JPH0222297A - 新規な糖蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、補体による細胞膜障害を抑制する作用を有す
る新規な糖蛋白質に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする問題点〕

補体は、血液及び体液中に存在する一群のグロテアーゼ
を含む反応系である。生体への異物／ 食を促したり、或いは異物の溶解を引きおこし、異物排
除に積極的に働く。また、補体の活性化の過程で生ずる
補体成分の種々のペプチド断片は、リンパ球を活性化し
たり、好中球を遊走したり、肥満細胞の脱顆粒を促す等
種々の細胞に作用し、多彩な免疫反応及び炎症反応に関
与している。

補体は異物には速やかに反応するが、自己の正常細胞上
では補体の活性化が進行しない。しかし、例えば慢性関
節リウマチ、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎等の
疾患の炎症部位では、補体があたかも自己の組織を異物
として認或いは該細胞膜を溶解する等の細胞障害を及ぼ
し、炎症反応を増悪させていると考えられている。

ａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ　（ＤＡ　Ｆ　）　　（Ｊ、　
Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、＋ヱノ１゜／　３“Δ　ざ−７！；
７．Ｊ’（／９ざグ　）〕・や分子量≦１（ｄの＋（ｏ
ｍｏｌｏｇｏｕｓ　　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　　ｆａ
ｃｔｏｒ　（ＨＲＦ）（ＰＮＡＳ、す、　ｇ９７ｊ−乙
９７９　（／９より〕がヒト細胞膜上に存在する補体抑
制因子として得られている。しかし、これらＤＡＦ％　
ＨＲＦの生体における詳細の機能は未だ解明されていな
い。

本発明者らは、これらの因子以外に自己細胞模上で補体
の活性化を抑制する機能を担う膜蛋白質を得るべく検討
した。先に、本発明者らはヒトの赤血球をマウスに免疫
し、そのマウスの膵臓を取出し、その膵臓細胞をマウス
ミエローマ細胞（ｐ３Ｕ／　）とポリエチレングリコー
ルを用いて融合し多数の抗体産生ハイブリドーマを得、
これらハイブリドーマの産生ずる抗体（培養上清）の中
から、あらかじめノイラミニダーゼ処理したヒｉ・赤血
球に反応させるとヒト補体によっても溶血反応を引きお
こすような抗体を産生ずる細胞を繰り返しスクリーニン
グして、単一の抗体を産生ずるハイブリドーマを得、単
りローン抗体／Ｆｔ抗体を取得した〔日本免疫学会総会
記事、二、グ９と（／９ざ７）、補体シンポジウム抄録
集、、２＆、／♂θ（／り了７）〕。

〔問題点を解決するための手段〕

今般、本発明者らは、この／Ｆｊ抗体の抗原を得るべく
更に鋭意検討した結果、従来の補体抑制因子とは異なる
、分子量が２θ〜２　Ｊ−ｌａｄの新規な糖蛋白質を得
るに至り本発明を完成した。

即ち本発明の要旨は、ヒト細胞膜由来の糖蛋白質であっ
て、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下「
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」と略す）による分子量が２Ｏ−２６
Ｋｄで、Ｎ−グリコシド型糖鎖及びホスファチジルイノ
シトールヲ含有し、補体による細胞膜障害を抑制する作
用を有することを特徴とする糖蛋白質に存する。

以下本発明を説明するに、本発明の糖蛋白質は、赤血球
、リンパ球、血管内皮細胞若しくはそれらを由来とする
腫瘍細胞及び正常株化細胞等のヒト細胞膜を原料とする
。例えばヒト赤血球等のヒト細胞を遠心（！θθ×ｇ１
　／θ分程度）によって集め、ダルベツコＰＢＳ　（日
永製薬社製、以下［ＰＢｓＪという。）等で洗浄後、低
張ＱＫ移して浸透圧による破砕、或いは窒素ガス圧によ
る破砕等により破砕する。得られる破砕液に低張液、例
えば／ｍＡフェニルメチルスルホニル７０リド（ＰＭＳ
Ｆ’）（シグマ社ｍ）、／ｍＭＥＤＴＡを含む／　Ｏｍ
Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，ｊ）を加え、遠心（
６０００〜／θθθＯｘｇ。

３０分程度）する。この操作を繰り返し行って細胞膜両
分を得る。

次いで、この洗浄膜画分から界面活性剤、例えば／チ程
度のβ−Ｎ−オクチルグルコシド（同位社製）または有
機溶媒、例えば２０％（ｖ／ｖ　）程度のブタノールを
含む上記緩衝液を用いて膜蛋白質を抽出し、この膜蛋白
質抽出液に硫安を加え、硫安飽和濃度３０〜６０チの蛋
白質の沈澱を遠心によって得る。

上述の硫安沈澱画分を少量の上記緩衝液に溶解ｕ、ＤＥ
ＡＥ−セファロースカラムクロマトグラフィー　Ｍｏ　
ｎ　ｏ　Ｓ−カラムクロマトグラフィー　ヒドロキシア
パタイトカラムクロマトグラフィー　フェニルセファロ
ースクロマトグラフィー　ＴＳＫ２θθθＳＷ（トーソ
ー社製）等のカラムクロマトグラフィーを適宜組み合せ
、モルモット赤血球のヒト補体による溶血反応の抑制活
性を指標として本発明の糖蛋白質を精製することができ
る。

或いは、日本免疫学会総会記事／７．４１９♂（／９Ｊ
’？）及び補体シンポジウム抄録集２グ。

７ＫＯ（／　９Ｊ’７　）に記載の方法で得られる／Ｆ
！抗体を用いて常法によりｉＦｒ抗体アフィニティーセ
ファロースを調製し、上述の膜蛋白質の硫安沈澱画分を
供し、０，１３Ｍ塩化ナトリウム、θ、７％ＣＩ−Ｉ　
Ａ　Ｐ　Ｓ　（シグマ社製）を含むθ、／Ｍグリシンー
塩酸緩衝液（ｐＨ，？、０）で溶出することによって本
発明の糖蛋白質を精製することができる。７Ｆｊ抗体は
福岡大学医学部微生物学教室から制限なく自由に入手可
能である。

或いはまだ、上記方法で得られる糖蛋白質の下記のよう
な部分アミノ酸配列のペプチドを合成し、それを常法に
従いウサギに免疫して抗血清を得、これよりＩｇＧ画分
を精製し、このＩｇＧをセファ９−スに結合させ、抗体
アフィニティーセファロースを調製して上述の硫安沈澱
画分を供し、θ、／Ｍグリシンー塩酸緩衝液（…、２．
Ｊ’　）で溶出することによって、本発明の糖蛋白質を
精製することができる。

（ａ）　　Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ　−Ｔｙｒ−Ａｓｎ
−Ｃｙｓ　−Ｐｒｏ　−Ａｓｎ　−Ｐｒ。

（ｂ）　　Ｔｈｒ−Ａｌａ　−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ
　−Ｔｈｒ　−Ａｌａ−Ｖａｔ かくして得られる本発明の糖蛋白質は、下記に示すよう
な性質を有する。

（１）電気泳動（／、２．！；％Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ
　Ｇ　Ｅ　）による分子量が２０〜２　ｊ　）（ｄ （２）糖鎖がＮ−グリコシド型糖鎖を含む（３）ホスフ
ァチジルイノシトールを含む（４）補体による細胞障害
を抑制する作用を有する。これは、例えば、モルモット
赤血球に容易に取り込まれてモルモット赤血球のヒト補
体による溶血反応が抑制されることによって確認される
。

（５）等電点け、／次元口にアンホライン（ファルマシ
ア社製）　ｐＩ　３．夕〜／θを用いた等電点電気泳動
を行ない、２次元目に非還元下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（／
、２．夕％）を用いて解析した結果、ｐＩ約夕、θ（主
バンド）とＩ）Ｉ約６．夕にバンドを得た。

（６）下記のアミノ酸組成を有する Ａｓｐ：２０，２％＋　Ｔ　ｈ　ｒ　；　’　−９％＋
　Ｓ　ｅ　ｒ　；　−？　、　／　％　＋Ｇｌｕ　；　
／　０．１％　　、Ｇｌ：！／　；　２，２％　、Ａｌ
ａ；乙、２％　。

Ｃｙ　ｓ　；０．６％　、　Ｖａｌ　；　４’、夕％　
、　Ｉｌｅ　；／、Ｑ％　。

Ｌ、ｅｕ；／θ−’　％　＋　Ｔｙ　ｒ　；♂−’％＋
Ｐｈｅ；乙、４ｔ％。

Ｔ、−、ｙｓ：り、７％　ｒ　ＨＩ　Ｓ　：　ｊ、／％
、Ａ、　ｒ　ｇ；　３−θチＰ　ｒ　ｏ　；　３−　ｊ
％ （７）下記の部分アミノ酸配列を有するＬｅｕ−Ｇｌｎ
−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−
Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔ
ｈｒ−Ａｌ　ａ−Ｖａ　ｌ　−Ｘ−Ｘ−３ｅｒ−３ｅｒ
　−Ａ、５ｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘ−Ｌｅｕ−
Ｘ−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ−Ａｌ　ａ　−Ｇｌ　ｙ−Ｘ−Ｇ
ｉｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｘ−Ｌｙｓ−ＸはＣｙ
ｓ又は他のアミノ酸残基を示す。

〔実施例〕

以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。

実施例／ （１）　　／ＦＪ抗体アフィニティーセファロースの調
製 ＣＮＢｒ　−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ
￥Ｂ（ファルマシア社製）を／ｍＭ塩酸中で／り〜３０
分間膨潤させた。このゲル溶液をグラスフィルター上で
吸引し、／ｍＭ塩酸を乾燥ゲル／Ｖあたりコθθゴ加え
、吸引洗浄を繰り返した。

次いで、ゲルをカップリング緩衝液（０，５Ｍ塩化ナト
リウムを含む０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ／、夕
〜と、７）を乾燥ゲルあたり１０ａｔで洗浄した。直ち
にカップリング緩衝液に溶解しである／Ｆ夕抗体溶液に
この洗浄ゲルを移し、カップリング反応を開始した。

このとき／Ｆ夕抗体量は／　ｍｅ膨潤ゲルに対し５〜７
０■であった。

カップリング反応はグ℃で／晩ゆるやかに攪拌しながら
行った。反応後、ゲル溶液をガラスロート上に移し、未
反応の抗体溶液を回収した。次いで、ゲルを７Ｍエタノ
ールアミン溶液に移し、グ℃で７６時間放置した。

反応を終了したゲルをガラスロート上に移し吸引した。

次いで、カップリング緩衝液で洗浄吸引を７０回繰り返
し、更に０．６Ｍ塩化ナトリウムを含む０．７Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ％、０）で７０回洗浄吸引を繰り返した。最
後にゲルをＰＢＳで３回洗浄吸引し％　／ｌ”Ｊ−抗体
アフィニティーセファロースｔｌ製した。

（２）　　ヒト赤血球膜の調製 （ａ）　　ヒト赤血球の洗浄 ３００〜グθＯｒｕｇのヒト血Ｈをｙｏｏ〜！０θ×ｇ
で７ｊ分間遠心し、上清を除いて赤血球画分を沈澱とし
て得た。この沈澱に／θｍＭＥＤＴＡ、／ｍＭＰＭｓＰ
を含むＰＢＳを加え、ダ００−３００×ｇで７５分間遠
心した。次いで、この沈澱に／　ｒｎＭＥ　ＤＴ　Ａ、
　／　ｍＭＪ’）ＭＳＦを含むＰＢＳを加え、４ｔｏｏ
〜ｊＯθ×ｇで７！分間遠心した。再び上清を除いて沈
澱を得な。この操作を上清が透明になるまで繰り返し行
った。

（１））赤血球の溶血及び赤血球膜の調製上記（ａ）で
得られた洗浄赤血球を／ｍＭＥＤＴＡ。

／　ｍ　Ｍ　Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆを含む７０ｍＭ）リス−塩
酸緩衝液（ｐｔ−１７，ｔ）（以下「緩衝液Ａ」と略す
）３〜グ！に移し、Ｅ℃で／晩攪拌しながら溶血させた
。

次いで、２ｊ、０００Ｘｇ、３０分間遠心して赤血球膜
画分を沈澱として回収した。この沈澱を緩衝液Ａに懸濁
して更に２！、００θ×ｇ１３θ分間遠心した。この操
作を沈澱として得られる赤血球膜の色が淡いピンク色に
なるまでおこなった。

（ｃ）　　赤血球膜両分の可溶化 上記（ｂ）で得られた赤血球膜両分を／％ｎ−オクチル
ーβ−Ｄ−グルコピラノシド（シグマ社製、以下「Ｎ０
Ｇｊと略す）を含む緩衝液Ａ　３００　ｍｌに懸濁し、
グ℃で／晩攪拌した。

次いで、この溶液を／θｊ、Ｏθ０×ｇで３０硫安を少
量ずつ加えた。攪拌を２〜３時間続けた後、１０，００
０×ｇで／５分間遠心して形 上清を得た。この上清に固Ｉ硫安を１０％飽和となるよ
うに加え％　グ℃で、２〜３時間攪拌後／θ、θ００×
ｇで／５分間遠心して沈澱を得た。この沈澱を少量の緩
衝液Ａに溶解し、終濃度θ、／チとなるようにＮＯＧを
添加した。

この溶液をθ、／チＮＯＧ及び０．７５Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む緩衝液Ａに対して、７℃にて／晩排出分子量３
夕θθの透析膜（スペクトラム社製）を用いて透析した
。

（ｄ）　　アフィニティーカラムクロマトグラフィー上
記（１）で調製した／Ｆｊ抗体アフィニティーセファロ
ースゲル（ｔｍｌ容量）のカラムを調製し、θ、／夕Ｍ
塩化ナトリウム及びθ、／％ＮＯＧを含む緩衝液Ａで平
衡化した。このカラムに上記（ｃ）で得た膜蛋白質の可
溶化液を吸着させた。吸着後、Ｏ９９ｊ塩化ナトリウム
及びθ、７％ＮＯＧを含む緩衝液Ａを／を流して洗浄し
た。洗浄後、０．１３Ｍ塩化ナトリウム及びθ、／％Ｃ
Ｉ−Ｉ　Ａ　Ｐ　Ｓを含む緩衝液Ａ１００ｍｅを流した
。次いで、０．／％ＣＨＡｉ：ＰＳ及びθ、／Ｊ−Ｍ塩
化ナトリウムを含む０．７Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈｊ、θ）で溶出した。溶出液は／　ｍｅずつ分画し、
７Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，ｔ）
を加えてすばやく中和した。Ａ２８０でモニターして蛋
白質が溶出された溶出画分を集め限外ろ過（排出分子量
７万以下）で濃縮し、０．／％ＣＨＡ　Ｐ　Ｓを含むＰ
ＢＳに対して前述の透析膜を用いて透析して１０θ〜／
ｊＯμ２の精製された本発明の糖蛋白質を得た。

（ｅ）　　本発明の糖蛋白質の性質 （１）分子量＝２θ〜２夕Ｋｄ　（／２．ｊチ還元、非
還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （２）糖鎖がＮ−グリコシド型糖鎖を含む本発明の糖蛋
白質（η／屑ｅ）ｔｏμ２に、２チＳＤＳ溶液を！θμ
を加え７分間煮沸した。次いでこの溶液にエンドグリコ
シダーゼＦ（べ一リンガー社製）／ユニット、７Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨｄ、Ｏ）　１００μｔ％ｏ、−２Ｊ”ＭＥ
ＤＴＡ（ｐＨ７，！　　）　　溶　液　／　　θ　　θ
　　１１１．／　　θ　チ　　ト　　リ　　ト　　ン　
Ｘ−１００（シグマ社製）！０μｔ１　コーメルカブト
エタノール／θμを及び蒸留水に／ワμｔを加え、３２
℃で７６時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、ｔ
ｏ％ト’）クロロ酢酸溶液コθθμｔを加え、氷上で１
ＯＩＪ間静置して遠心（１０θθＯ×ｇ１０分間）し、
上清をすてた。この沈澱に冷アセトン／　ｒａｔを加え
攪拌し、氷上で１０分間静置後遠心（１００θθＸｇ、
１０分間）して上清をすて、この操作をもう一度くり返
した。この沈澱をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料溶液で溶解して
、３分間煮沸した後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／、ｌ、Ｊ−％に
供した。対照としてエンドグリコシダーゼＦのみを含ま
ない反応溶液を本発明の糖蛋白質に加え、同時間同様の
処理を行った。エンドグリコシダーゼＦ処理を行ったも
のは、対照に比してＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でバンドが約０
ｊＫｄ低分子側にシフトしていた（図／）。

以上の結果より、本発明の糖蛋白質がＮ−グリコシド型
糖鎖を含むことが示された。

（３）ホスファチジルイノシトールを含む本発明の糖蛋
白を細胞表面上に有するＭＴ２（ヒ）Ｔ細胞白血病ウィ
ルス−／（ＨＴＬＶ−７）感染ヒトＴ細胞株〕を用いた
。ＭＴ−２／×／θ６細胞を含む培養液を遠心（／θ０
〜’Ｉ００×ｇ、Ｊ”分間）して細胞を集めた。ここに
ＰＢＳを加えておだやかに攪拌後、同様に遠心し上清を
すて、この操作を２度くり返した。このＭＴｊ細胞／　
Ｘ　／　０６コ（細胞）にホスファチジルイノシト−ル
特異的ホスボリパーゼＣ／タユニット（以下ｒＰＩ−Ｐ
ＬＣＪと略す。Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　９３．　／
７／７（／９Ｊ３）の方法によってＢ、　ｔｈｒｕｒｉ
ｎｇｅｉｎｓｉｓ　　Ｉ　ＡＭ／２０７７より精製）、
ｏ、２ｊＭシ、糖、７０ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ及び０
．７％ウシ血清アルブミンを含む／　ＯｒｎＭ　）リス
−塩酸（ｐＨ７，３）緩衝液／！０μｔを加え、おだや
かに攪拌しながら３７℃下で９０分間放置した。反応後
、ＰＢ８２ｍｔを加えて遠心（／θθ〜グθ０×ｇ１０
分間）シ、上清をすてた。この操作をさらに２回くり返
した。沈澱している細胞にヒツジＩｇＧ（カヘル社製）
（／　Ｏｍ’ｉ／ｍｅ）／θμを加え、攪拌後室温で７
０分間静置し、上述したようにＰＢＳを加えて遠心によ
る洗浄を３回くり返した。この沈澱に７Ｆｊ抗体（Ａ２
８００．／濃度）を２０μを加え、攪拌後室温で２０分
間静置した。再びＰＢＳを加えて遠心による洗浄を３回
くり返し、沈澱にＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（カベル
社製）２０μを加え、攪拌後室温で２０分間静置し、Ｐ
ＢＳを加えて遠心による洗浄を３回行った。

この沈澱にシース液（藤沢薬品社製）２００μｔを加え
て細胞浮遊液とし、ナイロンメ。

シュでろ過したろ液にさらに！０θμｔシース液を加え
、ＦＡＣＳアナライザー（フローサイトメトリー）に供
した。対照にＰＩ−ＰＬ　Ｃを含まない反応液で上述の
如＜ＭＴ２細胞を処理したものを用いた。

その結果、ＰＩ−ＰＬＯ処理を行ったＭＴλ細胞は、対
照に比べ９タチ本発明の糖蛋白質陰性細胞となった（図
２）。

以上の結果より本発明の糖蛋白質は、ホスファチジルイ
ノシトールを有し、これを介して膜に結合しているもの
と推定された。

（４）　　ヒト補体による細胞障害を抑制する作用を有
する。

例えばＰＢＳで十分洗浄した一２％モルモット赤血球２
夕μｔに本発明の糖蛋白質（任意の蛋白質濃度）を７２
．ｊμを加え、さらにＰＢＳグ乙２９．ｆμｔ　を加え
、３７℃で７時間おだやかに攪拌しながら放置した。反
応終了後６ｍＭマグネシウム％　７０ｍＭ　Ｅ　Ｇ　Ｔ
　Ａ及び０．７％ゼラチンを含むベロナール緩衝液（和
光紬薬社製）（ｒＭｇ−ＥＧＴＡ−ＧＶＢＪと略す）を
２　ｍｌ加え、遠心（／θ０〜グθθ×ｇ、１０分間）
し上清をすてた。再びＭｇ−ＥＧＴ　Ａ　−Ｇ　Ｖ　Ｂ
　１２　ｍｌ加え、上述同様の遠心を行ない上清をすて
た。沈澱にＭｇ−ＥＧＴＡ−ＧＶＢ　／θθμを及び正
常ヒト血清夕θｌｔｔを加え、３７℃で３０分間ゆっく
り攪拌した。

次いでグθｍＭＥＤＴＡ及び０．７％ゼラチンを含むベ
ロナール緩衝液／、θｍｌを加え、遠心（７００〜グ０
θ×ｇ、７０分間）を行った。

その上清をＡ４１４で測定し、　ヒト補体によるモルモ
ット赤血球の溶血率を測定した。対照として本発明の糖
蛋白質の代わりに同濃度のウシ血清アルブミンを用いた
。

その結果、本発明の糖蛋白質を、終濃度が／μ？／ｒｎ
ｌになるように加えたとき、モルモノト赤血球の溶血率
は９０チ抑制された。よって本発明の糖蛋白質は、赤血
球膜に吸着し、ヒト補体による細胞障害を抑制する作用
を有することが示された（図３）。

（５）等電点：／次元口にアンホライン（ファルマシア
社製）ｐ）Ｊ、ｊ〜１０を用いた等電点電気泳動を行な
い、２次元目に非還元下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（／コ、り
％）を用いて解析した結果、ｐ■約オ、θ（主バンド）
とｐＩ約ｇ、ｔにバンドを得た。

（６）アミノ酸組成（アミノ酸自動分析装置）Ａｓｐ：
２０．２％、Ｔ　ｈ　ｒ　：♂、９％、Ｓｅｒ：３．／
％。

Ｇｌｕ；　１０，６％、Ｑｌｙ　；コ、２％＋　Ａ　ｌ
　ａ　：乙、２％。

Ｃｙ　ｓ　；θ、＋％、Ｖａｔ：＠Ｊ％、ｌｉｅ：へク
チ。

１、Ｊ　ｅ　ｕ：　／　ｏ　、　ｉ％、ＴＹｒ　：　Ｊ
’、／　％　、　Ｐｈｅ　：　、１４１％。

Ｌ　ｙＳ　：り、／％、　Ｈｉ　ｓ　：　２．／％、Ａ
ｒｇ：　ＬＯ％。

ＰｒｏＳ３．ｊチ （７）部分アミノ酸配列 上記（ｄ）で得た糖蛋白質約２０μＶをＪ、Ｔ。

Ｂ　ａ　ｋ　ｅ　ｒ社製”　Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ　Ｂｕ
ｔｙｌ　”　（θ、り６Ｘ　２　ｊ　ｃｍ　）カラムを
用いた逆相系高速液体クロマトグラフィーにより分離し
・た。溶出条件は、００７％トリフルオロ酢酸水溶液か
ら？０チアセトニトリル／イソプロピルアルコール（３
／７　：　ｖ／ｖ　）混液を含む０．７％トリフルオロ
酢酸水溶液への９０分間の直線濃度勾配で、流速／ｍｌ
！／分で行った。蛋白質の検出は２／夕ｎｍの吸光度に
より行ったところ、図グに示すように約７３個の両分を
得た。

そのうち、約３乙分に溶出した両分を真空状態で乾燥後
、トリス緩衝液（／Ｍｔｌスー塩酸緩衝液（ｐＨ，ｒ、
ｔ）、含ｊＭ塩酸グアニジン）１００μｔに溶解し、コ
ーメルカブトエタノール０．！μｔを加え、窒素ガス下
グ０℃で２時間還元した後、モノヨード酢酸７■を加え
窒素ガス下、室温、庶光下で７時間反応させ、蛋白質の
還元カルボキシメチル化物を得た。

還元カルボキンメチル化蛋白質は上記逆相系高速液体ク
ロマトグラフィー条件で、３θチから９０％への３０分
間の直線濃度勾配で行った。上記と同様の検出を行った
ところ、約３個の両分を得た（図ｊ）。

そのうち、約２／分に溶出した両分を真空状態で乾燥後
、！θ％）リフルオロ酢酸／−０μｔに溶解し、ポリブ
レン処理したグラスフィルターに添加し、Ａｐｐｌｉｅ
ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社ｍ￥７０に型シークエンサ
ーでエドマン分解した。

Ｐ　Ｔ　Ｈ−アミノ酸の同定は三菱化成社製”ＭＣＩ　
　ｇｅｌ　ＯＤＳ　　ＩＨＵ”（０，￥６　ｘ／１ｃｍ
）カラムを用い、酢酸緩衝液（１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈグ、７）、０．０７％　ＳＤＳ及び３とチアセトニト
リルを含む）による単一溶媒溶出法を流速へ２　ｎｔｌ
　７分、温度４ｔ３℃で行い、ＰＴ　ｌ−１−アミノ酸
の検出は２６りｎｍの吸光度で行った。

その結果、この蛋白質のアミノ末端配列は下記の通りで
あることが明らかとなった。

Ｌｅ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｃｙ　５−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｃ
ｙｓ　−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ　−Ｔｈｒ−Ａｌａ−
Ａｓｐ　−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ　−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ
　−Ｘ−Ｘ−８ｅｒ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ
−Ａｌａ　−Ｘ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｉ、ｙｓ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｙ　−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｖａｔ　−Ｔｙｒ　−Ａｓ
ｎ−Ｘ−Ｌｙｓ−ＸはＣｙｓ又は他のアミノ酸残基を示
す。

実施例コ （１）　　合成ペプチドに対するポリクロナール抗体の
作成 （ａ）　　抗原の調製 キーホールリンベットヘモシアン（以下「Ｋ　Ｌ　Ｉ−
Ｉ　ｊと略す）（カルビオケム社製）約３０■をＰＢＳ
に対して％℃で／晩透析した。

透析後、−ｔθｍＭホウ酸ナトリウム−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ５’、０）で希釈し、蛋白質濃度を３０■／　ｍｅと
した。

次いで、下記の合成ペプチド各々７．夕■を０．７Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ♂、θ）３７５μｔに溶解
し、上記Ｋ　Ｌ　Ｈ溶液を各々に７２夕ｌＬｔ加えた。

（ａ）　　　Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ
−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒ。

（ｂ）　　Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−
Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ この溶液に２タチグルタールアルデヒド（シグマ社製）
溶液を各々に！μを加え、室温で／！分間放置した。再
度２ｊ％ゲルタールアルデヒド溶液を各々に夕μを加え
、室温で／！分間放置した。

次いで、７Ｍグリシン−塩酸（ｐＨ４，０）緩衝液／θ
０μｔを加え、室温で７０分間放置した。この溶液を各
々ＰＢＳに対し、グ℃、／昼夜透析した。透析終了後、
高速遠心し、滅菌し、小分けしてダ℃で保存した０ （ｂ）　　抗体の取得 」二記（ａ）テ得たＫ　Ｌ　Ｈ−ペプチド結合物２種類
を等量混合し、ＰＢＳを加え、総蛋白量が約−！　ｍ９
／　ｍｌとなるように調整し、これにＦ　ｒｅｕｎｄ完
全型アジュバント（デイフコ社製）を等１加えて混合し
、エマルジョンとした。

これをウサギの背部皮下ダ個所に０．／、ｌずつと、各
足前にθ、ｌａｔずつ免疫した。グ週間後に背部皮下グ
個所に追加免疫した。その後、２週間後に／　ａｔの同
様のＫ　Ｌ　Ｈ−ペプチド結合物（／η／　ｍｅ　）の
エマルジョンを背部皮下６個所に追加免疫した。注射後
２〜３週間目に全採血し、抗血清を得た。得られた抗血
清にグθチ飽和となるように固ン硫安を攪拌しながら加
え、２〜３時間、２℃で更に攪拌し続けた。攪拌後、１
０．θ００Ｘｇで／５分間遠心して沈澱を得、それを少
量のＰＢＳで溶解した。この溶液をあらかじめＰＢＳで
平衡化しておいたプロティンＡセルロファイン（生化学
工業社製）に供し、ＰＢＳで十分洗浄後０、／　Ｍグリ
シン−塩酸（ｐＩ（−２，♂）で溶出した。

蛋白質の溶出された両分を集め、直ちに７Ｍトリス溶液
を加え中和し、限外ろ過装置（排出分子量３万）を用い
て濃縮した。この抗体濃縮液を９℃で／晩ＰＢＳに対し
て透析し、精製ポリクローナル抗体を得た。

（２）糖蛋白質の精製 実施例／の（２）の（ｄ）において、／Ｆ！抗体の代わ
りに上記（２）で得たポリクローナル抗体を使用する外
は同様にして、アフィニティーセファ０−スゲルを作製
した。このポリクローナル抗体セファロースカラムを使
用し、実施例／の（２）の（ａ）〜（ｃ）で得た膜蛋白
質の可溶化液を供し同様にして精製をおこなった結果、
実施例／と同様の性質を有する本発明の糖蛋白質を得た
。

〔発明の効果〕

上記の様にして得られる本発明の糖蛋白質は、例えば次
の様な目的に利用することができる。

（１）本発明の糖蛋白質をウサギ、マウス等に免疫する
ことにより、補体の活性調節に係る重要な機能を担う膜
蛋白質に対する安定なポリクローナル抗体或いはモノク
ローナル抗体を得ることができる。

（２）本発明の糖蛋白質に対する抗体を利用して赤血球
、リンパ球等の細胞上の該糖蛋白質を定量することによ
り、例えば悪性貧血、慢性関節リュウマチ、全身性エリ
テマトーデス、糸球体腎炎等の種々の疾患の診断が可能
となる０ （３）本発明の糖蛋白質は、補体の活性化が関与する種
々の疾患の治療薬として使用し得る。

（４）同抗体を利用してガン細胞の溶解や悪性細胞の除
去等の治療に応用できる。

【図面の簡単な説明】

図／は、エンドグリコシダーゼＦ処理（図中／）及び無
処理（図中２）を施した本発明糖蛋白質の７２．ｔ％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動パターンを写真で表わした図
面である。 図２は、ＰＩ−ＰＬＯ処理（・曲・）及び無処理（−−
−−−）　１ｃ施した本発明糖蛋白質の細胞表面上から
の遊離状態を示す図面である。 図中、「−」は陰性対照（Ｆ　Ｉ　ＴＣ標識抗マウスＩ
ｇＧのＭ’ｒ２に対する非特異的吸着）を示す。 図３は、本発明糖蛋白質（−＠−）及び対照としてウシ
血清アルブミン（−ト）を加えた場合のモルモット赤血
球のヒト補体による溶血抑制効果を示す図面である。 図ダ及び図夕は、逆相系高速液体クロマトグラフィーの
溶出パターンを示す図であり、横軸は溶出時間（分）を
示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト細胞膜由来の糖蛋白質であって、ＳＤＳ−ポ
   リアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が２０〜２
   ５Ｋｄで、Ｎ−グリコシド型糖鎖及びホスファチジルイ
   ノシトールを含有し、補体による細胞膜障害を抑制する
   作用を有することを特徴とする糖蛋白質。