JPH02216460A - 脂質代謝異常検出用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は変性リポ蛋白の検出用キット、より詳しくは特
に心筋梗塞等の心疾患や、糖尿病、脳卒中等の脳血管障
害等の各種動脈硬化性疾患の発症因子としての脂質代謝
異常の臨床検査乃至診断に有用な新しい検査用キットに
関する。

従来の技術 脂質代謝異常とは、リポ蛋白の合成、分泌、異化の過程
で之等のいずれかが異常をきたす状態と定義でき、これ
は先天性リポ蛋白代謝異常と後天性リポ蛋白代謝異常と
に分類される。

また、上記脂質代謝異常は、種々の疾患、例えば心筋梗
塞等の心疾患、脳卒中等の脳血管障害等の各種動脈硬化
性疾患等の発症の重大な因子（リスクファクター）とさ
れており、２等疾患の進展、予後等に重大な影響を及ぼ
すことが知られており、該脂質代謝異常の検出は、各種
の臨床検査乃至診断に極めて重要な成果をもたらす。

従来、上記脂質代謝異常の検出法としては、血液中の総
コレステロール値をパラメーターとするものが最も一般
的に定着している。この方法は、血液中の総コレステロ
ール値を常法、例えば酵素法により測定し、読値が臨床
的及び経験的に設定された域値（正常域）を逸脱する場
合を脂質代謝異常として検出するものである。また近年
、血液中のリポ蛋白、即ち脂質とアポ蛋白との結合物を
比重により分画し、このうち特に高比重のリボ蛋白（高
密度リボ蛋白、ＨＤＬ）のコレステロール値を測定し、
この）ＩＤＬ−コレステロール値そのもの又は読値に対
する総コレステロール値から読値を引いた値、所謂動脈
硬化指数を、脂質代謝異常の検出パラメーターとする方
法も行なわれている。

しかしながら、現在までに蓄積された多くの免疫学的調
査の結果及び臨床的知見によれば、２等従来の脂質代謝
異常の検出方法は、実際の脂質代謝異常を必ずしも的確
に反映するものではなく、殊に臨床上その意義は低いこ
とがしばしば指摘されている。即ち、上記従来法はいず
れも総コレステロール値又はこれとＨＤＬコレステロー
ル値を測定するものであって、これらの測定値はいずれ
も脂質代謝異常とは必ずしも関連しない。特に総コレス
テロール値の高値は虚血性心疾患のリスクファクターの
一つとしての意義は有する〔例えばＭｅｄ、　Ｃｌ１ｎ
、　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍ、、　５８．３６３−３７９　（
１９Ｔ４）参照〕が、疾患と直接結びつくものではな（
、その検出方法による脂質代謝正常群における疾患の発
生や高度脂質代謝異常群における恒常的な健全性等は、
いずれも何ら希なものではない。またＨＤＬ−コレステ
ロール値及びこれを基準とする動脈硬化指数をパラメー
ターとする場合も、上記と同様に実際の脂質代謝異常を
必ずしも的確に反映するものではない〔動脈硬化、■（
４）、　９３１−９３６　（１９８６）等参照〕。

更に、最近の知見によると実際の脂質代謝異常には、超
低比重リボ蛋白（ＶＬＤＬ）等のリボ蛋白が生体内で何
らかの作用を受けることにより生成すると考えられる変
性リボ蛋白が、重大な影響を及ぼすという報告が種々な
されている〔例えばＨｕｔ、　Ｄ、　Ｙ、、　Ｉｎｎｅ
ｒａｒｉｔｙ、　Ｔ、　Ｌ、、　＆　Ｍａｈｌｅｙ、　
Ｒ。

Ｗ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５９．８
６０−８６９　（１９８４）　：Ｇｏｎｅｎ　Ｂ　ｅｔ
　ａｌ、、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ、　３０．８７５　（１
９８１）等参照〕。

従って、この変性リボ蛋白を検出できれば、脂質代謝異
常を正確に検出でき、これは該脂質代謝異常をもたらす
各種疾患の的確な診断手段として、殊に疾患の発見、進
展状態、治療効果の把握等の臨床分野において非常に有
効であると考えられるが、上記変性リボ蛋白の実体は現
在尚不明確で、その検出手段も現在知られていない。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、脂質代謝異常を正確に検出でき、該脂
質代謝異常をもたらす各種疾患の発見、進展状態、治療
効果の把握等を可能とする、臨床上非常に有効な変性リ
ボ蛋白の新しい検出手段、そのためのキットを提供する
ことにある。

本発明者は、上記目的より鋭意研究を重ねた結果、総血
漿リポ蛋白から、アポ蛋白Ａ−Ｉを構成成分とするリボ
蛋白（アポＡ−１含有リポ蛋白）及びアポ蛋白Ｂ−１０
０を構成成分とするりボ蛋白（アポＢ−１００含有リボ
蛋白）を除したものが、上記変性リボ蛋白に相当するこ
とを認めると共に、予め調製された特定の抗体を含むア
フィニティゲル混合物と被検血液とを接触させる時には
上記アポ蛋白ＡｍＩ含有リポ蛋白及びアポ蛋白Ｂ−１０
０含有リポ蛋白が兄事に系外に除去され、系の脂質測定
によって所望の変性リボ蛋白量を容易且つ確実に測定、
検出できることを見出し、ここに本発明を完成するに至
った。

課題を解決するための手段 即ち、本発明はアポ蛋白Ａ−Ｉに対するモノクローナル
抗体を結合させたアフィニティゲルとアポ蛋白Ｂ−１０
０に対するモノクローナル抗体を結合させたアフィニテ
ィゲルとの混合物を必須成分として含有することを特徴
とする変性リボ蛋白検出用キットに係わる。

本発明キットは、変性リボ蛋白、即ち血液中捻リポ蛋白
からアポ蛋白Ａｍ１含有リボ蛋白及びアポ蛋白Ｂ−１０
０含有リボ蛋白を除いたリポ蛋白を測定するためのもの
であり、本発明によれば、上記キットを利用して測定さ
れる変性リポ蛋白量をパラメーターとして、脂質代謝異
常の検出及びこれによる各種疾患の臨床検査乃至診断を
行ない得る。即ち、上記変性リボ蛋白は、脂質代謝が正
常な場合は血液中には殆んど存在しないが、脂質代謝異
常の程度に応じてその存在量が増加し、該異常を的確に
反映するものであり、本発明キットの利用によればこの
脂質代謝異常を正確に測定、検出できる。

以下、本発明キット及びその利用による変性リポ蛋白の
検定乃至脂質代謝異常の検定法につき詳述する。

本発明キットを利用した検定法において、検体としては
血液、特に空腹時の血清又は血漿が好ましく、之等は被
検者より採血後、常法に従い調製できる。

血液中のリポ蛋白は、コレステロール、トリグリセライ
ド、リン脂質、遊離脂肪酸等の脂質とアポ蛋白とが結合
して存在しているのであるから、変性リボ蛋白としては
その総量、その脂質のいずれか又は全部、そのアポ蛋白
の総量等をいずれも用い得、之等のコレステロール値は
、例えば酵素法により測定できる。

本発明に係わるキットは、アポ蛋白Ａ−Ｉに対するモノ
クローナル抗体（抗アポ蛋白Ａ−１抗体）及びアポ蛋白
Ｂ−１００に対するモノクローナル抗体（抗アポ蛋白Ｂ
−１００抗体）を結合させたアフィニテイゲルの混合物
をそのまま又は振盪及び遠心分離が可能なチューブに調
製しておくことが好ましく、また予め適当な緩衝液、例
えば０．０１Ｍｈリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）＋０．
１．５ＭＮａＣ／等の緩衝液で上記ゲルを平衡化してお
くのが好ましい。更に上記緩衝液には、例えばアジ化ナ
トリウム等の通常の保存剤を含ませることができる。

本発明に用いるアフィニテイゲルは、通常の方法で調製
できる。つまり、抗アポ蛋白Ａ−Ｉ抗体及び抗アポ蛋白
Ｂ−１００抗体のそれぞれをブロモシアン等で活性化さ
せたアフィニティゲルにカップリングさせ、その後両者
を混合し、適当な緩衝液にて平衡化する。ここで用いら
れる抗体としては、抗ヒトアポＡ−１モノクローナル抗
体及び抗体ヒトアポＢ−１００モノクローナル抗体（い
ずれも株式会社日本抗体研究所製造）を代表例として例
示できるが、特に之等に限定されるものではない。また
用いられるアフィニティゲルの代表例としては、例えば
予めブロモシアン等で活性化されたセファロース４Ｂ（
ファルマシア社製）等を例示でき、カップリング反応は
上記ゲルと蛋白とのカップリング反応に慣用される常法
に従い、通常ｐＨ８〜１０の範囲でゲル１　ｘｉ当たり
約１〜１０■（ＩｇＧ）の抗体を用いて、室温（約２０
〜２５℃）下に２時間以内で実施できる。

本発明キットの必須成分とする上記ゲル混合物における
抗アポ蛋白Ａ−Ｉ抗体及び抗アポ蛋白Ｂ−１００抗体の
配合割合は、特に限定されるものではなく、適宜決定で
きるが、通常前者に対して後者を等重量以上、好ましく
は約１〜２倍重量の範囲から選択するのが望ましい。ま
た得られるゲル混合物のｐＨは一般には約７〜７．５の
範囲に調整されるのが好適である。

かくして調整されるゲル混合物を必須成分とする本発明
キットには、更に必要に応じてサッカロースやウシ血清
蛋白等の安定化剤及び／又は保存剤を添加配合できる。

この保存剤はキットの使用に際し実験値に悪影響を与え
ないものから選択され、例えば代表的には希釈したアジ
化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ　ａｚｉｄｅ）等を使用で
きる。また本発明キットには水溶性もしくは水と混和し
得るグリセリン、アルコール類、グリコール類、グリコ
ール工−チル類等を含有させることもできる。

本発明キットを利用した変性リボ蛋白の検出の好ましい
一実施態様によれば、まず本発明キットの必須成分とす
るアフィニティゲル混合物を振盪及び遠心可能な適当な
容器乃至テストチューブに入れ、適当な緩衝液で平衡化
させた後、該容器内に所定量の被検血清を加え、室温で
静置又は振盪して反応させた後、比較的低速度（約８０
０〜１０１０００ｒｐで遠心分離し、得られる上清にコ
レステロール発色試薬を加えて所定時間インキュベート
した後、該上清の脂質又はアポ蛋白を吸光度測定器によ
り測定することによ・って、被検血清中の変性リボ蛋白
量を測定することができる。この方法における被検血清
の使用量は、通常本発明ゲル混合物重量の約１／８重量
程度、好ましくは１／４〜１／１６重量程度とするのが
よい。

発明の効果 本発明キットの利用によれば、変性リボ蛋白を簡便に測
定でき、これを脂質代謝異常のパラメーターとして該異
常を容易且つ有効に検出できる。

殊に、血液中の変性リボ蛋白量は脂質代謝異常及びその
程度を的確に反映するものであり、本発明キットを用い
た脂質代謝異常の検出によれば、前記した各種疾患の発
見、進展、治療効果の把握等、特に従来の検出法では把
握できなかった心筋梗塞等の心疾患や肥満等の病態の把
握を充分且つ有効に行ない得る。

実　　　施　　　例 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる
。

実施例　１ （１）患者より空腹時ＥＤＴＡ採血し、遠心分離（２５
００〜３０００ｒｐｍ）して血漿を得た。

得られた各血漿について、トリグリセライド量を酵素法
（ＴＧ−５５５、協和メディクス社製）により測定した
。またコレステロール量を酵素法（Ｍｅｒｅｋｏ　Ｔｅ
５ｔ　ＣＨＯ、関東化学社製、２１１／１０μｌ血漿、
３７℃、１０分間インキュベート）により測定（３６５
ｎＩｎでの吸光度測定）した。

已）　上記血漿２０μｌを試験管に加え、抗アポＡ−■
モノクローナル抗体及び抗アポＢ−１００モノクローナ
ル抗体をそれぞれ結合させたアフィニティゲル（ゲルｌ
　ｘｉ当り各抗体を蛋白量として１０■ずつカップリン
グ反応させたブロムシアン活性化セファロース−４Ｂ）
を含有する反応液（各ゲルを等量の０．ＯＩＭ）リス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，４）に混和して調製したもの、各抗
体のそれぞれ８０μｌを含む）６００μｌを分注し、振
盪を３０分間行ない、その後１５分間静置して上清２０
０μｌを分取した。

該上清ニＭｅｒｃｋｏ　Ｔｅ５ｔ　ＣＨＯ（関東化学社
製）２７Ａ’を添加し、３７°Ｃで２０分間インキュベ
ート後、該血清中のコレステロール量を３６５ｎｍでの
吸光度測定により求めた。

（３）その結果、トリグリセライドがコレステロールに
比べて高い相関を示しており、このことより、外因性脂
質代謝異常の一つの指標であるカイロミクロンレムナン
ド及び内因性脂質代謝異常の一つの指標である異常ＶＬ
ＤＬ　（β−）あるいはＩＤＬを反映する変性リボ蛋白
の検出が行ない得ることが確認できた。

（４）また、上記において複数の健常人を検体として、
同様にして「ロ漿コレステロール値及び変性リボ蛋白量
を求めた。

その相関関係を、横軸に血漿コレステロール値（■／ｄ
ｌ）、縦軸に変性リボ蛋白量（■／ｌＨ）を取り第１図
に示す。

読図より、本発明キットの利用により、健常人の変性リ
ボ蛋白量を、コレステロール値とは関連なく常に０付近
に測定できることが判る。

（５）比較のため、本発明キットを用いた上記方法に代
えて以下の方法を実施した。この方法は抗アポＡ−Ｉモ
ノクローナル抗体結合アフイニティゲルを充填したカラ
ムと、抗アポＢ−１００モノクローナル抗体結合アフイ
ニテイゲルを充填したカラムとを用いて、血漿中のアポ
蛋白Ａ−Ｉ含有リポ蛋白（吸着画分）とアポ蛋白Ｂ−１
００含有リボ蛋白（吸着画分）とのそれぞれのコレステ
ロール値を求め、之等を加算した値を血漿総コレステロ
ール値から差引くことによって、変性リポ蛋白のコレス
テロール値を求めるものであり、以下の通り行なわれた
。

即ち、抗アポＡ−Ｉモノクローナル抗体結合アフィニテ
ィゲルを充填したミニカラムと、抗アポＢ−１００モノ
クローナル抗体結合アフィニティゲルを充填したミニカ
ラムとに、各々前記（４）と同一の複数の健常人からの
血漿２５０μｌを流して吸着させ、カラムを０．ＯＩＭ
ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７，２）２０ｘｌで洗浄後、１Ｍ酢
酸及びＱ、５Ｍ　　ＮａＣ１混液１０１１で溶出させ、
溶出液に１／２倍量の３゜５Ｍ）リス塩酸緩衝液を加え
、その１１１にＭｅｒｃｋｏ　Ｔｅ５ｔＣＨＯ（関東化
学社製）２１１を添加し、３７℃で３０分間インキュベ
ートした後、コレステロール量を３６５ｎｍでの吸光度
測定により求めた。

次いで上記で求めた各コレステロール値を血漿総コレス
テロール値崩たりの比として、下記式（Ｉ）に従うパラ
メーター（Ｐ）を算出した。

但し、Ａは血漿総コレステロール値（■／ｄｊ）を、Ｂ
は血漿から分離したアポ蛋白Ａ−Ｉ含有リポ蛋白のコレ
ステロール値（■／ｄｌ）を、Ｃは血漿から分離したア
ポ蛋白Ｂ−１００含有リポ蛋白のコレステロール値（■
／ｄｌ）をそれぞれ示す。

得られた結果（血漿総コレステロール値：ＴＣＨＯ）及
び変性リポ蛋白コレステロール値：ＬｉｐｏＺ−ＣＨＯ
）を、前記（４）記載の本発明方法と対比して、下記第
１表に示す。

第　　　１　　　表 上記第１表より、本発明のキットを利用する方法によれ
ば、比較法に比べて、より正確に変性リポ蛋白量を測定
でき、バラツキのないことが判ると共に、本発明の測定
法は、それ自体容易且つ簡便であり、非常に優れたもの
であることが明らかである。

（６）更に、上記（４）において健常人に代えて糖尿病
患者、虚血性心疾患患者、脳血管障害患者のそれぞれ複
数人（各５名）を検体として、同様にして本発明キット
を利用して変性リポ蛋白コレステロール値（ＬｌｐｏＺ
−ＣＩＯ、■／ｄｊ）を求めると共に、総コレステロー
ル値（ＴＣＨＯ）、トリグリセライド値（ＴＧ）、高密
度リポ蛋白コレステロール値（）ＩＤＬ−Ｃ）をそれぞ
れ求めた。

即ち、上記（１）と同様にして調製した各患者の血漿２
０μｌを試験管に加え、抗アポＡ−Ｉモノクローナル抗
体及び抗アポＢ−１００モノクローナル抗体をそれぞれ
結合させたアフィニティゲル（ゲル１　ｙ／当り各抗体
を蛋白量として１０■ずつカップリング反応させたブロ
ムシアン活性化セファロース−４Ｂ）を含有する反応液
（各ゲルを等量の０．１５Ｍ　　ＮａＣ／含有０、ＯＩ
Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）に混和して調製した
、各抗体のそれぞれ１６０μｌを含む）６００μｌを分
注し、３０分間振盪後、１０分間静置して上清２００μ
ｌを分取し、次に該上清にＭｅｒｃｋｏ　Ｔｅ５ｔ　Ｃ
ＨＯ（関東化学社製）２ｚ／を添加し、３７°Ｃで２０
分間インキュベート後、該上清中のＬｌｐｏ−Ｚ−ＣＨ
Ｏ量を吸光度測定により求めた。

結果を各患者毎に下記第２表に示す。

第　　　２　　　表 第２表 （続き） ｑ）　更にＷＨＯが定めている高脂血症の型分類に従っ
て分類された患者の血漿を用いて、変性リポ蛋白量を上
記（１）と同様にして測定した。

その結果を下記第３表に示す。

第　　　３　　　表 実施例　２ 実施例１に従うトリグリセライド（ＴＧ）及び総コレス
テロール（Ｔ　ＣＨＯ）測定値が高値［ＴＧ＞１５０、
ＴＣＨＯ＞２５０］を示し、高脂血症を呈すると判断さ
れた患者につき、９８日間に亘って毎日朝晩プロブコー
ル５００■（２５０■錠２錠）を投与し、その投与開始
前（治療前）及び投与期間終了後に、それぞれ実施例１
と同様にして、トリグリセライド値及び血漿コレステロ
ール値を測定すると共に、実施例１に示したと同一の本
発明キットを利用して、変性リボ蛋白値を測定した。

その結果、トリグリセライド値は、治療前値４２５から
治療後値３８９に変化した。また、血漿コレステロール
値の変化は第２図（１）に、変性リボ蛋白値は第２図（
２）に示す通りであった。

之等の図から、本発明によれば症状に対応する正確な変
性リボ蛋白の測定が可能であり、疾患の診断が行ない得
ることが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明キットを利用した変性リボ蛋白の測定値
と血漿コレステロール値との相関を調べた図であり、第
２図（１）及び（２）は、高脂血症患者の血漿コレステ
ロール値及び変性リボ蛋白値を治療前後に測定した結果
を示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）アポ蛋白Ａ−Ｉに対するモノクローナル抗体を結
   合させたアフィニティゲルとアポ蛋白Ｂ−１００に対す
   るモノクローナル抗体を結合させたアフィニティゲルと
   の混合物を必須成分として含有することを特徴とする変
   性リポ蛋白検出用キット。