ）、（へ）および（チ）の産物
である二本鎖核酸、工程（ニ）、（ト）および（す）の
産物である一本鎖核酸に、下記のいずれかの手段によっ
て、固体担体と結合しうる部位からなる官能基と検出可
能な標識からなる官能基とを持たせること。

（Ｉ）両官能基の一方をまたは双方を個々に持つプライ
マーまたは官能基を持たないプライマーの使用および両
官能基の一方をまたは双方を個々に持つ単位核酸または
官能基を持たない単位核酸の使用によって、該合成核酸
鎖を両官能基を持つものとして得る。

（ｉｊ）該合成核酸鎖を一方の官能基を持つものとして
形成させ、その後、そこへ、該検体中において、他方の
官能基を導入する。

（ル）工程（ヌ）の産物である両官能基を持つ核酸鎖を
、該固体担体と結合しうる部位からなる官能基を利用し
て、該検体中において、固体担体と結合させること。

（ヲ）工程（ル）より得られる固体担体を洗浄して、固
体担体に結合していない核酸を除去すること。

（ワ）工程（ヲ）より得られる固体担体を、該標識から
なる官能基を利用する検出操作にイ・］して、固体担体
に結合している核酸の有無を、検出すべき核酸に対応す
るものとして検知すること。

効果 本発明による核酸配列の検出法は、前記で定義したよう
に、ポリメラーゼなどを用いて二種類の標識物で標識さ
れた検出対象の複製物（核酸配列）を得、該標識物の一
方を固相担体の固定用に、他方を検出のための標識とし
て目的の遺伝子を検出することからなり、いわゆるハイ
ブリダイゼーションという煩雑な操作を必要とせず、現
在、他の分野例えば抗原抗体反応の分野で利用されてい
る装置を容易に本性に応用することができる。その結果
、−度に多検体を分析することができる。

そして、核酸のハイブリダイゼーションやゲル電気泳動
での核酸の分離を必要としないため、核酸を含む試料は
粗精製の状態でよく、試料の調製も容易で、装置を用い
て行うことができる。

また、本発明ではハイブリダイゼーションを行わないで
ブライマーによる伸長反応を行うために、分析時間を大
幅に短縮することかできる。さらに、本測定法において
あらかしめ用意しておく標識物質としては、標識化ブラ
イマーあるいは標識化モノヌクレオチドていずれも化学
的に大量合成でき、従来のハイブリダイセーンヨン法の
ように天然のＤＮＡフラグメントを酵素等を使って標識
する必要はない。

さらに、それぞれの検出しようとする試料中において、
目的核酸（Ｉ）の塩基配列か微妙に（−塩基以上）異な
る場合も、ポリメラーゼ等の反応条件を適当に調節する
ことにより、プライマーが目的核酸に完全に相補的であ
る場合とそうでない場合を区別することができる。つま
り、ハイブリダイモーション法等によらないで容易に点
突然変異をも検出することができる。

そして、それぞれ官能基の異なる標識物質で標識された
複数のプライマーを使用すれば、同時に一種類以上の目
的核酸（Ｉ）に対する伸長反応を行う事かでき、それぞ
れの標識物質の官能基を利用する横用操作を行う事によ
って、同時に多数の１」的核酸の存在の有無を調べる事
かできる。

〔発明の詳細な説明〕

検出原理 本発明による少くとも一つの目的核酸の検出法は前記の
工程（イ）〜（ワ）を含んでなるが、この方法は、（ｉ
）検体中の目的核酸（核酸（Ｉ）という）からそれと相
補性の核酸を検体中でつくって（この核酸を合成核酸と
いう）、それについて検出を行うこと、（ｉｉ）検体中
の合成核酸を固体担体に固定して、合成核酸上の標識を
利用して検出を行うこと、（０４）上記の（Ｉ１）を行
うために合成核酸を固体担体への結合部位からなる官能
基と標識からなる官能基とを導入したものとして得るが
、官能基の導入を合成核酸のみか両官能基を共に持つけ
れども共存核酸は両官能基を共に持つことかないように
行って（前記工程（ヌ））、固体担体上での検出を選択
的なものとすること、を基本原理とするものである。

このように、目的核酸の塩基配列を写しとった合成核酸
は、検体中においてそれのみが前記両官能基を持たせで
あるから、すなわち、検体中の共存非目的核酸はこれら
の官能基を全く持たないかあるいは一方だけしか（たと
えば、固体担体への結合部位）持たないようにしである
から、検体を固体担体と接触させてから該固体担体を洗
浄すると、担体との結合部位を持たない共存核酸は洗い
流され、一方このような部位を持つ共存核酸は固体に結
合しているけれどもこれは標識を持たないので、核酸結
合固体について検出操作を実施しても検出されることな
く目的核酸のみが検出されて、上記の選択検出か可能と
なる。なお、検体中に目的核酸か存在しなければ、合成
核酸は生成せず、固体担体に結合する標識付き核酸も無
いところから、検出結果は検体には目的核酸不在と川る
。

このような選択検出性を実現すべき前記両官能基の導入
は、所謂プライマー（前記の核酸（■））を使用して、
たとえば目的核酸がＤＮＡであればそれを一本鎖にして
からＤＮＡポリメラーゼにより、目的核酸がＲＮＡであ
れば逆転写酵素によって、プライマーから鎖長を伸長さ
せ、その際に、プライマーとして両官能基のいずれをも
持たないもの、または一方を持つもの、または双方を個
々に持つもの（すなわち２種以上）を使用し、鎖長延伸
の際のモノマーないし単位核酸として両官能基のいずれ
をも持たないもの、または一方を持つもの、または双方
を個々に持つもの（すなわち２種以上）を使用して、該
合成核酸鎖を両官能基を持つものとして得ること、によ
って行なうのか好ましい。このように得られる両官能基
を持つ合成核酸鎖の具体例を挙げれば、１］的核酸（Ｉ
）か二本鎖ＤＮＡであるときに一方の鎖について、また
は一本鎖ＤＮＡであるときにはそれについて、固体担体
への結合部位を持つプライマー（核酸（■））をハイブ
リダイズさせ、そこへ単位核酸としてのｄＡＴＰ、、ｄ
ＴＴＰ、ｄＧＴＰ。

ｄＣＴＰ等（詳細後記）の少なくとも一種の存在下にＤ
ＮＡポリメラーゼを働かせて該プライマーの鎖長を伸長
させる際に、単位核酸の一個ないし一種あるいは複数個
ないし複数種に標識を持たせたものを使用して原ＤＮＡ
鎖と合成核酸鎖との二本鎖としたもの、二本鎖ＤＮＡ鎖
の一方について上記の通りに二本鎖構造体をつくり（た
たし、標識を持たせた単位核酸を使用しない）、他方の
ＤＮＡ鎖についても上記の通りに二本鎖構造体をつくり
（ただし、プライマーとしては標識を持たせたものを使
用する）、両二本路構造体から原ＤＮＡ由来の鎖を除去
して合成路を遊離させ、両合成鎖をハイブリダイズさせ
て、プライマーから供給された両官能基を持つ二本鎖と
したもの（遊離させた各合成路についてプライマーの付
加および（または）鎖長の伸長ないし合成路の形成を行
って、合成路からなる二本鎖の増幅を行うこともてきる
）、その他がある。

両官能基の導入は、その他の合目的的な方法によって実
施するこもできる。たとえば、両酒能基の一方をプライ
マーおよび（または）単位核酸に持たせて合成路を形成
させ、その後、他方の官能基を導入する方法によること
ができる。

標識付き合成核酸は固体担体との結合部位をも持たせで
ある訳であるか、この場合の「固体担体との結合部位」
は必すしも固体担体と直結しうる部位でなくてもよい。

すなわち、合成核酸側の該部位と固体担体側の結合部位
との間に介在して両者の結合を可能ないし促進しうる物
質（「捕捉用試薬」　（詳細後記））を介して固体担体
との結合が実現しうるようなものであってもよい。この
捕捉用試薬は、合成核酸側の固体担体との結合部位にあ
らかじめ結合させておいてもよく、固体担体側の該結合
部位に結合させておいてもよい。

また、ポリメラーゼによるプライマーの延伸反応は、別
々の官能基（標識）をもつそれぞれ別々のプライマーを
用いて、同−検体中抜数個のｌ」的核酸（Ｉ）に対して
同時に検出を行うこともてきる。

検出の実際 ａ、核酸 本発明でいう検出すべき核酸とは、検出しようとする塩
基配列を含むものであって、ＤＮＡでもＲＮＡてもよい
。このような核酸は大腸菌、ビールスおよび高等動植物
なとあらゆる生命体から調製することができる。また、
上記核酸を、本検出法に用いる場合、核酸は精製されて
いても、されていなくてもよい。

ｂ、プライマーおよびその伸長反応 （＋）プライマ＝（核酸（■）） 本発明でいうプライマーは、検出しようとする上記核酸
の塩基配列（ＤＮＡの場合は変性などの手段により、二
本鎖核酸配列を一本鎖にする必要がある）と特異的に相
補鎖を形成し、その３′末端にモノヌクレオチドを順次
付加されるもので、３′末端の水酸基が不可欠である。

一般に、プライマーとはオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドのことをさすが、天然から得られる長鎖のＤＮＡフラ
グメントでもよい。目的核酸（核酸（Ｉ））と特異的に
ハイブリダイズするのに充分な長さのものであるべきで
ある。

点突然変異を検出しようとする場合は、点突然変異を起
した目的核酸と特異的にハイブリダイズするのに充分な
長さを有し、かつ完全に相補的なプライマー及び点突然
変異を起してない該核酸と特異的にハイブリダイズする
のに充分な長さを有し、かつ完全に相補的なプライマー
の二種を用いる。これらのプライマーはいずれもオリゴ
デオキシリボヌクレオチドである。

この様なプライマーの具体例としては、例えば（Ｉ）　
　何も修飾されてないプライマー、（ＩＩ）　　固相担
体と結合可能な部位を有するプライマー、 （ＩＩＩ）　　標識物質か導入されたプライマー、（Ｉ
Ｖ）　　互いに異るプライマーであって、一方か固相担
体と結合可能な部位を有し、他方に標識物質か導入され
たもの、 なとを用いることができる。

なお、ここでいうプライマーの標識物質または固相担体
と結合可能な部位は、プライマーの伸長反応を妨げない
位置であればとこでもよいか、好ましくは５′末端であ
る。

標識物質としては、非放射性、放射性物質のとちらを用
いてもよい。

非放射性の標識物質としては、例えば後記実験例で示し
たビオチンのほかに、２，４−ジニトロフェニル基、フ
ルオレセインおよびその誘導体〔フルオレセインイソチ
オンアネート （ＦＩＴｃ））、ローダミンおよびその誘導体〔例えば
、テトラメチルローダミンイソチオンネート（ＴＲＩＴ
Ｃ）、テキサスレッド等〕、４−フルオロ−７−ニトロ
ベンゾフラン（ＮＢＤＦ）およびダンシルなどの螢光物
質あるいは化学発光物質なとかあり、いずれも公知手段
（特開昭５９−９３０９８号、特開昭５９−９３０９９
号各公報参照）により、標識化を行うことかできる。

また、放射性物質で標識する場合は、例えば１３１■、
１３３Ｉ、１４ｃ、３Ｈ１３５ｓ、３２Ｐ等ノ放射性同
位元素を用いて公知の手段により標識物質を導入するこ
とかできる。

一方、固相担体と結合可能な部位は、該担体と選択的に
反応可能なものであれば何んてあってもよい。その−例
としては、上記非放射性標識物質をそのまま用いること
ができるが、その場合、検出に用いるべき標識物質とは
、同一のものであってはいけない。好ましい〜具体例と
しては、ビオチン、あるいはフルオレセインなどの螢光
物質または２，４−ジニトロフェニル基なとのハプテン
をあらかじめプライマーに導入しておくことかできる。

なお、ここでいう固相担体は、後記に定義したものであ
る。

プライマーのこれらによる標識化は、プライマーかオリ
ゴデオキンリボヌクレオチドの場合、オリゴデオキンリ
ボヌクレオチドの化学合成の後でまたは、同時に化学的
に行イつれる（特開昭５９−９３０９８、特開昭５９−
９３０９９号各公報参照またプライマーか天然フラクメ
ントの場合にも化学的に標識することかできる［Ｌ、Ｅ
、　Ｏｒｇｅｌ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｃ
ｓ、１４．５５９１−５６０３．　（Ｉ９８［ｉ）　］
。

１】）プライマーの伸長反応 上記、プライマーのうち、例えば■）のプライマー（互
いに異るプライマーであって、一方か同相担体と結合可
能な部位を有し、他方か標識物質か導入されたもの）を
用いた伸長反応は４種類のデオキシリボヌクレオチド三
リン酸であるデオキシアデノンン三リン酸、デオキシグ
アノシン三すン酸、デオキシシチジン三リン酸およびチ
ミジン三リン酸のうち少くとも１種を基質としてプライ
マーにとりこませることにより行うことかできる。

この伸長反応にはＥ、コーリＤＮＡポリメラーゼ１、Ｅ
、コーリ　ＤＮＡポリメラーセＩのクレノー断片、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーセ、あるいは逆転写酵素か使用できる
。特に、高温で伸長反応を行える耐熱酵素を用いればプ
ライマーによる標的配列認識の特異性を高めることもで
きるＣＦ、Ｆ、ＣＩ＋ｅｈａｂら：　Ｎａｔｕｒｅ　３
２９．２９３−２９４　（Ｉ９８７））。

また、（Ｉｌｌｌｒ）のプライマー（標識物質のみか導
入されたもの）を用いた伸長反応は、固相担体と結合可
能な部位が導入された４種のデオキシリボヌクレオチド
三リン酸のうち少くとも一種のデオキシリボヌクレオチ
ド三リン酸の存在下、（ＩＩ）のプライマー（固相担体
と結合可能な部位のみが導入されたもの）を用いた伸長
反応は、標識物質が導入された４種のデオキシリボヌク
レオチド三リン酸のうち少くとも一種のデオキシリボヌ
クレオチド三リン酸の存在下、さらに（Ｉ）のプライマ
ー（何も修飾されてないもの）を用いた伸長反応は、固
相担体と結合可能な部位が導入された４種のデオキシリ
ボヌクレオチド三リン酸のうち少くとも一種のデオキシ
リボヌクレオチド三リン酸の存在下、■）と同様に反応
を行うことにより、伸長反応の過程で、新たな標識物を
発生さぜることかてきる。

なお、ここでいう標識物質または固相担体と結合可能な
部位か導入された４種のデオキシリボヌクレオチド三リ
ン酸は何も修飾されてない該ヌクレオチドの塩基部分に
前記で定義した標識物質または固相担体と結合可能な部
位が導入されたものであり、これらの化合物には種々の
誘導体がある。一般に、これらの各種誘導体はプライマ
ーに取り込まれる効率か減少する場合もあるか、無修飾
化体と同様に取りこませることかできる。たたし３２Ｐ
なとの放射性物質で標識したデオキシリボヌクレオチド
三リン酸は、非標識のものと同程度の効率でとりこまれ
る。代表的な非放射性標識モノヌクレオチド三リン酸と
しては、ビオチン化モノヌクレオチドリン酸ＣＰ、ｌ？
、　Ｌａｎｇｅｒら：　ＰｒｏｃＮａｔ　Ｉ、Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７８．６６３３−８６３７　
（Ｉ９８１）］があげられるが、そのほか螢光物質ある
いは発光物質で標識したもの、さらには２，４−ジニト
ロフェニル基のような抗体と結合するもの、でも良０゜
以上のような標識化モノヌクレオチドリン酸誘導体はそ
れぞれ伸長反応において取りこまれる効率が異なり、ま
た伸長反応に用いる酵素との親和性も重要であり、誘導
体と伸長反応に用いる酵素の組み合せも十分に考慮しな
ければならない。

また、より高感度の検出が求められる時、特に検出対象
の塩基配列の量が少ない時は、核酸配列の増幅法を用い
ることかできる〔特開昭６２−２８１号公報）。すなわ
ち、上記記載の標識プライマーおよび標識モノヌクレオ
チド三リン酸を使えば、容易に二種類の官能基（同相担
体と結合可能な部位または検出に用いる標識物質）を持
たせた標的塩基配列を増幅して得ることができる。

また、プライマーの伸長反応が正しく目的の位置で始ま
るためには、プライマーと鋳型（すなわわち目的核酸（
Ｉ））との間での相補性の度合、プライマーの長さ、反
応温度、なとの因子を考慮しなければならない。一般に
、プライマーの長さが短い場合や、相補性の度合か低い
場合は、反応をより低い温度にしなければならないこと
はいうまでもない。

また、プライマーの伸長反応をより正しい目的の位置で
行わせるためには、最初のプライマー（核酸（■））の
伸長反応以降に、得られる二本鎖核酸について、これを
一本鎖にした後、目的核酸（Ｉ）の、核酸（ＩＩ）とハ
イブリダイズする塩基部分より５′側の塩基部分と相補
的で、該塩基部分より短いが該塩基部分と特異的にハイ
ブリダイズするのに充分な長さの一本鎖核酸（核酸（■
））を用いてさらに新たな伸長反応を行うこともできる
（特願昭６３−１．４９１５７号）。

さらに、不法を用いて点突然変異などを検出する場合は
、上記に増してプライマーの伸長条件を考慮しなければ
ならない。たとえばプライマーと１」的核酸（Ｉ）との
間で形成した二本鎖（完全に相補的である場合とそうで
ない場合）の安定性に差を出すために反応液にＤＭＳＯ
を加えたり、競合プライマ＝（目的核酸（Ｉ）中の点突
然変異を調べる場合、正常の塩基配列に完全に相補的な
プライマーと点突然変異を起した塩基配列に完全に相補
的なプライマーの２種を混合してプライマーの伸長反応
を行う。この時、目的核酸（Ｉ）中の塩基配列が正常で
あれば後者のプライマーが競合プライマーであり、逆に
目的核酸（Ｉ）中の塩基配列に点突然変異を生じている
場合は前者が競合プライマーとなる。）を加えて伸長反
応を行う必要がある。

Ｃ１固相担体 本発明でいう固相担体は、反応に使用する溶媒およびす
べての試薬に対して不活性でかつ何らかの方法で該溶液
と分離できるものであれば何んてもよい。そのようなも
のとしては、例えば、ミクロタイターウェル、ポリスチ
レンボール、アガロースビーズ、ポリアクリルビーズな
どを用いることができる。

上記固相担体は、あらかじめ前記のプライマー伸長反応
により４１；じた二本鎖構造体（固相相体と結合可能な
部位と標識物質とが導入されているもの）を捕捉するた
めの捕捉用試薬を導入しておくことにより、固定化を容
易にかつ選択的に行うことができる。

この様な捕捉用試薬としては、上記の二本鎖構造体中に
存在する固相担体と結合可能な部位と選択的に反応する
ものであればよく、好ましくは温和な条件下で反応可能
なものがよい。また、両者間の結合様式としては、特異
的な結合が生じるものであれば、共有結合、非共有結合
を問わない。

好ましくは捕捉用試薬の活性を最大限保持できる結合法
が良い。これら捕捉用試薬の一具体例としては、ストレ
プトアビジン、抗体などが使われる。

例えば、ビオチン標識複製物を捕捉するにはストレプト
アビジン セインや２，４−ジニトロフェニル基の標識物に対して
はそれぞれの抗体を担体上に結合したものを、用いるこ
とができる。

ｄ、検出方法 前記記載の方法に従って調製された固相担体と上記工程
（イ）〜（ヌ）で調製された両猟能基具備核酸とを混合
して両者を結合させてから、該担体と結合しなかった目
的の塩基配列以外の核酸および検体に含まれる核酸以外
の不純物を適当な溶媒で洗浄する。ここでいう適当な溶
媒とは、核酸および標識物質なとすべての試薬が安定に
保たれなければならないことはもちろんのこと、固体担
体と合成核酸、固相担体と捕捉用試薬、捕捉用試薬と合
成核酸あるいは標識と合成核酸、との結合を切りはなす
ような条件であってはならない。また、二本鎖部分を有
する核酸配列中の両官能基か相補鎖の別々の鏡上に存在
する場合は、その相補鎖が解離するような条件であって
はならない。

また洗浄方法は、固定用担体の性質によって異なり、抗
原−抗体反応の分野で一般的に使われている方法に従え
ば良い。

このような洗浄操作によって、目的の検出対象核酸（核
酸（Ｉ））の複製物（合成核酸）のみを選択的に担体に
固定することができる。

次に、担体に固定された標識物質は、担体に固定したま
まあるいは溶液中に遊離した形で、検出することができ
る。遊離した形で検出するには、たとえば、標識物質と
捕捉用試薬との間の結合を切りはなす、あるいは標識物
質と合成核酸との間の結合を切りはなす、などの方法が
ある［１１ｅｒｍａｎ、　Ｔ、Ｍ等、Ａｎａｌ　、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙユｕ、４８−５５　（Ｉ９８Ｂ
）］　、また、両官能基が合成核酸の相補鎖の別々の鏡
上に存在する場合は、熱変性あるいは既知の他の方法に
よって二本鎖を分離し、演出用標識物質を含む鎖を溶液
中に遊離させることかできる。

また、二種類の異なる標識物で標識したプライマーを用
いて増幅反応を行った時、その増幅配列中に制限酵素の
部位か存在する場合は、担体に固定したあと、制限酵素
を用いて検出用標識を含む断片を固相担体から遊離させ
ることができる。

一方、増幅配列中に制限酵素の切断部位がない場合は検
出用標識物質を含む断片を固定用担体から遊離させるこ
とはできず、この方法を用いて増幅配列中に特定の制限
酵素の切断部位か存在するかどうかを調べることかでき
る。

標識物質の実際の検出は、使用する標識物質に応じて一
般的手法を用いればよい。たとえば、標識物質がラジオ
アイソトープであればそのまま活性を測定すれば良いし
、たとえばビオチンであればアビジン−もしくはストレ
プトアビジン−酵素結合体を用いて基質と反応させ、色
的又は螢光的手段により検出可能な成分を得ることかで
きる。

また、たとえば、標識物質が螢光であれば、そのまま螢
光光度計を用いて強度を測定することかできる。

さて、上記記載の方法において実際の試料を測定するに
は以下の点が重要である。

第一は、プライマーの伸長反応における非特異的伸長反
応である。これは、プライマーが目的とした塩基配列以
外のところに結合して伸長反応を起したものであるが、
このような非特異的伸長反応を防止するには一般的に考
察されているように、プライマーのＧＣ含量や長さを検
出対象ごとに十分検討しなければならない。なお、非特
異的伸長反応は反応温度を高くすることで十分解消する
ことかでき、耐熱ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎ　Ｅ　Ｂ）を
使用することによっても改善される。

第二番目は、未反応の標識物か担体に固定された捕捉用
試薬と結合して本来の検出すべき標識化複製物（合成核
酸）との反応を妨げることである。

この問題を解決するためには、第一に、担体に固定され
た捕捉用試薬の捕捉能を大きくすることがあげられる。

第二には、未反応の標識物を系外に除く事であるが、こ
れは、標識化プライマーあるいは標識化単位核酸（モノ
ヌクレオチド三リン酸）と検出対象となる複製物（合成
核酸）の性質の差を利用して簡易ゲル涌過法等で分離す
ることもてきる［Ｍａｎｉａｔｉｓら：　Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇｐ、４［１６（Ｉ９８２）］。

しかしなから、それらの方法は機械化という−１１から
考えると必ずしも好ましい方法とは言えない。そのよう
な点から、未反応の標識物の残存量をできるたけ少なく
するような反応条件を選ぶ事か重要である。たとえば、
固相担体と結合可能な部位か導入された一種のプライマ
ーを用い、標識物質が導入された単位核酸（モノヌクレ
オチド三リン酸）を基質として伸長反応を行う場合には
、プライマーの該部位を同相の捕捉用試薬と結合させ、
モノヌクレオチド三リン酸の標識部分を検出用として検
出するときにプライマーの量か担体の捕捉能を超えない
程度にしなければならない。

また、標識した二種類のプライマーを用いる場合も同様
で、ある程度複製物生成の効率が低ドしても、プライマ
ーの量を必要以上に使わないようにする。しかしなから
、未反応の標識物の残存量を少くするような反応条件は
、捕捉用試薬か導入された担体の捕捉能が十分である場
合は必要ない。

〔実験例〕

実施例］ この例は、大腸菌β−ガラクトシダーセ遺伝子の検出方
法を示すものである。

大腸菌ＪＭ１０３　（ファルマシア社）ではβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子の一部が欠失しており、その部分に相
当するプライマーを用いて伸長反応を行えば、欠失株（
ここではＪＭｌｏＢ）と野性株（ここではＨＢＩＯＩ　
（ＢＲＬ社））とを区別することか可能である。そこて
以下に示す方法を用いて野性株と欠失株を識別する実験
を行った。

大腸菌の遺伝子はＲａｙｍｏｎｄ　Ｌ等の方法［Ｒｅ−
ｃｏｍｂｉｎａｎｔ　　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
、　　ｐ、４５−４６．　　Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌ
ｅｙ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ　（Ｉ９
８３）］に従ってＪＭｌｏＢとＨＢ　１０１から抽出し
た。プライマーの構造は以下に示すように５′末端にビ
オチン（Ｂ　ｉ　ｏ）を導入したもので、自動ＤＮＡ合
成機Ｎ５−１（島原）を用いてアミノ化オリゴヌクレオ
チドを合成し、ビオチンのコノ１り酸イミドエステルを
用いてビオチン化した（特開昭５９−９３０９８号およ
び特開昭５９−９３０９９号各公報参照 （Ｂｌｏ）−ＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ
ＧＴＴＧＴＡ制限酵素ＥｃｏＲＩて消化した大腸菌ＤＮ
Ａをポリメラーゼ反応液〔全体で５０μΩ。１０％ＤＭ
Ｓ０，０．０５μｇプライマー、６７ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ　　　ｐＨ８，８，６，７ｍＭＭｇＣ１２，６，６
ｍＭ　　硫酸アンモニウム、１０ｍＭ　　β−メルカプ
トエタノール、６．７μＭ　　ＥＤＴＡ、２０ＭＭ　　
ｄＡＴＰ、２０ＭＭｄＧＴＰ、２０ＭＭ　　ＴＴＰ、１
μＭ〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰ　（ＮＥＣ−０１３Ｈ）に
加えた。これを９５°Ｃで７分間加熱したのち、室温で
５分置き、耐熱ＤＮＡポリタラーセ（０，５Ｕ、ニュー
イングランドバイオラブ社）を加えて５０°Ｃて１０分
間反応させた。

固定用担体であるストレプトアビジン−アガロース（Ｂ
ＲＬ）は、洗浄液（０，０１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ
７，２，０，１５Ｍ　　ＮａＣ１）で１回洗浄した。次
に、上記伸長反応混合物（５０Ｍｇ）と０．０２Ｍリン
酸バッファーｐＨ７，２，０，３Ｍ　　ＮａＣ１（５０
μ、＆）を混合し、前処理したストレプトアビジン−ア
ガロースに加え、室温で３０分放置した。反応後、洗浄
液（２００Ｈｇ）で５回洗浄し、ストレプトアビジン−
アガロース その結果、β−ガラクトシダーゼ遺伝子に関して野性型
であるＨＢＩＯＩと、欠失型であるＪＭｌｏＢとを識別
することができた。

実施例２ 、この例は、正常のβ−グロビン遺伝子とβ−グロビン
の組状赤血球貧血対立遺伝子とを識別する方法を示すも
のである。

正常および錐状赤血球貧血のβ−グロビン遺伝子は、い
ずれもＢａｍＨＩ断片をプラスミドｐＢＲ３２２に挿入
したｐＢＲ３２２−ＨβＰｓｔおよびｐＢＲ３２２−Ｈ
βＳを使用した　（Ｒ．Ｂ．　Ｗａｌｌａｃｅら　ＤＮ
Ａ　　３．　　７−１５，　　（Ｉ９８４）：］　。

プライマーは以下に示す構造のもので、それぞれ互いに
異なる鎖に相補的で、一方は、ポリヌクレオチドキナー
ゼ及び〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰて５′末端を標識し、他方
は実施例１と同様にして合成し、ビオチン化した。

３２Ｐ５°ＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡ
ＣＴＡＧＣ”°ーブライマーＡ５゛ （Ｂｌｏ）　−　ＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡ
ＣＧＴＴＣＡＣＣ　　−ブライ７−Ｂ制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで消化したプラスミド（ｐＢＲ３２２−ＨβＰｓｔあ
るいはｐＢＲ３２２−ＨＢＳ）１０ｎｇを耐熱ＤＮＡポ
リメラーセ反応液〔５０μｐ０１０％　ＤＭＳｏ。

０．３μｇ　プライマーＡ、０．３μｇ　プライマーＢ
１ニューイングランドバイオ９７社の操作書に従って６
７ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　ｐＨ８，８，６、７ｒ
ｎ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２．６．６ｍＭ硫酸アンモニ
ウム、１０　ｍ　Ｍ　　β−メルカプトエタノール、６
．７μＭ　　ＥＤＴＡ、３３μＭｄＡＴＰ、３３μＭ　
　ｄＧＴＰ、３３μＭｃｌｃＴＰ、３３μＭ　　ｄＴＴ
Ｐ）に加えた。この混合液を９５°Ｃで７分間加熱し、
室温にもどして５分間アニルリングした。つぎに、耐熱
ＤＮＡポリメラーセにューイングランドバイオラブθ、
）０．５Ｕを加え、５５°Ｃで１回ｌ」の伸長反応を５
分間行った。以後、９］°Ｃで１分の変性＋室温で５分
間のアニーリング＋５５℃で５分間の伸長反応、のサイ
クルを２０回繰り返した。次に、実施例１と同様にして
調製したストレプトアビジン−アガロース （　２　５　ｆｔｇ）、水Ｃ７５１１Ω）および０．　
　０２Ｍリン酸バッファーｐ）（７．２、０．３ＭＮａ
ＣＩ　　（Ｉ００μΩ）を加え、室温でゆっくり混ぜな
から３０分間反応させた。洗浄液（２００μｐ）で５回
洗浄した。つぎにストレプトアビジン−アカロースを等
量ずつ二つのチューブに分けた。その一方に制限酵素Ｄ
ｄｅＩの反応液〔１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（
ｐＨ７．５）、７ｍＭＭｇＣ１２、１５０ｍＭ　　Ｎａ
Ｃ１、７ｍＭメルカプトエタノール、１００μｇ／　ｍ
＋、子牛血清アルブミン〕１００μｇを加え、制限酵素
Ｄｄｅｌ（東洋紡、ＩＯＵ／μΩ）５μｇを加え、３７
°Ｃでゆっくりと混合しながら５時間反応させた。反応
後、洗浄液（２００μｍりで５回洗浄した。プラスミド
ｐＢＲ３２２−ＨβＰｓｔおよびｐＢＲ３２２−ＨＢＳ
それぞれについて、Ｄｄｅｌ消化前および消化後の担体
に残留する放射活性を７１１１１定して、Ｄｄｅｌ消化
による放射活性の減少を調べた。その結果、Ｄｄｅｌ消
化による放射活性の残留度は、ｐＢＲ３２２−ＨβＰｓ
ｔの場合４０％、ｐＢＲ３２２−ＨＢＳの場合９２％で
あって、両者を識別することかできた。

実施例３ この例は、−検体中の２種類の遺伝子を同時に検出する
方法を示すものである。

目的とする遺伝子としてヒトのβ−グロビン遺伝子とヒ
トパピローマウィルス１　６　（ＨＰＶ−１６）を選ん
た。β−グロビン遺伝子を増幅するためのプライマーと
して、β−グロビン遺伝子の二本鎖にそれぞれ相補的て
ビオチン標識にした Ｉ３　ｉ　０−Ｎｌｌ−ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣに
ＴＴＣＡＡＣ　（Ｂ　ｉ　ｏ−ＰＧ　］　）とＥＩＴＣ
（エオシンイソチオシアネート）で蛍光標識したＥＩＴ
Ｃ−Ｎｉｌ−ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧ
Ｃ（ＥＩＴＣ−ＰＧ２）を使用した。また、ＩＩＰＶ−
ＩＧのＥ６遺伝子を増幅するためのプライマーとしてビ
オチン標識した １３ｉｏ−Ｎ１１−ＴＧＡＧＣＡＡＴＴＡＡＡ′ｒＧＡ
ＣＡＧＣ（Ｂｉｏ−ＰＶＯＩ）とｌ’ｌｉ゛ｃて蛍光標
識したｌ）］　］ｉ゛ｃーＮｌｌーＴＧＴＧＣＴＴｉ’
Ｇｉ’ＡＣＧＣＡＣＡＡＣ１”ＩＴＣ−ＰＶＯ２）を使
用した。また検出するサンプルとしては正常のヒトの胎
盤の遺伝子およびＣａｓｋｊ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬＩ
５５０）を使用した。前者はヒ）・グロビン遺伝子を持
っているが、パピローマウィルスの遺伝子は存在しない
。後者はヒト由来の細胞で当然、ヒトのβ−グロビン遺
伝子をもっているが、ヒトパピローマウィルス１６の遺
伝子か増幅されて存在していることも明らかにされてい
るｉＴｈｃ　ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ　［ｉ，１３９
−１４４（Ｉ９８７）ｌ。

反応１．ヒトの胎盤の遺伝子（Ｉμｇ）とプライ７　−
　（Ｂｉｏ−ＰＶＯＩ（３００μｇ）　、ＰＩＴＣ−Ｐ
ＶＯ２（３００μｇ）、Ｂｊｏ−ＰＣｌ（３［］Ｄｎｇ
）、ＥＩＴＣ−ＰＧ２（３００μｇ）を反応液（ｆｌｉ
７ｍＭ　Ｔｒｊｓ　−ＨＣＩ　ｐＨ８．８　、　６．７
μ１Ｍ　ＭｇＣＩ２。

１６、６ｍＭ（ＮＨ４）２　　ＳＯ４，ＩＯｍＭメルカ
プトエタノール、６、７ｍＭ　ＥＤＴＡ，　２００　、
ｃｚＭ　ｄＡＴＰ，２００μＭ　ｄＧＴＰ，　２００μ
Ｍ　ｄＣＴＰ，　２００μＭＴＴＰ，１０％ＤＭＳＯＩ
　に加え（全液量＝４９μ＋）、９５℃で５分間変性し
た。５５０Ｃで１分間アニーリングしたのち、Ｔａｑポ
リメラーゼ（ＮＥＢ社，２０７μｍ　；１μｌ）を加え
て７０℃で２分間伸長反応を行った。次に９２°Ｃて１
分間変性し、５５°Ｃで１分間アニーリングした。

この変性、アニーリングおよび伸長反応を２５回繰り返
した。

反応２　：　Ｃａｋｉ細胞より得られたＤＮＡ　（Ｉμ
ｇ　）を使用して反応１と同様のプライマーでまったく
同様に伸長反応を行った。

ストレプトアビジンアガロースの調製：ストレプトアビ
ジンアガロース（ＢＲＬ社）は洗浄液（Ｉ０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ　−Ｈｅｌ　ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐｌ
（８，０゜０．１Ｍ　　Ｎａ１（ｃｌｏ４て２回洗浄し
たのち、これにサケ遺伝子（Ｉμｇ）を加えて前処理と
した。反応液１または反応液２の２０μｍを前処理した
ストレプトアビジンアガロース（５０μｍ）に加え室温
で１５分間放置した。これを先の洗浄液（５００μｍ）
で２回洗浄したのち、Ｉ　Ｍ　Ｎａ１１Ｃ１０４（５０
０μＩ）で２回洗浄した。次に、先の洗浄液（５００μ
ｍ〉て２回洗浄し、ｌｏｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　ｐ
ｌ＋７．５　、１ｍＭ　ＥＤＴＡｐＨ８，０、５０ｍＭ
　ＮａＣ１（５００ｕ　ｌ）で３回洗浄した。これに１
００ｍＭ　Ｎａ０Ｉｌ（５０ｔｔ　ｌ）を加えてＤＮＡ
を変性して上澄を得、さらに１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ
７，５、１ｍＭ　ＥＤ′ｒＡｐＨ８，０、５０ｍＭ　Ｎ
ａＣ１溶液（４５０μｌ）を加えて蛍光を測定した。Ｆ
ＩＴＣの蛍光測定は励起波長４８９　ｎｍ。

発光波長５２０叶で行い、ＥＩＴＣに関しては励起波長
５２０　ｎｎｌ、発光波長５４０ｎｍて螢光を測定した
。以下にそれぞれの螢光強度を相対強度で示した。

反応液１　　反応液２ この結果より正常のヒト胎盤ＤＮＡ中にはβ−グロビン
遺伝子のみか存在し、Ｃａ５ｋｉ細胞ではβ−グロビン
遺伝子とヒトパピローマ遺伝子の両方が存在することが
判定できた。

出願人代理人　　佐　　藤　　−雄　１手続補正書 平成　１年　３月２ｑ日 昭和６３年特許願第２３１７３７号 ２　発明の名称 検体中の目的核酸の検出法 ３　補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 湧水製薬株式会社 ？　補正の対象 ８補止の内容 （Ｉ）　　特許請求の範囲を別紙の通り補正する。

（２）　　明細書第９頁第１２行の「（ワ）」を１（力
）」に補正する。

（３）　　同書第９頁第１３行の「（ヌ）」を「（ル）
」に補正する。

（４）　　同書第１０頁第１４〜１５行の「二種の核酸
鎖」を「遊離の二種の合成核酸鎖同志」に補正する。

（５）　　同書第１１頁第１５行〜第１２頁第９行の「
（チ）必要に応じて、・・　繰り返して行なうこと。」
を、 「（チ）必要に応じて、（へ）を実施した後、最終的に
得られる二本鎖核酸について、これを一本鎖にして、そ
の少くとも一方について、核酸（ｎ）とハイブリダイズ
させ、そこへ単位核酸を（、Ｉ加させることによって鎖
長を伸長させて二本鎖核酸を形成させることから成る工
程を、１回行うか、または行った後更に同様の工程を少
なくとも１同順次段階的に繰り−９＝ 返して行なうこと。」に補正する。

（６）　　同書第１２頁第９行と１０行の間に、［（す
）必要に応じて、この二本鎖６酸の形成工程（チ）を核
酸（Ｉ）の核鎖について実施して最終的に得られる二本
鎖核酸から該合成核酸鎖をａ離させた後、核酸（Ｉ）の
６鎖とハイブリダイズしていた合成核酸鎖同志を、該検
体中において、その生得的な相補性を利用して相互にハ
イブリダイズさせて二本鎖核酸を形成させること。」を
挿入する。

（ア）　　同書第１２頁第１０行の「（す）」を１（ヌ
）」に補正する。

（８）　　同書同頁第１３行の「（ヌ）工程（ハ）、（
ホ）、（へ）および（チ）」を、「（ル）工程（ハ）、
（ホ）、（へ）、（チ）または（す）」に補正する。

り９）　　回書同頁第１４〜１５行の「工程（ニ）、（
ト）および（す）」を 「または工程（ニ）、（ト）または（ヌ）」に補正する
。

（ｊＯ）同書第１３頁第８行の「（ル）工程（ヌ）」を
「（ヲ）工程（ル）」に補正する。

り１１）同書同頁第１２行の「（ヲ）工程（ル）」を「
（ワ）工程（ヲ）」に補圧する。

（Ｉ２）同書同頁第１５行の「（ワ）工程（ヲ）」を「
（力）工程（ワ）」に補正する。

（Ｉ３）同書第１６頁第４行の「（イ）〜（ワ）」を「
（イ）〜（力）」に補正する。

（Ｉ４）同書同頁第１５行の「（ヌ）」を「（ル）」に
補正する。

特許請求の範囲 １、下記の上程（イ）〜（力）を実施することを特徴と
する、検体中の少くとも一つの目的核酸の検出法（たた
し、工程（〕Ｘ）〜（ル）は、該目的核酸が存在するも
のとして実施するものとする）。

（イ）少くとも一つの目的核酸（以下、核酸（Ｉ）とい
う）存在の有無を検知しようとする検体を用意すること
。

（ロ）°核酸（Ｉ）と相補的で、該核酸よりは短いが該
核酸と特異的にハイブリダイズするのに充分な長さの一
本鎖核酸（以下、核酸（ｎ）という）を用意すること。

（ハ）該検体中において、核酸（Ｉ）を、これが一本鎖
のものであればそのままで、これが二本鎖のものであれ
ば一本鎖にしてからその少なくとも一方について、核酸
（ＩＩ）と／＼イブリダイスさせ、この核酸（ＩＩ）を
プライマーとしてそこへ単位核酸を（−１加させること
によって鎖長を伸長させて、生成合成核酸鎖と核酸（Ｉ
）との二本鎖核酸を形成させること。

（ニ）必要に応して、該検体中において、上記二本鎖核
酸から該合成核酸鎖を遊離させること。

（ホ）必要に応じて、核酸（Ｉ）が二本鎖のものであっ
たときに６鎖について工程（ロ）、（ハ）および（ニ）
を実施して得られる遊離の二種の合成核酸鎖同志を、該
検体中において、その生得的な相補性を利用して相互に
ハイブリダイズさせること。

（へ）必要に応じて、工程（イ）〜（ハ）または（イ）
〜（ホ）を実施して得られる二本鎖核酸について、これ
を一本鎖にした後、その少くとも一方について、核酸（
ＩＩ）とハイブリダイズさせ、そこへ中位核酸を付加さ
せることによって鎖長を伸長させて二本鎖核酸を形成さ
せるか、あるいはこの二本鎖核酸の形成工程を核酸（Ｉ
）の６鎖について実施して得られる二本鎖核酸から該合
成核酸鎖を遊離させた後、核酸（Ｉ）の６鎖とハイブリ
ダイズしていた合成核酸鎖同志を、該検体中において、
その生得的な相補性を利用して相互にハイブリダイズさ
せて二本鎖核酸を形成させること。

（Ｉ・）必要に応じて、該検体中において、上記二本鎖
核酸から該合成核酸鎖を遊離させること。

（チ）必要に応じて、（へ）を実施した後、最終的に得
られる二本鎖核酸について、これを一本鎖にして、その
少くとも一方について、核酸（Ｕ＞とハイブリダイズさ
せ、そこへ単位核酸を（＝１加させることによって鎖長
を伸長させて二本鎖核酸を形成させることから成る工程
を、１回行うか、または行った後更に同様の工程を少な
くとも１回順次段階的に繰り返して行なうこと。

（す）必要に応じて、この二本鎖６酸の形成工程（チ）
を核酸（Ｉ）の６鎖について実施して最終的に得られる
二本鎖核酸から該合成核酸鎖をＭ離させた後、核酸（Ｉ
）の６鎖とハイブリダイズしていた合成核酸鎖同志を、
該検体中において、その生得的な相補性を利用して相互
にハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成させること。

（ヌ）必要に応して、該検体中において、上記二本鎖（
衾酸から該ご成核酸鎖を遊離させること。

（ル）工程（ハ）、（ホ）、（へ）、（チ）、または（
す）の産物である二本鎖核酸、または工程（ニ）、（Ｉ
・）または（ヌ）の産物である一本鎖核酸に、下記のい
ずれかの手段によって、固体担体と結合しうる部位から
なる官能基と検出可能な標識からなる官能基とを持たせ
ること。

（Ｉ）両官能基の−Ｊｊをまたは双方を個々に持つプラ
イマーまたは官能基を持たないプライマーの使用および
両官能基の一方をまたは双方を個々に持つ単位核酸また
は官能基を持たない単位核酸の使用によって、該合成核
酸鎖を両止能基を持つものとして得る。

（ｉｉ）該合成核酸鎖を一方の官能基を持つものとして
形成させ、その後、そこへ、該検体中において、他方の
官能基を導入する。

（ヲ）工程（ル）の産物である両官能基を持つ核酸鎖を
、該固体担体と結合しうる部位からなる官能基を利用し
て、該検体中において、固体担体と結合させること。

（ワ）上程（ヲ）より得られる固体担体を洗浄して、固
体担体に結合していない核酸を除去すること。

（力）工程（ワ）より得られる固体担体を、該標識から
なる官能基を利用する検出操作に付して、固体担体に結
合している核酸の有無を、検出すべき核酸に対応するも
のとして検知すること。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の工程（イ）〜（ワ）を実施することを特徴と
   する、検体中の少くとも一つの目的核酸の検出法（ただ
   し、工程（ハ）〜（ヌ）は、該目的核酸が存在するもの
   として実施するものとする）。 （イ）少くとも一つの目的核酸（以下、核酸（ I ）と
   いう）存在の有無を検知しようとする検体を用意するこ
   と。 （ロ）核酸（ I ）と相補的で、該核酸よりは短いが該
   核酸と特異的にハイブリダイズするのに充分な長さの一
   本鎖核酸（以下、核酸（II）という）を用意すること。 （ハ）該検体中において、核酸（ I ）を、これが一本
   鎖のものであればそのままで、これが二本鎖のものであ
   れば一本鎖にしてからその少なくとも一方について、核
   酸（II）とハイブリダイズさせ、この核酸（II）をプラ
   イマーとしてそこへ単位核酸を付加させることによって
   鎖長を伸長させて、生成合成核酸鎖と核酸（ I ）との
   二本鎖核酸を形成させること。 （ニ）必要に応じて、該検体中において、上記二本鎖核
   酸から該合成核酸鎖を遊離させること。 （ホ）必要に応じて、核酸（ I ）が二本鎖のものであ
   ったときに各鎖について工程（ロ）、 （ハ）および（ニ）を実施して得られる二種の核酸鎖を
   、該検体中において、その生得的な相補性を利用して相
   互にハイブリダイズさせること。 （ヘ）必要に応じて、工程（イ）〜（ハ）または（イ）
   〜（ホ）を実施して得られる二本鎖核酸について、これ
   を一本鎖にした後、その少くとも一方について、核酸（
   II）とハイブリダイズさせ、そこへ単位核酸を付加させ
   ることによって鎖長を伸長させて二本鎖核酸を形成させ
   るか、あるいはこの二本鎖核酸の形成工程を核酸（ I
   ）の各鎖について実施して得られる二本鎖核酸から該合
   成核酸鎖を遊離させた後、核酸（ I ）の各鎖とハイブ
   リダイズしていた合成核酸鎖同志を、該検体中において
   、その生得的な相補性を利用して相互にハイブリダイズ
   させて二本鎖核酸を形成させること。 （ト）必要に応じて、該検体中において、上記二本鎖核
   酸から該合成核酸鎖を遊離させること。 （チ）必要に応じて、（ヘ）を実施した後、最終的に得
   られる二本鎖核酸について、これを一本鎖にして、その
   少くとも一方について、核酸（II）とハイブリダイズさ
   せ、そこへ単位核酸を付加させることによって鎖長を伸
   長させて二本鎖核酸を形成させるか、あるいはこの二本
   鎖核酸の形成工程を核酸（ I ）の各鎖について実施し
   て得られる二本鎖核酸から該合成核酸鎖を遊離させた後
   、核酸（ I ）の各鎖とハイブリダイズしていた合成核
   酸鎖同志を、該検体中において、その生得的な相補性を
   利用して相互にハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成
   させることから成る工程を、１回行うかまたは複数回に
   わたって順次段階的に繰り返して行なうこと。 （リ）必要に応じて、該検体中において、上記二本鎖核
   酸から該合成核酸鎖を遊離させること。 （ヌ）工程（ハ）、（ホ）、（ヘ）および（チ）の産物
   である二本鎖核酸、工程（ニ）、（ト）および（リ）の
   産物である一本鎖核酸に、下記のいずれかの手段によっ
   て、固体担体と結合しうる部位からなる官能基と検出可
   能な標識からなる官能基とを持たせること。（ｉ）両官
   能基の一方をまたは双方を個々に持つプライマーまたは
   官能基を持たないプライマーの使用および両官能基の一
   方をまたは双方を個々に持つ単位核酸または官能基を持
   たない単位核酸の使用によって、該合成核酸鎖を両官能
   基を持つものとして得る。 （ｉｉ）該合成核酸鎖を一方の官能基を持つものとして
   形成させ、その後、そこへ、該検体中において、他方の
   官能基を導入する。 （ル）工程（ヌ）の産物である両官能基を持つ核酸鎖を
   、該固体担体と結合しうる部位からなる官能基を利用し
   て、該検体中において、固体担体と結合させること。 （ヲ）工程（ル）より得られる固体担体を洗浄して、固
   体担体に結合していない核酸を除去すること。 （ワ）工程（ヲ）より得られる固体担体を、該標識から
   なる官能基を利用する検出操作に付して、固体担体に結
   合している核酸の有無を、検出すべき核酸に対応するも
   のとして検知すること。