JPH02216459A - ハプテンである抗原に対し高親和性を持つ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、医療診断分野、化学分析などに有用な免疫的
検出方法において最も重要な働き有する抗体の高性能化
に関するものである。特に、それ自体では免疫反応を引
き起こすことのできない低分子化合物すなわちハプテン
に対して、高いアフィニティーを持つ抗体の作製に関す
る。

さらに詳細には、中枢神経興奮作用を有し覚醒剤の一種
であるメタンフェタミンに対して、高い親和力を持つ抗
体及びモノクローナル抗体の作製に関する。

従来の技術 血液中の微量成分や、大気中の特定成分の検出を行なう
際には、非常に多くの不純物から特定の極微嚢成分を確
実に検出する必要がある。このような目的のために、近
年抗体の反応に基づく免疫的検出方法が盛んに仙究され
ている。

免疫的検出方法は放射性同位体を用いるラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＢ）と、酵素を用いる工ンザイムイムノア
ッセイ（ＥＩＡ）に大別される。安全性や簡便性の点か
らは、ＥＩＡが有利である。

ここでＥＩＡとして一般的なエンザイムリンクトイムノ
ンルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法について説明する
。第１図において１はタンパク質を非特異的に吸着する
プラスチック（ボリスヂＥン等）のマイクロプレートで
ある。２は被測定物質である抗原に適当な官能基を導入
し、これを介してタンパク質と化学的に結合した固相抗
原で、マイクロプレートｌに吸着している。３は非測定
物質に対して結合能を持つ抗体であり、固相抗原２と平
衡的に結合している。すなわち抗体３は固相抗原２を介
してマイクロプレートｌに固定化されている。この状態
で、４の被測定物質である抗原を導入すれば抗体３に対
して固相抗原２と被測定物質である抗原４が競争的に結
合する。したがって抗体３の一部が被測定物質である抗
原４と結合することになり、結果的に一部の抗体３はマ
イクロプレート１に固定化されていない状態になる。当
然被測定物質である抗体４が多いほどマイクロプレート
ｌに固定化されていない抗体３は増加する。ここで洗浄
を行なうことにより、マイクロプレーｌ司に固定化され
ていない抗体３を除去することができる。マイクロプレ
ートｌに固定化されていない抗体３を除去した後、抗体
３に対して結合能を持つ抗体５を加える。ただし、抗体
５は６の酵素と一定の比で化学的に結合している。抗体
３に未結合の抗体５を洗浄によって除去した後、酵素６
の活性を測定する。活性と酵素６の量との間には正の相
関があるので、活性を測定することにより酵素Ｇの量を
定量する事ができる。酵素６の量がわかれば、遡ってマ
イクロプレー）１に固相抗原２を介して固定化された抗
体３の量が定量可能であり、さらに被測定物質である抗
原４が定量できる。この際、検出感度を決定する第一の
要因は抗体３の被測定物質である抗原４に対する親和力
である。

抗体とは生物が産生ずるタンパク質の一種で、特定の物
質すなわち抗原とのみ選択的に結合する性質がある。抗
原は、それに結合する抗体の作製方法の違いから２種類
に大別される。１つは直接動物体内に注射することによ
り抗体を産生ずることができるもので、通常分子量致方
以上の巨大分子がこれに相当する。他方は比較的分子量
の小さいもので、適当なタンパク質に化学結合して初め
て抗体の産生を誘導する免疫原となり得る。特に後者の
ような抗原はハプテンと呼ばれている。ハプテンである
抗原に対する抗体の作製方法に関しては、例えば以下の
文猷（ハプテンズ　アンド　キャリアーズ、Ｏ，マケラ
　アンド　１．　　Ｊ、　　Ｔ。

セパラ、ハンドブック　オブ　エクスペリメンタル　イ
ムノロジー　フォース　エディシドン、ｖＯｌ　、１．
　　Ｃｈａｐ　３、：Ｌデイティラド　バイ　Ｄ、　　
Ｍ。

ヴエイアー　ブラックウェル　サイエンティフィック　
パブリケーシ日ンズ、オックスフォード、１９８Ｇ、　
　Ｈａｐｔｅｎｓ　ａｎｄ　Ｃａｒｒｌｅｒｓ、　０．
　Ｋａｋｅｌａ　ａｎｄ　１、Ｊ、Ｔ、５ｅｐｐａｌａ
、　　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　　ｏｆ　　Ｅｘｐｅｒｌｓ＋
ｅｎｔａｌ　　Ｉ＋ｗｍｕ−ｎｏｌｏｇｙ　４ｔｈ　ｅ
ｄｌ−Ｎｏｎ、　Ｖｏｌ、１．　Ｃｈａｐ　３．　ｅｄ
　ｂｙ　Ｄ。

Ｍ、Ｗｅｌｒ、　Ｂｌａｃｋｖｅｌｌ　５ｃｌｅｎｔ１
ｆ１ｃ　Ｐｕｂｌｉｆｌｃａｔｌｏｎｓ。

０ｘｆｏｒｄ、　１９８Ｇ、）に記載されている。すな
わち、ハプテンに化学結合が可能な官能基が存在すれば
、その官能基を用いてタンパク質と結合して免疫原とす
る。もし、対象とするハプテンに官能基が存在しなけれ
ば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の適切な官能
基と、炭素数１から１０程度アルキル鎖からなるスペー
サーを導入したハプテンの誘導体を合成した後、架橋試
薬等で適当なタンパク質と結合して免疫原を得るのが一
般的である。より具体的な例を示せば、タカミらは覚醒
剤の一種であるメタンフェタミン（ＭＡ）をハプテンで
ある抗原とする抗体の作製に関して報告している（タカ
ミ、フタダ　アンド　タカハシ、ジャパニーズジャーナ
ル　オブ　リーガル　メディスン、Ｔａｋａｍｌ、　Ｆ
ｕｋｕｄａ　ａｎｄ　Ｔａｋａｈａｓｈｌ、　Ｊｐｎ、
　Ｊ、Ｉ　Ｌｅｇａｌ　Ｍｅｄ、、　３７（４）、　４
１７ｊ１９８３）。すなわち、ＭＡの第二アミンにアミ
ノブチル基を導入してアミノブチルメタンフェタミン（
ＡＢＭＡ）とし、これをタンパク質と結合して免疫原と
している。

発明が解決しようとする課題 しかしながら上記の免疫原で作製した抗体は、目的抗原
であるＨＡよりもむしろ抗原誘導体であるＡＢＭＡに対
して高い親和力を有していることが発明者らの検討によ
り明かになった。即ち従来の方法で得られる抗体はあく
まで抗原誘導体に対する抗体である。抗原誘導体は、官
能基、スペーサー等の導入により、本来目的とする抗原
とは異なった構造なので、本来目的とする抗原に対して
高い親和力の抗体を作るのは困難であるという課題が浮
き彫りにされた。

また、このため、従来の方法によって得られる抗体を用
いて、例えば上記ＥＬＩＳＡ法で本来目的とする抗原を
被測定物質として測定を行う際、多量の被測定物質であ
る抗原が導入されてもマイクロプレートに固定化されて
いない抗体が増加しないので、被測定物質である抗原を
高感度に検出することが不可能となる。

課題を解決するための手段 上記課題を解決するため、官能基及びスペーサーを導入
した状態で目的抗原と類似性の高い物質を抗原誘導体合
成の出発物質とすることを考えた。

具体的には、目的抗原分子中のアルキル基が水素原子と
置換した物質を出発物質として、この水素原子の位置に
タンパク質と結合可能な官能基及びスペーサーを導入し
、この官能基を介してタンパク質と結合させて得られる
免疫原を作製することが考えられる。

より具体的には、中枢神経興奮作用を存し覚醒剤の一種
であるメタンフェタミン（ＨＡ）を目的抗原とし、かか
る抗原に対して高い親和力を持つ抗体を作製するために
、ＭＡのＮ−アルキル基であるメチル基が水素原子に置
換された構造を有するアンフェタミン（ＡＰ）にタンパ
ク質と結合可能な官能基及びスペーサーとしてアミノブ
チル基を導入した抗原誘導体であるアミノブチルアンフ
ェタミン（ＡＢＡＰ）を用いた。以下にＡＰｌＡＢＡＰ
、　ＭＡ、　　ＡＢＭＡの化学構造を示す。

［ＡＰ］ ［ＡＢＭＡ］ ［ＡＥＩＡＰ］ ［ＭＡ］ ＭＡとＡＢＡＰとに化学構造上の高い類似性があること
分かる。

他の好ましい抗原誘導体としては、以下の構造式（ｎは
整数を示す）で示されるアンフェタミン誘導体が挙げら
れる。ｎは整数であり、特にｎは１から１０の整数が好
ましい。ｎが４の場合には、以下の構造式はＡＢＡＰを
示す。

これらのアンフェタミン誘導体は、ＡＰに、例えばトブ
ロモブチルフタルイミドなどのトハロアルキルフタルイ
ミドを反応させてＮ−（４−フタルイミジルアルキル）
アンフェタミンとし、ついでこれをヒドラジンで処理す
ることによって容易に得ることができる。

次にアミノブチル基を介して、ＡＢＡＰをスカシ貝由来
のヘモシアニン（ＫＬＩ（）と結合し、免疫原とした。

ＫＬＨ以外にも、例えばエワトリ等から得られるガンマ
グロブリン、牛血清アルブミンなどのタンパク質を用い
てもよい。また他のアンフェタミン誘導体もその分子中
のアルキル基を介してＫＬＩ＋等のタンパク質に結合さ
せることができる。ＡＢＡＰなどのアンフェタミン誘導
体とタンパク質との結合は通常の方法によって行なうこ
とができる。すなわち、例えばＮ−サクシイミジル３−
（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）
、トリレン−２，４−ジイソシアネート、グルタルアル
デヒド、過ヨウ素酸、ｌ、５−ジフルオロ−２，４−ジ
ニトロベンゼン（ＤＦＤＮＩ３）　、サクシニミジル４
−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カル
ボキシレートＣＳＭＣＣ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチ
リロキシ）サクシニミド（ＣＭＢＳ）、Ｎ−（ε−マレ
イミドカプロイロキシ）サクシニミド（ＥＭＣＳ）など
の通常の結合試薬を用いて実施できる。

かくして得られる免疫原は、目的抗原であるＨ＆と化学
構造上の類似性の高い構造を含んでいる。

この免疫原を動物体内に注射して抗体を作製し、さらに
得られた抗体を用いてＭＡを被測定物質とするＥＬＩＳ
Ａを行なった。

なお、免疫に用いる動物はは乳類であればすべて適用で
きるが、実験の簡便さからマウスを選択した。マウスの
系統はＡ／Ｊが最も免疫応答が高く３好適であった。

作用 上記の如く、官能基及びスペーサーを導入した状態で目
的抗原と化学構造上の類似性の高い物質を出発物質とし
、これに官能基及びスペーサーを導入した抗原誘導体を
該官能基を介してタンパク質と結合させて作製した免疫
原を用いれば、その免疫原は目的抗原と化学構造上の類
似性の高い構造を含む。従って、このような免疫原を動
物体内に注射すれば、動物の血清中から目的抗原に対し
て高い親和力を持つ抗体が得られる。

また、上記免疫原で感作した動物の脾臓細胞とミエロー
マ細胞とを融合することによって、目的抗原に対して高
い親和力を有するモノクローナル抗体を産生ずるハイブ
リドーマを得ることもできる。ハイブリドーマの調整は
、ケーラーとミルシュタインの方法（ケーラー　エト　
アール、ネイチ＋　−２５Ｇ、４９５（１９７５）、　
Ｋｏｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２５
Ｇ、　４９５（１９７５））として知られている通常の
手法により行なうことができる。

具体的には、ＡＢＡＰとＫＬＩＩをムＲＡＰのアミノブ
チル基を介して結合した免疫原をＡ／Ｊ系統のマウスの
体内に注射し、その血清からＡＲＩＡに比べＨＡに対し
てより高い親和力を持つ抗体を得ることができた。

さらに、該マウスの脾臓細胞と８−アザグアニン耐性株
の一つであるマウスミエローマ細胞ＸＧ３−ムｇ８・６
５３を、ポリエチレングリコールなどの融合促進剤の存
在下で融合せしめ、得られる融合細胞をｆｌＡＴ培地中
で培養して、ムＢＭＡに比べＭＡに対してより高い親和
力を有するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドー
マを作製することができた。

また、このハイブリドーマを適当な培地中で培養し、そ
の上清からＡＢＭＡに比べＨＡに対してより高い親和力
を有するモノクローナル抗体を得ることができた。

得られたＡＢｉｌＡに比べＭＡに対してより高い親和力
を有する抗体及びモノクローナル抗体を用いて、ＭＡを
被測定物質とするＥＬＩＳＡを行なったところ、従来に
方法で得られた抗体を用いた場合に比べて、ＭＡの検出
感度が約１０００倍向上した。従って、これら抗体は診
断分野、化学分析などにおいて極めて有用である。

実施例 本発明の一実施例として中枢神経興奮作用を有し覚醒剤
の一つであるＨＡを目的抗原とし、かかる抗原に対して
高い親和力を持つ抗体を作製した。

以下、操作手順に従って実施例の詳細な説明を行なう。

実施例１ 最初に、抗血清の作製方法について述べる。

（１）　ＡＢＡＰの合成法 ＡＰ　２．００ｇ、　　Ｎ−ブロモブチルフタルイミド
（アルドリッチ　ケミカル　カンパニー　Ｉｎｃ、　　
製）４．１７ｇおよび炭酸水素ナトリウム３．１４ｇを
ベンゼン１０ｓｌ中で１６時間還流した。反応液から溶
媒を除去した後、シリカゲルを担体とした分取用薄層ク
ロマトグラフィー（ＴＬＣ）　　（メルク　アンド　Ｃ
ｏｚＩ　ｎ　ｃ、　　製）を用いて精製した。展開溶媒
は、メタノールとクロロホルムを体積比で５＝８５に混
合したものをアンモニアで飽和して用いた。ＡＢＡＰの
Ｒｆ値は０．７であった。メタノールでシリカゲル中の
ＡＢＡＰを抽出した結果、１．５９ｇのＮ−（４−フタ
ルイミジルブチル）アンフェタミン（ＰＩＢＡＰ）が得
られた。

ＰＩＢＡＰ　１．５０ｇを５ｍｌの９５％エダノールに
溶解し、０．２５ｇのヒドラジンｌ水和物を加えて１．
５時間還流したところ、少量の白色沈澱が生じた。再び
濾過した後、濾液をＩＮ塩酸で酸性にし、生じた白色沈
澱を除去した。さらに、この溶液を水酸化ナトリウムで
アルカリ性にすると、油層が分離した。油層をジエチル
エーテルで抽出し、溜去後、前項と同条件のＴＬＣで精
製した。目的物はニンヒドリン試薬と反応して青紫色を
呈する。この反応を利用してＴＬＣ上の目的物を確認し
た。最終的に０．７５ｇのＮ−（４−アミノブチル）ア
ンフェタミン（ＡＢＡＰ）が得られた。

（２）免疫原の作製法 ＡＢＡＰ　１９．１Ｂを２０１１μｌの０．５Ｎ塩酸に
溶解し、０゜ＩＭ　リン酸バッフ１−溶液（ｐＨ７，５
）　４．８ｍｌで希釈した。この溶液に、チオール基導
入試薬であるＮ−サクシニミジル−３−（２−ピリジル
ジチオ）−プロピオネイト（ＳＰＤＰ）　　（ファルマ
シア　ＬＫＢ　　バイオテクノロジー製）　１２゜５ｍ
ｇを１１のエタノールに溶解したものを加え、３０分間
攪拌し反応させた。反応の進行状況を確認するため、反
応液をＴＬＣ上に展開した。展開溶媒は前項と同じ物を
用いた。５ＰＤＰはＴＬＣ上で、２５４ｎｍの紫外光を
吸収する黒いスポットとして確認される。３０分間攪拌
を行なった反応液ではＴＬＣ上の黒いスポットが消失し
ており、５ＰＤＰは完全にＡＢＡＰと反応していた。こ
のようにして５ＰＤＰとＡＢＡＰの結合物（ＡＰ−５Ｐ
Ｉ）Ｐ）を得た。

一方、ＫＬＨを０．１ＭのＮａＣ１を含む０．１Ｍ　　
リン酸ハッ７　ｙ　　（ｐＨ７，０）に溶解し、２．２
ｍｇ／ｍｌのＫＬＨ溶液を調整した。５ＰＤＰ　５１．
８ｍｇをエタノール４．２１に溶解したものを、ＫＬＨ
溶液に滴下し、１２時間攪拌し反応させた。その後、セ
ファデックスＧ−２５（ファルマシア　ＬＫＢ　　バイ
オテクノロジー製）を用いたゲル濾過により、反応液中
の未反応の５ＰＤＰを分離し、ＫＬＩＩと５ＰＴＩＰの
結合物（ＫＬＨ−ＳＰＤＰ）を得た。セファデックスＧ
−２５は、直径４ｃｍ長さ５０ｃｍのカラムに充填し、
毎分６．９０１１の流速で用いた。ジチオスレイトール
ヲＯ，１Ｍ　リン酸バッファーに溶解し、この溶液１．
８ｍｌをＫＬ［ｌ−５ＰＤＰに加え、還元をおこなった
。混合溶液を、再び上記と同条件でセファデックスＧ−
２５カラムでゲルｄ過した後、この溶液１０ＢＩＩｌｌ
にＡＰ−ＳＰＤＰ溶液を徐々に加えた。３０分後、上記
と同条件でセファデックスＧ−２５カラムによるゲル濾
過をおこなったところ、ＫＬＩ（１分子あたりＡＰ　Ｉ
４．３分子が導入された。このようにして得られたＫＬ
）ＩとＡＰの結合物（ＡＰ−ＫＬＨ）を免疫原として用
いた。

（３）免疫方法 ＡＰ−ＫＬＩＩ溶液を０．ＩＭ　ＮａＣｌを含む０．１
Ｍ　リン酸バッフ１−溶液（ｐＨ７，０）で希釈し、Ｋ
ＬＨ′ａ度をＩｍｇ／ｍｌに調整した。このＡＰ−ＫＬ
）Ｉ溶液とコンプリートフロインドアジュバントを等量
混合し、ホモジナイザーで乳化したものを、８週齢のマ
ウスの腹腔に注射した。注射量は一匹のマウスについて
１００μｌとした。なお、マウスの系統は前述したよう
にＡ／Ｊを用いた。

（４）　ＥＬＩＳＡによる抗血清の評価ＡＰ−ＫＬ）ｆ
による免疫後１８週を経過した時点で、マウスの血清を
採取した。この血清を用いてＥＬｉＳＡをおこない、Ｍ
Ａ及びＡＢＭＡを被１１１１１定物質とした際の測定感
度を求めた。ＥＬＩＳＡは、以下の条件でおこなった。

牛血清アルブミン（ＢＳＡ）　１分子に対して抗原誘導
体であるＡＥｔＭＡ　０．４分子が導入されたＵＳＡと
ＡＢＭＡの化学的結合物（ＭＡ−ＢＳＡ）を固相抗原と
して、ポリスチレンでできた９６穴（９８ｖｅｌｌ）　
ＥＬＩＳＡ用プレート（コースタ−コーポレーション製
）上に吸着固定した。マウスより採取した抗血清をフォ
スフェートバッフアートセライン（ＰＢＳ）で１０．０
００倍に希釈し、各種濃度のＭＡまたはＡＢＭＡ溶液と
Ｈｌに混合した。この混合溶液を９６穴ＥＬＩＳＡ用プ
レートにＩ穴あたり１００μ！分注した。３時間経過後
、混合溶液を除去し、９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートをＰ
ＢＳで洗浄した。

この操作によって、プレート上のＭＡ−ＢＳＡに未結合
の抗血清中の抗体は除去される。ついで、抗血清中に含
まれるマウス抗体に結合能を持つ抗体を上記と同量分注
した。この抗体は、ペロキシダーゼ（ＰＯＤ）と化学的
に結合された、いわゆるＰＯＤ標識抗体である。３０分
経過後、ＰＯＤ標識抗体溶液を除去し、再びＰＢＳで９
６穴ＥＬＩＳＡ用プレートの洗浄をおこなった。この操
作で、プレート上の固相抗原に結合したマウス抗体に未
結合ＰＯＤ標識抗体は除去される。一方、ＰＯＤの基質
である０−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）　４０Ｉｎｇ
を０．１Ｍ　リン酸クエン酸バッファー（ｐＨ５，０）
　ＩＯｎ＋Ｉに溶解し、４μｍの３０％Ｈ２Ｏ２を混合
した。この混合溶液を、未結合のＰＯＤ標識抗体を除去
後ＰＢＳで洗浄済みの９６穴Ｅ１、ＩｓＡ用プレートに
、！穴あたり１００μｍ分注した。１〜２分後、プレー
ト上に結合したＰＯＤ標識抗体のＰＯＤの働きによりＯ
ＰＤが酸化され、４９２ｎｍに極大を持つ発色が観察さ
れた。４Ｎ硫酸を１穴あたり２５μｍ分注して酵素反応
を停止した後、分光光度計によって各室の溶液の４９２
ｎｍの吸光度を測定した。測定結果を第２図に実線で示
す。

また比較例として、上記ＡＰ−ＫＬ１１と同様に合成し
たＭＡとＫＬＩＩの化学的結合物（ＨＡ−ＫＬＨ）を用
いて免疫したマウスの、免疫後１８週経過した時点で採
取した血清について、上記と同条件でＥＬＩＳＡをおこ
なった結果を第２図に点線で示す。

第２図において縦軸は４９２ｎＩ１１の相対吸光度であ
り、酵素活性を示す。すなわち、固相抗原に結合した抗
血清中のマウス抗体の相対量を示しており、あるＭＡ？
Ｊ１度での相対吸光度の低下があれば、その濃度のＭＡ
が検出可能であると言える。横軸は、測定に用いた抗血
清とＭＡまたはＡＢＭＡの混合溶液の、ＭＡまたはＡＢ
ＭＡの濃度を示す。横に引いた点線は相対吸光度５０％
を表わす。

第２図の結果について検討を加える。

曲線ａは従来法で作製した抗体による一人の検出曲線、
曲線すは従来法で得られた抗体によるＡＢＭＡの検出曲
線、曲線Ｃは本実施法で作製した抗体によるにＡの検出
曲線、曲線ｄは本実施法で作製した抗体によるＡＢＭＡ
の検出曲線を示す。

＊ｆＭＡ−ＫＬ■で免疫して得られた抗血清について、
相対吸光度が５０％に減少するＭＡ濃度を曲線ａで見る
と、１０−３・６Ｍであった。ＡＢＭＡについては曲線
Ｂを見ると、１０−６・２Ｍで相対吸光度が５０％に減
少している。

すなわち、ＡＢＭＡはＭＡに比べ、抗血清中のマウス抗
体の固相抗原への結合を約５０倍強く阻害するといえる
。言い替えれば、ＨＡ−ＫＬＨの免疫によって得られた
抗体は、ＭＡよりＡＨＭＡに対して約５０倍強く結合す
る。一方、ＥＬＩＳＡに用いた固相抗原がＡＢＭＡとＢ
ＳＡの化学的結合物であり、ＡＢＭＡと同じ構造を含ん
でいることを考えれば、ＭＡ−ＫＬＨの免疫によって得
られた抗体はＭＡより固相抗原に強く結合することが予
想される。前述したように、ＥＬＩＳＡの測定原理は、
固相抗原と被測定物質である抗原が抗体に競争的に結合
する結果、抗体の固相抗原への結合が阻害され、抗体の
固相抗原への結合量が減少することを利用している。抗
体が固相抗原により強く結合すれば、被測定物質である
抗原による抗体の固相抗原への結合の阻害が起こりに＜
＜、結果として測定感度の低下を招く。

一方、ＡＰ−ＫＬＨによって免疫した抗血清では、相対
吸光度が５０％に減少するときのにＡ濃度は曲線Ｃよす
ＩＰ”Ｍ１ＡＢＩＩＡテハ曲線ｄ、にり１０−”Ｍテあ
った。

つまり、ＡＰ−ＫＬＩＩで免疫して得られる抗体はＨＡ
−ＫＬＨで免疫したときとは逆に、抗原誘導体ＡＢＭＡ
よりもＭＡに対して約５０倍強く結合する。したがって
、前述したような測定感度の低下は考えられない。事実
、ＡＰ−ＫＬＨによる免疫で得られた抗血清を用いたＥ
ＬＩＳＡで、相対吸光度が５０％に減少するＭ、Ａ濃度
である１０−”・呻は、ＨＡ−ＫＬＨによる免疫で得ら
れた抗血清を用いた場合に比べ約１０００分の１の低濃
度であった。

なお、上記の考え方に基づく免疫原は本実施例に示した
ＭＡ以外についても、分子食１ｏｏｏ以下のハプテンに
対する抗体を作製する際、一般的に適用可能である。さ
らに、本実施例で感作した動物の膵臓細胞とミエローマ
細胞を融合したハイブリドーマ細胞から産生される抗体
、いわゆるモノクローナル抗体も、当然抗血清と同様の
性質を示す。

すなわち、目的抗原であるハプテンに対し最も強く結合
するモノクローナル抗体を得ることができる。以下、モ
ノクローナル抗体の作製方法について述べる。

実施例２ 実施例１で、ＡＢＭＡに比べＨＡに強く結合する抗体の
産生が確認されたマウスを用いてモノクローナル抗体の
作製をおこなった。以下手順を追って、実施例の説明を
おこなう。

（１）マウスのブースト ＡＰ−ＫＬＨによる免疫後７週の時点で、脾臓を肥大さ
せるためにマウスにブースト処理を施した。すなわち、
ＡＰ−ＫＬＨをＰＢＳでｌｌ１ｇ／ｍｌに希釈し、マウ
ス１匹あたり１００μｌを腹腔内に注射した。

（２）細胞融合 ブースト後３臼目にマウスの膵臓細胞を取り出し、マウ
スミエローマ細胞Ｘ８３−Ａｇ３・６５３と融合した。

以下手順を詳細に示す。

（１）マウスを屠殺、消毒後クリーンベンチ内に移動し
た。以下の操作はすべてクリーンベンチ内で無菌的にお
こなった。

（＋Ｓ）マウスの脾臓を摘出し、予め５１のイシコフ改
変ダルベツコ培地（ＩＭＤＭ）　　（シグマ　ケミカル
カンパニー製）に浸漬していたステンレスメツシュ上に
移した。ハサミで脾臓に約１０カ所の切り目を入れ、細
胞摘出用のガラス棒を用いて注意深く脾臓を押しつぶし
た。この操作により、膵臓細胞はＩＭＤ狙こ懸濁される
。膵臓細胞を懸濁したＩＭＤＭを１５ｍ１遠心管に移し
た後、メツシュ上に残った細胞をさらに５１のＩＭＤＭ
で洗浄し、これも遠心管に加えた。以下（ｌｘ）までの
操作は、極力細胞の温度を４°Ｃに保つよう、遠心機を
冷却し、随時水浴を用いた。

（目１）＃臓細胞の懸濁液を、８００ｇで７分間遠心分
離をおこない、上清をアスピレータで除去した。

（１ｖ）不要成分である赤血球を破壊するため、ＮＨ４
Ｃｌを含むトリスバッファー１０＋ｇｌを加え、管底に
付着している細胞をピペットで撹拌してほぐした。

５〜ＩＯ分氷上で放置した後、８００ｇで７分間遠心分
離をおこない、上清をアスピレータで除去した。

（ｙ）ハンクス平衡塩液（大阪大学微生物病研究所Ｉｉ
ｌ）１０ｍｌを加え、遠心管底部の細胞を攪拌してほぐ
した後、氷上で５〜１０分放置した。組織断片が沈降し
た場合は、この断片を取らないよう細胞懸濁液のみを別
の遠心管に移した。８００ｇで７分間遠心分離をおこな
い、上清をアスピレータで除去した。

（ｖｌ）再びハンクス平衡塩液１０ｍ１を加え、管底部
の細胞を攪拌してほぐした。８００ｇで７分間遠心分離
をおこない、上清をアスピレータで除去した。

（ｖｌｌ）ハンクス平衡塩液１３〜１４ｍ１を加えて、
管底部の細胞を攪拌してほぐした。

（ｖｌｌり前項で得た脾臓細胞懸濁液５０μｌに、細胞
染色液であるニグロシン溶液を５０μｌを加え、約１分
後に血球計算盤を用いて細胞数を求めた。細胞数は５　
、１ｘｌＯ’ｃｅｌ　Ｉｓ／ｍｌであった。

（ｌｘ）　　（以降の操作は前記（ｖｌ）項からの遠心
時間を利用して交互におこない、膵臓細胞とミエローマ
細胞の計数を同時におこなうようにするのが好ましい。

また、以降の操作はミエローマ細胞を常温以下に冷却す
ることのないよう、異なる温度設定の遠心機を用いた。

）培養中のミエローマ細胞４５ＩＩｌｌを５０ｍ１遠心
管に移し、８００ｇで７分間遠心した。上清をアスピレ
ータで除去した。

（Ｘ）ハンクス平衡塩液１０１を加え、管底部のミエロ
ーマ細胞を攪拌してほぐした。８００ｇで７分間遠心分
離した後、上清をアスピレータで除去した。この操作を
２回繰り返した。

（ｘｌ）ハンクス平衡塩液１３ａｌを加え、管底部のミ
エローマ細胞を攪拌してほぐした。

（Ｘ目）　ＣＶ目１）項と同様の方法で細胞数の計測を
おこなった。細胞数は、１．５ｘｌＯ’ｃｅｌ　Ｉｓ／
ｎ＋Ｉであった。

（ｘｌｌｆ）　（ｖｍ）で得た脾臓細胞懸濁液を常温に
戻したちの９１と（ｘｌ）で得たミエローマ細胞懸濁液
１１ｖｌをよく混合し、２０００ｇで５分間遠心分離し
た後、上溝をアスピレータで除去した。

（ｘｌｖ）　　（以降の操作はクリーンベンチ内に置い
た約４０°Ｃの水浴中でおこなった。）前項で得られた
沈降細胞上に、平均分子ｉ　１５００のポリエチレング
ＩＪ　：ｌ−ル（ＰＥＧ）　、０．５ｍｌをピペットで
暖やかに撹拌しながら１分かけて加えた。さらに１．５
分間攪拌を続けた。

（ｘｖ）さらにＩＭＤＭを１ｍｌ／ｗｉｎの速度で５１
加えた後、続く１分間でＩＭＤＩを５１を加えた。最後
に［ＭＤＭｌｏｍｌを加えた後１０００ｇで７分間遠心
分離し、ＰＥＧを含む上清をアスピレータで完全に除去
した。

（ｘｖｌ）前項で得られた沈降細胞にフィーダー細胞と
して（Ｖ目１）の脾臓細胞懸濁液を３１加え、さらに１
０％の牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むＩ（ＡＴ培地（シグ
マケミカル　カンパニー製）を加えて、総量を２３ｍ１
とした。ピペットで細胞をほぐした後、培養用の９６穴
プレートに！穴あたり１００μｍずつ分注した。以上の
操作を２匹のマウスについておこない、計６枚のプレー
トに細胞！！！濁液を分注した。

（ＸＹｌｌ）　ＣＯ２インキユベータ内にプレートを移
動し、培養を開始した。インキュベータ内のｃｏ２ｔＭ
度は５％、温度は３７℃に保った。

（ｘｖｉｌｌ）　１日後、ｌｘあたり１００μｌのＨＡ
Ｔ培地を加え、１週間培養を続けた。

（３）抗体のモノクローン化 ＨＡＴ培地中での、パイブリドーマ細胞の培養開始後１
週間を経過したプレートについて、以下の操作をおこな
った。

（１）各人の培養上清を１穴あたり１００μｍ採取し、
ＰＢＳで希釈して２〜１０，０００倍の希釈系列を作製
した後、これを用いたＥＬＩＳＡをおこなった。固相抗
原としてＢＳＡ　１分子あたりＭＡ　Ｏ，４分子が化学
的に結合したもの（ＨＡ−ＢＳＡ）を用い、被測定物質
を加えなかった。

その他の操作法は前述したＥＬＩＳＡと同様である。こ
のようなＥＬＩＳＡでは、各培養上清中の抗体の固相抗
原に対する結合能を比較することができる。すなわち、
より大きな希釈度で高い吸光度を示す培養上清中には、
固相抗原に対して高い親和力を持つ抗体が含まれている
可能性が高い。吸光度の高いものからいくつかの培養上
清を選び、それらの培養上清を採取した大中の細胞のみ
培養を続けた。

培養のスケールは、適宜大きくしていった。

（１１）前項で選んだ培養上清について、さらに厳密な
ＥＬＩＳＡをおこなった。培養上清をＰＢＳで適当に希
釈し、固相抗原としてＭＡ−ＵＳＡを用いた。被測定物
質としてはＨＡを加えた。その他の操作は前述したＥＬ
ＩＳＡと同様である。ＭＡの測定感度の高いものから１
３の培養上清を選び、それらの培養上清を採取した大中
の細胞の培養を続けた。

（ｉｉｉ）選択した！９の培養上清を産生じた細胞をそ
れぞれＩにＤＭに懸濁し、ニグロシンを用いて細胞数を
計測した。

（１ｖ）それぞれの細胞懸濁液をＩＩＴ培地（シグマ　
ケミカル　カンパニー製）で希釈し、細胞が１００μｍ
あたり１個含まれるように調整した。

（Ｙ）生後５週のマウスから胸腺を摘出し、胸腺細胞を
■Ｔ培地中に懸濁して、１００μｍあたり２Ｘ１０ｉ個
の胸腺細胞が含まれるように調整した。

、　（Ｙｌ）　（Ｙ）の胸腺細胞懸濁液を１０枚の９６
穴培養用プレートに、ｌ穴あたり１０１）μ１分注した
。さらに、（１ｖ）の細胞懸濁液をｌ穴あたり１００μ
ｌ加えた。

（ｖｌｌ）　ＣＯ２インキユベータ内で培養を続けなが
ら、培養上清のＥＬＩＳＡをおこなった。条件は（目）
項と同様とした。ＨＡの測定感度の高い培養上清が得ら
れた細胞については、適宜培養サイズを大きくしながら
培養を続けた。ＥＬＩＳＡによる選別を続けた結果、最
終的に５穴を選択した。すなわち、５種のモノクローナ
ル抗体産生細胞ラインを得た。これらの細胞を２００ｍ
１のＩＭＤＭ中で、１１あたり５ｘｌＯ’個の細胞が含
まれるまで培養を続けた。

５ｍのモノクローナル細胞産生細胞ラインのうち、ＭＡ
に対して最も高い親和力を有するモノクローナル抗体を
産生ずる細胞ライン２Ｄ５５Ａを、ブダペスト条約に基
づき、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所特許
微生物寄託センターに寄託した（受託番号：微工研条寄
第２５６４号（ＦＥＲＭＢＰ−２５６４））。

（４）細胞の保存 最終的に選別された細胞ラインの培養液を遠心管に移し
、８００ｇで７分間遠心分離し、上清をアスピレータで
除去した。管底部の細胞を、ＦＣＳとジメチルスルホキ
シドを３対ｌに混合した溶液に懸濁し、１１あたり５Ｘ
ｌＧ”個の細胞が存在するように調整した。この懸濁液
を一８θ℃で凍結した後、液体窒素内に移して長期保存
状態にした。

（５）抗体の精製 プロティンＡセファロース４Ｂ（ファルマシア　ＬＫＢ
　　バイオテクノロジー製）を用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーにより、細胞の培養上清からモノクロ
ーナル抗体を精製した。精製したモノクローナル抗体は
、ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分斬
量約ｓｏ、ｏｏｏの■鎖と２０．ＧＯＯのし鎖からなる
ｌｇＧであることが確認された。

（６）抗体の各種ハプテンに対するアフィニティーの比
較 精製したモノクローナル抗体の内、２Ｄ５５Ａから産生
されたものについてＥＬＩＳＡをおこなった。固相抗原
はＭＡ−ＢＳＡを用い、鮎、ＡＢＭＡｌＡＰ、　　ＡＢ
ＡＰの４種のハプテンについて測定をおこなった。他の
測定条件は前述のＥＬＩＳＡと同様とした。４９２ｎｍ
の相対吸光度が５０％に減少する濃度を、上記の４種の
ハプテンについて比較したところ、ＡＰが最も高濃度で
あり、次いでＡＢＭＡ、　　ＡＢＡＰ、　　ＨＡの順で
あった。４９２ｎｍの吸光度を５０％に減少させるため
に、ＡＰではＨＡに比べ約１００倍の濃度が必要であっ
た。すなわち、ＡＰ−ＫＬＩＩを免疫原として用いるこ
とにより、上記４種のハプテンの内１１Ａに対して最も
高いアフィニティーを有する抗体が作製できたことが証
明された。

び本実施法で得られた抗血清でＥＬＩＳＡを行なった際
の、にムおよびムＢＭＡの検出感度を比較した図である
。

Ｉ・・Φマイクロプレート、２・・・固相抗原、３・・
・抗体、４・・・抗原、５・・働抗体３に結合する抗体
、６・・拳抗体５に化学的に結合した酵素、代理人の氏
名　弁理士　粟野重孝　ほか１名鍋 図

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）ハプテンとスペーサーとしてのアルキル鎖を介し
   て前記ハプテンと結合されたタンパク質とからなる免疫
   原であって、前記ハプテン分子中のアルキル基が水素原
   子で置換された化合物に相当する物質を出発物質として
   用いて、この出発物質の該水素原子に相当する位置にス
   ペーサーとしてのアルキル鎖及び官能基を導入し、この
   アルキル鎖及び官能基を介して該タンパク質に結合させ
   て得られる免疫原がハプテンの化学構造と類似性の高い
   構造を保持している免疫原。
2. （２）ハプテンがメタンフェタミンであり、このハプテ
   ンの分子中のＮ−メチル基が水素原子で置換された化合
   物に相当するアンフェタミンを出発物質とし、アンフェ
   タミンの第一アミンにスペーサーとしてのアルキル鎖及
   び官能基を導入し、このアルキル鎖及び官能基を介して
   該タンパク質に結合させて得られる、メタンフェタミン
   に対して高い親和性を有する能力のある請求項１記載の
   免疫原。
3. （３）以下の構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるアンフェタミン誘導体の末端第１アミン部分
   を介してアンフェタミンとタンパク質を結合させた、メ
   タンフェタミンに対して高い親和力を有する抗体の産生
   を誘導する能力のある請求項１記載の免疫原。ただしｎ
   は整数を示す。
4. （４）ｎが１から１０の整数である請求項３記載の免疫
   原。
5. （５）アミノブチルアンフェタミンとタンパク質とを結
   合せしめた、メタンフェタミンに対して高い親和力を有
   する抗体の産生を誘導する能力のある請求項１記載の免
   疫原。
6. （６）タンパク質が、スカシ貝由来のヘモシアニン、エ
   ワトリ由来のガンマグロブリン、牛血清アルブミンのい
   ずれかである請求項１記載の免疫原。
7. （７）請求項１記載の免疫原により感作された動物の血
   清から得られる該ハプテンに対して高い親和力を有する
   抗体。
8. （８）免疫原が請求項５記載の免疫原である請求項７記
   載の抗体。
9. （９）請求項１記載の免疫原により感作された動物の脾
   臓細胞とミエローマ細胞を融合してなる、該ハプテンに
   対して高い親和力を有するモノクローナル抗体を産生す
   るハイブリドーマ。
10. （１０）請求項５記載の免疫原により感作された動物の
    脾臓細胞を用いる請求項９記載のハイブリドーマ。
11. （１１）受託番号微工研条寄第２５６４号（ＦＥＲＭ　
    ＢＰ−２５６４）を有する請求項９記載のハイブリドー
    マ。
12. （１２）請求項９記載のハイブリドーマより産生される
    モノクローナル抗体。
13. （１３）分子量約５０，０００のＨ鎖と約２０，０００
    のＬ鎖からなるｌｇＧである請求項１２記載のモノクロ
    ーナル抗体。