JPS63258493A - 抗ガングリオシドｇｍ↓１単クロ−ン性抗体、これを産生する細胞及びこれから成る試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、ガングリオシドＧＭ、に対する単クローン
性抗体、それを産生ずる細胞、及びそれから成る、ガン
グリオシドＧＭ、の検出又は定量のための試薬に関する
。

［従来技術及びその欠点コ この明細書において、糖質、脂質の名称及び結合様式の
表示等は、この分野の研究における一般名あるいは慣用
名に従った。

糖脂質は細胞の発生、分化、癌化の研究において特に注
目を浴びている生体物質である。糖脂質の中てシアル酸
を含有するスフィンゴ糖脂質を総称して、特にガングリ
オシドと呼び、ガングリオシドＧＭ＋（以下、単にＧＭ
、という）もその１っである。

ＧＭ、はヒト及び種々の動物において特に神経系組織に
多く存在する物質である。癌患者又は自己免疫疾患の１
種である全身性エリテマトーデス（以下ＳＬＥという）
患者の血中のガングリオシド組成か健常人のそれとは顕
著に異なることか報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　９８巻８４３頁１９８
５年）。すなわち、血中に免疫複合体の形て存在するガ
ングリオシドは、健常人てはその主たるものか０Ｍ３で
あるのに対し、癌又はＳＬＥの患者ては０Ｍ３はほとん
どみられず、代りにＧＭＩやＧＤｌｌ、か主たるガング
リオシドである。従って、血中のＧＭ、を正確に定量す
ることかてきれば癌又はＳＬＥにかかっているか否かを
予想することがてきる。

ＧＭ、の定量、同定及び精製のための手段として、従来
の化学的及び生化学的方法に加えて、Ｇ　Ｍ　１に対す
る特異的な抗体を用いる免疫学的方法か用いられるよう
になった。従来、ＧＭ、に対する抗体は、それを適当な
担体及び免疫アジュバントと共にウサギに免疫すること
により得られる抗血清由来のものか使用されてきた。そ
れはいわゆる多クローン性抗体であり、作られる抗体の
ロット、又は免疫に用いられる個体により特異性か必ず
しも一定しない場合かあり、その欠点のない単クローン
性抗体の取得が望まれている。

［発明か解決しようとする問題点］ 本願発明者らは、鋭意研究の結果、ＧＭ、に対して極め
て特異的て高い抗体価を有する抗ＧＭ、単クローン性抗
体を作製することに成功し、この発明を完成するに至っ
た。

すなわち、この発明は、ＧＭ、のみを特異的に認識する
抗ＧＭ、単クローン性抗体を提供する。

さらにまた、この発明は、ＧＭＩで免疫化した動物由来
の抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合細胞てあって、上
記抗Ｇ　Ｍ　１単クロ一ン性抗体を産生ずるハイフリト
ーマを提供する。

また、この発明は、ＥＢウィルスに感染したリンパ珠に
由来し、上記抗ＧＭ、単クローン性抗体を産生ずる細胞
株を提供する。

さらに、この発明は、」−記抗ＧＭ、単クローン性抗体
から成るガングリオシドＧＭ、検出又は定量用試薬を提
供する。

［発明の効果］ この発明により、ＧＭ、に対し、極めて特異的て高い抗
体価を有する抗ＧＭ、単クローン性抗体か提供された。

この単クローン性抗体は、後の実施例において明らかに
なるように、Ｇ　Ｍ　１に類似した糖鎖な有する他のガ
ングリオシドとは反応せず、ＧＭ、に対して極めて特異
的に反応する。従って、この発明の抗ＧＭ、単クローン
抗体を用いてＧＭ、を極めて感度良く定量することかて
きる。従って、この発明の単クローン性抗体を用いて血
中のＧＭ、を感度良く定量することがてきるので、この
発明の単クローン性抗体を含むこの発明の試薬により、
被検者か癌又はＳＬＨにかかっている蓋然性を感度良く
知ることができる。

さらにまた、この発明により、上記単クローン性抗体を
産生ずる新規な細胞か提供された。

［発明の詳細な説明］ この発明の単クローン性抗体は、ＧＭ、のみと特異的に
結合し、その特異性は極めて高い。すなわち、後の実施
例で明らかになるように、この発明の単クローン性抗体
はＧＭ、に対する抗体価か２１６以上と極めて高く、一
方、ＧＭ□の糖鎖と類似の糖鎖又はそれを有する他の糖
脂質、ずなわち、ＧａｌＣｅｒ、　ＬａｃＣ：ｅｒ、　
Ｇｂ３．　Ｇｂ、　、　ＧＡ２、Ｇ　Ａ　＋　、ガング
リオシド０Ｍ３．ガングリオシドＧ　Ｍ　２　、ガング
リオシドＧＤ、ａ、ガングリオシドＧＤ１ａ、ガングリ
オシドＧＤ１ｂ、ガングリオシドＧＴＩｂ、ガングリオ
シドＧ　Ｑ　ｓ　ｂ、ガングリオシドＦｕｃ−Ｇ　Ｍ　
、　、　ｎＬｃ、、及びシアロシルｎＬｃ４　（ただし
、Ｇａｌはガラクトース、Ｃｅｒはセラミド、Ｌａｃは
ラクトース、Ｆｕｃはフコース、ｎ　１．ｃ４はパラク
ロボシトを示す）に対しては実質的に特異的な反応を示
さず、その抗体価は２２以下である。

この発明の単クローン性抗ＧＭ、抗体は、ＧＭ１で免疫
した吐乳動物の抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合によ
りバイプリトーマを作る方法（以下ハイブリドーマ法と
呼ぶ）又は、ヒトのＢリンパ球にＥＢウィルス（以下、
ＥＢＶという）を感染させ形質転換を起こさせる方法（
以下ＥＢＶ形質転換法と呼ぶ）のいずれによっても作製
することかできる。すなわち、上記の方法て増殖性を与
えられた抗体産生細胞から抗ＧＭ、抗体を産生ずるクロ
ーンのみを選別し、単クローンとした後１．これより上
記特性を有する単クローン性抗体を分離することにより
製造することかてきる。

ハイフリトーマ法について次に詳細に説明する。この発
明において、ハイフリトーマの作製は、公知の方法、例
えばＮａｔｕｒｅ　２５６巻、４９５頁、１９７５年に
記載の方法又はその変法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＥｘｐ
ｅｒｉｎ＋ｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　１５０　巻
、１００８頁、１９７９年）等に準して行なうことがて
きる。

免疫原として用いるＧＭ、を調製する動物種及び臓器は
特定されないか、一般にはＧＭ、はそれを多量に含有す
る、例えばウシのような動物の脳から調製される。この
明細書で後に記載される実施例及び試験例て使用された
ＧＭ、も、特に断らない限り、ウシ脳から公知の方法て
分離、精製されたものである。また、免疫原としては、
精製ＧＭ１に加えて、それを表面に有する種々の細胞、
さらにはＧＭ、の抗原決定基である糖鎖部分を含有する
物質又は細胞のいずれを用いてもよい。

ＧＭ、を免疫する吐乳動物の種類は特に限定されないか
、細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適合性を考慮して
選択すのか望ましく、一般にはヒト、マウス、ラット又
は場合によってはウサギ等が使用される。

ＧＭ、の免疫にはｉｎ　ｖｉｖｏ及びｉｎ　ｖｉｔｒｏ
の方法のいずれもが使用てきる。ｉｎ　ｖｉｖｏの免疫
の場合はＧＭ、を生理食塩液、リン酸緩衝液（以下ＰＢ
Ｓという）等に適当濃度に希釈後、これを動物に静脈内
、皮下内又は腹腔内注射等により投与すればよい。より
具体的に述へると、例えば精製したＧＭ、を用いる場合
には、これをＰＢＳ等で適当濃度に希釈し、サルモネラ
菌ミネソタ株、ウシ血清アルラミン（以下ＢＳＡ）等の
通常用いられる担体と共に、これを動物に４〜１４日毎
に数回から士数回投与し、動物ｌ固体の総投与量かｌＯ
〜３００　ｇｇ程度になるようにするのが好ましい。ま
た、ｉｎ　ｖｉｖｏの免疫に膜成分又は細胞自体を用い
る場合も同様にして行なわれ、例えば膜成分を用いる場
合は総投与量か１〜１００ｍｇ／固体、細胞自体を用い
る場合は総投ケ量か１０６〜１０９個／固体となるよう
にするのか好ましい。この場合、必要に応しては適当な
免疫アジュバント、例えばフロイントの完全アジュバン
トを用いることかてきる。

このｉｎ　ｖｉｖｏの免疫の場合、抗体産生細胞は牌細
胞、リンパ節細胞、腹腔内リンパ球、又は末梢血リンパ
球のいずれてあってもよいが最終免疫４日後の牌細胞を
用いるのか最も好ましい。

また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの系における免疫の場合には、
いわゆるｉｎ　ｖｉｔｒｏ感作の方法を用いることがて
きる。これは牌細胞、リンパ節細胞、腹腔内リンパ球及
び末梢血リンパ球のうちから適宜選ばれたリンパ球を免
疫原であるＧＭ□と共に約１週間ｉｎ　ｖｉｔｒｏて培
養することにより、ＧＭ、に対する抗体産生細胞を出現
させることを意図したものである。この場合、Ｇ　Ｍ　
１か精製品であれば細胞培養培地に溶解させるか、ある
いはヒツジ赤血球、リポソーム又はサルモネラ菌ミネソ
タ株等の適当な担体に吸着させて、リンパ球と共に培養
する。

また、Ｇ　Ｍ　１を含有する細胞自体、又はその膜成分
を免疫原とする場合は、培地に溶解又は懸濁させ、リン
パ球と共に培養する。また、細胞自体を用いる場合は、
マイトマイシン処理又は放射線照射等の処理を行なった
後に、リンパ球と培養することが望ましい。リンパ球の
培養用培地はＰＲＭ１１６４０　、タルベツコーのＭＥ
Ｍ　（以下、Ｄ−ＭＥＭという）等のリンパ球培養に通
常使用されるものであれば、いずれを用いてもかまわな
いか、それらは使用時にウシ胎児血清（以下ＦＣ３とい
う）を５〜２０％の濃度に添加することが望ましい。ま
た、培地には必要に応して２−メルカプトエタノール（
以下２−ＭＥという）及びポークライードマイトジェン
（以下ＰＷＭという）をそれぞれ５　ｘ　１０−５Ｍ及
び５〜３０川ｇ／ｍｌの最終濃度に加えておくと、効率
良＜ＧＭ、のｉｎ　ｖｉｔｒｏ感作を成立させることか
できる。

リンパ球の培養時の細胞濃度は、培養に用いる器具によ
っても異なるか、一般には１０６〜Ｉ０７／ｍｌか好ま
しい。

免疫原である精製ＧＭ、、ＧＭ、含有細胞及びその膜成
分は、それぞれ１〜２０　ｇｇ／＋ｎ１．　１〜１００
ｍｇ／ｍｌ、及び０．１〜１０ｎ＋ｇ／ｍｌの最終濃度
で使用することか好ましい。

続いて、上記のようにｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔ
ｒ。

の系ての免疫により得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞
を融合する。

骨髄腫細胞としては、既に公知の種々の細胞、例えばマ
ウスにおけるＮ５−１、Ｐ３、Ｐ３−旧、Ｘ４５、Ｘ６
３．６．５．３．、ＳＦ３、ラットにおけ７１１．Ｙ３
、Ａｇ１．２．３等を使用することかできる。

細胞融合は公知の方法に準して行なうことがてき、例え
ば融合促進剤含有培地中で保温することにより行なわれ
る。

融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（
以下ＰＥＧという）、センダイウィルス等が使用され、
さらに融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等
の補助剤を添加することかできる。

リンパ球と骨髄腫細胞との使用比は一般の方法と変りか
なく、例えば骨髄腫細胞に対しリンパ球を約ｌ〜ｌＯ倍
程度用いればよい。

上記融合時の培地としては、細胞培養に利用される通常
の各種培地か利用てき、通常はＦｅ２などの血清を抜い
ておくことが好ましい。

融合は、上記免疫細胞と骨髄腫細胞の所定量を上記培地
内てよく混ぜ、遠心後上清を除去し、予め３７°Ｃ程度
に加温したＰＥＧ溶液（ＰＥＧは例えば平均分子量１０
００〜６０００程度のものを使用）を、通常、培地に約
３０からＳｏｗ／ｖ％の最終濃度で加えて混合すること
により行なわれる。以後、適当な培地を逐次添加して遠
心し、上清な除去する操作を繰り返すことによりハイブ
リドーマか形成される。

所望のハイツリドーマの分離は、上記細胞融合の細胞を
、通常のハイブリドーマ選択用培地て培養することによ
り行なわれる。前記した骨髄腫細胞株はヒボキサンチン
グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲ
Ｔ）欠損株てあり、従って、ＨＡＴ培地（ヒボキサンチ
ン、アミノブチリ。

ン及びチミジンを含む培地）中ては生育てきない。それ
故、ＨＡＴ培地中で増殖してくる細胞を選択すればよい
。該ＨＡＴ培地での細胞の培養は、目的とするハイブリ
ドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な時間、通常数日
から数週間性なえばよい。

このようにして得られるハイブリドーマは通常のクロー
ニング方法、例えば限界希釈法又は軟寒天法を用いて、
目的とする抗体産生株の検索及び単クローン化か行なわ
れる。

該抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳＡ法（Ｊａｐａ
ｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ５１＠、３０９頁、１９８１
年）及びプラーク法、凝集反応法、オクタ−コニ−法、
ＲＩＡ法等の一般に抗体の検出に用いられている種々の
方法によって行なわれる。

このようにしてハイツリドーマ法により単クローン性抗
ＧＭ、抗体産生細胞株か得られる。

次にＥＢＶ形質転換法による単クローン性抗Ｇ　Ｍ　１
抗体の作製について述べる。末法はヒトＢリンパ球にＥ
ＢＶを感染させると、その各々のＢリンパ球において増
殖のみならず、抗体産生が引き起こされるという原理に
基づくものである。その場合、ＥＢＶは特定のＢリンパ
球のクローンのみに働いて上記の効果をもたらすのでは
なく、基本的には全てのクローンに働き、それらに増殖
及び抗体産生な引き起こすのである。それ故、末法ては
ヒトＢリンパ球にＥＢＶを感染させた後、所望の抗体を
産生するクローンのみを選別し、これを用いて所望の単
クローン性抗体を得ることができる。

この方法によるヒトリンパ球の形質転換は、公知の方法
、例えばＮａｔｕｒｅ　２６７巻、５２頁、１９７９年
に記載の方法等に準じて行なうことかてきる。

Ｂリンパ球を得る臓器は、それがリンパ系臓器であれば
特に限定されないか、ヒト由来の材料という特殊性を考
慮すると、一般には健常人の末梢血リンパ球か用いられ
る。

ウィルス源としてはＥＢＶ持続産生細胞、例えばＥＢＶ
感染マーモセット白血球細胞株であるＢ−９５−８細胞
（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏ
ｎａｌＡｃａｄｅＩｌｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ
　ＵＳＡ　７０巻、１９０頁、１９７３年）の培養上清
等を用いるととがてきる。

この方法ては、先ずＢリンパ球をＥＢＶに感染させるの
であるが、この場合、リンパ球画分からＢリンパ球のみ
を特に分離する必要はなく、常法に従って得られるリン
パ球にＥＢＶを感染させればよい。

先ず、リンパ球のベレットにウィルス液をリンパ球１　
ｘ　１０’個に対して１０ｍ１程度加えて混合し、３７
°Ｃ１５％ＣＯ２の条件下で１時間保温し、リンパ球を
ＥＢＶに感染させる。

このようにして得られた感染リンパ球を細胞培養用培地
に分散し、２〜５週間、３７℃、５％ＣＯ□の条件下で
培養する。

培養用培地は特に限定されず、ＲＰＭＩ　１６４０、Ｄ
−ＭＥＭ等の通常のリンパ球培養用のものであればいず
れを用いてもかまわないか、それらに使用時にＦｅ２を
１０〜２０％の濃度に添加することが好ましい。また、
その培地には０．５〜Ｉ　Ｂ／ｍｌの最終濃度にグルタ
ミンを加えるとさらに効率良く細胞を増殖させることか
できる。

このようにして得られる形質転換Ｂリンパ球は、前記ハ
イツリドーマ法の場合と同様な方法で、目的とする抗体
産生株の検索及び単クローン化か行なわれる。

該抗体産生株の検索は、ハイフリトーマ法の場合と同様
、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等の一般に抗体の検出に用い
られている種々の方法で行なうことかできる。

このようにして、ＥＢＶ形質転換によっても単クローン
性抗ＧＭ、抗体産生細胞株を得ることかできる。

」二記のこの発明の単クローン性抗ＧＭ、抗体を産生ず
る細胞株は、その取得法がハイフリトーマ法又はＥＢＶ
形質転換法のいずれてあっても、通常の培地て継代培養
か可能てあり、また、液体窒素中て容易に長期保存か可
能である。

本願発明者は、該単クローン性抗ＧＭ、抗体産生株の代
表として、後述の実施例１で得られたクローンＭＸ−１
を財団法人発酵研究所（大阪市淀用区十三木町２−１７
−８５）に寄託している（受入番号ＩＦＯ５０１１５）
。

上記のようにして得た特定の細胞株からこの発明の単ク
ローン性抗体を得るには、それらの細胞株を常法に従っ
て大量培養し、その培養上清から分離する方法、あるい
は、それらの細胞株をそれと適合性のある哺乳動物に投
り−し増殖させ、その血清又は腹水から分離する方法を
採用することかできる。

この発明の単クローン性抗ＧＭ、抗体は、ＧＭ、（その
抗原決定基である糖鎖部分）のみを特異的に極めて高感
度に認識するので、ＧＭ、の高感度検出又は定量試薬と
しての用途を有する。

上記したように、癌患者又はＳＬＥという患者の血中の
ガングリオシド組成か健常人のそれとは顕著に異なるこ
とか報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　９８巻　８４３頁１９８５年）。従っ
て、この発明の単クローン性抗ＧＭ、抗体はまた、ガン
及びＳＬＥ診断試薬としての用途を有する。

上記この発明の単クローン性抗ＧＭ、抗体から成るこの
発明の定量試薬を用いたＧＭ□の免疫学的同定及び定量
は、一般の生体内物質の免疫学的定量の場合と同様な方
法で行なうことができる。その方法は特に限定されない
か、例えば、ラジオイミュノアウセイ（ＲＩＡ）、Ｅｌ
、ＩＳＡ　、薄層クロマトクラフィー（以下、ＴＬＣと
いう）−免疫染色、又は免疫組織化学等が使用てきる。

また、ＲＩＡ及びＥＬＩＳＡでは、いわゆる競争法又は
サンドウィッチ法等か使用できるが、それらに限定され
るものではない。

さらに、この発明の試薬を用いたＧＭ、の免疫学的同定
及び定量は、癌患者及びＳＬＥ患者血中のＧＭ、のみに
適用されるものではなく、広く、ヒト及び各種実験材料
の血中、体液中、臓器中又は排泄物中ＧＭ、にも適用可
能であることは言うまでもない。

また、後述の試験例３で示されるように、この発明の単
クローン性抗ＧＭ、抗体は、他の糖脂質に対する単クロ
ーン性抗体と同様に、それにより認識されるエピトープ
はＧＭ、の糖鎖構造である。従って、この発明の試薬は
、ＧＭ、のみならず、ＧＭ、の糖鎖構造を有する分子の
検出及び定量にも有用であることは言うまてもない。

後述の実施例で明らかになるように、癌患者及びＳＬＥ
患者の体液中のａＭ１濃度は上昇するか、その変化は正
常状態に比して、せいぜい数倍からｌＯ数倍程度である
。この程度の変化は、従来の多クローン性抗体を用いて
は感度良く検出することかてきない。また、従来の化学
的分析による場合には、ガングリオシドか大量に必要で
あるのて、例えば」二記Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏ
ｃｈｅ＋＋＋１ｓｔｒｙ　９８巻８４３頁１９８５年て
は患者の血液を体外回路により固定化プロティンＡカラ
ムに通しさせ、そのカラムに免疫クロッリンＧをガング
リオシドとの免疫複合体の形て吸着させた後、その複合
体を回収し、ガングリオシドを得ている。しかしながら
、体外回路を形成してこれに血液を循環させるようなこ
とは癌患者のように体力の低下した者に対して頻繁に行
なうことは実際上不可能である。

この発明の試薬は、感度か極めて高いのて、患者から微
量の血液を採取してＧＭ□の定量を行なうことができる
。従って、この発明により、癌及びＳＬＨの実際的な診
断か初めて可能になった。

［発明の実施例］ 実施例１ 精製したＧＭ、　１００　ｐ、ｇとホルマリン処理サル
モネラ菌ミネソタ株（ＡＴＣＣ９７００）　４００ｇｇ
を４０°Ｃに保温した生理食塩液４ｍｌに加え、よく攪
拌し、均一な懸濁液とした。得られた懸濁液を、マウス
及びラットに４日毎に１回当りＧＭ、１０ｇｇ含有分づ
つ、合計４〜１５回静脈内投与した。最終投与の４日後
に牌臓を摘出し、牌細胞３　ｘ　１０８個とＮ５−１マ
ウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣＴｌ８１８）　３　ｘ　１０
’個を５０％ポリエチレングリコール存在下で細胞融合
を行なわせた。このハイブリドーマを９６ウエル平底の
培養用プラスチックプレート（ファルコン（登録商標）
）に分注し、ＨＡＴ培地を含む１０％　ＦＣ９添加Ｄ−
ＭＥＭ培地中テ３７０Ｃ１５％　Ｃ０２の条件下で培養
した。ハイツリドーマの増殖が認められたウェルについ
て、以下に記載するＥＬＩＳＡ法を用いて、培養上清中
の抗ＧＭ１抗体の存在の有無を検索した。ＥＬＩＳＡ法
は９６ウエルプラスチツクプレート（ファルコン（登録
商標））を用い、先ずエチルアルコールに１０　ｐｇ／
ｍｌの濃度に溶解したＧＭ、液０．０５ｍ１ずつを各ウ
ェルに分注し、溶媒を自然蒸発させ、ＧＭ、をブレー１
−に吸着させた。その各ウェルに一次抗体としての被検
培養上清を反応させ、よく洗浄の後、二次抗体としての
パーオキシダーゼで標識された抗マウス免疫グロツリン
抗体（免疫動物にマウスを用いた場合）、又は抗ラット
免疫グロブリン抗体（免疫動物にラットを用いた場合）
を反応させた。

引き続き２，２′−アジノビス（３−エチルベンズーチ
アソリンスル）オン酸）の２アンモニウム塩（以下へＢ
ＴＳ）を基質としたパーオキシダーゼ反応を行なわせ、
各ウェルの発色度を自限で、あるいは９６ウ工ルＥＬＩ
ＳＡ用自動光度計（波長４１４ｎＩｌ）を用いて読み取
った。

培養上清中に抗ＧＭ、抗体価が認められたウェルのハイ
ツリドーマは、さらに限界希釈法でクローニングを行な
い、単クローンとした。

このようにして得られた単クローン性のハイブリドーマ
はプラスチック培養フラスコて大量培養を行ない、所望
の単クローン性抗ＧＭ、抗体産生細胞株を得た。これら
の細胞株の培養上清から、あるいは、免疫抑制剤プリス
タン（２，６，１，０゜１４−テトラメチルペンタデカ
ン、アルドリッチ社製）て前処理したヌードマウスにそ
れらの細胞株を移植後の腹水から、単クローン性抗ＧＭ
、抗体を得た。また、必要に応じて、５ｏｚ飽和硫酸ア
ンモニウム法により、それらの抗体を精製した。

このようにして、単クローン性抗ＧＭ、抗体を得ること
がてきた。後述の試験例ては、マウス由来の単クローン
性抗ＧＭ、抗体ＭＸ−１、ＭＸ−２及びＭＸ−３を用い
た。また、このような単クローン性抗Ｇ　Ｍ　＋抗体Ｍ
Ｘ−］、ＭＸ−２及びＭＸ−３を産生ずルハイブリドー
マをバイブリド−ｖＭＸ−１、ＭＸ−２、ＭＸ−３と命
名した。

実施例２ 精製したＧＭ、２ｍｇとＢＳＡｌｍｇを生理食塩液１１
に懸濁又は溶解させた後、等容量のフロイント完全アジ
ュバントを用いて油中水型エマルションを作製し、それ
をウサギの四肢の足踏部に０．２１つづ（計０．８ｎ＋
ｌ）注射した。その４週間後に初回免疫の場合と同様な
方法でＧＭ、を含むエマルジョンを作製し、ハイツリド
ーマ皮下に計１ｍｌを注射し追加免疫を行なった。その
４日後に牌臓を摘出し、実施例１て述べたものと同様な
方法てＮ５−１骨髄腫細胞融合及び抗ＧＭ、抗体産生バ
イプリトーマのクローニングを行ない単クローン性抗体
産生株ｌクローンを得た。なお、細胞融合後ＨＡＴ培地
中てのハイツリドーマの増殖には２４ウエルプラスチツ
クプレート（ファルコン（登録商標）カタログ番号３８
４７）を用いた。また、ＥＬＩＳＡ法に用いる二次抗体
はパーオキシターゼ標識抗つサギ免疫グロツリン抗体を
用いた。

実施例３ ヒト末梢血から、フィコールパック（ファルマシア社登
録商標）を用いて常法通りリンパ球（単核細胞）を調製
した後、培地にｌ　ｘ　Ｉｎ’／ｌｌの濃度に懸濁した
。

培地は１０駕ＦＣ３添加ＲＰＭＩ　１６４０培地を用い
、使用時に、さらに２−ＭＥ及びＰＷＭをそれぞれ５ｘ
１０−５Ｍ、及び：Ｉ０７ｐｇ／ｌｌ１ｌの最終濃度に
含有させて使用した。続いて、マールフルツク型培養瓶
（Ｌａｎｃｅｔ　２巻、１２７９頁、１９６７年）の内
筒に１　ｘ　１０’／ｍｌの濃度のリンパ球懸濁液を１
１、外筒にＰＷＭを含まない培地１０ｍ１をそれぞれ加
え、内筒液と外筒液の境界に透析チューンを張った。

ＧＭ、は内円らの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ　８７　＠、１８２９頁、１０００年
）に準じて作製した卵黄レシチン及びコレステロールか
ら構成されるリポソームに取り込ませ、５ｇｇ＃ｎｌの
ＧＭ、の最終濃度て培養瓶の内筒に加えた。

かくして、リンパ球をＧＭ、と共に３７℃、５％Ｃ０２
の条件下で６日間培養した。続いて、実施例１に記載し
たものと同様な方法てＮ５−１との細胞融合及び抗ＧＭ
、抗体産生ハイブリドーマのクローニングを行ない、単
クローン性抗体産生株１クローンを得た。

なお、本実施例の場合、ＥＬＩＳＡ法における二次抗体
はバーオキシターゼ標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を用
いた。

実施例４ 先ず、ＥＢＶを持続的に産生放出しているＢ−９５−８
細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１２）を、クルクミンを０．
８６ｍｇ／ｍｌの最終濃度に含有し、さらに２０％　Ｆ
ｅ２か添加されたＲＰＭＴ　１６４０培地（以下、完全
培地と呼ぶ）中に３　ｘ　１０５／ｍｌの濃度に懸濁し
、３７°Ｃ１５％ＣＯ２の条件下て培養した。７日後に
得られる培養上清を以下に使用するウィルス液とした。

続いて、常法に基づき、フィコールバック（登録商標）
を用いて得られたリンパ球のベレットにウィルス液を、
リンパ球１　ｘ　１０’個に対し１０ｍ１の割合て加え
、混合し、３７°Ｃ１５％Ｃ０２の条件下て１時間保温
した。このＥＢＶ感染リンパ球を２　ｘ　１０５〜６　
ｘ　１０５／ｍｌの濃度て完全培地に懸濁し、それを平
底の９６ウエル培養用プラスチツクプレート（ファルコ
ン（登録商標）の各ウェルに０．１［１１１づつ分注し
、３７°Ｃ１５％Ｃ０２の条件下て培養を開始した。そ
の４日後に各ウェル当り０．１ｍｌづつ新鮮な完全培地
を加えた。その後、３〜４日毎に培養−Ｌ清の半量を新
鮮な完全培地と交換し、培養を継続した。２〜４週間後
、細胞増殖のみられたウェルの培養上清中の抗ＧＭ。

抗体価を前記実施例１て述べたＥＬＩＳＡ法を用いて測
定した。なお、この場合、二次抗体はパーオキシターゼ
標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を用いた。

上清中に抗ＧＭ、抗体価の認められたウェル中の細胞を
２４ウエル培養プレート、６ウエル培養プレート、６ｃ
Ｉ１１プラスチツクデイツシユの培養」二清中に抗ＧＭ
、抗体価の認められたものについて、常法に従って軟寒
天法てクローニングを行ない、単クローン性の抗ＧＭ、
産生細胞株ｌクローン得、これを細胞株１１Ｘ−１と命
名した。

この細胞株を大量培養して得られる培養上清から、５０
％飽和硫酸アンモニウム沈殿法により単クローン性抗Ｇ
Ｍ、抗体ＨＸ−１を得た。

試験例１ 実施例１で得られた単クローン性抗ＧＭ、抗体（ＭＸ−
１、ＭＸ−２及びＭＸ−３）　ノ免疫グロブリン抗体の
クラスをＥＬＩＳＡ法により決定した。すなわち、該単
クローン性抗体にパーオキシダーゼて標識されたマウス
免疫クロッリンの各クラスに対する抗体を反応させ、続
いてＡＢＴＳを基質としてパーオキシダーゼ反応を行な
わせた。

ソノ結果、ＭＸ−１及びＭＸ−２は、いずれもＩｇＭ、
ＭＸ−３はＩｇＧ、のクラスに属するものと判明した。

［試験例２］ 実施例１及び４て得られた単クローン性抗ＧＭ、抗体の
種々の糖脂質に対する反応性をＥＬＩＳＡ法を用いて検
討した。用いた糖脂質はＧＭ、の他に、類縁構造を有す
るＧａ１Ｃ：ｅｒ　（ウシ脳由来）　、　ＬａｃＣｅｒ
　（ウシ脳由来）、ａｔｚ　　（ヒト赤血球由来）、ａ
ｂ＜（ヒト赤血球由来）、ＧＡ２（ウシ脳由来）、ＧＡ
Ｉ（ウシ脳由来）、ＧＭ。

（ウシ脳由来）、０Ｍ２　（ウシ脳由来）、ＧＤ、ａ（
ウシ脳由来）、ＧＤ＋ｂ（ウシ脳由来）、ＧＴ＋ｂ（ウ
シ脳由来）、ＧＱＩｂ（ウシ脳由来）、Ｆｕｃ−Ｇ　Ｍ
　、　　（ラット赤血球由来）　、　ｎＬｃ４　（ヒト
赤血球由来）、及びシアロシルｎＬｃ４　（ウシ赤血球
由来）である（構造は末尾の第３表に示す）。各糖脂質
に対する抗体価は、ＥＬＩＳＡで発色が肉眼で認められ
る最大の希釈倍数（以下２の累乗の形で表わす）て示し
た。

その結果は下記第１表に示すように、ＭＸ−１。

ＭＸ−２、ＭＸ−３及びＨＸ−１ノイずれもかＧＭ、　
に対し高い抗体価を示した。しかしながら、その他の糖
脂質に対しては、いずれの抗体も反応しなかった（抗体
価は、全て２２以下）。

第１表 試験例３ 上記実施例て得られたＭＸ−１，ＭＸ−２、ＭＸ−３及
びＨＸ−１の各クローンの単クローン性抗ＧＭ、抗体の
糖脂質特異性をＴＬＣ−免疫染色法を用いてさらに検討
した。末法はシリカゲルのＴＬＣて糖脂質を分画した後
、　ＥＬＩＳＡ法と同様の原理を用いて、その薄層プレ
ート上で免疫染色を行なうものである。

この方法では、糖脂質検出の感度は非常に高く、かつ、
各糖脂質に微量混入する物質への反応を否定てきる利点
がある。それ故、糖脂質に対する抗体の特異性を検討す
るには、最も優れた方法の１つとして現在この分野の研
究で汎用されている。

本試験例ては、束らによって報告された方法（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　９５　巻、
１５１７頁、１９８４年）に準してＴＬＣ−酵素免疫染
色を行なった。

先ず、ＧＭ、を始めとする各糖脂質（由来は試験例２の
項に記載）をシリカゲルの薄層プレート（マツヘライ・
ナーゲル社製、ボリタラム・シルＧ）にスポットした。

クロロホルム−メチルアルコール−０，２５％塩化カリ
ウム（５０：４０：１０．　ｖ／ｖ）の混液を溶媒とし
て約２５分間の展開を行なった。展開後の各糖脂質の位
置をオルシノールにより求めた。

オルシノール反応用と並行して免疫染色用の展開を同時
に行ない、以下の方法で染色した。先ず、展開後の薄層
のプレートに１次抗体として実施例１て作製したＭＸ−
Ｌ　ＭＸ−２、ＭＸ−３、実施例４て作製したｌｌＸ−
１又は多クローン性抗Ｇ　Ｍ　ｒウサギ抗体のいずれか
を反応させた。多クローン性抗ＧＭ、ウサギ抗体は、実
施例２に記載された方法てＧＭ、をウサギに免疫し、追
加免疫の２週間後に採血して得られた抗血清を用いた。

続いてマウス、ヒトあるいはウサギの免疫グロブリンに
対する抗体（いずれもパーオキシターゼ標識）を適宜選
択し、二次抗体としてプレートに反応させた。

さらに、基質として、４−クロロ−１−ナフトールを用
いてパーオキシターゼ反応による発色を行なわせた。

第２表に示すように、この発明の抗Ｇ　Ｍ　１単クロ一
ン性抗体は、いずれもＧ　Ｍ　１のスボ・ントにのみ反
応した。対照に用いた多クローン性抗ＧＭ、抗体はＧ　
Ｍ　ｓのみならず、弱いながらもＧＡ、及びＧＤ、、と
も反応した。

第２表 １）−は発色無し、＋は弱い発色有り、＋十は強い発色
有りを示す。

以上の結果から、実施例１で得られたＭＸ−］、ＭＸ−
２、及びＭＸ−３、さらに実施例４で得られたＨＸ−１
のいずれの単クローン性抗ＧＭ、抗体もＧＭ、のみの特
異的なものであることか示された。さらに、その点にお
いて、それらの単クローン性抗ＧＭ、抗体は、これまで
の公知の方法で作製され、使用されてきた多クローン性
抗ＧＭ、ウサギ抗体に対して高い有意性を示すものであ
る。

また、この実施例の結果から、この発明の単クローン性
抗ＧＭ、抗体はＧａｌβ］−＋３ＧａｌＮＡｃβ１−＋
　４［５Ａ（Ｘ　２−＋　３］Ｇａｌβ１−＋４ＧＩｃ
の糖鎖構造を認識するものと推定される。

試験例４ プロティンＡを固定したポリスチレンボールをガラスの
試験管に入れ、さらにその中に癌又はＳＬＥ患者の血清
１１を入れ、４°Ｃで１晩放置した。ポリエチレンボー
ルな洗浄後、０．３Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，
８）により免疫複合体かプロティンＡから解離すると共
に、免疫複合体自身もＧＭ、と免疫グロブリンＧに解離
する。試験管からポリスチレンボールを除去し、試験管
にクロロホルム−メチルアルコールの混液（２：１．ｖ
／ｖ）　１２ｍ１を加えよく振盪した。遠心後、下層の
クロロホルム層の両分を取り、蒸発乾固させせた。これ
を適当量の１％ＢＳＡ含有ＰＢＳに溶解し、下記のＧＭ
、測定用の検体とした。

ＧＭ、の測定は次に述へるＥＬＩＳＡ法を用いた。先ず
、９６ウエルのマイクロタイトレージョンプレート（以
下プレートという）の各ウェルに検体液１００．１を入
れ、続いて、この発明の単クローン性抗ＧＭ、抗体ＭＸ
−１を結合したポリスチレンボールを加え、プレートを
３７°Ｃて３時間保温した。プレートを洗浄後、さらに
１％ＢＳＡ及び０．０５％ツイーン２０（ポリオキシエ
チレンソルビタンモノラウレイト）含有ＰＢＳに溶解し
たビオチン他車クローン性抗Ｇ　Ｍ　ｒ抗体（ビオチン
化は常法により行なった）１００．１を加え室温て１時
間反応させた。さらに洗浄後、１％ＢＳＡ及び０．０５
％ツイーン２０含有ＰＢＳに溶解したバーオキシターゼ
標識アビジンを加え室温て１時間反応させた。洗浄後、
ＡＢＴＳを基質としてパーオキシターゼ反応を行なわせ
、各ウェルの発色度を９６ウ工ルＥＬＩＳＡ用自動光度
計（波長４１４ｎｍ）を用いて測定した。前記実施例３
に記載の方法てＧＭ、をリポソームに封入し、それを用
いた標準曲線に基づいてＧＭ、濃度を求めた。

その結果は、図面に示す通り、癌患者及びＳＬＥ患者に
おいては健常人と比較して高いＧＭ。

値を示した。また、その場合、ＧＭ、の高値は癌の種類
に関係なく認められた。なお、図において、ＧＭ、濃度
は任意の濃度単位（Ｕ／［０１）に補正して表わされて
いる。

このように、この発明の単クローン性抗ＧＭ、抗体及び
それを使用した血中ＧＭ、測定系は、癌及びＳＬＥの診
断に極めて有用なものである。

また、本試験例４てはポリスチレンボールに結合された
「不溶化」抗体、及びビオチンで標識された抗体として
は、いずれもこの発明の単クローン性抗体を用いたか、
この場合は、ｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ　という極めて低いＧ
Ｍ、濃度範囲で直線の標準曲線か得られた。

一方、用いた不溶化抗体及び標識抗体が、いずれも従来
より使用されてきた多クローン性抗ＧＭ、ウサギ抗体の
場合は、１０〜１１００ｎ／ｍｌの濃度範囲で直線の標
準曲線が得られた。

また、不溶化抗体としてこの発明の単クローン性抗体Ｍ
Ｘ−１、標識抗体として多クローン性抗ＧＭ、ウサギ抗
体を用いた場合は５〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で直線
の標準曲線が得られた。

このように、本試験例４に用いた、いわゆるサントウィ
ッチ法によるＧＭ、の測定ては、単クローン性抗体を用
いることにより測定感度か上昇した。

また、いわゆる競争法によるＧＭ、の定量においても、
多クローン性抗ＧＭ、抗体を用いた場合は１０〜］００
ｎｇ＃＋ｌのＧＭ、濃度て直線の標準曲線か得られたか
、この発明の単クローン性抗ＧＭ。

抗体ＭＸ−１を用いると３〜３０ｎｇ／ｍｌの範囲て直
線の標準曲線か得られた。

上記のように、ＧＭ、の測定にこの発明の単クローン性
抗体を使用したところ、多クローン性抗体使用の場合に
比較して、高い測定感度の測定系が得られた。それによ
り、従来、多クローン性抗体を用いた測定系ては、測定
が不可能であった疾患状態における体液中ＧＭ、濃度の
変動を検出することか可能となった。このことも、従来
の多クローン性抗ＧＭ□抗体に対するこの発明の単クロ
ーン性抗ＧＭ、抗体の優れている点である。

【図面の簡単な説明】

図面はこの発明の単クローン性抗ＧＭ、抗体ＭＸ−１を
用いたＥＬＩＳＡ法により求めた各種癌患者及びＳＬＥ
患者血中のＧＭ、濃度の個々の値を示すものである。

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）ガングリオシドＧＭ＿１のみを特異的に認識する
   抗ガングリオシドＧＭ＿１単クローン性抗体。
2. （２）前記単クローン抗体は、ガングリオシドＧＭ＿１
   に対し２＾１＾６以上の抗体価を有し、ＧａｌＣｅｒ、
   ＬａｃＣｅｒ、Ｇｂ＿３、Ｇｂ＿４、ＧＡ＿２、ＧＡ＿
   １、ガングリオシドＧＭ＿３、ガングリオシドＧＭ＿２
   、ガングリオシドＧＤ＿１＿ａ、ガングリオシドＧＤ＿
   １＿ｂ、ガングリオシドＧＴ＿１＿ｂ、ガングリオシド
   ＧＱ＿１＿ｂ、ガングリオシドＦｕｃ−ＧＭ＿１、ｎＬ
   ｃ＿４、及びシアロシルｎＬｃ４（ただし、Ｇａｌはガ
   ラクトース、Ｃｅｒはセラミド、Ｌａｃはラクトース、
   Ｆｕｃはフコース、ｎＬｃ＿４はパラグロボシドを示す
   ）とは実質的に反応しない特許請求の範囲第１項記載の
   単クローン性抗体。
3. （３）ＭＸ−１である特許請求の範囲第２項記載の単ク
   ローン性抗体。
4. （４）ＭＸ−２である特許請求の範囲第２項記載の単ク
   ローン性抗体。
5. （５）ＭＸ−３である特許請求の範囲第２項記載の単ク
   ローン性抗体。
6. （６）ＨＸ−１である特許請求の範囲第２項記載の単ク
   ローン性抗体。
7. （７）ガングリオシドＧＭ＿１で免疫化した動物由来の
   抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合細胞であって、ガン
   グリオシドＧＭ＿１のみを特異的に認識する抗ガングリ
   オシドＧＭ＿１単クローン性抗体を産生するハイブリド
   ーマ。
8. （８）ハイブリドーマＭＸ−１である特許請求の範囲第
   ８項記載のハイブリドーマ。
9. （９）ハイブリドーマＭＸ−２である特許請求の範囲第
   ７項記載のハイブリドーマ。
10. （１０）ハイブリドーマＭＸ−３である特許請求の範囲
    第７項記載のハイブリドーマ。
11. （１１）ＥＢウイルスに感染したリンパ球に由来し、ガ
    ングリオシドＧＭ＿１のみを特異的に認識する抗ガング
    リオシドＧＭ＿１単クローン性抗体を産生する細胞株。
12. （１２）細胞株ＨＸ−１である特許請求の範囲第１１項
    記載の細胞株。
13. （１３）ガングリオシドＧＭ＿１のみを特異的に認識す
    る抗ガングリオシドＧＭ＿１単クローン性抗体から成る
    、ガングリオシドＧＭ＿１を検出又は定量するための試
    薬。
14. （１４）前記単クローン性抗体は、ガングリオシドＧＭ
    ＿１に対し２＾１＾６以上の抗体価を有し、ＧａｌＣｅ
    ｒ、ＬａｃＣｅｒ、Ｇｂ＿３、Ｇｂ＿４、ＧＡ＿２、Ｇ
    Ａ＿１、ガングリオシドＧＭ＿３、ガングリオシドＧＭ
    ＿２、ガングリオシドＧＤ＿１＿ａ、ガングリオシドＧ
    Ｄ＿１＿ｂ、ガングリオシドＧＴ＿１＿ｂ、ガングリオ
    シドＧＱ＿１＿ｂ、ガングリオシドＦｕｃ−ＧＭ＿１、
    ｎＬｃ＿４、及びシアロシルｎＬｃ４（ただし、Ｇａｌ
    はガラクトース、Ｃｅｒはセラミド、Ｌａｃはラクトー
    ス、Ｆｕｃはフコース、ｎＬｃ＿４はパラグロボシドを
    示す）とは実質的に反応しない特許請求の範囲第１３項
    記載の試薬。
15. （１５）前記単クローン性抗体はＭＸ−１である特許請
    求の範囲第１４項記載の試薬。
16. （１６）前記単クローン性抗体はＭＸ−２である特許請
    求の範囲第１４項記載の試薬。
17. （１７）前記単クローン性抗体はＭＸ−３である特許請
    求の範囲第１４項記載の試薬。
18. （１８）前記単クローン性抗体はＨＸ−１である特許請
    求の範囲第１４項記載の試薬。
19. （１９）癌及び全身性エリテマトーデス診断試薬である
    特許請求の範囲第１３項ないし第１８項のいずれか１項
    に記載の試薬。
20. （２０）ガングリオシドＧＭ＿１のみを特異的に認識す
    る抗ガングリオシドＧＭ＿１単クローン性抗体を用いた
    ＧＭ＿１の検出及び定量方法。