JPH02222696A - 蛋白質の産生方法 - Google Patents
蛋白質の産生方法Info
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- JPH02222696A JPH02222696A JP1042166A JP4216689A JPH02222696A JP H02222696 A JPH02222696 A JP H02222696A JP 1042166 A JP1042166 A JP 1042166A JP 4216689 A JP4216689 A JP 4216689A JP H02222696 A JPH02222696 A JP H02222696A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- inhibitor
- cells
- protease
- medium
- serum
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- Granted
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞
またはヒト肝細胞を宿主細胞とする形質転換体を無血清
或いは低濃度血清培地中で培養して、目的とする蛋白質
を産生ずる方法に関するものである。
またはヒト肝細胞を宿主細胞とする形質転換体を無血清
或いは低濃度血清培地中で培養して、目的とする蛋白質
を産生ずる方法に関するものである。
（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点）／
近年、組換えＤＮＡ含有細胞や細胞融合体等を培養して
、該構造遺伝子を発現させ蛋白質を産生させる方法が実
施されている。そして、構造遺伝子が動物由来のもので
ある場合、天然によシ近い蛋白質を得るために宿主細胞
として動物細胞を使用する例が増えている。
、該構造遺伝子を発現させ蛋白質を産生させる方法が実
施されている。そして、構造遺伝子が動物由来のもので
ある場合、天然によシ近い蛋白質を得るために宿主細胞
として動物細胞を使用する例が増えている。
従来、動物細胞培養物から目的物を取得する場合、動物
細胞の増殖が未だ行われている段階で培養を止めて、得
られる培養物から目的物を取得する方法が一般的である
。
細胞の増殖が未だ行われている段階で培養を止めて、得
られる培養物から目的物を取得する方法が一般的である
。
そのため、培養液中には動物細胞の増殖に必要な血清が
約５〜１０（１）程度経験的に添加されている。従って
、培養物中には血清由来の蛋白質が混在することとなシ
、目的とする蛋白質を精製するのに手間がかかるという
問題点があった。
約５〜１０（１）程度経験的に添加されている。従って
、培養物中には血清由来の蛋白質が混在することとなシ
、目的とする蛋白質を精製するのに手間がかかるという
問題点があった。
本発明者らは、ＣＨＯ細胞及びヒト肝細胞を宿主細胞と
して無血清培地或いは低濃度血清培地で培養して目的物
を産生させることを試みた。
して無血清培地或いは低濃度血清培地で培養して目的物
を産生させることを試みた。
しかしながら、一定時間培養を行うと、経時的に目的物
の生産量が減少した。本発明者らの検討によれば、それ
は宿主細胞由来のセリンプロテアーゼ等の分泌プロテア
ーゼ又は死細胞よシ漏出したプロテアーゼ等によって目
的蛋白質が分解されることがその一因であることが分っ
た。
の生産量が減少した。本発明者らの検討によれば、それ
は宿主細胞由来のセリンプロテアーゼ等の分泌プロテア
ーゼ又は死細胞よシ漏出したプロテアーゼ等によって目
的蛋白質が分解されることがその一因であることが分っ
た。
ｃ問題点を解決するための手段）
そこで、本発明者らは、種々のプロテアーゼ阻害剤を存
在させて培養する方法を種々検討した結果、特定の所謂
Ｃ／インヒビター（Ｍｅｔｈｏｄｓン Ｅｎｚｙｍｏｌ 、、（メ７ツズ イン エンザイモロ
ジー）ざ０，１ＩＪ−Ｉ−ダｊ （／りｒ／）〕を存
在させることによって所期の目的が達成されることを知
得し、本発明を完成するに至った。
在させて培養する方法を種々検討した結果、特定の所謂
Ｃ／インヒビター（Ｍｅｔｈｏｄｓン Ｅｎｚｙｍｏｌ 、、（メ７ツズ イン エンザイモロ
ジー）ざ０，１ＩＪ−Ｉ−ダｊ （／りｒ／）〕を存
在させることによって所期の目的が達成されることを知
得し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明の要旨は、蛋白質をコードする構造遺伝子
を含むＤＮＡを導入して形質転換されたチャイニーズハ
ムスター卵巣細胞又はヒト肝細胞を培養して該構造遺伝
子を発現させ、該蛋白質を産生させる方法において、細
胞培養を無血清培地又は低濃度血清培地中Ｃ／インヒビ
ター又はＣ／インヒビター様グロテアーゼ阻害剤の存在
下に行うことを特徴とする蛋白質の産生方法に存する。
を含むＤＮＡを導入して形質転換されたチャイニーズハ
ムスター卵巣細胞又はヒト肝細胞を培養して該構造遺伝
子を発現させ、該蛋白質を産生させる方法において、細
胞培養を無血清培地又は低濃度血清培地中Ｃ／インヒビ
ター又はＣ／インヒビター様グロテアーゼ阻害剤の存在
下に行うことを特徴とする蛋白質の産生方法に存する。
以下本発明を説明するに、本発明で使用する宿主細胞は
、チャイニーズノ・ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はヒ
ト肝細胞であり、それらの公知のいずれの細胞株も使用
することができる。
、チャイニーズノ・ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はヒ
ト肝細胞であり、それらの公知のいずれの細胞株も使用
することができる。
具体的には、例えば、ＣＨＯＫｌ （Ｊ 、Ｅｘｐ、Ｍ
ｅｄ 、 。
ｅｄ 、 。
（ジャーナル オブ イクスペリメンタル メディシン
）。
）。
ｉｏｒ 、りＩＩ！ （ｔ ’？！Ｉ ）］％ＣＨＯｄ
ｈｆｒ−（Ｐｒｏｃ。
ｈｆｒ−（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ Ｃプロシーデ
ィングスオブ ザ ナショナル アカデミ−オプ サイ
エンシズ オプ ザ ニーニスニー）７７、弘２／ｌ−
４１２２０（ｉｙｒｏ）’３ を代表とするＣＨＯ由
来変異株〔蛋白質核酸ｆＲ，素、 ２７，６１７−１２
（／Ｐ１２））、ヒト肝（癌）由来細胞株ＮｕＥ、 Ｋ
Ｎ［Ｃａｎ、Ｒａｓ、。
ィングスオブ ザ ナショナル アカデミ−オプ サイ
エンシズ オプ ザ ニーニスニー）７７、弘２／ｌ−
４１２２０（ｉｙｒｏ）’３ を代表とするＣＨＯ由
来変異株〔蛋白質核酸ｆＲ，素、 ２７，６１７−１２
（／Ｐ１２））、ヒト肝（癌）由来細胞株ＮｕＥ、 Ｋ
Ｎ［Ｃａｎ、Ｒａｓ、。
（ｌり７４） 〕、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣｃａｔ、Ｎ
ｏ、 ＨＢｒｏｔｓ）等が挙げられる。
ｏ、 ＨＢｒｏｔｓ）等が挙げられる。
本発明の宿主細胞を形質転換する方法は特に制限される
ものでなく、公知の組換えＤＮＡ技術或いは細胞融合法
により、目的の構造遺伝子を含むＤＮＡを宿主細胞中に
導入することができる。
ものでなく、公知の組換えＤＮＡ技術或いは細胞融合法
により、目的の構造遺伝子を含むＤＮＡを宿主細胞中に
導入することができる。
該構造遺伝子としては、セリンプロテアーゼで分解され
るアミノ酸配列を有するアポリポプロティンＥ等の遺伝
子、或いはＣ１ｒ、Ｃ３Ｓ１Ｃ４、Ｃ２等の各補体成分
等の遺伝子を特に有利に使用し得るが、その他ヒト血漿
蛋白質、各種蛋白性ホルモン、成長因子、ウィルス抗原
、リセブター等の公知の種々の遺伝子発現にも使用する
ことができる。
るアミノ酸配列を有するアポリポプロティンＥ等の遺伝
子、或いはＣ１ｒ、Ｃ３Ｓ１Ｃ４、Ｃ２等の各補体成分
等の遺伝子を特に有利に使用し得るが、その他ヒト血漿
蛋白質、各種蛋白性ホルモン、成長因子、ウィルス抗原
、リセブター等の公知の種々の遺伝子発現にも使用する
ことができる。
上記構造遺伝子を、例えば、プラスミドｐＫＣＲＨ−２
Ｃ特開昭Ａ／−２１１タタＯ号公報〕等に組込んで得ら
れる発現ベクターを、常法に従って宿主細胞に導入した
り、或いはヒト肝細胞株又はハムスター由来細胞株と目
的とする遺伝子を含む異種動物細胞、特にヒトの各臓器
の細胞を常法に従って融合することによって、その各臓
器に存在する目的遺伝子を導入して形質転換する。
Ｃ特開昭Ａ／−２１１タタＯ号公報〕等に組込んで得ら
れる発現ベクターを、常法に従って宿主細胞に導入した
り、或いはヒト肝細胞株又はハムスター由来細胞株と目
的とする遺伝子を含む異種動物細胞、特にヒトの各臓器
の細胞を常法に従って融合することによって、その各臓
器に存在する目的遺伝子を導入して形質転換する。
上記の様にして得られる形質転換体の培養は、ＣＨＯ細
胞又はヒト肝細胞の生存維持に必要な栄養分を含む基本
合成培地中で、特定のプロテアーゼ阻害剤、即ち、Ｃ／
インヒビター又はＣ／インヒビター様グロテアーゼ阻害
剤の存在下に行う。
胞又はヒト肝細胞の生存維持に必要な栄養分を含む基本
合成培地中で、特定のプロテアーゼ阻害剤、即ち、Ｃ／
インヒビター又はＣ／インヒビター様グロテアーゼ阻害
剤の存在下に行う。
基本合成培地としては、アミノ酸、糖類、ビタミン類、
無機塩類を主成分とし、その他者種核酸、補酵素、蛋白
質加水分解物等を含む培地で、具体的には、例えばｅＲ
ＤＦ（極東製薬社製）： Ｈａｒｌｔｓ Ｆ／ ０、Ｆ
１２、Ｆ ／ ２−Ｍ％Ｆ −／ ２ Ｋ ；Ｐｕｃｋ
ｌｏ−１０，ｊ−１０；ＲＰＭＩ ／１．ＯＪ、／ ４
３０゜／ｌ、３１１、／ ｔ ｕＯ；５ｗ１ｒｎ ６７
−Ｇ ； Ｔｒｏｗｅｌｌ Ｔｒ； ５ｃｈｎｅｉｄｅ
ｒ ； ＭＢ ７ Ｊ’コアｔ、７ｏｓ；Ｗｉ ｌｌｉ
ａｍ Ｄ、 Ｅ ； Ｆｉｓｈｅｒ； ＮＣＴＣ／ Ｊ
ｊ ；０ｖｉＲＬ１０１、ｔ ；Ａ２＋ＡＤＧ ；
ＩＭＤＭ；ＤＭＥ； Ｌ−／ ０゜−／ ｒ ； Ｍ
ＣＣ０’ｙｊａ ； ／タタ；ＭＥＭ；ＢＭＥＭ；
α−ＭＥＭ （以上ギプコ社製）：ラクトアルブミン分
解物培地（シグマ社製）等が挙げられる。
無機塩類を主成分とし、その他者種核酸、補酵素、蛋白
質加水分解物等を含む培地で、具体的には、例えばｅＲ
ＤＦ（極東製薬社製）： Ｈａｒｌｔｓ Ｆ／ ０、Ｆ
１２、Ｆ ／ ２−Ｍ％Ｆ −／ ２ Ｋ ；Ｐｕｃｋ
ｌｏ−１０，ｊ−１０；ＲＰＭＩ ／１．ＯＪ、／ ４
３０゜／ｌ、３１１、／ ｔ ｕＯ；５ｗ１ｒｎ ６７
−Ｇ ； Ｔｒｏｗｅｌｌ Ｔｒ； ５ｃｈｎｅｉｄｅ
ｒ ； ＭＢ ７ Ｊ’コアｔ、７ｏｓ；Ｗｉ ｌｌｉ
ａｍ Ｄ、 Ｅ ； Ｆｉｓｈｅｒ； ＮＣＴＣ／ Ｊ
ｊ ；０ｖｉＲＬ１０１、ｔ ；Ａ２＋ＡＤＧ ；
ＩＭＤＭ；ＤＭＥ； Ｌ−／ ０゜−／ ｒ ； Ｍ
ＣＣ０’ｙｊａ ； ／タタ；ＭＥＭ；ＢＭＥＭ；
α−ＭＥＭ （以上ギプコ社製）：ラクトアルブミン分
解物培地（シグマ社製）等が挙げられる。
本発明で使用するプロテアーゼ阻害剤としては、Ｃ／イ
ンヒビター又はＣ／インヒビター様の活性を有する種々
のプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。例えば、（ａ）牛
胎児血清由来プロテアーゼ阻害剤、即ち牛胎児血清中に
通常夕０〜ｉｏｏ■／！の濃度で存在し、５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）のＮ
末端のアミノ酸配列が、Ｎ −Ａ ｓ ｐ ａｇｅ ｔ
ａＩｌｅ＊ＶａｌａＧｌｙｅＰｒｏ＊Ｇｌｙ＊Ｐｒｏ
＊Ｇｌｙ＊ＡｓｐｓＧｌｙ＊Ｇｌｎ・Ｓｅｒ である
プロテアーゼ阻害剤〔なお、このプロテアーゼ阻害剤は
、牛胎児血清から精製することができる。例えば、まず
牛胎児血清をａｏ−ｔｏ％飽和硫酸アンモニウム溶液で
塩析し、次にこれを２倍に希釈したダルベツコＰＢＳ（
＋７７酸バッファ塩類液：以下、「ＰＢＳＪと略す）で
平衡化し、ヘパリンセファロースカラムまたはそれと同
等品に吸着させ、同１／２濃度のＰＢＳで洗浄後、ＰＢ
Ｓで溶出する。次にＰＢＳ溶出画分をノ＼イドロキシア
パタイトカラムにかけて、／（７ｍＭリン酸バッファｊ
ＯｍＭ塩化ナトリウムから３００ｍＭリン酸バッファ
ｊ ＯｍＭ塩化ナトリウムのグラジェントを用い電導度
λ、２ｍｈｏ（そ−）前後に溶出することによりさらに
精製することができる。
ンヒビター又はＣ／インヒビター様の活性を有する種々
のプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。例えば、（ａ）牛
胎児血清由来プロテアーゼ阻害剤、即ち牛胎児血清中に
通常夕０〜ｉｏｏ■／！の濃度で存在し、５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）のＮ
末端のアミノ酸配列が、Ｎ −Ａ ｓ ｐ ａｇｅ ｔ
ａＩｌｅ＊ＶａｌａＧｌｙｅＰｒｏ＊Ｇｌｙ＊Ｐｒｏ
＊Ｇｌｙ＊ＡｓｐｓＧｌｙ＊Ｇｌｎ・Ｓｅｒ である
プロテアーゼ阻害剤〔なお、このプロテアーゼ阻害剤は
、牛胎児血清から精製することができる。例えば、まず
牛胎児血清をａｏ−ｔｏ％飽和硫酸アンモニウム溶液で
塩析し、次にこれを２倍に希釈したダルベツコＰＢＳ（
＋７７酸バッファ塩類液：以下、「ＰＢＳＪと略す）で
平衡化し、ヘパリンセファロースカラムまたはそれと同
等品に吸着させ、同１／２濃度のＰＢＳで洗浄後、ＰＢ
Ｓで溶出する。次にＰＢＳ溶出画分をノ＼イドロキシア
パタイトカラムにかけて、／（７ｍＭリン酸バッファｊ
ＯｍＭ塩化ナトリウムから３００ｍＭリン酸バッファ
ｊ ＯｍＭ塩化ナトリウムのグラジェントを用い電導度
λ、２ｍｈｏ（そ−）前後に溶出することによりさらに
精製することができる。
また、サラにフェニルセファロースカラムにかけて、／
Ｍ硫酸アンモニウム１０ｍＭリン酸バッファから１０ｍ
Ｍリン酸バッファのグラジェントで溶出分画することに
より、最初のピークとして溶出される。本段階において
５Ｏ８−ＰＡＧＥで単一バンドにまで精製され、牛胎児
血清ｌ！より純品として数７００μ２以上が得られる。
Ｍ硫酸アンモニウム１０ｍＭリン酸バッファから１０ｍ
Ｍリン酸バッファのグラジェントで溶出分画することに
より、最初のピークとして溶出される。本段階において
５Ｏ８−ＰＡＧＥで単一バンドにまで精製され、牛胎児
血清ｌ！より純品として数７００μ２以上が得られる。
本発明においては、本プロテアーゼ阻害剤は部分精製品
でもよく、例えば上記ヘパリンセファロースカラムまで
精製したものであってもよい。）、（ｂ） 牛血清由
来Ｃ／インヒビター様グロテアーゼ阻害剤（（Ｂｉｏｃ
ｈｉｍｉ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。
でもよく、例えば上記ヘパリンセファロースカラムまで
精製したものであってもよい。）、（ｂ） 牛血清由
来Ｃ／インヒビター様グロテアーゼ阻害剤（（Ｂｉｏｃ
ｈｉｍｉ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。
Ａｃｔａ （バイオキミカ エバイオフィジカ アクタ
）、り２３．／６７−／７り（／りｒ７）に記載の方法
に従って得られる。〕、（Ｃ）牛血漿由来抗ファクター
Ｘ ＩＩ ａ阻害剤（Ｊ 、Ｂｉｏｌ、、Ｃｈｅｒｒ＋
、 （ジャーナル オプ バイオロジカル ケミスト
リイ ）、互互土、ｌコア／μ〜ｌコ７コ／（／り♂７
）に記載の方法に従って得られる。〕または（ｄ）ヒト
Ｃ／インヒビター（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、
（ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲイ
ション）己土、ｊり３−ｔｏ４ｔｃｉり７よ）に記載の
方法に従って得られる。〕等の蛋白性プロテアーゼ阻害
剤、或いは（ｅ）６−アミジツーコーナフチルｐ−グア
ニジノベ／シェードジメタンスルホ／酸塩（メシル酸ナ
ファモスタット）ロチアーゼ阻害剤等が挙げられる。
）、り２３．／６７−／７り（／りｒ７）に記載の方法
に従って得られる。〕、（Ｃ）牛血漿由来抗ファクター
Ｘ ＩＩ ａ阻害剤（Ｊ 、Ｂｉｏｌ、、Ｃｈｅｒｒ＋
、 （ジャーナル オプ バイオロジカル ケミスト
リイ ）、互互土、ｌコア／μ〜ｌコ７コ／（／り♂７
）に記載の方法に従って得られる。〕または（ｄ）ヒト
Ｃ／インヒビター（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、
（ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲイ
ション）己土、ｊり３−ｔｏ４ｔｃｉり７よ）に記載の
方法に従って得られる。〕等の蛋白性プロテアーゼ阻害
剤、或いは（ｅ）６−アミジツーコーナフチルｐ−グア
ニジノベ／シェードジメタンスルホ／酸塩（メシル酸ナ
ファモスタット）ロチアーゼ阻害剤等が挙げられる。
上記プロテアーゼ阻害剤は、使用する阻害剤の種類によ
り異なるが、例えば（ａｔ〜（５）の蛋白性プロテアー
ゼ阻害剤の場合は、培地中／Ｑ〜／、０００ ｎｇ／ｙ
ｘｌの範囲で使用し、（ｅ）及びｆｆ）の合成プロテア
ーゼ阻害剤の場合は、培地中それぞれ０．／−７ｍＭ及
び２〜３ｍＭの範囲で使用するのが好ましい。
り異なるが、例えば（ａｔ〜（５）の蛋白性プロテアー
ゼ阻害剤の場合は、培地中／Ｑ〜／、０００ ｎｇ／ｙ
ｘｌの範囲で使用し、（ｅ）及びｆｆ）の合成プロテア
ーゼ阻害剤の場合は、培地中それぞれ０．／−７ｍＭ及
び２〜３ｍＭの範囲で使用するのが好ましい。
本発明においては、目的蛋白質のＮＨに影響を与えない
程度、例えばｏ、ｒ％以下の牛胎児血清、新生仔牛血清
等の血清を培地中に添加してもよい。
程度、例えばｏ、ｒ％以下の牛胎児血清、新生仔牛血清
等の血清を培地中に添加してもよい。
培養法としては付着した状態でも浮遊化した状態でもよ
く、システムとしてもシャ・−レやフラスコを用いた培
養から、攪はん培養、エアーリフト培養、固定床培養装
置、流動床培養装置、ホローファイバー マイクロキャ
リアー マイクロカプセル培養等いずれの装置を用いて
も良い０ 培養開始時の播き込み細胞数を約／（７’Ｃｅ１ｌｓ／
ゴ以上とし、３７℃前後でｊ％００９雰囲気下に培養を
行う。播き込み後任意の時間まで増殖させた後、通常コ
ンフルエントな状態になった時期に、本発明のプロテア
ーゼ阻害剤を含む培地に換えて更に培養を続けると、目
的蛋白質が得られる。培養は目的蛋白質がインタクトな
状態の物質として最大となる時期まで続ける。
く、システムとしてもシャ・−レやフラスコを用いた培
養から、攪はん培養、エアーリフト培養、固定床培養装
置、流動床培養装置、ホローファイバー マイクロキャ
リアー マイクロカプセル培養等いずれの装置を用いて
も良い０ 培養開始時の播き込み細胞数を約／（７’Ｃｅ１ｌｓ／
ゴ以上とし、３７℃前後でｊ％００９雰囲気下に培養を
行う。播き込み後任意の時間まで増殖させた後、通常コ
ンフルエントな状態になった時期に、本発明のプロテア
ーゼ阻害剤を含む培地に換えて更に培養を続けると、目
的蛋白質が得られる。培養は目的蛋白質がインタクトな
状態の物質として最大となる時期まで続ける。
かくして得られる培養液からの目的の蛋白質の精製は、
常法に従い、塩析、イオン交換クロマトグラフィー 疎
水クロマトグラフィー ゲル濾過、アフィニティークロ
マトグラフィー液層分配、等電点沈殿、等電点電気泳動
、）・イドロキシアパタイトクロマトグラフィー 逆相
クロマトグラフィー等を適宜組合せて行えばよい０ （発明の効果） 本発明に従えば、培養中に目的蛋白質が分解され＃≠る
こ・とがないので生産性が向上（培地利用効率が向上）
し、しかも、血清由来の夾雑蛋白質及び目的蛋白質の分
解物等が殆んど含まれていないので目的蛋白質を容易に
精製できる。
常法に従い、塩析、イオン交換クロマトグラフィー 疎
水クロマトグラフィー ゲル濾過、アフィニティークロ
マトグラフィー液層分配、等電点沈殿、等電点電気泳動
、）・イドロキシアパタイトクロマトグラフィー 逆相
クロマトグラフィー等を適宜組合せて行えばよい０ （発明の効果） 本発明に従えば、培養中に目的蛋白質が分解され＃≠る
こ・とがないので生産性が向上（培地利用効率が向上）
し、しかも、血清由来の夾雑蛋白質及び目的蛋白質の分
解物等が殆んど含まれていないので目的蛋白質を容易に
精製できる。
（実施例）
以下に実施例を挙げて更に本発明を具体的に説明する。
実施例１
特開昭４／−２♂！タタＯ号公報の実施例／に記載され
た方法に従って作製されたアポリボプロティンＥ産生組
換えＣＨＯ細胞（３ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）をよ係
牛血清を含有するｅ−ＲＤＦ（ｐＨ７，４ｔ）培地ｊ
ｘｔｌ中、！％ＣＯ，雰囲気下、３７℃で培養増殖した
。培養約５日後、コンフルエントな状態に達した時点で
、各種プロテアーゼ阻害剤を含む無血清培地であるｅ
−ＲＤ Ｆ（ｐＨ７，弘±０．２）培地よｘｌに移し換
え、更に培養を続け、培養時間に対するアポリボプロテ
ィンＥの生産量を測定した。その結果を第１図に示シた
（なお、アポリボプロティンＥの生産量は、特開昭ｔ／
−２♂ｊタタＯ号公報の実施例１に記載の方法及び５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥによって調べた。）。
た方法に従って作製されたアポリボプロティンＥ産生組
換えＣＨＯ細胞（３ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）をよ係
牛血清を含有するｅ−ＲＤＦ（ｐＨ７，４ｔ）培地ｊ
ｘｔｌ中、！％ＣＯ，雰囲気下、３７℃で培養増殖した
。培養約５日後、コンフルエントな状態に達した時点で
、各種プロテアーゼ阻害剤を含む無血清培地であるｅ
−ＲＤ Ｆ（ｐＨ７，弘±０．２）培地よｘｌに移し換
え、更に培養を続け、培養時間に対するアポリボプロテ
ィンＥの生産量を測定した。その結果を第１図に示シた
（なお、アポリボプロティンＥの生産量は、特開昭ｔ／
−２♂ｊタタＯ号公報の実施例１に記載の方法及び５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥによって調べた。）。
第１図から明らかなように５本発明の方法に従い、プロ
テアーゼ阻害剤を含む培地で培養することによりアポリ
ボプロティンＥの生産量が増大する。
テアーゼ阻害剤を含む培地で培養することによりアポリ
ボプロティンＥの生産量が増大する。
第１図は、アポリボプロティンＥ産生組換えＣＨＯ細胞
をグロテアーゼ阻害剤含有培地で培養した時のアポリボ
プロティンＥ生産の経時変化を表わす図である。なお、
図中の記号の表わす意味は以下の通９である。 ０−Ｏ： プロテアーゼ阻害剤無添加 （コントロール） Δ−咄： 牛胎児血清由来プロテアーゼ阻害剤（前記（
ａ） ） ／ ！Ｏｎｇ／ｍｅ口）−（コニ ・−一・： ム ： ★ ： 牛胎児血清由来プロテアーゼ阻害 剤（前記（ａ） ） Ｊ 、ｒ Ｏｒｌ ｇ ／ Ｒ１
同 上 ｊｏｏ ロｇ ／ ｍ／ベンズアミジン
ＪｍＭ メシル酸ナファスタット ０、／ ／ ｍＭ
をグロテアーゼ阻害剤含有培地で培養した時のアポリボ
プロティンＥ生産の経時変化を表わす図である。なお、
図中の記号の表わす意味は以下の通９である。 ０−Ｏ： プロテアーゼ阻害剤無添加 （コントロール） Δ−咄： 牛胎児血清由来プロテアーゼ阻害剤（前記（
ａ） ） ／ ！Ｏｎｇ／ｍｅ口）−（コニ ・−一・： ム ： ★ ： 牛胎児血清由来プロテアーゼ阻害 剤（前記（ａ） ） Ｊ 、ｒ Ｏｒｌ ｇ ／ Ｒ１
同 上 ｊｏｏ ロｇ ／ ｍ／ベンズアミジン
ＪｍＭ メシル酸ナファスタット ０、／ ／ ｍＭ
Claims (1)
- （１）蛋白質をコードする構造遺伝子を含むＤＮＡで形
質転換されたチャイニーズハムスター卵巣細胞又はヒト
肝細胞を培養して該構造遺伝子を発現させ、該蛋白質を
産生させる方法において、細胞培養を無血清地又は低濃
度血清培地中、Ｃ／インヒビター又はＣ／インヒビター
様プロテアーゼ阻害剤の存在下に行うことを特徴とする
蛋白質の産生方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1042166A JP2751325B2 (ja) | 1989-02-22 | 1989-02-22 | 蛋白質の産生方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1042166A JP2751325B2 (ja) | 1989-02-22 | 1989-02-22 | 蛋白質の産生方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02222696A true JPH02222696A (ja) | 1990-09-05 |
| JP2751325B2 JP2751325B2 (ja) | 1998-05-18 |
Family
ID=12628382
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1042166A Expired - Fee Related JP2751325B2 (ja) | 1989-02-22 | 1989-02-22 | 蛋白質の産生方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2751325B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0600875A4 (en) * | 1991-06-26 | 1995-01-25 | Bio Technology General Corp | CLEANING RECOMBINANT APOLIPOPROTEINS-E FROM BACTERIA. |
| EP1247865A2 (en) | 1990-10-17 | 2002-10-09 | The Wellcome Foundation Limited | Antibody for use in therapy |
-
1989
- 1989-02-22 JP JP1042166A patent/JP2751325B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1247865A2 (en) | 1990-10-17 | 2002-10-09 | The Wellcome Foundation Limited | Antibody for use in therapy |
| EP1247865B1 (en) * | 1990-10-17 | 2005-06-15 | The Wellcome Foundation Limited | Antibody for use in therapy |
| EP0600875A4 (en) * | 1991-06-26 | 1995-01-25 | Bio Technology General Corp | CLEANING RECOMBINANT APOLIPOPROTEINS-E FROM BACTERIA. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2751325B2 (ja) | 1998-05-18 |
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