JPH02216453A - シクロスポリンの測定法 - Google Patents
シクロスポリンの測定法Info
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- JPH02216453A JPH02216453A JP3886089A JP3886089A JPH02216453A JP H02216453 A JPH02216453 A JP H02216453A JP 3886089 A JP3886089 A JP 3886089A JP 3886089 A JP3886089 A JP 3886089A JP H02216453 A JPH02216453 A JP H02216453A
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- cyclosporin
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、シクロスポリン、特に血清、血漿および全血
中に含有されるシクロスポリンを、高速液体クロマトグ
ラフィーを用いて精度良く容易に測定する方法、特に自
動化可能な測定方法に関する。
中に含有されるシクロスポリンを、高速液体クロマトグ
ラフィーを用いて精度良く容易に測定する方法、特に自
動化可能な測定方法に関する。
（従来の技術）
血液中に含まれる各種成分の測定が病理学的研究１診断
、治療などのために行われている。例えば、薬物として
投与されるシクロスポリンＡ （ｃｙｃｌｔ＋５ｐｏｒ
ｉｎＡＨｃｙＡ）の血中濃度をモニタリングすることに
より、該薬物の投与量の決定がなされている。 Ｃ！／
Ａは、環状ペプチドであり椰力な免疫抑制作用を示す。
、治療などのために行われている。例えば、薬物として
投与されるシクロスポリンＡ （ｃｙｃｌｔ＋５ｐｏｒ
ｉｎＡＨｃｙＡ）の血中濃度をモニタリングすることに
より、該薬物の投与量の決定がなされている。 Ｃ！／
Ａは、環状ペプチドであり椰力な免疫抑制作用を示す。
このＣｙ＾の消化吸収は個人差が大きく、投与期間など
によっても吸収効率が変動するため血中濃度をモニタリ
ングすることが必要である。このｃｙｔは１通常１次の
方法（「医学のあゆみ」第１２９巻、第９号、６２３〜
６２７ （１９７４） ）により測定される。まず、血
漿または血清をあらかじめ適度に親水処理された除タン
パクカラムに通し、 ｃｙＡを吸着させるとともにタン
パクを吸着させることなく通過させて除去する。このカ
ラムにメタノールを流してｃｙｔを溶出させ、）容出液
から溶媒を揮発させた後、アセトニトリル−水（７０；
３０）を溶離液として高速液体クロマトグラフィー（Ｉ
ＩＰＬＣ）によりＣＶＡの測定を行う。
によっても吸収効率が変動するため血中濃度をモニタリ
ングすることが必要である。このｃｙｔは１通常１次の
方法（「医学のあゆみ」第１２９巻、第９号、６２３〜
６２７ （１９７４） ）により測定される。まず、血
漿または血清をあらかじめ適度に親水処理された除タン
パクカラムに通し、 ｃｙＡを吸着させるとともにタン
パクを吸着させることなく通過させて除去する。このカ
ラムにメタノールを流してｃｙｔを溶出させ、）容出液
から溶媒を揮発させた後、アセトニトリル−水（７０；
３０）を溶離液として高速液体クロマトグラフィー（Ｉ
ＩＰＬＣ）によりＣＶＡの測定を行う。
上記ＣｙＡの測定においては、試料としては。全血から
血球成分を除いた血漿、または血清が用いられる。しか
し、シクロスポリンは血球中にも含有されるため、上記
血漿または血清を使用する方法では不正確であることが
指摘されている。全血中のシクロスポリンを測定する方
法としては１例えば、ジャーナル オブ クロマトグラ
フィー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ
ａｐｈｙ ） ＋３４Ｎ１９８５）＋４１１〜４１９頁
、にアセトニトリルを用い溶血させた後にＣｙＡを測定
する方法が記載されている。それによればまず、採取し
た全血にアセトニトリルを添加して溶血させ４タンパク
成分を沈澱させた後、遠心分離して上清を集める。この
上清部分をシリカゲルを用いた逆相クロマトグラフィー
にかげてｃｙｔおよびＣｙＡ以外の疎水成分を吸着させ
てその他の成分を除去することにより前処理した後、
００５シリカゲルカラムにかけて分離し、測定を行う
。
血球成分を除いた血漿、または血清が用いられる。しか
し、シクロスポリンは血球中にも含有されるため、上記
血漿または血清を使用する方法では不正確であることが
指摘されている。全血中のシクロスポリンを測定する方
法としては１例えば、ジャーナル オブ クロマトグラ
フィー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ
ａｐｈｙ ） ＋３４Ｎ１９８５）＋４１１〜４１９頁
、にアセトニトリルを用い溶血させた後にＣｙＡを測定
する方法が記載されている。それによればまず、採取し
た全血にアセトニトリルを添加して溶血させ４タンパク
成分を沈澱させた後、遠心分離して上清を集める。この
上清部分をシリカゲルを用いた逆相クロマトグラフィー
にかげてｃｙｔおよびＣｙＡ以外の疎水成分を吸着させ
てその他の成分を除去することにより前処理した後、
００５シリカゲルカラムにかけて分離し、測定を行う
。
このように、血液中のシクロスポリンを測定する各種方
法が開発されているが、さらに精度よくかつ簡便にシク
ロスポリンを測定する方法の開発が望まれている。
法が開発されているが、さらに精度よくかつ簡便にシク
ロスポリンを測定する方法の開発が望まれている。
（発明が解決しようとする課題）
本発明の目的は、血漿、血清、全血などの試料に含有さ
れるシクロスポリンを精度良く、容易に測定し得る方法
を提供することにある。本発明の他の目的は上記試料中
のシクロスポリンを、高速液体クロマトグラフィーを用
いて自動的に短時間のうちに測定し得る方法を提供する
ことにある。
れるシクロスポリンを精度良く、容易に測定し得る方法
を提供することにある。本発明の他の目的は上記試料中
のシクロスポリンを、高速液体クロマトグラフィーを用
いて自動的に短時間のうちに測定し得る方法を提供する
ことにある。
（課題を解決するための手段および作用）本発明のシク
ロスポリンの測定法は、シクロスポリンを高速液体クロ
マトグラフィーで測定する方法であって、シクロスポリ
ンを含む試料を４０゛Ｃ以上に保持された前処理カラム
に導き該シクロスポリンを吸着させ５かつ該試料中のタ
ンパク成分を吸着させることなく通過させる工程、およ
び該前処理カラムに溶離液を流してシクロスポリンを脱
着させて分離用カラムに導き、これを測定する工程、を
包含し、そのことにより上記目的が達成される。
ロスポリンの測定法は、シクロスポリンを高速液体クロ
マトグラフィーで測定する方法であって、シクロスポリ
ンを含む試料を４０゛Ｃ以上に保持された前処理カラム
に導き該シクロスポリンを吸着させ５かつ該試料中のタ
ンパク成分を吸着させることなく通過させる工程、およ
び該前処理カラムに溶離液を流してシクロスポリンを脱
着させて分離用カラムに導き、これを測定する工程、を
包含し、そのことにより上記目的が達成される。
本発明に用いられる前処理カラムに充填される充填剤と
しては、逆相クロマトグラフィー用充填剤が用いられる
。なかでも解離基を持たない合成高分子系充填剤が好適
である。一般に疎水性の強い合成高分子系充填剤は、タ
ンパクを強く吸着するが、これに親水性を付与していく
とタンパクを吸着しなくなる。さらに親水性の度合を高
くすると、シクロスポリンをも吸着しなくなる。本発明
に用いられる充填剤としては、所定の割合で水酸基など
の親水基とアルキル基などの疎水基とを合わせ持つ合成
高分子系充填剤が用いられる。このような充填剤は、特
定の条件で２例えば水や特定ｐＨの緩衝液中では２非タ
ンパク物質であるシクロスポリンを吸着するが、タンパ
クは吸着せず、そして、他の条件下、たとえば有機溶媒
が添加された液中では、これに吸着したシクロスポリン
を溶離する性質を有する。このような充填剤としては。
しては、逆相クロマトグラフィー用充填剤が用いられる
。なかでも解離基を持たない合成高分子系充填剤が好適
である。一般に疎水性の強い合成高分子系充填剤は、タ
ンパクを強く吸着するが、これに親水性を付与していく
とタンパクを吸着しなくなる。さらに親水性の度合を高
くすると、シクロスポリンをも吸着しなくなる。本発明
に用いられる充填剤としては、所定の割合で水酸基など
の親水基とアルキル基などの疎水基とを合わせ持つ合成
高分子系充填剤が用いられる。このような充填剤は、特
定の条件で２例えば水や特定ｐＨの緩衝液中では２非タ
ンパク物質であるシクロスポリンを吸着するが、タンパ
クは吸着せず、そして、他の条件下、たとえば有機溶媒
が添加された液中では、これに吸着したシクロスポリン
を溶離する性質を有する。このような充填剤としては。
例えば、アクリル系モノマーを（共）重合成分とする
（共）重合体である粒子が用いられる。そのようなモノ
マーとしては、ポリエチレングリコールモノ（またはジ
）−（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール
モノ（またはジ）−アクリレート、テトラメチロールメ
タンモノ （またはジ ）１月 アクリレートなどがあ
る。これらの七ツマ−の懸濁重合によって得られ１その
粒径が５〜３０μｍ程度の微粒子が特に好適である。一
般に。
（共）重合体である粒子が用いられる。そのようなモノ
マーとしては、ポリエチレングリコールモノ（またはジ
）−（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール
モノ（またはジ）−アクリレート、テトラメチロールメ
タンモノ （またはジ ）１月 アクリレートなどがあ
る。これらの七ツマ−の懸濁重合によって得られ１その
粒径が５〜３０μｍ程度の微粒子が特に好適である。一
般に。
逆相クロマトグラフィー用充填剤のうちでもＯＤＳシリ
カゲル（オクタデシルシリル基が結合したシリカゲル）
充填剤およびＣＮシリカゲル（ニトリル基が結合したシ
リカゲル）充填剤などはンラノール基が存在し、タンパ
クが吸着されるため１本発明方法には適当ではない。イ
オン交換クロマトグラフィー用の充填剤もある限られた
条件下においては使用可能であるが、はとんどの場合１
本発明方法に使用するのは不適当である。
カゲル（オクタデシルシリル基が結合したシリカゲル）
充填剤およびＣＮシリカゲル（ニトリル基が結合したシ
リカゲル）充填剤などはンラノール基が存在し、タンパ
クが吸着されるため１本発明方法には適当ではない。イ
オン交換クロマトグラフィー用の充填剤もある限られた
条件下においては使用可能であるが、はとんどの場合１
本発明方法に使用するのは不適当である。
分析カラムに充填される充填剤としては上記前処理カラ
ムに充填される充填剤よりもシクロスポリンの吸着性の
高い充填剤が、前処理カラムの充填剤の種類などに応じ
て適宜選択される。例えば。
ムに充填される充填剤よりもシクロスポリンの吸着性の
高い充填剤が、前処理カラムの充填剤の種類などに応じ
て適宜選択される。例えば。
ＣＮシリカゲル充填剤などが用いられる。
本発明方法は１例えば第１図に示す装置により具体化さ
れる。この装置は、接続端Ａ−Ｆを有する六方バルブ４
．該六方バルブの接続端Ｂ−Ｅを介して接続された前処
理カラム５および該六方バルブの接続端Ｃに接続された
分析カラム８を有する。
れる。この装置は、接続端Ａ−Ｆを有する六方バルブ４
．該六方バルブの接続端Ｂ−Ｅを介して接続された前処
理カラム５および該六方バルブの接続端Ｃに接続された
分析カラム８を有する。
前処理カラム５には上記逆相クロマトグラフィー用充填
剤が充填され１分析カラムには１例えば。
剤が充填され１分析カラムには１例えば。
ＣＮシリカゲルが充填されている。
例えば、血液中のシクロスポリンを測定する場合には、
血漿または血清を含む試料を調製する。
血漿または血清を含む試料を調製する。
全血中のシクロスポリンの測定を行なう場合には。
採取した血液に界面活性剤溶液を添加し、振盪して血球
成分を破壊（溶血）させ、これを試料とする。まず、第
１図の装置において、水槽１中のイオン交換水もしくは
緩衝液をポンプ２によって試料インジェクター３および
接続端Ａ−Ｂを経て前処理カラム５に送り、そこから接
続端Ｅ−Ｆを通り系外に排出する。次に、上記溶血によ
り調製した試料を試料インジェクターから系内へ注入す
る。
成分を破壊（溶血）させ、これを試料とする。まず、第
１図の装置において、水槽１中のイオン交換水もしくは
緩衝液をポンプ２によって試料インジェクター３および
接続端Ａ−Ｂを経て前処理カラム５に送り、そこから接
続端Ｅ−Ｆを通り系外に排出する。次に、上記溶血によ
り調製した試料を試料インジェクターから系内へ注入す
る。
注入された試料は、ポンプ２によりイオン交換水もしく
は緩衝液と共に移送されて前処理カラム５に達する。こ
こで、前処理カラム５は４０℃以上に保持される。試料
中のシクロスポリン（非タンパク性物質である）は該カ
ラムの充填剤に吸着される。他方、該試料中のタンパク
成分は吸着されないでカラム５を通過し、六方バルブ４
の接続端Ｅ・Ｆを経て系外に排出される。
は緩衝液と共に移送されて前処理カラム５に達する。こ
こで、前処理カラム５は４０℃以上に保持される。試料
中のシクロスポリン（非タンパク性物質である）は該カ
ラムの充填剤に吸着される。他方、該試料中のタンパク
成分は吸着されないでカラム５を通過し、六方バルブ４
の接続端Ｅ・Ｆを経て系外に排出される。
溶離液槽６には、上記前処理カラム５に吸着したシクロ
スポリンを溶離させ得る溶離液が収容されている。この
溶離液はポンプ７により、接続端りおよびＣを経由して
分析カラム８へ送られる。
スポリンを溶離させ得る溶離液が収容されている。この
溶離液はポンプ７により、接続端りおよびＣを経由して
分析カラム８へ送られる。
次いで第２図に示すように、六方バルブ４を切り換えて
接続＠Ｄを已に接続すると、ポンプ７により溶離液槽６
中の溶離液が接続端りおよびＥを経て前処理カラム５に
供給される。溶離液がカラム５を通過することにより、
吸着されたシクロスポリンが溶離され、溶離液と共に接
続端ＢおよびＣを経て分析カラム８に達する。シクロス
ポリンは分析カラム８で分離され２分析カラム８以降に
設けられた図外の適宜な検出器により検出される。
接続＠Ｄを已に接続すると、ポンプ７により溶離液槽６
中の溶離液が接続端りおよびＥを経て前処理カラム５に
供給される。溶離液がカラム５を通過することにより、
吸着されたシクロスポリンが溶離され、溶離液と共に接
続端ＢおよびＣを経て分析カラム８に達する。シクロス
ポリンは分析カラム８で分離され２分析カラム８以降に
設けられた図外の適宜な検出器により検出される。
分析カラム８には前処理カラムに用いられる充填剤より
も吸着性の高い充填剤が充填されているため、前処理カ
ラムに吸着されていたシクロスポリンは溶離液によって
完全に溶離し、精度良く分離し測定される。
も吸着性の高い充填剤が充填されているため、前処理カ
ラムに吸着されていたシクロスポリンは溶離液によって
完全に溶離し、精度良く分離し測定される。
以上に述べた例では前処理カラム５におけるポンプ２に
よるイオン交換水の進行方向と、ポンプ７による溶離液
の進行方向とはそれぞれ反対方向になっているが、これ
に限られる必要はない。進行方向が同じ方向となるよう
な接続方式が採用されてもよい。第２図に示すような接
続に切換えた後、シクロスポリンが六方バルブ４の接続
端Ｃを通過して分析カラム８に達したころを見計らって
。
よるイオン交換水の進行方向と、ポンプ７による溶離液
の進行方向とはそれぞれ反対方向になっているが、これ
に限られる必要はない。進行方向が同じ方向となるよう
な接続方式が採用されてもよい。第２図に示すような接
続に切換えた後、シクロスポリンが六方バルブ４の接続
端Ｃを通過して分析カラム８に達したころを見計らって
。
六方バルブ４を第１図に示される接続にさらに切換える
こともできる。このように切換えることにより２分析カ
ラム８で分析を行ないながら１次の試料を前処理カラム
５に通し次の分析のための前処理を行なうことができる
。
こともできる。このように切換えることにより２分析カ
ラム８で分析を行ないながら１次の試料を前処理カラム
５に通し次の分析のための前処理を行なうことができる
。
本発明の方法においては、上記のように、前処理カラム
５が４０’Ｃ以上、好ましくは５０〜８０’Ｃに保持さ
れている。シクロスポリンは分子量が比較的太きく （
ＣｙＡの分子量は１２０３） 、かつ環状の分子構造を
有するため、常温では前処理カラムの充填剤の細孔内へ
の拡散速度が非常に遅い。しかし。
５が４０’Ｃ以上、好ましくは５０〜８０’Ｃに保持さ
れている。シクロスポリンは分子量が比較的太きく （
ＣｙＡの分子量は１２０３） 、かつ環状の分子構造を
有するため、常温では前処理カラムの充填剤の細孔内へ
の拡散速度が非常に遅い。しかし。
上記４０℃以上という温度条件下においては該拡散速度
が速くなるため、効果的にカラムに吸着される。従って
、シクロスポリンの回収率が非常に高くなる。前処理カ
ラムが４０℃以下の場合には、このような高回収率は達
成されない。例えば、正常男子全血にＣＹＡ （サンド
社、スイス国）を５００ｎｇ／ｍの割合で加え、その０
．１ ｄに溶血試薬（ポリエチレングリコールラウリル
エーテル１Ａｔｌａｓ 社Ｍ。
が速くなるため、効果的にカラムに吸着される。従って
、シクロスポリンの回収率が非常に高くなる。前処理カ
ラムが４０℃以下の場合には、このような高回収率は達
成されない。例えば、正常男子全血にＣＹＡ （サンド
社、スイス国）を５００ｎｇ／ｍの割合で加え、その０
．１ ｄに溶血試薬（ポリエチレングリコールラウリル
エーテル１Ａｔｌａｓ 社Ｍ。
Ａｔ１ａｓＧ−２１３３の０．５ ｗ／ｖ％水溶液）Ｏ
，ｇｄを加えて振盪した溶血検体を用い、上記前処理カ
ラムの温度を２８℃に設定して分析を行なったところ、
ＣｙＡの回収率は５０％以下であった。このような現
象はステロイドなどのシクロスポリン以外の物質を被測
定物質とした場合には認められない。
，ｇｄを加えて振盪した溶血検体を用い、上記前処理カ
ラムの温度を２８℃に設定して分析を行なったところ、
ＣｙＡの回収率は５０％以下であった。このような現
象はステロイドなどのシクロスポリン以外の物質を被測
定物質とした場合には認められない。
第１図の装置を用い、前処理カラムの充填剤として合成
高分子充填剤を用いると、該カラム温度が４０℃の場合
にはＣＶＡの回収率は約９０％、５０℃以上ではほぼ１
００％となる。カラム温度の上限は充填剤の耐熱性およ
び溶離液の沸点により異なり。
高分子充填剤を用いると、該カラム温度が４０℃の場合
にはＣＶＡの回収率は約９０％、５０℃以上ではほぼ１
００％となる。カラム温度の上限は充填剤の耐熱性およ
び溶離液の沸点により異なり。
通常８０℃程度とされる。このように２本発明において
は、合成高分子充填剤を用いた前処理カラムで効果的に
タンパク成分が除去されると同時にシクロスポリンが効
果的に該カラム内に吸着するため、シクロスポリンが分
析カラムで分析後、精度良く測定され得る。
は、合成高分子充填剤を用いた前処理カラムで効果的に
タンパク成分が除去されると同時にシクロスポリンが効
果的に該カラム内に吸着するため、シクロスポリンが分
析カラムで分析後、精度良く測定され得る。
（実施例）
以下に本発明を実施例につき説明する。
実１韮
高圧六方バルブ４に、前処理カラム５および液体クロマ
トグラフィー（品性製作所製、モデル■、Ｃ６Ａ）に組
み込まれた分析カラム８などを第１図に示すように接続
した。前処理カラム５としては、内径４閤、長さ１．５
ｃｍのステンレス製カラムを用いた。充填剤としては粒
子径５〜２０μｍのアクリル系高分子多孔性粒子を用い
た。このアクリル系高分子多孔性粒子は、４重量％ポリ
ビニルアルコール水溶液４００ｍ１中にテトラエチレン
グリコールジメタクリレート４０ｇ、テトラメチロール
メタントリアクリレートＬｏｇ、）ルエン４０ｇおよび
ベンゾイルパーオキサイド０６５ｇを加え、これを１５
Ｏｒｐｍで撹拌しながら８０″Ｃで１０時間反応させ１
反応後熱水およびアセトンで洗浄して得られた。
トグラフィー（品性製作所製、モデル■、Ｃ６Ａ）に組
み込まれた分析カラム８などを第１図に示すように接続
した。前処理カラム５としては、内径４閤、長さ１．５
ｃｍのステンレス製カラムを用いた。充填剤としては粒
子径５〜２０μｍのアクリル系高分子多孔性粒子を用い
た。このアクリル系高分子多孔性粒子は、４重量％ポリ
ビニルアルコール水溶液４００ｍ１中にテトラエチレン
グリコールジメタクリレート４０ｇ、テトラメチロール
メタントリアクリレートＬｏｇ、）ルエン４０ｇおよび
ベンゾイルパーオキサイド０６５ｇを加え、これを１５
Ｏｒｐｍで撹拌しながら８０″Ｃで１０時間反応させ１
反応後熱水およびアセトンで洗浄して得られた。
正常男子全血にシクロスポリンＡ（サンド社製）を５０
０ｎｇ ／−の割合で添加し、そのｏ、ｉ＊に、溶血試
薬０．９ ｄを加えて振盪した。溶血試薬としては、ポ
リエチレングリコールラウリルエーテルを主成分とする
界面活性剤（Ａｔｌａｓ社製、 Ａｔ１ａｓ Ｇ−２１
３３； ＦＩＬＢ値１３．１） （７）０．５Ｗ／Ｖ％
水溶液に内部標準物質としてシクロスポリンＤ （サン
ド社製）を５０ｎｇ／雁の割合で添加したものを用いた
。上記得られた溶血液５００μ！を試料とした。ポンプ
２により水槽１中のイオン交換水を１ 、０ ｍｌ ７
分の流速で六方バルブ４の接続端Ａ−８を経て２６０℃
に設定した前処理カラム５に流しながら、試料インジェ
クター３から上記試料を注入した。１０分後に六方バル
ブ４を切り換え第２図に示すように接続した。ポンプ７
により、溶離液槽Ｇ中からアセトニトリル対水が４４
： ５６の溶離液を１．２ ｄ／分の流速で六方バルブ
接続端Ｄ−Ｅ、前処理カラム５そして六方バルブ接続端
Ｂ−Ｃを経て液体クロマトグラフィーの分析カラム８へ
通した。上記溶離液の流通により溶離したＣｙＡの測定
を行なった。使用した分析カラムはシリカ系ＣＮカラム
（積木化学工業■製１メディポーラーｃｈｉ；カラムサ
イズ内径４．６ｍｍＨ長さ２５ｃｍ）であり、検出は波
長２２０ｎｎ＋の吸光度によって行った。得られたクロ
マトグラムを第３図に示す。第３図において２ ａはＣ
ｙＡのピークを１ｂはＣｙＤのピークを示す。このよう
に２本発明方法により、シクロスポリンＡおよびＤが、
単独ピークとして分離・測定されることがわかる。別に
作成した検量線から、 ＣｙＡの血中濃度は４８８ｎｇ
／ｄであると算出され２回収率は９７．６％と良好であ
ることがわかった。
０ｎｇ ／−の割合で添加し、そのｏ、ｉ＊に、溶血試
薬０．９ ｄを加えて振盪した。溶血試薬としては、ポ
リエチレングリコールラウリルエーテルを主成分とする
界面活性剤（Ａｔｌａｓ社製、 Ａｔ１ａｓ Ｇ−２１
３３； ＦＩＬＢ値１３．１） （７）０．５Ｗ／Ｖ％
水溶液に内部標準物質としてシクロスポリンＤ （サン
ド社製）を５０ｎｇ／雁の割合で添加したものを用いた
。上記得られた溶血液５００μ！を試料とした。ポンプ
２により水槽１中のイオン交換水を１ 、０ ｍｌ ７
分の流速で六方バルブ４の接続端Ａ−８を経て２６０℃
に設定した前処理カラム５に流しながら、試料インジェ
クター３から上記試料を注入した。１０分後に六方バル
ブ４を切り換え第２図に示すように接続した。ポンプ７
により、溶離液槽Ｇ中からアセトニトリル対水が４４
： ５６の溶離液を１．２ ｄ／分の流速で六方バルブ
接続端Ｄ−Ｅ、前処理カラム５そして六方バルブ接続端
Ｂ−Ｃを経て液体クロマトグラフィーの分析カラム８へ
通した。上記溶離液の流通により溶離したＣｙＡの測定
を行なった。使用した分析カラムはシリカ系ＣＮカラム
（積木化学工業■製１メディポーラーｃｈｉ；カラムサ
イズ内径４．６ｍｍＨ長さ２５ｃｍ）であり、検出は波
長２２０ｎｎ＋の吸光度によって行った。得られたクロ
マトグラムを第３図に示す。第３図において２ ａはＣ
ｙＡのピークを１ｂはＣｙＤのピークを示す。このよう
に２本発明方法により、シクロスポリンＡおよびＤが、
単独ピークとして分離・測定されることがわかる。別に
作成した検量線から、 ＣｙＡの血中濃度は４８８ｎｇ
／ｄであると算出され２回収率は９７．６％と良好であ
ることがわかった。
次に、前処理カラム温度を２８℃，４０″Ｃ，５０’Ｃ
および７０℃に設定して、同様にＣｙＡの測定を行なっ
た。
および７０℃に設定して、同様にＣｙＡの測定を行なっ
た。
それぞれの場合のＣｙＡの回収率を６０’Ｃのものも含
めて表に示す。
めて表に示す。
表
表から、前処理カラムは４０℃以上、好ましくは５０℃
以上に設定するのが適当であることが明らかである。
以上に設定するのが適当であることが明らかである。
（発明の効果）
本発明方法によれば、このように、検体中のシクロスポ
リンが精度よく容易に測定される。本発明方法は特に自
動化高速液体クロマトグラフィーによる血中のシクロス
ポリンの測定に好適であり、例えば、投与量から容易に
血中濃度を予測することの難しいＣｙＡの血中濃度のモ
ニタリングなど。
リンが精度よく容易に測定される。本発明方法は特に自
動化高速液体クロマトグラフィーによる血中のシクロス
ポリンの測定に好適であり、例えば、投与量から容易に
血中濃度を予測することの難しいＣｙＡの血中濃度のモ
ニタリングなど。
広範囲にわたる利用が可能である。
４、 ゛の なｉ′日
第１図および第２図は本発明方法の実施に用いられる測
定装置の一例を示す接続図１第３図は本発明方法により
血中のシクロスポリンＡおよびＤを測定したときに得ら
れたクロマトグラムである。
定装置の一例を示す接続図１第３図は本発明方法により
血中のシクロスポリンＡおよびＤを測定したときに得ら
れたクロマトグラムである。
ｌ・・・水槽、２，７・・・ポンプ、３・・・試料イン
ジェクター、４・・・大力バルブ、５・・・前処理カラ
ム、６・・・溶離液槽、８・・・分析カラム。
ジェクター、４・・・大力バルブ、５・・・前処理カラ
ム、６・・・溶離液槽、８・・・分析カラム。
以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、シクロスポリンを高速液体クロマトグラフィーで測
定する方法であって、 シクロスポリンを含む試料を４０℃以上に保持された前
処理カラムに導き該シクロスポリンを吸着させ、かつ該
試料中のタンパク成分を吸着させることなく通過させる
工程、および 該前処理カラムに溶離液を流してシクロスポリンを脱着
させて分離用カラムに導き、これを測定する工程、 を包含するシクロスポリンの測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3886089A JPH02216453A (ja) | 1989-02-17 | 1989-02-17 | シクロスポリンの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3886089A JPH02216453A (ja) | 1989-02-17 | 1989-02-17 | シクロスポリンの測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02216453A true JPH02216453A (ja) | 1990-08-29 |
Family
ID=12536958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3886089A Pending JPH02216453A (ja) | 1989-02-17 | 1989-02-17 | シクロスポリンの測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02216453A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997046575A1 (en) * | 1996-06-05 | 1997-12-11 | Poli Industria Chimica, S.P.A. | Method of isolating cyclosporins |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58223061A (ja) * | 1982-06-18 | 1983-12-24 | Sekisui Chem Co Ltd | 非蛋白物質の分析方法 |
| JPS5968671A (ja) * | 1982-10-13 | 1984-04-18 | Sekisui Chem Co Ltd | エストロジエンの定量法 |
| JPS62259061A (ja) * | 1986-05-02 | 1987-11-11 | Sekisui Chem Co Ltd | 非蛋白物質分離用充填剤 |
| US4722999A (en) * | 1985-05-03 | 1988-02-02 | Yale University | Cyclophilin |
-
1989
- 1989-02-17 JP JP3886089A patent/JPH02216453A/ja active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58223061A (ja) * | 1982-06-18 | 1983-12-24 | Sekisui Chem Co Ltd | 非蛋白物質の分析方法 |
| JPS5968671A (ja) * | 1982-10-13 | 1984-04-18 | Sekisui Chem Co Ltd | エストロジエンの定量法 |
| US4722999A (en) * | 1985-05-03 | 1988-02-02 | Yale University | Cyclophilin |
| JPS62259061A (ja) * | 1986-05-02 | 1987-11-11 | Sekisui Chem Co Ltd | 非蛋白物質分離用充填剤 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997046575A1 (en) * | 1996-06-05 | 1997-12-11 | Poli Industria Chimica, S.P.A. | Method of isolating cyclosporins |
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