【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
（産業上の技術分野）
本発明はＤ−アミノアシラーゼの製造法に関す
る。さらに詳しくはＤ−アミノアシラーゼ生産能
力を持つストレプトミセス属の微生物の変異処理
により得られるＬ−アミノアシラーゼ生産能欠損
変異株を栄養培地中で培養し、Ｄ−アミノアシラ
ーゼを生成蓄積せしめ、これを採取する方法に関
する。この発明は例えば近年抗生物質の側鎖やペ
プチド医薬品等の用途に求められる光学純度の高
いＤ−アミノ酸の製造等に極めて有効な酸素の製
造方法を提供しようとするものである。
（従来技術）
Ｄ−アミノアシラーゼの製造方法として、これ
までにシユードモナス（Pseudomonas）属細菌
による方法（ネイチヤー（Naiture）、181、1225
（1952））、フアカルタテイブ・メタノール資化性
菌による方法（特開昭55−42534）および本発明
者の一人である杉江らのストレプトミセス
（Streptomyces）属放線菌による方法（特開昭53
−59092）が知られている。
（発明が解決しようとする問題点）
しかしながら、これらいずれの方法もＤ−選択
性に問題がある。即ち、これらの微生物を用いて
Ｄ−アミノアシラーゼを生産する時、いずれも同
時にＬ−アミノアシラーゼが生産され、採取した
菌体あるいは菌体から超音波等により抽出した粗
酵素液を用いての反応で得られる目的生産物の光
学純度は十分に満足し得るものではない。
（問題点を解決するための手段）
かかる事情を鑑がみ、本発明者らはＤ−アミノ
アシラーゼの工業生産を目的にＤ−アミノアシラ
ーゼ生産菌の改良につき鋭意検討の結果ストレプ
トミセス属のＤ−アミノアシラーゼ生産菌の変異
株の中からＤ−アミノアシラーゼ生産能を維持し
たままで、不要酵素であるＬ−アミノアシラーゼ
生産能が実質的に欠損した菌株を見いだし本発明
を完成した。従来、Ｄ−アミノアシラーゼ生産菌
に関する育種については全く報告はなく、本発明
者らにより、はじめて得られたものである。
（使用する微生物）
本発明で使用する微生物はストレプトミセス属
に属するＤ−アミノアシラーゼ生産菌を親株とし
て、これに通常の変異誘導操作、例えば紫外線、
Ｘ−線照射あるいはＮ−ニトロソグアニジン
（NTGと略す）、亜硝酸等の化学薬剤処理を施し、
変異処理した菌株の中からＬ−アミノアシラーゼ
活性の欠損した菌株を選択することにより得られ
るものであればいずれも用いることができ、Ｌ−
アミノアシラーゼ活性の欠損している点で先行技
術で用いられた菌と区別できる。好適な菌株の具
体例としてはストレプトミセス・ツイルス
（Streptomyces tuirus）IFO13418から誘導され
たＬ−アミノアシラーゼ欠損変異株であるストレ
プトミセス・ツイルスＯ−33（微工研菌寄第8446
号）が挙げられる。
（変異誘導法）
次に本発明で使用する変異株の選抜方法を以下
の実験例にて示す。
実験例
ストレプトミセス・ツイルスIFO13418を第一
表に示す寒天斜面培地で培養し、生育した菌体を
0.01％ツイーン80を含む生理食塩水に懸濁させ
る。これを無菌ガーゼでろ過し胞子懸濁液（106
〜107コ／mlの胞子を含む）を得る。これにNTG
を加え（濃度29μｇ／ml）、30℃で30〜90分イン
キユベートする。続いて胞子を生理食塩水で２回
洗浄した後、第一表に示す寒天平板培地に塗沫
し、30℃で、６〜12日培養した。生育したコロニ
ーを第二表に示す液体培地で30℃、２〜４日間培
養する。得られた菌体を集め0.1Mリン酸バツフ
アー（PH7.0）で洗浄した後、Ｎ−アセチル−Ｌ
−アミノ酸と共に30℃で24時間反応させる。菌体
を除いた反応液中のアミノ酸の有無をチエツクす
ることによりＬ−アミノアシラーゼ生産能の低下
または欠損した変異株を選抜した。さらにＮ−ア
セチル−DL−アミノ酸を基質にした反応で二次
評価を行ない、親株と同等以上のＤ−アミノアシ
ラーゼ生産能を維持し、かつＬ−アミノアシラー
ゼ生産能の著しく低下した変異株をえた。この菌
株はストレプトミセス・ツイルス０−33（微工研
菌寄第8446号）として寄託した。
（変異株の培養方法）
本発明の変異株は、通常の栄養源、即ち炭素
源、窒素源、無機塩類の存在下で行なわれる。こ
の酵素生産誘導物質として、Ｄ−またはDL−フ
エニルグリシン、Ｄ−またはDL−バリン、Ｄ−
またはDL−ロイシンなどのＤ−またはDL−アミ
ノ酸、またはＤ−またはDL−アミノ酸の誘導体、
例えばＮ−アセチル−Ｄ−またはDL−フエニル
グリシンなどを例示できる。また窒素源としては
有機窒素の添加が必要で、例えばポリペプトン、
肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカーな
どを適宜添加し、また必要に応じて、培地１ml当
たり100μｇ程度の塩化コバルトを添加してもよ
い。培養はPH５〜８の範囲で可能であるが、PH６
〜７の範囲内で行なうのがより望ましく、また培
養温度は20〜37℃の範囲で可能であるが、30℃が
より望ましい。培養には酸素の供給が必要で、通
気撹はんを行なう必要がある。
（酵素の回収と反応方法）
本発明で得られるＤ−アミノアシラーゼは主に
菌体内に生産されるので、得られた菌体を水洗
後、酵素剤として回収してもよく、あるいは、常
法により菌体を破砕またはリゾチーム等で溶菌し
て酵素を抽出し、これを酵素剤として回収しても
よい。酵素剤で連続酵素反応を行なうには、水洗
菌体をそのまま使用してもよく、またこれをポリ
アクリルアミド等で包括したり、菌体から抽出し
た酵素を常法により固定化したものも使用可能で
ある。
（発明の効果）
Ｄ−アミノ酸等の有用な光学活性化合物の製造
に有用なＤ−アミノアシラーゼの工業生産への最
大の欠点であつた菌体内のきよう雑Ｌ−アミノア
シラーゼを菌株の育種により克服した。本発明の
変異株を用いることにより、菌体からの抽出酵素
または菌体をそのまま酵素反応に利用するいずれ
の方法でも高純度のＤ−アミノアシラーゼ活性を
容易に得ることができ産業上の効果は極めて大き
いものである。
以下、本発明を実施例により詳述するが本発明
はこれらの実施例に限定されるものではない。
(Industrial Technical Field) The present invention relates to a method for producing D-aminoacylase. More specifically, a mutant strain lacking L-aminoacylase production ability obtained by mutagenesis of a Streptomyces microorganism capable of producing D-aminoacylase is cultured in a nutrient medium to produce and accumulate D-aminoacylase. Concerning the method of collection. The present invention aims to provide a method for producing oxygen that is extremely effective for, for example, producing D-amino acids with high optical purity, which are required in recent years for applications such as antibiotic side chains and peptide medicines. (Prior Art) As a method for producing D-aminoacylase, a method using bacteria of the genus Pseudomonas (Nature, 181 , 1225) has been proposed.
(1952)), a method using methanol-assimilating bacteria (Japanese Unexamined Patent Publication No. 55-42534), and a method using Streptomyces genus actinomycetes by one of the inventors, Sugie et al.
−59092) is known. (Problems to be Solved by the Invention) However, all of these methods have problems with D-selectivity. That is, when D-aminoacylase is produced using these microorganisms, L-aminoacylase is simultaneously produced, and the reaction is carried out using collected microorganisms or a crude enzyme solution extracted from the microorganisms by ultrasound, etc. The optical purity of the target product obtained is not fully satisfactory. (Means for Solving the Problems) In view of the above circumstances, the present inventors conducted intensive studies on improving D-aminoacylase-producing bacteria for the purpose of industrial production of D-aminoacylase, and as a result, D. - Among mutant strains of aminoacylase-producing bacteria, a strain was found that was substantially deficient in the ability to produce L-aminoacylase, an unnecessary enzyme, while maintaining the ability to produce D-aminoacylase, and the present invention was completed. Until now, there have been no reports on the breeding of D-aminoacylase-producing bacteria, and this was obtained for the first time by the present inventors. (Microorganisms used) The microorganisms used in the present invention are D-aminoacylase-producing bacteria belonging to the genus Streptomyces as a parent strain, and are subjected to conventional mutagenesis procedures such as ultraviolet rays, etc.
X-ray irradiation or chemical treatment with N-nitrosoguanidine (abbreviated as NTG), nitrous acid, etc.
Any strain that can be obtained by selecting a strain deficient in L-aminoacylase activity from mutagenized strains can be used;
It can be distinguished from the bacteria used in the prior art by lacking aminoacylase activity. A specific example of a suitable strain is Streptomyces tuirus O-33, an L-aminoacylase-deficient mutant strain derived from Streptomyces tuirus IFO13418 (Feikoken Bacterial Serial No. 8446).
). (Mutation induction method) Next, the method for selecting mutant strains used in the present invention will be shown in the following experimental examples. Experimental example Streptomyces twillus IFO13418 was cultured on the agar slant medium shown in Table 1, and the grown bacterial cells were
Suspend in saline containing 0.01% Tween 80. Filter this through sterile gauze to obtain a spore suspension (10 6
~ 107 spores/ml). NTG for this
(concentration 29 μg/ml) and incubate at 30°C for 30 to 90 minutes. Subsequently, the spores were washed twice with physiological saline, then spread on the agar plate medium shown in Table 1, and cultured at 30°C for 6 to 12 days. The grown colonies are cultured in the liquid medium shown in Table 2 at 30°C for 2 to 4 days. The obtained bacterial cells were collected and washed with 0.1M phosphate buffer (PH7.0), and then N-acetyl-L
- React with amino acids for 24 hours at 30°C. Mutant strains with decreased or deficient L-aminoacylase production ability were selected by checking the presence or absence of amino acids in the reaction solution from which the bacterial cells were removed. Furthermore, we performed a secondary evaluation using a reaction using N-acetyl-DL-amino acid as a substrate, and obtained a mutant strain that maintained D-aminoacylase production ability equivalent to or higher than that of the parent strain, and had a significantly reduced L-aminoacylase production ability. . This strain was deposited as Streptomyces twillus 0-33 (Feikoken Bacteria No. 8446). (Method for culturing mutant strains) The mutant strains of the present invention are cultivated in the presence of conventional nutritional sources, ie, carbon sources, nitrogen sources, and inorganic salts. The enzyme production inducers include D- or DL-phenylglycine, D- or DL-valine, D-
or a D- or DL-amino acid, such as DL-leucine, or a derivative of a D- or DL-amino acid,
Examples include N-acetyl-D- or DL-phenylglycine. It is also necessary to add organic nitrogen as a nitrogen source, such as polypeptone,
Meat extract, yeast extract, corn steep liquor, etc. may be added as appropriate, and if necessary, about 100 μg of cobalt chloride may be added per 1 ml of the medium. Cultivation is possible in the pH range of 5 to 8, but
It is more desirable to carry out the cultivation within the range of 7 to 7 degrees Celsius, and the culturing temperature can be within the range of 20 to 37 degrees Celsius, but 30 degrees Celsius is more preferable. Culture requires oxygen supply and aeration and agitation. (Enzyme recovery and reaction method) Since the D-aminoacylase obtained in the present invention is mainly produced within the bacterial cells, the obtained bacterial cells may be washed with water and then recovered as an enzyme preparation, or the conventional method may be used. The enzyme may be extracted by crushing the bacterial cells or lysing them with lysozyme or the like, and then recovering this as an enzyme preparation. To carry out continuous enzymatic reactions with enzyme agents, water-washed bacterial cells can be used as is, or they can be wrapped in polyacrylamide, etc., or enzymes extracted from bacterial cells can be immobilized using conventional methods. It is. (Effect of the invention) By breeding bacterial strains, we have been able to eliminate the harmful and miscellaneous L-aminoacylase in bacterial cells, which has been the biggest drawback to the industrial production of D-aminoacylase, which is useful for the production of useful optically active compounds such as D-amino acids. I overcame it. By using the mutant strain of the present invention, high-purity D-aminoacylase activity can be easily obtained by extracting the enzyme from the bacterial cells or using the bacterial cells as they are for enzymatic reactions, and the industrial effect is low. It is extremely large. Hereinafter, the present invention will be explained in detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
【表】【table】
【表】
実施例 １
可溶性デンプン２％、マルトース１％、グリセ
リン１％、ポリペプトン0.5％、酵母エキス0.5
％、肉エキス1.5％、コーンスチープリカー１％、
NaC10.5％、DL−バリン1.5％を含む栄養培地
（PH7.0）100mlに変異株０−33株（微工研菌寄第
8446号）の胞子を接種し30℃、毎分110回転で４
日間培養した。培養液から菌体を集め生理食塩水
で十分洗浄した後、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
に懸濁し、超音波破砕器（19.5KHz）で細胞を破
砕する。遠心分離で細胞の破片を除去して、Ｄ−
アミノアシラーゼの粗酵素液を得た。酵素反応は
0.05MのＮ−アセチル−DL−バリンを基質とし
て培養液１mlに相当する粗酵素液を用いて、30
℃、24時間反応させた。反応生成物の分析は、
HPLCで行なつた。分析方法はダイセル化学工業
製光学分割カラムWHを用いる方法および、キラ
ルモビールフエイズ法（J.Am.Chem.Soc.102、
5115（1980））の二つの方法で行なつた。その結
果、24時間反応後、Ｎ−アセチル−Ｄ−バリンの
99.5％がＤ−バリンに転換した。一方、Ｎ−アセ
チル−Ｌ−バリンは、ほとんど反応せず、わずか
に0.4％がＬ−バリンに転換した。キラルモビー
ルフエイズ法での分析結果を第１図に示した。培
養液１ml中の酵素が１時間に1μモルのＤ−バリ
ンを生ずる酵素活性を１単位とするとき、Ｄ−ア
ミノアシラーゼ活性は37単位であつた。
比較例 １
実施例１と同様の栄養培地100mlに親株である
ストレプトミセス・ツイルスIFO13418株の胞子
を接種し、30℃で毎分110回転の培養で４日間培
養した。実施例１と同様の方法で粗酵素液を得
た。0.05MのＮ−アセチル−DL−バリンを基質
として、培養液１mlに相当する粗酵素液を用い
て、30℃、24時間反応させた。反応生成物の分析
は実施例１と同様にして行なつた。24時間反応
後、Ｎ−アセチル−Ｄ−バリンの90％がＤ−バリ
ンに転換した。一方のＮ−アセチル−Ｌ−バリン
は48.6％がＬ−バリンに転換した。キラルモビー
ルフエイズ法での分析結果を第２図に示した。
実施例 ２
実施例１と同様の栄養培地で変異株０−33株を
培養し、同様の操作で粗酵素液を得た。0.05Mの
Ｎ−アセチル−DL−フエニルグリシンを基質と
して培養液１mlに相当する粗酵素液を用いて30
℃、24時間反応させた。反応生成物の分析は実施
例１と同様にして行なつた。24時間反応後、Ｎ−
アセチル−Ｄ−フエニルグリシンの100％がＤ−
フエニルグリシンに転換していた。一方、Ｎ−ア
セチル−Ｌ−フエニルグリシンは全く反応しなか
つた。
比較例 ２
比較例１と同様にして粗酵素液を得た。0.05M
のＮ−アセチル−DL−フエニルグリシンを基質
として培養液１mlに相当する粗酵素液を用いて30
℃、24時間反応させた。反応生成物の分析は実施
例１と同様にしておこなつた。24時間反応後、Ｎ
−アセチル−Ｄ−フエニルグリシンの84.8％がＤ
−フエニルグリシンに転換した。一方、Ｎ−アセ
チル−Ｌ−フエニルグリシンは13.3％がＬ−フエ
ニルグリシンに転換した。
実施例 ３
実施例１で示した栄養培地で変異株０−33株を
培養し、菌体を集めた。さらに、この菌体を十分
洗浄した後、0.05MのＮ−アセチル−DL−バリ
ンを基質に、培養液１mlに相当する菌体懸濁液を
用いて30℃で酵素反応させた。10時間反応後、Ｎ
−アセチル−Ｄ−バリンの86％がＤ−バリンに転
換した。一方、Ｎ−アセチル−Ｌ−バリンは全く
反応しなかつた。[Table] Example 1 Soluble starch 2%, maltose 1%, glycerin 1%, polypeptone 0.5%, yeast extract 0.5
%, meat extract 1.5%, corn steep liquor 1%,
100 ml of nutrient medium (PH7.0) containing 10.5% NaC and 1.5% DL-valine was added to mutant strains 0-33
8446) and inoculated with spores at 30℃ and 110 revolutions per minute.
Cultured for 1 day. After collecting bacterial cells from the culture solution and thoroughly washing them with physiological saline, add them to 0.1M phosphate buffer (PH7.0).
and disrupt the cells using an ultrasonic disruptor (19.5KHz). Cell debris was removed by centrifugation and D-
A crude enzyme solution of aminoacylase was obtained. The enzymatic reaction
Using 0.05 M N-acetyl-DL-valine as a substrate and a crude enzyme solution equivalent to 1 ml of culture solution,
℃ for 24 hours. Analysis of reaction products is
This was done using HPLC. The analytical methods are a method using an optical resolution column WH manufactured by Daicel Chemical Industries, and a chiral mobile phase method (J.Am.Chem.Soc. 102 ,
5115 (1980)). As a result, after 24 hours of reaction, N-acetyl-D-valine
99.5% was converted to D-valine. On the other hand, N-acetyl-L-valine hardly reacted and only 0.4% was converted to L-valine. The analysis results using the chiral mobile phase method are shown in Figure 1. The D-aminoacylase activity was 37 units when the enzyme activity in 1 ml of the culture solution to produce 1 μmol of D-valine per hour is defined as 1 unit. Comparative Example 1 Spores of the parent strain Streptomyces twillus IFO13418 were inoculated into 100 ml of the same nutrient medium as in Example 1, and cultured at 30° C. at 110 revolutions per minute for 4 days. A crude enzyme solution was obtained in the same manner as in Example 1. Using 0.05 M N-acetyl-DL-valine as a substrate and a crude enzyme solution equivalent to 1 ml of culture solution, the reaction was carried out at 30° C. for 24 hours. Analysis of the reaction product was carried out in the same manner as in Example 1. After 24 hours of reaction, 90% of N-acetyl-D-valine was converted to D-valine. On the other hand, 48.6% of N-acetyl-L-valine was converted to L-valine. The analysis results using the chiral mobile phase method are shown in Figure 2. Example 2 Mutant strains 0-33 were cultured in the same nutrient medium as in Example 1, and a crude enzyme solution was obtained in the same manner. Using 0.05M N-acetyl-DL-phenylglycine as a substrate and a crude enzyme solution equivalent to 1ml of culture solution,
℃ for 24 hours. Analysis of the reaction product was carried out in the same manner as in Example 1. After 24 hours of reaction, N-
100% of acetyl-D-phenylglycine is D-
It was converted to phenylglycine. On the other hand, N-acetyl-L-phenylglycine did not react at all. Comparative Example 2 A crude enzyme solution was obtained in the same manner as in Comparative Example 1. 0.05M
Using crude enzyme solution equivalent to 1 ml of culture solution using N-acetyl-DL-phenylglycine as a substrate,
℃ for 24 hours. Analysis of the reaction product was carried out in the same manner as in Example 1. After 24 hours reaction, N
-84.8% of acetyl-D-phenylglycine is D
- Converted to phenylglycine. On the other hand, 13.3% of N-acetyl-L-phenylglycine was converted to L-phenylglycine. Example 3 Mutant strains 0-33 were cultured in the nutrient medium shown in Example 1, and bacterial cells were collected. Furthermore, after thoroughly washing the cells, an enzymatic reaction was carried out at 30° C. using 0.05M N-acetyl-DL-valine as a substrate and a cell suspension equivalent to 1 ml of the culture solution. After 10 hours of reaction, N
-86% of acetyl-D-valine was converted to D-valine. On the other hand, N-acetyl-L-valine did not react at all.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]
第１図は実施例１で得られた酵素反応液の、
HPLCによる分析のクロマトグラムを示したもの
である。第２図は比較例１で得られた酵素反応液
の、HPLCによる分析のクロマトグラムを示した
ものである。
Figure 1 shows the enzyme reaction solution obtained in Example 1.
This shows a chromatogram analyzed by HPLC. FIG. 2 shows a chromatogram of the enzyme reaction solution obtained in Comparative Example 1 analyzed by HPLC.