JPH0221797B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の技術分野） 本発明はＤ−アミノアシラーゼの製造法に関す
る。さらに詳しくはＤ−アミノアシラーゼ生産能
力を持つストレプトミセス属の微生物の変異処理
により得られるＬ−アミノアシラーゼ生産能欠損
変異株を栄養培地中で培養し、Ｄ−アミノアシラ
ーゼを生成蓄積せしめ、これを採取する方法に関
する。この発明は例えば近年抗生物質の側鎖やペ
プチド医薬品等の用途に求められる光学純度の高
いＤ−アミノ酸の製造等に極めて有効な酸素の製
造方法を提供しようとするものである。 （従来技術） Ｄ−アミノアシラーゼの製造方法として、これ
までにシユードモナス（Pseudomonas）属細菌
による方法（ネイチヤー（Naiture）、181、1225
（1952））、フアカルタテイブ・メタノール資化性
菌による方法（特開昭55−42534）および本発明
者の一人である杉江らのストレプトミセス
（Streptomyces）属放線菌による方法（特開昭53
−59092）が知られている。 （発明が解決しようとする問題点） しかしながら、これらいずれの方法もＤ−選択
性に問題がある。即ち、これらの微生物を用いて
Ｄ−アミノアシラーゼを生産する時、いずれも同
時にＬ−アミノアシラーゼが生産され、採取した
菌体あるいは菌体から超音波等により抽出した粗
酵素液を用いての反応で得られる目的生産物の光
学純度は十分に満足し得るものではない。 （問題点を解決するための手段） かかる事情を鑑がみ、本発明者らはＤ−アミノ
アシラーゼの工業生産を目的にＤ−アミノアシラ
ーゼ生産菌の改良につき鋭意検討の結果ストレプ
トミセス属のＤ−アミノアシラーゼ生産菌の変異
株の中からＤ−アミノアシラーゼ生産能を維持し
たままで、不要酵素であるＬ−アミノアシラーゼ
生産能が実質的に欠損した菌株を見いだし本発明
を完成した。従来、Ｄ−アミノアシラーゼ生産菌
に関する育種については全く報告はなく、本発明
者らにより、はじめて得られたものである。 （使用する微生物） 本発明で使用する微生物はストレプトミセス属
に属するＤ−アミノアシラーゼ生産菌を親株とし
て、これに通常の変異誘導操作、例えば紫外線、
Ｘ−線照射あるいはＮ−ニトロソグアニジン
（NTGと略す）、亜硝酸等の化学薬剤処理を施し、
変異処理した菌株の中からＬ−アミノアシラーゼ
活性の欠損した菌株を選択することにより得られ
るものであればいずれも用いることができ、Ｌ−
アミノアシラーゼ活性の欠損している点で先行技
術で用いられた菌と区別できる。好適な菌株の具
体例としてはストレプトミセス・ツイルス
（Streptomyces tuirus）IFO13418から誘導され
たＬ−アミノアシラーゼ欠損変異株であるストレ
プトミセス・ツイルスＯ−33（微工研菌寄第8446
号）が挙げられる。 （変異誘導法） 次に本発明で使用する変異株の選抜方法を以下
の実験例にて示す。 実験例 ストレプトミセス・ツイルスIFO13418を第一
表に示す寒天斜面培地で培養し、生育した菌体を
0.01％ツイーン80を含む生理食塩水に懸濁させ
る。これを無菌ガーゼでろ過し胞子懸濁液（10⁶
〜10⁷コ／mlの胞子を含む）を得る。これにNTG
を加え（濃度29μｇ／ml）、30℃で30〜90分イン
キユベートする。続いて胞子を生理食塩水で２回
洗浄した後、第一表に示す寒天平板培地に塗沫
し、30℃で、６〜12日培養した。生育したコロニ
ーを第二表に示す液体培地で30℃、２〜４日間培
養する。得られた菌体を集め0.1Mリン酸バツフ
アー（PH7.0）で洗浄した後、Ｎ−アセチル−Ｌ
−アミノ酸と共に30℃で24時間反応させる。菌体
を除いた反応液中のアミノ酸の有無をチエツクす
ることによりＬ−アミノアシラーゼ生産能の低下
または欠損した変異株を選抜した。さらにＮ−ア
セチル−DL−アミノ酸を基質にした反応で二次
評価を行ない、親株と同等以上のＤ−アミノアシ
ラーゼ生産能を維持し、かつＬ−アミノアシラー
ゼ生産能の著しく低下した変異株をえた。この菌
株はストレプトミセス・ツイルス０−33（微工研
菌寄第8446号）として寄託した。 （変異株の培養方法） 本発明の変異株は、通常の栄養源、即ち炭素
源、窒素源、無機塩類の存在下で行なわれる。こ
の酵素生産誘導物質として、Ｄ−またはDL−フ
エニルグリシン、Ｄ−またはDL−バリン、Ｄ−
またはDL−ロイシンなどのＤ−またはDL−アミ
ノ酸、またはＤ−またはDL−アミノ酸の誘導体、
例えばＮ−アセチル−Ｄ−またはDL−フエニル
グリシンなどを例示できる。また窒素源としては
有機窒素の添加が必要で、例えばポリペプトン、
肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカーな
どを適宜添加し、また必要に応じて、培地１ml当
たり100μｇ程度の塩化コバルトを添加してもよ
い。培養はPH５〜８の範囲で可能であるが、PH６
〜７の範囲内で行なうのがより望ましく、また培
養温度は20〜37℃の範囲で可能であるが、30℃が
より望ましい。培養には酸素の供給が必要で、通
気撹はんを行なう必要がある。 （酵素の回収と反応方法） 本発明で得られるＤ−アミノアシラーゼは主に
菌体内に生産されるので、得られた菌体を水洗
後、酵素剤として回収してもよく、あるいは、常
法により菌体を破砕またはリゾチーム等で溶菌し
て酵素を抽出し、これを酵素剤として回収しても
よい。酵素剤で連続酵素反応を行なうには、水洗
菌体をそのまま使用してもよく、またこれをポリ
アクリルアミド等で包括したり、菌体から抽出し
た酵素を常法により固定化したものも使用可能で
ある。 （発明の効果） Ｄ−アミノ酸等の有用な光学活性化合物の製造
に有用なＤ−アミノアシラーゼの工業生産への最
大の欠点であつた菌体内のきよう雑Ｌ−アミノア
シラーゼを菌株の育種により克服した。本発明の
変異株を用いることにより、菌体からの抽出酵素
または菌体をそのまま酵素反応に利用するいずれ
の方法でも高純度のＤ−アミノアシラーゼ活性を
容易に得ることができ産業上の効果は極めて大き
いものである。 以下、本発明を実施例により詳述するが本発明
はこれらの実施例に限定されるものではない。

【表】

【表】 実施例 １ 可溶性デンプン２％、マルトース１％、グリセ
リン１％、ポリペプトン0.5％、酵母エキス0.5
％、肉エキス1.5％、コーンスチープリカー１％、
NaC10.5％、DL−バリン1.5％を含む栄養培地
（PH7.0）100mlに変異株０−33株（微工研菌寄第
8446号）の胞子を接種し30℃、毎分110回転で４
日間培養した。培養液から菌体を集め生理食塩水
で十分洗浄した後、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
に懸濁し、超音波破砕器（19.5KHz）で細胞を破
砕する。遠心分離で細胞の破片を除去して、Ｄ−
アミノアシラーゼの粗酵素液を得た。酵素反応は
0.05MのＮ−アセチル−DL−バリンを基質とし
て培養液１mlに相当する粗酵素液を用いて、30
℃、24時間反応させた。反応生成物の分析は、
HPLCで行なつた。分析方法はダイセル化学工業
製光学分割カラムWHを用いる方法および、キラ
ルモビールフエイズ法（J.Am.Chem.Soc.102、
5115（1980））の二つの方法で行なつた。その結
果、24時間反応後、Ｎ−アセチル−Ｄ−バリンの
99.5％がＤ−バリンに転換した。一方、Ｎ−アセ
チル−Ｌ−バリンは、ほとんど反応せず、わずか
に0.4％がＬ−バリンに転換した。キラルモビー
ルフエイズ法での分析結果を第１図に示した。培
養液１ml中の酵素が１時間に1μモルのＤ−バリ
ンを生ずる酵素活性を１単位とするとき、Ｄ−ア
ミノアシラーゼ活性は37単位であつた。 比較例 １ 実施例１と同様の栄養培地100mlに親株である
ストレプトミセス・ツイルスIFO13418株の胞子
を接種し、30℃で毎分110回転の培養で４日間培
養した。実施例１と同様の方法で粗酵素液を得
た。0.05MのＮ−アセチル−DL−バリンを基質
として、培養液１mlに相当する粗酵素液を用い
て、30℃、24時間反応させた。反応生成物の分析
は実施例１と同様にして行なつた。24時間反応
後、Ｎ−アセチル−Ｄ−バリンの90％がＤ−バリ
ンに転換した。一方のＮ−アセチル−Ｌ−バリン
は48.6％がＬ−バリンに転換した。キラルモビー
ルフエイズ法での分析結果を第２図に示した。 実施例 ２ 実施例１と同様の栄養培地で変異株０−33株を
培養し、同様の操作で粗酵素液を得た。0.05Mの
Ｎ−アセチル−DL−フエニルグリシンを基質と
して培養液１mlに相当する粗酵素液を用いて30
℃、24時間反応させた。反応生成物の分析は実施
例１と同様にして行なつた。24時間反応後、Ｎ−
アセチル−Ｄ−フエニルグリシンの100％がＤ−
フエニルグリシンに転換していた。一方、Ｎ−ア
セチル−Ｌ−フエニルグリシンは全く反応しなか
つた。 比較例 ２ 比較例１と同様にして粗酵素液を得た。0.05M
のＮ−アセチル−DL−フエニルグリシンを基質
として培養液１mlに相当する粗酵素液を用いて30
℃、24時間反応させた。反応生成物の分析は実施
例１と同様にしておこなつた。24時間反応後、Ｎ
−アセチル−Ｄ−フエニルグリシンの84.8％がＤ
−フエニルグリシンに転換した。一方、Ｎ−アセ
チル−Ｌ−フエニルグリシンは13.3％がＬ−フエ
ニルグリシンに転換した。 実施例 ３ 実施例１で示した栄養培地で変異株０−33株を
培養し、菌体を集めた。さらに、この菌体を十分
洗浄した後、0.05MのＮ−アセチル−DL−バリ
ンを基質に、培養液１mlに相当する菌体懸濁液を
用いて30℃で酵素反応させた。10時間反応後、Ｎ
−アセチル−Ｄ−バリンの86％がＤ−バリンに転
換した。一方、Ｎ−アセチル−Ｌ−バリンは全く
反応しなかつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られた酵素反応液の、
HPLCによる分析のクロマトグラムを示したもの
である。第２図は比較例１で得られた酵素反応液
の、HPLCによる分析のクロマトグラムを示した
ものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ストレプトミセス属に属し、Ｌ−アミノアシ
   ラーゼ生産能が実質的に欠損し、かつＤ−アミノ
   アシラーゼ生産能を有する微生物を栄養培地中で
   培養し、Ｄ−アミノアシラーゼを生成・採取する
   ことを特徴とするＤ−アミノアシラーゼの製造
   法。