JPH02219587A - トリペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トリペプチドは、例えば視床下部ホルモノコ９ナドレリ
ンおよびその類似体のような生活性ペプチドの合成にお
ける重要な中間体である。このために、）リベプチドは
一方においては良好な収率でそして他方においては高純
度で、本つとも端的な方法で入手されなければならない
。

トリペプチドの製造についてこれまで開示された方法は
、最適のやり方で４これらの条件を満足せずそして重大
な不利点を有している。すなわち、例えは、ＥＰ−Ａ　
１５へ２８０１Ｃ記載されている方法により製造された
生成物は、副生成物により不純化さｈており、これは次
の合成工程において明らかに不利となる。本発明の目的
は、上述した不利点を有しておらずそして端的な方法で
艮好な収率で高純度の生成物を与えるトリペプチドの製
造方法を提供せんとするものである。

従って、本発明は、プロピルホスホン酸無水物（Ｐｒｏ
ｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒｉｄｅ　）
の存在下において一般式■ Ｕ’−Ｂ　−ＯＨＩＩ （式中、ｖ’ｔｔ水素添加分解により除去できるウレタ
ン保護基でありそしてＢＦｉ後述するｔ義を有す）の化
合物を一般式ｍ Ｈ−Ｃ−ＯＲＩ （式中、Ｒａ１〜４個の炭素原子を有するアルキルを示
しセしてＣは後述する意義を有す）の化合物と反応させ
、水素添加分解によって保護基ＵＩを除去し、一般式■ Ｈ−Ｂ−Ｃ−ＯＲＮ の得しれた化合物を、プロピルホスホン酸無水物の存在
下において、一般式■ Ｕ−Ａ−ＯＨＶ の化合物と反応させ、そして最後＆ＣＲを酵素的に除去
することからなる一般式Ｉ Ｕ−Ａ−Ｂ−Ｃ−ＯＨＩ （式中、Ｕｔｌ水素またはウレタン保護基を示し、Ａは
天然α−アミノ酸またはその誘導体を示し、ＢＦｉ天然
α−アミノ酸またはその誘導体を示しそしてＣＦｉ芳香
族α−アミノ酸を示す）のトリペプチドの製造方法に関
するものである。

Ｕが示すウレタン保護基は、好ましくは例えばＫｏｎｔ
ａ）ｃｔｅ　Ｍｅｒｃｋ　３／７９．１４頁に記載され
ているようなペプチド化学において慣用されているウレ
タン保護基である。

ベンジルオキシカルボニルおよび第３プチルオキシカル
ゴニル基が特ＫｔＦｆましい。

水素添加分解により除去できるウレタン保護基Ｕ／は、
好ましくはベンジルオキシカルがニル基である。

Ａおよび（または）Ｂが示す天然α−アミノ酸またはそ
の誘導体は好ましくは、Ｇｌｙ　、　Ａｌａ　。

８ｅｒ　、　Ｔｈｒ　、　Ｖａｌ、Ｌｅｕ　、　ＩＩｓ
　、　Ｇｌｕ　、　Ｇｉｎ　。

ｐ−Ｇ１１１％Ｔｙｒ、Ｐｈｅ％Ｔｘ”ｐおよびＨｌｓ
である。

Ｓｅｒ　、　Ｔｈｒ　、　ＴｒｐおよびＰｈｅが特に好
ましい。

Ｃが示す芳香族α−アミノ酸は、好ましくはＴｙｒまた
１ｊＰｈｅである。

一般式■中のＲは、好ましくはメチルを示す。

ＵおよヒＵ′がベンジルオキシカルビニルを示し、Ａが
Ｔｒｐを示し、ＢがＢｏｘを示し、ＣがＴｙｒを示しそ
してＲがメチルを示す方法が、非常に特に好ましい。

プロピルホスホン酸無水物の存在下におけるペプチド結
合の形成は、ＰＰＡ法として知られている（　ＡｘＪｇ
ｅｗ、　Ｃｈｅｍ、　Ｉｎｔ、　Ｂｄ、　１９．１３３
（１９８０））。

この反応は、好ましくは極性溶剤例えばジメチルアセト
アミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド
、燐酸トリス（ジメチルアミド）、Ｎ−メチルピロリｒ
ｙｔたは水中において実施される。しかしながら、クロ
ロホルム、塩化メチレンまたは酢酸エチルもまた使用さ
れる。また、水と上記溶剤との混合物も有利な方法で使
用することができる。酢酸エチル／水混合物が特に好ま
しい０合成は、−１０℃と室温との間で実施する仁とが
できる。約０℃で開始しそして次に室温に上昇さぜるこ
とが好ましい。

水素添加分解によるＵ’ｉｌｌ基の除去は、Ｐｄ／Ｃ触
媒上で水素を使用して既知方法で有利に実施される。

最後の反応工程における酵素的エステロリシスは、好ま
しくはトリプシンおよび（または）キモトリプシンを使
用して実施される（　Ｈｏｐｐｅ　−８ｅｙｌｅｒａ　
Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ　ｆ−ＴｌｈＹｌｉｌｌｏｌ、
Ｃｈｅｍｉｅ　　５５６ｍ２４Ｂ（１９６４））。トリ
プシンが特に好ましい。適当である場合は、例えばＥｐ
−ｘ　１７８，５５５　に記載されているように支持体
上に既知方法により固定［７た酵素を、使用することも
できる。この場合においては、酵素は基質の量に関して
０．０１〜２０１ｒＪ１％の量で有利に使用される。酵
素の２重量係の量が特に好ましい。

使用することのできる溶剤の例は、水、ジメチルホルム
アミド、メタノール、エタノール、イソプロノ臂ノール
、ブタノール、酢′酸エチル、酢酸ブチル、トルエンま
たは塩化メチレンである。酢酸エチル／水混合物が好ま
しい。温度は有利に＃：ｔＯ〜６０℃の間にある。２０
〜３５℃の範囲の温度が好ましい。反応媒質のＰＦＩ＃
′ｊ：、好ましくＩ／ｉ４〜１００間、特に好ましくは
４〜８の間の範ＩｔｌＫある。

本発明による方法は、それぞれの中間体を単離するよう
な方法で実施することができる。しかしながら、反応は
、好ましくは１−ポット方法で、換言すれば中間体を単
離することなしに実施される。一般式…、■およびＶの
出発化合物は、既知でありそして常用の方法により得る
ことができる。

驚くべきことには、本発明による方法は、高度な化学的
および光学的純度の生成物を与える。

このものは困難なしに更に合成に使用することができる
。同様に収率もすぐれておシそして使用した一般式ｍの
化合物の量を基にして４０〜５０鳴の間にある。

特Ｋｊｌ＜べきことＫＦｉ、本発明の方法は、純度およ
び収率の両方の点において、３工程のみからなるＢＰ−
Ａ　１５４２８０の方法に比較して顕著にすぐれている
。

実施例 Ｚ−Ｔｒｐ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−ＯＨ （ｍｌ　水３５０１を、２！の攪拌装置中に入れそして
Ｚ−８ｅｒ−ＯＨ４７，８？　（０，２００モル）、Ｈ
−Ｔｙｒ−ＯＭｅ　ｘ　ＨＣｌ　４６．４　？　（０，
２００モル）および塩化ナトリウム１５０ｔを導入する
。また、酢酸エチル７００ｄを加えそしてすべての物質
が溶解した後に、混合物の−をＮ−エチルモルホリン約
２５−の添加によって５．０に調整する。最高３０℃（
終りに若干冷却する）で約３０分のＰＰＡ溶液［Ｗ（Ｐ
ＰＡ）　＝５０　％　）約２２０　Ｍｌ　（０，４２モ
ル）の添加中、Ｎ−エチルモルホリン約１１０１（０８
６モル）をＰＨｓ、　ｏにおいてｐＨ−５ｔａｔポンプ
によシ加える。沈澱が反応混合物中で形成したときに、
ＰＰＡ添加を終了する。次Ｋ、沈澱を水３５０１１ｔの
添加により再溶解する。水性相を分離漏斗中で分離しそ
して次にエステル相を酸性硫酸カリウム溶液〔Ｗ（ＫＨ
ＳＯ３）＝１０係）７００１ｔおよび重炭酸ナトリウム
溶液Ｌ　Ｗ（ＮａＨＣＯ５）＝５％〕７００ｄで洗浄す
る。反応混合物からの水性相および洗液相は捨てる。

（ｔ）ｌ　　第１のカップリングからのエステル相約７
ＱＱｉｌ、水２００−およびパラジウム炭素（Ｗ（Ｐ（
１）　＝　２．５％）３．３Ｆを、２！の攪拌装置中に
入れそして水素の流れを２５〜３０℃で通す。反応中、
−を−−５ｔａｔボンゾおよび塩酸（Ｃ（ＨＣｔ）＝１
モル／！〕　　約１６１１ｊ（α１６モル）の添加によ
り４．０ＫＭ持する。反応の完了（塩酸が本はや消費さ
れなくなったとき）（約３０分）後、反応混合物を吸引
漏斗によって濾過しそして水性相を分離漏斗中でエステ
ル相から分離する。

エステル相は捨てる。

（ｃ）　　水素添加分解からの水性相約４６０１および
酢酸エチル７００−を、２！の攪拌装置忙入れそしてＺ
−Ｔｒｐ−ＯＨ５０，７ｔ　（０，１５モル）および塩
化ナトリウム１２５ｆを加える。すべての物質が溶解し
た後に、ＰＨをＮ−エチルモルホリン約１９１で５．　
ＯＫ調整する。最高３０℃（終シに若干冷却する）で約
３０分のＰＰＡｆ＃液（Ｗ　（ＰＰＡ）；５０優〕約２
２（１／（０，４２モル）の添加中、Ｎ−エチルモルホ
リンＩＮ１０ｍ（０，８６モル）ヲｐ）ｉ　５．　Ｏに
おいて−−５ｔａｔポンプにより加える。　ＰＰＡ添加
は、沈澱が反応混合物中で形成したときに終了する６次
に、沈澱を水３５０ｄの添加により再溶塀する。水性相
を分離漏斗中において分離しそして次にエステル相を、
酸性硫酸カリウム溶液（Ｗ（ＫＨＳＯ３）　＝　１０嗟
〕７００νおよび重炭酸ナトリウム溶液（Ｗ（ＮａＨＣ
Ｏｓ）　＝５　優）　７００−ずつで数回、Ｚ−’Ｉ’
τｐ−ＯＨが完全に除去（’ｊ’ＬＣ’分析により）さ
れるまで洗浄する。反応混合物からの水性相および洗液
相は捨てる。

（ｄ）　　第２のカップリングからのエステル相約７０
０１１１！！および水７００１を、２！の攪拌装置に入
れそして６５〜４０℃に加熱しそして初期にトリプシン
１ｔを加える。反応は直ぐに開始するそしてその間、−
を水酸化す）　ＩＪウム溶液（Ｃ（ＮａＯＨ）　＝　１
モル／！〕約１１０１１１４（０，１１モル）でＰＨ７
，ＯＫ一定に維持する。反応は約７時間持続し、そして
この間、速度を更にトリプシン０．５２を添加すること
により増大させる。トリプシン添加が水酸化ナトリウム
溶液の吸収速度の僅かな増大のみをひき起す場合または
ＴＬＣ分析が出発物質の残留を示さない場合に１反応は
完了する。反応溶液を吸引漏斗に↓シ清浄化しそしてエ
ステル相を分離漏斗中に、おいて水性相から分離する。

エステル相を捨てる。

はじめに水性相を、毎回酢酸エチル７００１を使用して
、燐酸二水素カリウム４．０２の添加および溶解により
ｐＨ５，８〜６．０で２回珈盪することにより抽出する
。エステル相を捨てる。次ｋ。

水性相を毎回酢酸エチル７００　ｔｎｌを使用して、氷
酢酸的５１Ｌｔの添加により調整しｆｃｐＨ５，０で３
回振盪することにより抽出する。水性相を捨てる。エス
テル相はトリペプチドを含有している。

このエステル相を真空蒸発乾固してゆるく固まった結晶
の形態でトリペプチドを得る。この生成物を４０℃の真
空かま中で乾燥する。

重量：５１．２ｆ 収率：　Ｈ−Ｔｙｒ−ＯＭｅ　Ｘ　ＨＣｔを基にして４
２．０１純１１ｆ　：　９８．２　’４　（ＨＰＬＣＬ
ｉＣｈｒｏｓｏｒｂ　Ｓｉ　６０／ペプチド駿衝液で測
定） 比較実施例 Ｚ−Ｔｒｐ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−ＯＨを、ＢＰ−Ａ　Ｉ　
５６，２８０に記載された方法により展進した。

収率：３０ｓ 純１　：　７８．８　％　（ＨＰＬＣＬｌｃｈｒｏｓｏ
ｒｂ　ｓｉ　６０／ペツチド緩衝液で測定）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）プロピルホスホン酸無水物の存在下において式II Ｕ′−Ｂ−ＯＨ　II （式中、Ｕ′は水素添加分解により除去できるウレタン
   保護基でありそしてＢは後述する意義を有す）の化合物
   を式III Ｈ−Ｃ−ＯＲ　III　 （式中、Ｒは１〜４個の炭素原子を有するアルキルを示
   しそしてＣは後述する意義を有す）の化合物と反応させ
   、水素添加分解によつて保護基Ｕ′を除去し、式IV Ｈ−Ｂ−Ｃ−ＯＲ　IV　 の得られた化合物を、プロピルホスホン酸無水物の存在
   下において、式Ｖ Ｕ−Ａ−ＯＨ　Ｖ の化合物と反応させ、そして最後にＲを酵素的に除去す
   ることからなる一般式 I Ｕ−Ａ−Ｂ−Ｃ−ＯＨ　 I （式中、Ｕは水素またはウレタン保護基を示し、Ａは天
   然α−アミノ酸またはその誘導体を示し、Ｂは天然α−
   アミノ酸またはその誘導体を示しそしてＣは芳香族α−
   アミノ酸を示す）のトリペプチドの製造方法。 ２）Ｕがベンジルオキシカルボニルまたは第３ブチルオ
   キシカルボニルを示す請求項１記載の方法。 ３）Ａおよび（または）Ｂが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ
   、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、
   ｐ−Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＨｉｓを示
   す請求項１および（または）２記載の方法。 ４）Ａおよび（または）ＢがＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐま
   たはＰｈｅを示す請求項１〜３の何れかの項記載の方法
   。 ５）ＣがＴｙｒまたはＰｈｅを示す請求項１〜４の何れ
   かの項記載の方法。 ６）Ｕ′がベンジルオキシカルボニルを示す請求項１〜
   ５の何れかの項記載の方法。 ７）Ｒがメチルを示す請求項１〜６の何れかの項記載の
   方法。 ８）反応を酢酸エチル／水混合物中でプロピルホスホン
   酸無水物の存在下において実施する請求項１〜７の何れ
   かの項記載の方法。 ９）酵素エステロリシスをトリプシンおよび（または）
   α−キモトリプシンを使用して実施する請求項１〜８の
   何れかの項記載の方法。 １０）ＵおよびＵ′がベンジルオキシカルボニルを示し
   、ＡがＴｒｐを示し、ＢがＳｅｒを示し、ＣがＴｙｒを
   示しそしてＲかメチルを示す請求項１〜９の何れかの項
   記載の方法。