JPH0774799B2 - 血中成分の測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，血中成分，特に血液および血球中に含有され
る成分を，高速液体クロマトグラフィーを用いて精度良
く容易に測定する方法，特に自動化可能な測定方法に関
する。

（従来の技術） 血液中に含まれる各種成分の測定が病理学的研究，診
断，治療などのために行われている。例えば，血液中の
薬物濃度をモニタニリングすることにより，薬物投与量
の決定がなされている。このような薬物の例としては，
シクロスポリンＡ（cyclosporinA;CyA）が挙げられる。
CyAは，環状ペプチドであり強力な免疫抑制作用を示
す。このCyAの消化吸収は個人差が大きく，投与期間な
どによっても吸収効率が変動するため血中濃度をモニタ
リングすることが必要である。このCyAは，通常，次の
方法（「医学のあゆみ」第129巻，第９号,623〜627（19
74））により測定される。まず，血液をあらかじめ適度
に親水処理された除タンパクカラムに通し,CyAを吸着さ
せるとともにタンパクを吸着させることなく通過させて
除去する，このカラムにメタノールを流してCyAを溶出
させ，溶出液から溶媒を揮発させた後，アセトニトリル
−水（70:30）を溶離液として高速液体クロマトグラフ
ィー（HPLC）によりCyAの測定を行う。

上記CyAの測定法のように，通常，血液中の成分を測定
する場合には，全血から血球成分を除いた血漿，または
血清が用いられる。なぜなら，ヘモグロビンを有する赤
血球が検体中に含まれると，紫外および可視領域の全域
にわたって大きな吸収が現れ，分光学的手法による測定
が不能となるためである。しかし，目的とする被測定成
分が血球中にも含有される場合があるため，上記血漿ま
たは血清を使用する方法では不正確であることが指摘さ
れている。例えば，上記CyAは血球中にも取り込まれ，
かつ血液を採取した時点から，血球内と血漿内との薬物
濃度の比率が徐々に変化する。

血漿および血球の両方に含まれる被測定成分を測定する
ときに，上記高速液体クロマトグラフィーを用いた測定
法においては，除タンパクカラムが血球により目詰まり
を起こすため採用することができない。血漿および血球
内の被測定成分を測定するには溶血させて血球成分を破
壊する必要がある。たとえば，ジャーナル オブ クロ
マトグラフィー（Journal of Chromatography）,341（1
985）,411〜419頁，にはアセトニトリルを用い溶血させ
た後にCyAを測定する方法が記載されている。それによ
ればまず，採取した全血にアセトニトリルを添加して溶
血させ，タンパク成分を沈澱させた後，遠心分離して上
清を集める。この上清部分をシリカゲルを用いた逆相ク
ロマトグラフィーにかけてCyAおよびCyA以外の疎水成分
を吸着させてその他の成分を除去することにより前処理
した後,ODSシリカゲルカラムにかけて分離し，測定を行
う。

このように，全血中の被測定成分を測定し得る方法が開
発されているが，遠心分離など処理工程が複雑化するた
め自動測定に応用することはできない。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の欠点を解決することであり，その目
的とするところは，血漿および血球中に含有される被測
定物質を精度良く，容易に測定し得る方法を提供するこ
とにある。本発明の他の目的は血中の被測定成分を，例
えば全血を試料として自動的に短時間のうちに測定し得
る方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段および作用） 本発明の血中成分の測定法は，血液または血球成分を含
有する試料中の被測定物質を高速液体クロマトグラフィ
ーで測定する方法であって,HLB値が10〜17の非イオン界
面活性剤を含む溶液と該試料とを混合して，該試料中の
血球成分を破壊する工程，該混合後の試料溶液を前処理
カラムに導き該被測定物質を吸着させ，かつ該試料溶液
中のタンパク成分を吸着させることなく通過させる工
程，および該前処理カラムに溶離液を流して被測定物質
を脱着させて分離用カラムに導き，これを測定する工
程，を包含し，そのことにより上記目的が達成される。

本発明方法に用いられる界面活性剤は，血球を破壊する
溶血剤として用いられる。非イオン系界面活性剤が用い
られ，そのHLB値は10〜17の範囲である。HLB値とは，界
面活性剤の分子が有する親水性基と親油性基との相対的
割合を示すパラメーターである。HLB値が大きいと親水
性基の占める割合が大きく，従って親水性の度合が高く
なり,HLB値が小さいと疎水性基の占める割合が大きく，
従って親油性の度合が高くなる。非イオン系界面活性剤
が有する親水性基としては，ポリオキシエチレン基，水
酸基などが，そして疎水性基としては，脂肪族または芳
香族の炭化水素基がある。本発明に用いられる界面活性
剤としては,HLB値が上記範囲のポリオキシエチレンアル
キルエーテル，ポリオキシエチレンアルキルフェニルエ
ーテル，ポリオキシエチレンアラルキルフェニルエーテ
ル（例えば，ポリオキシエチレントリベンジルフェニル
エーテル）などが挙げられる。HLB値が10を下まわると
親水性が低くなり，水溶液中ではミセルを形成して不透
明になるため測定が正確になされず，かつ，これらをカ
ラムに供給すると，カラムもしくはフィルターの目詰ま
りを起こすという問題が生じる。逆にHLB値が17を越え
ると血球の細胞膜の破壊が完全に行われない。

上記界面活性剤は，通常水溶液として用いられるが，界
面活性剤の溶解性を高めるために，水と混合し得る有機
溶媒が加えられてもよい。このような有機溶媒として
は，メチルアルコール，エチルアルコール，アセトン，
アセトニトリルなどがある。これらの有機溶媒は，血液
中のタンパクが凝固して沈澱を生じない範囲内で，使用
される。その濃度は，通常,30％以下である。上記界面
活性剤の使用量は，血液1mlもしくは血液1ml中に含有さ
れる血球成分量あたり10〜500mgである。例えば，上記
界面活性剤を0.01〜２重量％の割合で含有する溶液を使
用する場合には，血液1mlあたり２〜100mlの割合で添加
される。

血球成分を破壊する方法としては，有機溶媒を用いて血
球細胞膜の脂質を溶解する方法；および水を添加して浸
透圧差により上記の細胞膜を破壊する方法も知られてい
るが，いずれも破壊された膜成分および他のタンパク成
分が沈澱するため，不適当である。

本発明に用いられる前処理カラムに充填される充填剤と
しては，逆相クロマトグラフィー用充填剤が用いられ
る。なかでも解離基を持たない合成高分子系充填剤が好
適である。一般に疎水性の強い合成高分子系充填剤は，
タンパクを強く吸着するが，これに親水性を付与してい
くとタンパクを吸着しなくなる。さらに親水性の度合を
高くすると,CyAなどの被測定物質をも吸着しなくなる。
本発明の充填剤としては，所定の割合で水酸基などの親
水基とアルキル基などの疎水基とを合わせ持つ合成高分
子系充填剤が用いられる。このような充填剤は，特定の
条件で，例えば水や特定pHの緩衝液中では，非タンパク
物質である被測定物質を吸着するが，タンパクは吸着せ
ず，そして，他の条件下，たとえば上記と異なるpHの緩
衝液中では，これに吸着した上記被測定物質を溶離する
性質を有する。このような充填剤としては，例えば，ア
クリル系モノマーを（共）重合成分とする（共）重合体
である粒子が用いられる。そのようなモノマーとして
は，ポリエチレングリコールモノ（またはジ）−（メ
タ）アクリレート，ポリプロピレングリコールモノ（ま
たはジ）−アクリレート，テトラメチロールメタンモノ
（またはジ，トリ）アクリレートなどがある。これらの
モノマーの懸濁重合によって得られ，その粒径が５〜30
μｍ程度の微粒子が特に好適である。一般に，逆相クロ
マトグラフィー用充填剤のうちでもODSシリカゲル（オ
クタデシルシリル基が結合したシリカゲル）充填剤およ
びCNシリカゲル（ニトリル基が結合したシリカゲル）充
填剤などはシラノール基が存在し，タンパクが吸着され
るため，本発明方法には適当ではない。イオン交換クロ
マトグラフィー用の充填剤もある限られた条件下におい
ては使用可能であるが，ほとんどの場合，本発明方法に
使用するのは不適当である。

分析カラムに充填される充填剤としては上記前処理カラ
ムに充填される充填剤よりも被測定物質の吸着性の高い
充填剤が，被測定物質および前処理カラムの充填剤の種
類に応じて適宜選択される。例えば,ODSシリカゲル充填
剤などが用いられる。

本発明方法は，例えば第１図に示す装置により具体化さ
れる。この装置は，接続端Ａ−Ｆを有する六方バルブ4,
該六方バルブの接続端Ｂ・Ｅを介して接続された前処理
カラム５および該六方バルブの接続端Ｃに接続された分
析カラム８を有する。前処理カラム５には上記逆相クロ
マトグラフィー用充填剤が充填され，分析カラムには，
被測定物質の種類に応じて適当な充填剤（例えば,CyAを
測定する場合にはODSシリカゲル）が充填されている。

例えば，全血中の被測定物質の測定を行なう場合には，
採取した血液に上記界面活性剤溶液を添加し，振盪して
血球成分を破壊（溶血）させ，これを試料とする。ま
ず，第１図の装置において，水槽１中のイオン交換水も
しくは緩衝液をポンプ２によって試料インジェクター３
および接続端Ａ・Ｂを経て前処理カラム５に送り，そこ
から接続端Ｅ・Ｆを通り系外に排出する。次に，上記溶
血により調製した試料を試料インジェクターから系内へ
注入する。注入された試料は，ポンプ２によりイオン交
換水もしくは緩衝液と共に移送されて前処理カラム５に
達する。ここで試料中の被測定物質（非タンパク性物質
である）は該カラムの充填剤に吸着される。他方，該試
料中のタンパク成分は吸着されないでカラム５を通過
し，六方バルブ４の接続端Ｅ・Ｆを経て系外に排出され
る。

溶離液槽６には，上記前処理カラム５に吸着した被測定
物質を溶融させ得る溶離液が収容されている。この溶離
液はポンプ７により，接続端ＤおよびＣを経由して分析
カラム８へ送られる。次いで第２図に示すように，六方
バルブ４を切り換えて接続端ＤをＥに接続すると，ポン
プ７により溶離液槽６中の溶離液が接続端ＤおよびＥを
経て前処理カラム５に供給される。溶離液がカラム５を
通過することにより，吸着された被測定物質が溶離さ
れ，溶離液と共に接続端ＢおよびＣを経て分析カラム８
に達する。被測定物質は分析カラム８で分離され，分析
カラム８以降に設けられた図外の適宜な検出器により検
出される。分析カラム８には前処理カラムに用いられる
充填剤よりも吸着性の高い充填剤が充填されているた
め，前処理カラムに吸着されていた被測定物質は溶離液
によって完全に溶離し，精度良く分離し測定される。

以上に述べた例では前処理カラム５におけるポンプ２に
よるイオン交換水の進行方向と，ポンプ７による溶離液
の進行方向とはそれぞれ反対方向になっているが，これ
に限られる必要はない。進行方向が同じ方向となるよう
な接続方式が採用されてもよい。第２図に示すような接
続に切換えた後，被測定物質が六方バルブ４の接続端Ｃ
を通過して分析カラム８に達したころを見計らって，六
方バルブ４を第１図に示される接続にさらに切換えるこ
ともできる。このように切換えることにより，分析カラ
ム８で分析を行ないながら，次の試料を前処理カラム５
に通し次の分析のための前処理を行なうことができる。

上記本発明の方法においては，所定のHLB値を有する非
イオン界面活性剤が溶血剤として使用される。そのた
め，効果的に血球成分を破壊して，血球中に含有される
被測定成分を放出させることが可能である。破壊された
膜成分やその他のタンパク，及び脂質成分は均一に試料
中に分散し，これらが沈澱することがない。そのため，
従来のように遠心分離により膜成分やタンパク成分を沈
澱させて除去するという工程を必要とせず，そのまま,H
PLCにかけて分析することが可能となる。血球成分によ
りカラムが目詰まりを起こすこともない。上記界面活性
剤で処理された試料は，合成高分子充填剤を用いた前処
理カラムで効果的にタンパク成分が除去されるため，被
測定成分は，分析カラムで分析後，精度良く測定され得
る。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

実施例１ 高圧六方バルブ４に，前処理カラム５および液体クロマ
トグラフィー（島津製作所製，モデルLC6A）に組み込ま
れた分析カラム８などを第１図に示すように接続した。
前処理カラム５としては，内径4mm,長さ1.5cmのステン
レス製カラムを用いた。充填剤としては粒子径５〜20μ
ｍのアクリル系高分子多孔性粒子を用いた。このアクリ
ル系高分子多孔性粒子は,4重量％ポリビニルアルコール
水溶液400ml中にテトラエチレングリコールジメタクリ
レート40g,テトラメチロールメタントリアクリレート10
g,トルエン40gおよびベンゾイルパーオキサイド0.5gを
加え，これを400rpmで攪拌しながら80℃で10時間反応さ
せ，反応後熱水およびアセトンで洗浄して得られた。

正常男子全血にシクロスポリンＡ（サンド社製）を800n
g/mlの割合で添加し，その0.5mlに，溶血試薬2mlを加え
て振盪した。溶血試薬としては，ポリエチレングリコー
ルラウリルエーテルを主成分とする界面活性剤（Atlas
社製,Atlas G−2133;HLB値13.1）の2W/V％水溶液に内部
標準物質としてシクロスポリンＤ（サンド社製）を200n
g/mlの割合で添加したものを用いた。上記得られた溶血
液500μを試料とした。ポンプ２により水槽１中のイ
オン交換水を1.0ml/分の流速で六方パルブ４の接続端Ａ
・Ｂを経て前処理カラム５に流しながら，試料インジェ
クター３から上記試料を注入した。10分後に六方バルブ
４を切り換え第２図に示すように接続した。ポンプ７に
より，溶離液槽６中からアセトニトリル対水が70:30の
溶離液を1.5ml/分の流速で六方バルブ接続端Ｄ・E,前処
理カラム５そして六方バルブ接続端Ｂ・Ｃを経て液体ク
ロマトグラフィーの分析カラム８へ通した。上記溶離液
の流通により溶融したCyAの測定を行なった。使用した
分析カラムはシリカ系ODSカラム（積水化学工業（株）
製，メディポーラーODS;カラムサイズ内径4.6mm;長さ25
cm）であり，検出は波長210nmの吸光度によって行っ
た。得られたクロマトグラムを第３図（Ａ）に示す。第
３図（Ａ）において,aはCyAのピークを,bはCyDのピーク
を示す。

別にシクロスポリンＡを添加せずに同様の方法により測
定を行なったところ第３図（Ｂ）に示すクロマトグラム
が得られた。第３図（Ａ）および（Ｂ）を比較すると，
本発明方法により，シクロスポリンＡおよびＤが，単独
ピークとして分離・測定されることがわかる。別に作成
した検量線から,CyAの血中濃度は760ng/mlであると算出
され，回収率は95％と良好であることがわかった。

実施例２ ポリエチレングリコールソルビタンモノパルミテートを
主成分とする界面活性剤であるTween−20（Atlas社製;H
LB値15.6）を2W/V％の割合で水−エタノール混合液（9
0:10v/v）に混合して溶血試薬を得た。これを用いたこ
と以外は，実施例１と同様に操作したところ,CyAおよび
Ｄのピークが実施例１と同様に確認された。回収率はい
ずれも93％であった。

実施例３−１ 界面活性剤としてAltas G−3705（Atlas社製;HLB値10.
8）を用い，その2gを10％エタノール水溶液100mlに添加
し，室温にてスターラーで５分間攪拌し，その溶解性を
目視観察した。次にこの溶液を実施例１の装置のインジ
ェクターから注入し，カラムの圧力および目詰まりが起
こるか否かを観察した。別に，この界面活性剤2mlに抗
凝固処理した全血0.5mlを加えて振盪し，目視および顕
微鏡観察を行ない溶血が完全に行われたか否かを観察し
た。その結果を下表に示す。実施例３−２〜３−３およ
び比較例１−１〜１−２の結果もあわせて下表に示す。

実施例３−２ 界面活性剤としてAltas G−2133（Atlas社製;HLB値13.
1）を用いたこと以外は実施例２−１と同様である。

実施例３−３ 界面活性剤としてBrij 35（Atlas社製;HLB値16.9）を用
いたこと以外は実施例２−１と同様である。

比較例１−１ Brij 30（Atlas社製;HLB値9.5）を用いたこと以外は実
施例３−１と同様である。

比較例１−２ Altas G−2159（Atlas社製;HLB値18.8）を用いたこと以
外は実施例２−１と同様である。

実施例４ 健常人全血を採血後，該血液1mlに対し，直ちに抗凝固
剤（日本商事株式会社製；アングロット）１滴を加え
た。これにシクロスポリンＡを800ng/mlの割合となるよ
うに添加し,CyA含有全血を調製した。これを,37℃にて
３時間加温し，直ちに遠心分離により血球（沈降物）お
よび血漿（上澄み）とに分離した。血球と血漿との容量
比は55対45であった。

得られた血漿を，医学のあゆみ第129巻，第９号,623頁
に記載の方法で測定したところ，血漿中のシクロスポリ
ンＡの濃度は640ng/mlであった。次に，上記血球0.25ml
に対し，実施例１で用いたのと同様の溶血試薬2.25mlを
加え，実施例１と同様の方法および装置によりシクロス
ポリンＡを測定したところ，その濃度は840ng/mlであっ
た。これらの結果により，シクロスポリンＡは37℃,3時
間のインキュベーションにて，最初血漿中に溶解してい
たものが徐々に血球中に溶解してゆくことが確認され
た。

〔発明の効果〕

本発明方法によれば，このように，血漿中および血球中
に含有される成分が精度よく容易に測定される。本発明
方法は特に自動化高速液体クロマトグラフィーによる血
中成分の測定に好適であり，例えば，投与量から容易に
血中濃度を予測することの難しいCyAの血中濃度のモニ
タリングなど，広範囲にわたる利用が可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は本発明方法の実施に用いられる測
定装置の一例を示す接続図，第３図（Ａ）および（Ｂ）
は本発明方法により血中のシクロスポリンＡおよびＤを
測定したときに得られたクロマトグラムである。 １……水槽,2,7……ポンプ,3……試料インジェクター,4
……六方バルブ,5……前処理カラム,6……溶離液槽,8…
…分析カラム。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】血液または血球成分を含有する試料中の被
   測定物質を高速液体クロマトグラフィーで測定する方法
   であって， HLB値が10〜17の非イオン界面活性剤を含む溶液と該試
   料とを混合して，該試料中の血球成分を破壊する工程， 該混合後の試料溶液を前処理カラムに導き該被測定物質
   を吸着させ，かつ該試料溶液中のタンパク成分を吸着さ
   せることなく通過させる工程，および 該前処理カラムに溶離液を流して被測定物質を脱着させ
   て分離用カラムに導き，これを測定する工程， を包含する血中成分の測定法。
2. 【請求項２】前記被測定物質がシクロスポリン誘導体で
   ある特許請求の範囲第１項に記載の測定法。