JPH021808B2 - - Google Patents
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- JPH021808B2 JPH021808B2 JP57226236A JP22623682A JPH021808B2 JP H021808 B2 JPH021808 B2 JP H021808B2 JP 57226236 A JP57226236 A JP 57226236A JP 22623682 A JP22623682 A JP 22623682A JP H021808 B2 JPH021808 B2 JP H021808B2
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- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6881—Cluster-antibody conjugates, i.e. the modifying agent consists of a plurality of antibodies covalently linked to each other or of different antigen-binding fragments covalently linked to each other
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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Description
本発明は新規な細胞毒性複合体を活性成分とす
る癌治療用剤とその製造法に関する。更に詳しく
は、殺すべき細胞（以下標的細胞という）のもつ
特定の抗原と特異的に結合しうる免疫グロブリ
ン、あるいはその抗原結合部位を含むフラグメン
トからなる構成部分と、細胞毒性物質を結合せし
めた血清アルブミンからなる構成部分を有する、
新規な細胞毒性複合体を活性成分とする癌治療用
剤とその製造法である。 ある種の細胞だけを選択的に殺すことを目的と
して、その標的細胞と特異的に結合しうる免疫グ
ロブリンを種々の細胞毒性物質と結合させる試み
がなされてきた。例えば、免疫グロブリンにｐ―
ジ（２―クロロエチル）アミノ―Ｌ―フエニルア
ラニン等を結合した複合体（特開昭51−61640）、
免疫グロブリンにメトトレキセート等を結合した
複合体（特開昭56−65829）、免疫グロブリンにク
ロラムブシル等を結合した複合体（特開昭56−
65828）、免疫グロブリンにマイトマイシン―Ｃ等
を結合した複合体（特開昭55−92325）、免疫グロ
ブリンにダウノマイシンを結合した複合体（特開
昭51−144723）等が知られている。 これらの方法で得られた細胞毒性複合体は、ガ
ン細胞と選択的に結合しガン細胞に毒性を発揮す
ることが期待されるものであり、非常に興味のあ
る複合体である。しかしながら細胞毒性物質を直
接抗体に結合する場合は、免疫グロブリンに多数
の細胞毒性物質を結合すると、抗体の抗原認識活
性が低下してしまうので、かかる困難を回避する
ためには、少数の細胞毒性物質を結合するにとど
めざるをえない。 本発明者等は、かかる先行技術の欠点を解決す
べく鋭意研究を行なつた結果、先ず血清アルブミ
ンに多数の細胞毒性物質を結合せしめ、然る後か
かる細胞毒性物質を結合せしめた血清アルブミン
を免疫グロブリンまたはそのフラグメントと結合
せしめれば、抗体活性を損うことなく多数の細胞
毒性物質を結合した免疫グロブリン―細胞毒性物
質複合体を製造し得ることを見い出して本発明に
到達した。 すなわち、本発明は殺すべき細胞のもつている
特定の抗原と特異的に結合し得る免疫グロブリン
またはそのフラグメントと、細胞毒性物質をイミ
ノ基によつて結合せしめた血清アルブミンを、少
なくとも１つの硫黄原子を介して共有結合させて
なる細胞毒性複合体を活性成分とする癌治療用
剤、並びにその製造法に関するものである。 本発明において、殺すべき細胞のもつている特
定の抗原と特異的に結合しうる免疫グロブリン
（細胞毒性蛋白複合体の誘導部）とは次のような
ものである。腫瘍細胞あるいは特定のリンパ球等
の標的細胞あるいはそれらを含む組織で免疫され
たヒト、サル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサ
ギ、モルモツト、ハムスター、ラツト、マウス等
の動物から分離された抗血清より、エタノール分
画、硫安分画、イオン交換あるいは分子篩カラム
クロマトグラフイー等の公知の手段によつて調製
される免疫グロブリン、あるいは標的細胞で免疫
した動物より採取された抗体産生細胞を発癌性の
ある物質で癌化させたり、ミエローマ細胞と融合
させてハイブリドーマにしたりすることによつて
得られるモノクロナルな抗体をいう。また標的細
胞に結合した免疫グロブリンを界面活性剤等で分
離して得られる、標的細胞に特異的なグロブリン
も本発明の免疫グロブリンに含まれる。 免疫グロブリンにはIgG，IgA，IgM，IgD，
IgEの５つのクラスが知られており、さらに各ク
ラスはいくつかのサブクラスから成つていること
が知られている。しかし、その基本構造は、２本
の重鎖と２本の軽鎖とから成る点、また抗原結合
活性をもつFab部分とエフエクター活性をもつFc
部分から成る点において一致している。ただし、
IgMは５量体、IgAは一部２量体で存在する。 細胞毒性蛋白複合体の誘導部としては、免疫グ
ロブリン分子全体を用いてもよいが、その抗原結
合部位を含むが、Fc部分をもたないフラグメン
トを用いてもよい。Fc部分を含む複合体にあつ
ては、Fc部分による標的細胞以外の細胞に対す
る非特異的吸着及び細胞膜上のFcリセブターと
の結合が起こり、細胞毒性蛋白複合体の殺すべき
細胞に対する選択性が減じることがあり、また免
疫グロブリンがヒトにとつて異種製白である場
合、その抗原性は、Fc部分において特に強いの
で、蛋白複合体の抗原性を低下させるために、
Fc部分のない免疫グロブリンのフラグメントが、
細胞毒性蛋白複合体の誘導部として望ましいこと
がある。一般に、免疫グロブリンをパパイン
（papain）、トリブシン（trypsin）、キモトリプシ
ン（chymotrypsin）、プラスミン（plasmin）等
の蛋白分解酵素で分解すると、抗原結合部分を１
つもつ、いわゆるFabフラグメントが得られる。
またペプシン（pepsin）分解、条件によつてはト
リプシン分解によつても抗原結合部分を２つも
つ、いわゆるＦ（ab′）2フラグメントが得られる。
このフラグメントはさらにメルカプタンで処理す
ると、一価のFab′フラグメントになる。さらに
免疫グロブリンを変性させつつ分解させると抗原
結合部分（バリアブル・リージヨン variable
region）のみが得られる。免疫グロブリン及び免
疫グロブリン由来の例えば上記のフラグメント
は、免疫グロブリンがいかなるクラス、サブクラ
スであれ、いずれも本発明の蛋白複合体の誘導部
として用いることもできる。 本発明の細胞毒性複合体の他方の成分は、細胞
毒性物質を結合せしめた血清アルブミンである
が、かかる細胞毒性物質の担体となる血清アルブ
ミンとしては人及び各種の動物の血清アルブミン
が用いられるが、特に好ましくは人及び牛の血清
アルブミンである。また細胞毒性物質とは、その
分子構造中にカルボキシル基、活性エステル基、
酸アジド基、アルデヒド基、ハロアシル基のいず
れかを有する抗癌活性を有する化合物をいい、血
清アルブミンのアミノ基と反応する。その具体例
としては、次下の化学式で表わされる化合物を挙
げることができるが、これらに限られるものでは
ない。 ニトロソウレア誘導体 クロラムブシル誘導体 マイトマイシン―Ｃ誘導体 ダウノマイシン誘導体 ５―フルオロ―2′―デオキシウリジン誘導体 デスアセチルビンプラスチン酸アジド誘導体 メトトレキヤート活性エステル誘導体 アクチノマイシン―Ｄオキサジノン誘導体 本発明の免疫グロブリンまたはそのフラグメン
トと、細胞毒性物質を結合せしめた血清アルブミ
ンを、共有結合させてなる細胞毒性複合体の中で
は、その製造、精製及び活性上、下記式〔〕 Ab〔―B1―S1―Al（―NH―Cy）n〕o……〔〕 〔Abは免疫グロブリンまたはそのフラグメント
を、Alは血清アルブミンを、Cyは細胞毒性物質
を表す。S1及びNHはそれぞれ血清アルブミン中
の硫黄原子及びイミノ基を表す。B1は２価の有
機基を表す。ｍは１〜30の整数を、ｎは１〜10の
整数を表す。〕 で表される複合体が好ましく、その中でも下記式
〔〕または〔〕 〔Ab，Al，Cy，S1，NH，ｍ及びｎの定義は式
〔〕の場合と同じ。S2は硫黄原子を、B2，B3及
びB4は２価の有機基をt2及びt3は同一または異な
つて０または１を表す。〕 で表される複合体が特に好ましい。 上記式〔〕，〔〕及び〔〕において、S1は
血清アルブミン中の硫黄原子を表わし、システイ
ンまたはシスチンいずれに由来する硫黄原子であ
つてもよい。 上記式〔〕においてt2＝０の場合には、S2は
免疫グロブリンまたはそのフラグメントに由来す
る硫黄原子であり、t2＝１の場合には架橋剤によ
り導入された硫黄原子である。式〔〕において
t3＝０の場合には、硫黄原子S1とS2は直接結合し
ジスルフイド基を形成する。一方t3＝１の場合に
は、硫黄原子S1とS2は２価の有機基B3を介して
結合するが、B3はチオール基と反応する２個の
官能基を有する架橋剤、例えば下記式〔〕 〔B5は２価の有機基である。〕 で表わされる架橋剤あるいはベンゾキノンに由来
する２価の有機基である。式〔〕におけるB2
は、例えば下記式〔〕 〔Ｘの定義は式〔Ｖ〕に同じ。B6は２価の有機
基をＹは活性エステルのアルコール残基を表わ
す。〕 で表わされる架橋剤、下記式〔XI〕、 〔Ｘの定義は式〔〕に、B6の定義は式〔〕
に同じである。Ｚはイミドエステルのアルコール
残基を、Ｑはハロゲン原子を表わす。〕 で表わされる架橋剤、下記式〔XII〕 で表わされる架橋剤（２―イミノチオラクトン）
下記式〔〕 で表わされる架橋剤（Ｎ―アセチルホモシステイ
ン）、で表わされる架橋剤に由来する２価の有機
基である。 Ｘで表わされる、結合している硫黄原子と共に
活性ジスルフイド基を形成し得る１価の有機基の
具体例としては、例えば２―ピリジンチオ基
る癌治療用剤とその製造法に関する。更に詳しく
は、殺すべき細胞（以下標的細胞という）のもつ
特定の抗原と特異的に結合しうる免疫グロブリ
ン、あるいはその抗原結合部位を含むフラグメン
トからなる構成部分と、細胞毒性物質を結合せし
めた血清アルブミンからなる構成部分を有する、
新規な細胞毒性複合体を活性成分とする癌治療用
剤とその製造法である。 ある種の細胞だけを選択的に殺すことを目的と
して、その標的細胞と特異的に結合しうる免疫グ
ロブリンを種々の細胞毒性物質と結合させる試み
がなされてきた。例えば、免疫グロブリンにｐ―
ジ（２―クロロエチル）アミノ―Ｌ―フエニルア
ラニン等を結合した複合体（特開昭51−61640）、
免疫グロブリンにメトトレキセート等を結合した
複合体（特開昭56−65829）、免疫グロブリンにク
ロラムブシル等を結合した複合体（特開昭56−
65828）、免疫グロブリンにマイトマイシン―Ｃ等
を結合した複合体（特開昭55−92325）、免疫グロ
ブリンにダウノマイシンを結合した複合体（特開
昭51−144723）等が知られている。 これらの方法で得られた細胞毒性複合体は、ガ
ン細胞と選択的に結合しガン細胞に毒性を発揮す
ることが期待されるものであり、非常に興味のあ
る複合体である。しかしながら細胞毒性物質を直
接抗体に結合する場合は、免疫グロブリンに多数
の細胞毒性物質を結合すると、抗体の抗原認識活
性が低下してしまうので、かかる困難を回避する
ためには、少数の細胞毒性物質を結合するにとど
めざるをえない。 本発明者等は、かかる先行技術の欠点を解決す
べく鋭意研究を行なつた結果、先ず血清アルブミ
ンに多数の細胞毒性物質を結合せしめ、然る後か
かる細胞毒性物質を結合せしめた血清アルブミン
を免疫グロブリンまたはそのフラグメントと結合
せしめれば、抗体活性を損うことなく多数の細胞
毒性物質を結合した免疫グロブリン―細胞毒性物
質複合体を製造し得ることを見い出して本発明に
到達した。 すなわち、本発明は殺すべき細胞のもつている
特定の抗原と特異的に結合し得る免疫グロブリン
またはそのフラグメントと、細胞毒性物質をイミ
ノ基によつて結合せしめた血清アルブミンを、少
なくとも１つの硫黄原子を介して共有結合させて
なる細胞毒性複合体を活性成分とする癌治療用
剤、並びにその製造法に関するものである。 本発明において、殺すべき細胞のもつている特
定の抗原と特異的に結合しうる免疫グロブリン
（細胞毒性蛋白複合体の誘導部）とは次のような
ものである。腫瘍細胞あるいは特定のリンパ球等
の標的細胞あるいはそれらを含む組織で免疫され
たヒト、サル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサ
ギ、モルモツト、ハムスター、ラツト、マウス等
の動物から分離された抗血清より、エタノール分
画、硫安分画、イオン交換あるいは分子篩カラム
クロマトグラフイー等の公知の手段によつて調製
される免疫グロブリン、あるいは標的細胞で免疫
した動物より採取された抗体産生細胞を発癌性の
ある物質で癌化させたり、ミエローマ細胞と融合
させてハイブリドーマにしたりすることによつて
得られるモノクロナルな抗体をいう。また標的細
胞に結合した免疫グロブリンを界面活性剤等で分
離して得られる、標的細胞に特異的なグロブリン
も本発明の免疫グロブリンに含まれる。 免疫グロブリンにはIgG，IgA，IgM，IgD，
IgEの５つのクラスが知られており、さらに各ク
ラスはいくつかのサブクラスから成つていること
が知られている。しかし、その基本構造は、２本
の重鎖と２本の軽鎖とから成る点、また抗原結合
活性をもつFab部分とエフエクター活性をもつFc
部分から成る点において一致している。ただし、
IgMは５量体、IgAは一部２量体で存在する。 細胞毒性蛋白複合体の誘導部としては、免疫グ
ロブリン分子全体を用いてもよいが、その抗原結
合部位を含むが、Fc部分をもたないフラグメン
トを用いてもよい。Fc部分を含む複合体にあつ
ては、Fc部分による標的細胞以外の細胞に対す
る非特異的吸着及び細胞膜上のFcリセブターと
の結合が起こり、細胞毒性蛋白複合体の殺すべき
細胞に対する選択性が減じることがあり、また免
疫グロブリンがヒトにとつて異種製白である場
合、その抗原性は、Fc部分において特に強いの
で、蛋白複合体の抗原性を低下させるために、
Fc部分のない免疫グロブリンのフラグメントが、
細胞毒性蛋白複合体の誘導部として望ましいこと
がある。一般に、免疫グロブリンをパパイン
（papain）、トリブシン（trypsin）、キモトリプシ
ン（chymotrypsin）、プラスミン（plasmin）等
の蛋白分解酵素で分解すると、抗原結合部分を１
つもつ、いわゆるFabフラグメントが得られる。
またペプシン（pepsin）分解、条件によつてはト
リプシン分解によつても抗原結合部分を２つも
つ、いわゆるＦ（ab′）2フラグメントが得られる。
このフラグメントはさらにメルカプタンで処理す
ると、一価のFab′フラグメントになる。さらに
免疫グロブリンを変性させつつ分解させると抗原
結合部分（バリアブル・リージヨン variable
region）のみが得られる。免疫グロブリン及び免
疫グロブリン由来の例えば上記のフラグメント
は、免疫グロブリンがいかなるクラス、サブクラ
スであれ、いずれも本発明の蛋白複合体の誘導部
として用いることもできる。 本発明の細胞毒性複合体の他方の成分は、細胞
毒性物質を結合せしめた血清アルブミンである
が、かかる細胞毒性物質の担体となる血清アルブ
ミンとしては人及び各種の動物の血清アルブミン
が用いられるが、特に好ましくは人及び牛の血清
アルブミンである。また細胞毒性物質とは、その
分子構造中にカルボキシル基、活性エステル基、
酸アジド基、アルデヒド基、ハロアシル基のいず
れかを有する抗癌活性を有する化合物をいい、血
清アルブミンのアミノ基と反応する。その具体例
としては、次下の化学式で表わされる化合物を挙
げることができるが、これらに限られるものでは
ない。 ニトロソウレア誘導体 クロラムブシル誘導体 マイトマイシン―Ｃ誘導体 ダウノマイシン誘導体 ５―フルオロ―2′―デオキシウリジン誘導体 デスアセチルビンプラスチン酸アジド誘導体 メトトレキヤート活性エステル誘導体 アクチノマイシン―Ｄオキサジノン誘導体 本発明の免疫グロブリンまたはそのフラグメン
トと、細胞毒性物質を結合せしめた血清アルブミ
ンを、共有結合させてなる細胞毒性複合体の中で
は、その製造、精製及び活性上、下記式〔〕 Ab〔―B1―S1―Al（―NH―Cy）n〕o……〔〕 〔Abは免疫グロブリンまたはそのフラグメント
を、Alは血清アルブミンを、Cyは細胞毒性物質
を表す。S1及びNHはそれぞれ血清アルブミン中
の硫黄原子及びイミノ基を表す。B1は２価の有
機基を表す。ｍは１〜30の整数を、ｎは１〜10の
整数を表す。〕 で表される複合体が好ましく、その中でも下記式
〔〕または〔〕 〔Ab，Al，Cy，S1，NH，ｍ及びｎの定義は式
〔〕の場合と同じ。S2は硫黄原子を、B2，B3及
びB4は２価の有機基をt2及びt3は同一または異な
つて０または１を表す。〕 で表される複合体が特に好ましい。 上記式〔〕，〔〕及び〔〕において、S1は
血清アルブミン中の硫黄原子を表わし、システイ
ンまたはシスチンいずれに由来する硫黄原子であ
つてもよい。 上記式〔〕においてt2＝０の場合には、S2は
免疫グロブリンまたはそのフラグメントに由来す
る硫黄原子であり、t2＝１の場合には架橋剤によ
り導入された硫黄原子である。式〔〕において
t3＝０の場合には、硫黄原子S1とS2は直接結合し
ジスルフイド基を形成する。一方t3＝１の場合に
は、硫黄原子S1とS2は２価の有機基B3を介して
結合するが、B3はチオール基と反応する２個の
官能基を有する架橋剤、例えば下記式〔〕 〔B5は２価の有機基である。〕 で表わされる架橋剤あるいはベンゾキノンに由来
する２価の有機基である。式〔〕におけるB2
は、例えば下記式〔〕 〔Ｘの定義は式〔Ｖ〕に同じ。B6は２価の有機
基をＹは活性エステルのアルコール残基を表わ
す。〕 で表わされる架橋剤、下記式〔XI〕、 〔Ｘの定義は式〔〕に、B6の定義は式〔〕
に同じである。Ｚはイミドエステルのアルコール
残基を、Ｑはハロゲン原子を表わす。〕 で表わされる架橋剤、下記式〔XII〕 で表わされる架橋剤（２―イミノチオラクトン）
下記式〔〕 で表わされる架橋剤（Ｎ―アセチルホモシステイ
ン）、で表わされる架橋剤に由来する２価の有機
基である。 Ｘで表わされる、結合している硫黄原子と共に
活性ジスルフイド基を形成し得る１価の有機基の
具体例としては、例えば２―ピリジンチオ基
【式】４―ピリジルチオ基
【式】３―カルボキシ―４―ニト
ロフエニルチオ基
【式】４―
カルボキシ―２―ピリジルチオ基
【式】Ｎ―オキシ―２―ピ
リジルチオ基
【式】２―ニトロフエ
ニルチオ基
【式】４―ニトロ―２―
ピリジルチオ基
【式】２―ベ
ンゾチアゾイルチオ基
【式】
２―ベンゾイミダゾイルチオ基
【式】及びＮ―フエニルアミノ
―N′―フエニルイミノメチルチオ基
【式】等を挙げることができ
る。
B5またはB6で表わされる２価の有機基は、化
学的に不活性であれば特に限定されないが、一般
的には分岐を有するか有しないアルキレン基、フ
エニレン基等から適宜選ばれる。Ｙで表わされる
活性エステルのアルコール残基の具体例としては
２，４―ジニトロフエノキシ基
学的に不活性であれば特に限定されないが、一般
的には分岐を有するか有しないアルキレン基、フ
エニレン基等から適宜選ばれる。Ｙで表わされる
活性エステルのアルコール残基の具体例としては
２，４―ジニトロフエノキシ基
【式】サクシンイミドキシ基
【式】等を挙げることができる。Ｚ
で表わされるイミドエステルのアルコール残基の
具体例としてはメトキシ、エトキシ基等を挙げる
ことができる。Ｑで表わされるハロゲン原子の具
体例としては塩素、臭素等を挙げることができ
る。 架橋剤の具体例としは、式〔〕で表わされる
架橋剤として、Ｎ，N′―（１，２―フエニレン）
ジマレイミド
具体例としてはメトキシ、エトキシ基等を挙げる
ことができる。Ｑで表わされるハロゲン原子の具
体例としては塩素、臭素等を挙げることができ
る。 架橋剤の具体例としは、式〔〕で表わされる
架橋剤として、Ｎ，N′―（１，２―フエニレン）
ジマレイミド
【式】Ｎ，
N′―（１，４―フエニレン）ジマレイミド
【式】４，4′―ビス（マ
レオイルアミノ）アゾベンゼン
ビス（Ｎ―マレイミドメチル）エーテル
【式】を、式
〔Ｘ〕で表わされる架橋剤として、Ｎ―サクシン
イミジル３―（２―ピリジルジチオ）プロピオネ
ート、Ｎ―サクシンイミジル３―（２，４―ジニ
トロフエノキシ）ブチレートを、式〔XI〕で表わ
される架橋剤として、メチル３―（２―ピリジル
ジチオ）プロピオンイミデート塩酸塩を挙げるこ
とができる。 上記式〔〕においてB4は、例えば下記式
〔Ｘ〕、 〔Ｙの定義は式〔〕に同じ。B7は２価の有機
基である。〕 で表わされる、マレイミド基を有する架橋剤に由
来する２価の有機基である。B7で表わされる２
価の有機基は、化学的に不活性であれば特に限定
されないが、一般的には分枝を有するか有しない
アルキレン基、フエニレン基等から適宜選ばれ
る。 〔〕で表わされる架橋剤の具体例としては、
例えばメタ―（Ｎ―マレイミド）安息香酸Ｎ―ヒ
ドロキシサクシンイミドエステル
イミジル３―（２―ピリジルジチオ）プロピオネ
ート、Ｎ―サクシンイミジル３―（２，４―ジニ
トロフエノキシ）ブチレートを、式〔XI〕で表わ
される架橋剤として、メチル３―（２―ピリジル
ジチオ）プロピオンイミデート塩酸塩を挙げるこ
とができる。 上記式〔〕においてB4は、例えば下記式
〔Ｘ〕、 〔Ｙの定義は式〔〕に同じ。B7は２価の有機
基である。〕 で表わされる、マレイミド基を有する架橋剤に由
来する２価の有機基である。B7で表わされる２
価の有機基は、化学的に不活性であれば特に限定
されないが、一般的には分枝を有するか有しない
アルキレン基、フエニレン基等から適宜選ばれ
る。 〔〕で表わされる架橋剤の具体例としては、
例えばメタ―（Ｎ―マレイミド）安息香酸Ｎ―ヒ
ドロキシサクシンイミドエステル
【式】メタ―
（Ｎ―マレイミド）安息香酸２，４―ジニトロフ
エニルエステル、β―（Ｎ―マレイミド）プロピ
オン酸Ｎ―ヒドロキシサクシンイミドエステル等
を挙げることができる。 本発明の細胞毒性複合体は、免疫グロブリンま
たはそのフラグメントと、細胞毒性物質を結合せ
しめた血清アルブミンを、共有結合させることに
より製造することができる。例えば、本発明の細
胞毒性複合体の内式〔―１〕で表わされる複合
体は、例えば、発生または導入したチオール基を
有する下記式〔〕 Ab〔―（B2）t2―S2H〕o′ ……〔〕 〔Abの定義は式〔〕に同じ。S2，B2及びt2の
定義は式〔〕に同じ。n′は１〜10の整数であ
る。〕 で表わされる免疫グロブリンまたはそのフラグメ
ントと、下記式〔〕 XS1―Al（―NH―Cy）n ……〔〕 〔Al，Cy，S1，NH及びｍの定義は式〔〕に
同じ。Ｘは隣接する硫黄原子と共に活性ジスルフ
イド結合を形成し得る基を表わす。〕 で表わされる細胞毒性物質を結合した活性ジスル
フイド基を有する血清アルブミンを反応せしめる
か、または、誘導または導入した活性ジスルフイ
ド基を有する下記式〔〕 Ab〔―（B2）t2S2X〕o′ ……〔〕 〔Abの定義は式〔〕に同じ。S2，B2及びt2の
定義は式〔〕に同じ。n′の定義は式〔〕に同
じ。Ｘの定義は式〔〕に同じ。〕 で表わされる免疫グロブリンまたはそのフラグメ
ントと、下記式〔〕 HS1―Al（―NH―Cy）n ……〔〕 〔Al，Cy，S1，NH及びｍの定義は式〔〕に
同じ。〕 で表わされる細胞毒性物質を結合した血清アルブ
ミンを反応せしめることにより製造することがで
きる。 前記式〔〕において、t2＝０の場合には、式
〔〕で表わされる免疫グロブリンまたはそのフ
ラグメントは、Fab′，IgMより得られる一量体
IgMsによつて代表される如くそれ自体チオール
基を有するか、またはジスルフイド基より発生せ
しめたチオール基を有する免疫グロブリンまたは
そのフラグメントである。t2＝１である式〔〕
で表わされる導入されたチオール基を有する免疫
グロブリンまたはそのフラグメントは、例えば免
疫グロブリンまたはそのフラグメントに前記式
〔〕または〔XI〕で表わされる架橋剤を反応さ
せた後、導入された活性ジスルフイド基より還元
操作によりチオール基を発生せしめるか、また
は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントに前
記式〔XII〕または〔〕で表わされる架橋剤を
反応させることにより製造することができる。 上記式〔〕において、t2＝０の場合には、か
かる活性ジスルフイド基を有する免疫グロブリン
またはそのフラグメントは、例えば、それ自体の
または発生せしめたチオール基を有する免疫グロ
ブリンまたはそのフラグメントに活性ジスルフイ
ド基導入剤を作用させることにより製造すること
ができる。 上記の目的に用いることができる活性ジスルフ
イド化合物としては、例えば、２―ピリジルジス
ルフイド
エニルエステル、β―（Ｎ―マレイミド）プロピ
オン酸Ｎ―ヒドロキシサクシンイミドエステル等
を挙げることができる。 本発明の細胞毒性複合体は、免疫グロブリンま
たはそのフラグメントと、細胞毒性物質を結合せ
しめた血清アルブミンを、共有結合させることに
より製造することができる。例えば、本発明の細
胞毒性複合体の内式〔―１〕で表わされる複合
体は、例えば、発生または導入したチオール基を
有する下記式〔〕 Ab〔―（B2）t2―S2H〕o′ ……〔〕 〔Abの定義は式〔〕に同じ。S2，B2及びt2の
定義は式〔〕に同じ。n′は１〜10の整数であ
る。〕 で表わされる免疫グロブリンまたはそのフラグメ
ントと、下記式〔〕 XS1―Al（―NH―Cy）n ……〔〕 〔Al，Cy，S1，NH及びｍの定義は式〔〕に
同じ。Ｘは隣接する硫黄原子と共に活性ジスルフ
イド結合を形成し得る基を表わす。〕 で表わされる細胞毒性物質を結合した活性ジスル
フイド基を有する血清アルブミンを反応せしめる
か、または、誘導または導入した活性ジスルフイ
ド基を有する下記式〔〕 Ab〔―（B2）t2S2X〕o′ ……〔〕 〔Abの定義は式〔〕に同じ。S2，B2及びt2の
定義は式〔〕に同じ。n′の定義は式〔〕に同
じ。Ｘの定義は式〔〕に同じ。〕 で表わされる免疫グロブリンまたはそのフラグメ
ントと、下記式〔〕 HS1―Al（―NH―Cy）n ……〔〕 〔Al，Cy，S1，NH及びｍの定義は式〔〕に
同じ。〕 で表わされる細胞毒性物質を結合した血清アルブ
ミンを反応せしめることにより製造することがで
きる。 前記式〔〕において、t2＝０の場合には、式
〔〕で表わされる免疫グロブリンまたはそのフ
ラグメントは、Fab′，IgMより得られる一量体
IgMsによつて代表される如くそれ自体チオール
基を有するか、またはジスルフイド基より発生せ
しめたチオール基を有する免疫グロブリンまたは
そのフラグメントである。t2＝１である式〔〕
で表わされる導入されたチオール基を有する免疫
グロブリンまたはそのフラグメントは、例えば免
疫グロブリンまたはそのフラグメントに前記式
〔〕または〔XI〕で表わされる架橋剤を反応さ
せた後、導入された活性ジスルフイド基より還元
操作によりチオール基を発生せしめるか、また
は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントに前
記式〔XII〕または〔〕で表わされる架橋剤を
反応させることにより製造することができる。 上記式〔〕において、t2＝０の場合には、か
かる活性ジスルフイド基を有する免疫グロブリン
またはそのフラグメントは、例えば、それ自体の
または発生せしめたチオール基を有する免疫グロ
ブリンまたはそのフラグメントに活性ジスルフイ
ド基導入剤を作用させることにより製造すること
ができる。 上記の目的に用いることができる活性ジスルフ
イド化合物としては、例えば、２―ピリジルジス
ルフイド
【式】４―ピリ
ジルジスルフイド
【式】５，5′―ジチオ
ビス（２―ニトロ安息香酸）
【式】４―カ
ルボキシ―２―ピリジルジスルフイド
Ｎ―オキシ―２―ピリジルスルフイド
【式】２―ニトロフエニ
ルジスルフイド
【式】４
―ニトロ―２―ピリジルジスルフイド
【式】２―ベ
ンゾチアゾイルジスルフイド
【式】２―ベ
ンゾイミダゾイルジスルフイド
【式】Ｎ―フ
エニルアミノ―N′―フエニルイミノメチルジス
ルフイド を挙げることができる。 また、前述のＦ（ab′）2のヒンジ部分のジスルフ
イド結合を、例えば亜硫酸イオンによりスルホ化
分解して分子中にＳ―スルホ基（―Ｓ―SO3 -）
を有するFab′を得ることができるが、この物も、
式〔〕で表わされる細胞毒性物質を結合した血
清アルブミンと好適に反応して、式〔―１〕で
表わされる細胞毒性複合体を生成する。 式〔〕または〔〕で表わされる細胞毒性物
質を結合した血清アルブミンの製造方法について
は後述する。 また、本発明の細胞毒性複合体の内式〔―
２〕で表わされる複合体は、例えば、前記式
〔〕で表わされる発生または導入したチオール
基を有する免疫グロブリンまたはそのフラグメン
トと、前記式〔〕で表わされる細胞毒性物質を
結合した血清アルブミンを、チオール基と反応し
得る官能基を２個有する架橋剤を用いて結合する
ことにより製造することができる。本反応を行な
う場合は、２段階の反応として行なうのが好まし
い。即ち、最初に、式〔〕で表わされる発生ま
たは導入したチオール基を有する免疫グロブリン
またはそのフラグメントか、或いは式〔〕で表
わされる細胞毒性物質を結合した血清アルブミン
に、過剰の、例えば式〔〕で表わされる架橋剤
を反応させ、精製処理をほどこした後、得られた
中間体に他方の蛋白を作用せしめる。以上の反応
手順により、目的とする式〔―２〕で表わされ
る細胞毒性複合体を得ることができる。 さらに、本発明の細胞毒性複合体の内式〔〕
で表わされる複合体は、例えば、上記式〔〕で
表わされる細胞毒性物質を結合した血清アルブミ
ンと、下記式〔〕 〔Abの定義は式〔〕に同じ。n′の定義は式
〔〕に同じ。B4の定義は式〔〕に同じ。〕 で表わされる導入されたマレイミド基をもつ免疫
グロブリンまたはそのフラグメントを反応せしめ
ることにより製造することができる。 上記式〔〕で表わされる導入されたマレイミ
ド基をもつ免疫グロブリンまたはそのフラグメン
トは、例えば、免疫グロブリンまたはそのフラグ
メントに前記式〔〕で表わされるマレイミド
基を有する架橋剤を反応せしめることにより製造
することができる。 次に、前記式〔〕または〔〕で表わされる
細胞毒性物質を結合した血清アルブミンの製造方
法について述べる。かかる細胞毒性物質を結合し
た血清アルブミンは各種の方法により製造できる
が、例示すれば以下の通りである。 先ず血清アルブミンが有するチオール基に、前
記式〔〕で表わされる活性ジスルフイド基を有
する免疫グロブリンまたはそのフラグメントの製
造法の項で例示した２―ピリジルジスルフイド
基、４―ピリジルジスルフイド等の活性ジスルフ
イド化合物を反応させて、下記式〔〕 XS1―Al ……〔〕 〔Al，S1及びＸの定義は式〔〕に同じ。〕 で表わされる活性ジスルフイド基を有する血清ア
ルブミンを得る。次いでこれを適当な細胞毒性物
質と反応させて、アルブミンのアミノ基に細胞毒
性物質を結合せしめることにより、前記式〔〕
で表わされる細胞毒性物質を結合した活性ジスル
フイド基を有する血清アルブミンを得る。前記式
〔〕で表わされる血清アルブミン誘導体は、例
えば、上記の如くして得た式〔〕で表わされる
活性ジスルフイド基を有するアルブミン誘導体を
２―メルカブトエタノールまたはジチオスレイト
ールで処理することにより得ることができる。 また、下記の方法によつても前記式〔〕また
は〔〕で表わされる細胞毒性物質を結合した血
清アルブミンを製造することができる。血清アル
ブミンを、そのチオール基を活性ジスルフイド基
に変換することなく、直ちに適当な細胞毒性物質
と反応させて、アルブミンのアミノ基に細胞毒性
物質を結合せしめ、次いで、２―メルカプトエタ
ノールまたはジチオスレイトール等のチオール試
薬で処理し、アルブミンのジスルフイド基または
アルブミンのチオール基にシステインやグルタチ
オンが結合して生じたジスルフイド基を切断する
ことにより前記式〔〕で表わされる血清アルブ
ミン誘導体を得る。前記式〔〕で表わされる細
胞毒性物質を結合した活性ジスルフイド基を有す
る血清アルブミンは、例えば、上記の如くして得
た式〔〕で表わされる誘導体のチオール基に、
２―ピリジルジスルフイド、４―ピリジルジスル
フイド、５，5′―ジチオビス（２―ニトロ安息香
酸）等の活性ジスルフイド化合物を反応させて製
造することができる。 本発明の細胞毒性複合体の製造法を例示すれば
次の通りである。 (1) 式〔〕で表わされる発生または導入したチ
オール基を有する免疫グロブリンまたはそのフ
ラグメントと式〔〕で表わされる細胞毒性物
質を結合した活性ジスルフイド基を有する血清
アルブミンを反応させるか、式〔〕で表わさ
れる活性ジスルフイド基を有する免疫グロブリ
ンまたはそのフラグメントと式〔〕で表わさ
れる細胞毒性物質を結合した血清アルブミンを
反応させる方法。 これらの方法においては、式〔〕で表わさ
れるチオール基を有する免疫グロブリンまたは
そのフラグメント１モルに対し、式〔〕で表
わされる細胞毒性物質を結合した活性ジスルフ
イド基を有する血清アルブミンを0.3〜20モル
の割合で使用するのが好ましい。反応は、両蛋
白をPH５〜10の緩衡液に合計の蛋白濃度が0.5
〜100mg／ml（より好ましくは１〜20mg／ml）
になるように混じ、０〜60℃でで静置、もしく
は反応混液と同じPHの緩衡液に対し透析するこ
とにより行なうことができる。反応時間は反応
スケール、反応条件によるが、一般には４時間
〜３日間である。得られた細胞毒性複合体の、
反応混合物からの分離、精製は通常用いられる
操作、例えば透析、分子ふるいのカラムクロマ
トグラフイーによつて行なうことができる。 (2) 式〔〕で表わされるチオール基を有する免
疫グロブリンまたはそのフラグメントと式
〔〕で表わされる細胞毒性物質を結合した血
清アルブミンを、両者のチオール基と反応しう
る前述した式〔〕の架橋剤を用いて結合する
方法。 この方法において、反応はチオール基を有す
る免疫グロブリンまたはそのフラグメント、架
橋剤、細胞毒性物質を結合した血清アルブミン
三者を同時に接触させて行なうこともできる
が、好ましくはどちらか一方の蛋白に架橋剤を
反応させた後、次いで、その生成物に他方の蛋
白を反応せしめることにより製造される。まず
架橋剤を反応させる蛋白１モルに対し、好まし
くは、架橋剤及び他方の蛋白がそれぞれ0.8〜
50モル、0.8〜10モル用いられる。反応はまず、
チオール基を有する免疫グロブリンまたはその
フラグメント或いは細胞毒性物質を結合した血
清アルブミンのPH５〜10の緩衡液の溶液（蛋白
濃度は好ましくは0.5〜100mg／ml、より好まし
くは１〜20mg／mlに調製する）に、０〜60℃で
攪拌しながら、少量の溶媒、例えば、Ｎ，
N′―ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホ
キシド、１，２―ジメトキシエタン、メタノー
ル、エタノール、アセトン等に溶かした架橋剤
を添加して行なわれる。次いで、透析または分
子ふるいのカラムクロマトグラフイーにより、
未反応の架橋剤を除いた後、もう一方の蛋白の
PH６〜10の緩衡液の溶液（好ましい蛋白濃度の
範囲は上に記載したのと同じである）を添加し
て、０〜60℃で反応せしめる。上記方法によつ
て得られる細胞毒性複合体の、反応混合物から
の分離、精製は通常用いられる操作、例えば分
子ふるいのカラムクロマトグラフイーによつて
行なうことができる。 (3) 式〔〕で表わされる細胞毒性物質を結合し
た血清アルブミンと式〔〕で表わされる導入
されたマレイミド基をもつ免疫グロブリンまた
はそのフラグメントを反応させる方法。 この方法においては、式〔〕で表わされる
導入されたマレイミド基をもつ免疫グロブリン
またはそのフラグメント１モルに対し式〔〕
で表わされる細胞毒性物質を結合した血清アル
ブミンを0.3〜10モルの割合で使用するのが好
ましい。反応は、両蛋白をPH５〜10の緩衡液に
合計の蛋白濃度が0.5〜100mg／ml（より好まし
くは１〜20mg／ml）になるように混じ、０〜60
℃で静置して行なうことができる。反応時間は
反応スケール、反応条件によるが、一般には４
時間〜３日間である。得られた細胞毒性複合体
の、反応混合物からの分離、精製は通常用いら
れる操作、例えば透析、分子ふるいのカラムク
ロマトグラフイーによつて行なうことができ
る。 本発明における化合物は患者に対し、静注、動
注等の投与方法により投薬される。 製薬は、無菌の水性液剤として与えられる。こ
のような製剤はまた、防腐剤、安定剤のような補
助剤を含むことができる。 これらの溶液剤は、例えばバクテリア保留フイ
ルターをとおす濾過、殺菌剤の配合、あるいは照
射等の処理を適宜行うことによつて無菌化でき
る。また無菌の固形製剤を製造し、使用直前に無
菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用する
ことができる。 本発明の癌用治療用の有効投与量は年令、性
別、患者の状態により異なるが、一般には102〜
105μｇ／人／day程度に投与するのがよい。 本発明の癌治療用剤の実験動物に対する毒性
は、結合する細胞毒の種類にもよるが、一般に、
細胞毒そのものの毒性よりも弱い。例えば、マイ
トマシンＣとの結合体のマウスに対するLD50値
は、約3000mg／Kgである。 以下実施例により本発明を詳述する。 参考例 １ (イ) 抗マウス白血病L1210 IgGの精製 マウス白血病L1210細胞１×106個をフロイ
ント完全アジユバンドとのエマルジヨンとし、
家兎に静脈注射した。その後更に、１週間間隔
で３回、それぞれ約１×106個のL1210細胞を
アジユバンドと共に皮下注射し、最終投与日か
ら８日後に採血した。得られた血液をプール
し、血清を分離し、その血清を56℃、30分間加
熱、非働化した。こうして得られた抗L1210血
清200mlに、硫安の飽和水溶液200mlを加えて、
生じた沈澱を遠心分離によつて分取した。この
沈澱を0.01Mリン酸緩衡液（PH7.6）50mlに溶
解し、更に同緩衡液に対して十分に透析した。
この透析内液を同じ緩衡液で平衡化したジエチ
ルアミノエチルセルロースカラムクロマトグラ
フイー（カラムサイズ３cm×94cm）かけて、未
吸着分画として抗L1210 IgGを含む溶液を得
た。 (ロ) 免疫グロブリンよりＦ（ab′）2フラグメントの
分離 上記(イ)の如くして得られた抗L1210 IgGの
1.2ｇを0.1M酢酸緩衡液（PH4.5）40mlに溶解
し、24mgのペプシンを添加して、37℃で約18時
間分解した後、分解生成物を生理食塩水中でセ
フアデツクスG200カラムクロマトグラフイー
（カラムサイズ3.5cm×140cm）にかけて、分子
量約10万のところに流出する蛋白として純粋な
Ｆ（ab′）2フラグメントを得た。 (ハ) Fab′フラグメントの調製 上記(ロ)の如くして得られたＦ（ab′）2フラグメ
ント18.4mgを含む0.01Mトリス・塩酸―0.14M
塩化ナトリウム（以後NaClと省略する）―
2mMエチレンジアミン四酢酸（以後EDTAと
省略する）溶液（PH8.3）2.0mlに、150nMの２
―メルカプトエタノール水溶液を0.02ml加え
て、37℃で１時間還元した。反応後、その溶液
を5mM酢酸緩衡液―0.14M塩化ナトリウム―
1mMEDTA溶液（PH5.5）（以下、ANE緩衡液
と略す）で平衡化したセフアデツクスG25カラ
ムクロマトグラフイー（1.0cm×20cm）にかけ
て２―メルカプトエタノールを除去し、チオー
ル基１個を有するFab′フラグメントを得た。 (ニ) IgMの精製 (イ)の如くして、得られた抗L1210抗血清100
mlに飽和硫安溶液100mlを添加し、生じた沈澱
を遠心分離した。沈澱を、少量の0.9％塩化ナ
トリウム溶液に溶解し、1mM塩化マンガン、
1mM塩化マグネシウム、1mM塩化カルシウム
及び0.5M塩化ナトリウムを含む0.1Mトリス塩
酸緩衡液（PH7.4）に十分に透析した。次いで
同緩衡液に平衡化したCon Ａセフアロース
（1.5×20cmにかけ、0.5Mメチル―α―Ｄ―グ
リコシドの存在下、37℃にて溶出した。溶出画
分に同容積の飽和硫安溶液を加え、生じた沈澱
を遠心分離し、0.9％塩化ナトリウムに溶解し
た。更に、遠心分離して生じた不溶液を除いた
のち、0.9％塩化ナトリウム溶液に平衡化した
セフアデツクＧ・200カラムクロマトグラフイ
ー（2.2cm×102cm）にかけ、第１ピークにIgM
画分をえた。 こうして得たIgM画分は、同容積の飽和硫安
溶液を加えて生じた沈澱を遠心分離した後、少
量の0.9％塩化ナトリウム溶液にかし、0.9％塩
化ナトリウム溶液に充分透析した。 (ホ) IgM5の調製 0.9％塩化ナトリウム溶液に溶解したウサギ
IgM（9.5mg／ml）1.8mlに、1Mトリス塩酸緩衡
液（PH8.6）に溶解した0.2Mシステイン0.2mlを
混合し、室温16時間還元した後、セフアデツク
スＧ―25（0.8×43cm）を用いるゲル２過
（2mM酢酸緩衡溶液―0.14M NaCl―1mM
EDTA（PH5.5）により、過剰のシステインを除
いた。 (ヘ) 抗マウス乳癌MM46Ig2bモノクローン抗体の
調製 細胞融合法により得られた抗MM46 IgG2b
抗体産生性ハイブリドーマ（瀬戸加大ら、ジヤ
ーナル オブ イムノロジー（J.Immunol）、
第128巻、201〜205頁、1982年参照）を、ヌー
ドマウス15匹の腹腔に、一匹当り２×107個接
種し、10日後に腹水液を採取し、得られた腹水
液50mlを遠心し、その上清を５の0.1Mリン
酸緩衡液（PH8.0）に十分透析した。透析内液
を同じ緩衡液で十分に平衡化されたプロテイン
Ａ・セフアロースカラム（カラムサイズ1.5×
12.5cm）にかけて、十分に素通り蛋白を流し出
した後、0.1Mクエン酸緩衡液（PH5.0）で不純
蛋白を溶出し、その後0.1Mクエン酸緩衡液
（PH3.0）で吸着していたIgG2bを溶出し、溶出
液のPHを2M Tris―HCl緩衡液（PH8.2）で中
性にもどし、その後５の20mMリン酸緩衡液
（PH7.5）に十分透析し、105mg（17.7ml）の抗
MM46モノクローン抗体（IgG2b）を得た。ま
た、正常マウス血清50mlより、上記と同様にし
て非免疫IgG2b25mg（7.0ml）を得た。 (ト) 抗マウス乳癌MM46 IgMモノクローン抗体
の調製 細胞融合法により得られた抗MM46 IgM抗
体産生性ハイブリードーマ（瀬戸加大ら、ジヤ
ーナル オブ イムノロジー（J.Jmmunol.）、
第128巻、201〜205頁、1982年参照）を、ヌー
ドマウスの腹腔に、一匹当り１×106個接種し、
14日後より１日おきに３回腹水液を採取し、全
マウスより得られた腹水液を遠心し、得られた
上清100mlに0.9％食塩水100mlと飽和硫酸アン
モニウム水200mlを加えて４℃に一夜放置した。
生じた沈殿を遠心分離により分離し、0.9％食
塩水40mlに溶かして、0.1Mトリス・塩酸緩衡
液―1mM塩化マンガン―1mM塩化カルシウム
―1mM塩化カルシウム―1mM塩化マグネシウ
ム―0.5M塩化ナトリウム（PH7.8）（緩衡液Ｉ）
に対して透析した。得られた溶液を、緩衡液Ｉ
に平衡化されたコンA.セフアロースカラム
（カラムサイズ1.5×16cm）に４℃でかけた。カ
ラムより緩衡液Ｉで十分に素通り蛋白を流し出
した後、カラムを37℃に加温し、0.5Mメチル
―α―Ｄ―グルコシドを含む緩衡液ＩでIgM蛋
白を溶出させた。溶出液を濃縮し、３回に分け
て、0.9％食塩水中でセフアロース4Bカラム
（カラムサイズ2.0×92cm）を用いてゲル過を
行い、IgM分画を濃縮し、0.9％食塩水に透析
して抗MM46Ig抗体を得た。 (チ) 抗MM46IgMモノクローン抗体のIgMsフラ
グメントの調製 上記(ト)の如くして得られたMM46IgM抗体の
溶液（10.0mg／ml）3.8mlに、0.4ML―システイ
ンの1Mトリス・塩酸緩衡液（PH8.0）溶液0.2
mlを加え、24時間37℃に放置し、次いで0.5M
ヨードアセトアミドの1Mトリス・塩酸緩衡液
（PH8.0）溶液0.2mlで10分処理した。反応液を
0.1Mリン塩緩衡液―0.1M塩化ナトリウム（PH
7.0）（緩衡液）に対して透析して、抗
MM46IgMモノクローン抗体のIgMsフラグメ
ントを得た。 実施例 １ １―(イ) 参考例１―(ホ)で得られたIgMs12.4mgを溶解
した緩衡液（5mM酢酸緩衡液―0.14M塩化ナ
トリウム、PH5.5、以下緩衡液Ａと省略する）
1.8mlに、緩衡液Ａに溶解した、架橋剤Ｎ，
N′―ビス（マレイミドメチル）エーテル（以
下BMEと省略する）の飽和溶液1.8mlを混合
し、室温で30分反応させた後、過剰のBMEを、
セフアデツクスＧ―25（0.8×43m、溶媒は緩衡
液Ａ）を用いるゲルろ過により除いた。相当す
る画分を集め修飾IgMs10.2mgを含有する溶液
7.7mlが得られた（１〜１〜）。この溶液は、直ち
に、１―(ハ)における反応に使用した。 １―(ロ) 一方、公知の方法（シージエイバーネツトら
（C.J.Barnett）、ジヤーナル オブ メデイシ
ナル ケミストーリ、（Jurnal of Medicinal
Chemistry）第21巻、第88〜96頁、1978年参
照）により、式１―２〜で示されるデスアセチル
ビンブラスチン酸アジド中間体を得た。即ち、
デスアセチルビンプラスチン酸ヒドラジド10mg
を、1N塩酸0.5mlに溶解し、0゜にて0.1N亜硝酸
ソーダ溶液を0.15ml加えた。５分間反応後0゜に
てテトラヒドロフラン0.5mlを加え、1N水酸化
ナトリウム0.5mlで中和すると、式１〜２で示
される反応性のデスアセチルビンブラスチン酸
アジド中間体を含む溶液が得られた。上記溶液
に、下記実施例３―(イ)で得られた２―チオピリ
ジル化した人血清アルブミン46mgを含有する
0.2Mホウ酸緩衡液（PH9.0）5.0mlを加え、室温
にて２時間攪拌した。次いで1Nのアンモニア
0.1mlを加えてさらに２時間反応せしめた。反
応液をセフアデツクスＧ―25のカラム（１cm×
40cm、溶媒は0.1Mリン酸―0.1M塩化ナトリウ
ム緩衡液PH7.5）に通して溶媒を交換し、相当
する画分を集めた（12.5ml）。 次いで4゜にて1Mジチオスレイトール
（DTT）（溶媒は、0.1Mリン酸緩衡液PH7.5）
4.0μを加え、1.5時間反応せしめたのち（１
―３〜）、反応液をセロフアンチユーブに入れ、
緩衡液Ａに対して4゜にて充分透析した。回収液
（13.0ml）に含有される生成物の蛋白質及び薬
剤濃度は、２つの波長、即ち、280nmと270nm
における吸光度を測定し、得られた値を同じ２
波長に対する非修飾人血アルブミンおよび非修
飾ビンブラスチンの吸光度に関連づけて決定し
た。人血清アルブミン蛋白質量は、35mg、デス
アセチルビンブラスチン残基量と、蛋白量の比
より、人血清アルブミン１分子には薬剤が平均
4.9個結合していることが判明した。又、人血
清アルブミンのチオール基は下記実施例２―(ハ)
の方法で定量した結果、平均0.67個であつた。 １―(ハ) １―(イ)で得られた修飾IgMsの溶液2.0mlと、
１―(ロ)で得られたデスアセチルビンブラスチン
を結合した人血清アルブミンの溶液3.0mlを混
合し、4゜で一夜反応せしめた。反応液をソデウ
ムドデシルサルフエート電気泳動により調べる
と、生成物はIgMsにHSAが結合した式１―４〜
で表わされる複合体を含有する事が判明した。
セフアデツクスＧ―150スーパーフアインのカ
ラム（1.5×90cm）を用いるゲルろ過により精
製して複合体を得た。 実施例 ２ ２―(イ) マレイミド基を導入したIgG抗体の調製 上記参考例１―(イ)で得られたウサギIgG30mg
0.1Mリン酸緩衡液―0.1M塩化ナトリウム（以
後NaClと省略する）（PH7.0）1.0mlの溶液とし、
これにＮ―サクシイミジルｍ―マレイミドベン
ゾエート（以下SMBと略す）の100mMジメチ
ルホルムアミド（以下DMFと省略）溶液20μl
を室温下に加え、35分間ゆつくり攪拌したの
ち、素速くセフアデツクスＧ―25のカラム
（1.0×40cm、0.1Mリン酸緩衡液PH6.5）に通し、
低分子を除くと、マレイミド基を導入されたウ
サギIgGを含む溶液9.5mlが得られた（２―１〜）。 かくして得られた溶液に含有される蛋白質の
量及び、IgG分子に導入されたマレイミド基の
数は下記のごとく定量した。 IgGの量は280nmの吸光度測定より29.2mgで
あつた。 IgGの分子に導入されたマレイミド基の数
は、下記のごとく、適当量のサンプル中のIgG
及びマレイミド基の量を定量して求めた。溶液
1.0mlを取り、Ｎ―（２，４―ジニトロフエニ
ル）システイン（以下DNPシステインと省略）
100mM DMF溶液5μを加え、4゜で一夜放置
した。反応液をセフアデツクスＧ―25（0.01M
―リン酸ナトリウム緩衡液―0.14M NaClPH
7.0）に0.01M―リン酸ナトリウム緩衡液―
0.14M NaClで通し、蛋白溶出部をプールし
た。280nmの吸収極大よりIgGの濃度を、
360nmの吸収極大より、マレイミド基に反応し
たDNP―システイン残基の濃度を求めた。た
だし、DNP―システイン残基の280nmにおけ
る吸光度は、360nmの極大値の28.1％として、
IgG濃度の算出値を補正した。 以上の手続きにより、IgG分子に導入された
DNP―システインと反応性のマレイミ基の数
を求めた。 〔DNP〕／〔IgG〕＝DNPの吸光度／DNPの分子吸光係数／
IgGの吸光度／IgGの分子吸光係数＝0.237／17000／0.80
2／2.025×105＝3.52 一方、マレイミド基量の定量に用いたDNP
一方システインのIgGへの非特異的吸着による
測定値誤差を修正するために、次の実験を行な
つた。 ウサギIgG3.15mgの0.1Mリン酸緩衡液0.14M
NaCl（PH6.5）1.0mlに、上記DNP―システイン
溶液5.0μを加え、4゜で１夜放置したのち、セ
フアデツクスＧ―25で、上記と同様に分離し、
蛋白質溶出部をまとめた。280nmと360nmの吸
光度よりIgG1分子に吸着したDNP―システイ
ンの数を求めると、 〔DNP〕／〔IgG〕＝0.008／17000／0.504／2.025×10
5＝0.19 この値によつて、上で求めたマレイミド基数
を補正すると、3.52―0.19＝3.33 即ち、IgG分子に導入されたマレイミド基の
数は3.33コである。 ２―(ロ) ２―ピリジルジチオ基を含有する牛血清
アルブミンの調製 牛血清アルブミン（以下BSAと省略する）
の結晶（市販品）132mgを0.1Mリン酸ナトリウ
ム緩衡液―0.1M NaCl―1mMEDTA溶液（PH
7.0）5.0mlに溶解し、２―ピリジルジスルフイ
ド4.4mgをDMF0.1mlに溶解した溶液を添加し、
4゜で１夜反応した。反応液をセロフアンチユー
ブに入れ、４℃にて２日間、0.01Mリン酸緩衡
液―0.4M NaCl―1m MEDTA（PH7.0）に対し
て透析した。透析回収液をセフアデツクスＧ―
25（0.01Mリン酸緩衡液―0.14M NaCl―
1mMEDTA、PH7.0）（１cm×40cm）のカラム
に通し、蛋白質溶出部10.2mlを得た。回収BSA
量、96.3mg（280nmの吸光度による）。 得られた２―ピリジルジチオ基を有する
BSA上の活性ジスルフイド残基の量は、１部
のサンプルに過剰のジチオスレイトールを作用
させ、遊離したチオピリドンの吸収極大値
（343nm）における吸収度を測定して定量した。
１方、該サンプル中のBSAの量は、280nmに
おける吸光度を測定して求めた。BSA1分子に
存在する活性ジスルフイド残基の数は、これら
の測定値の比で表わされる。即ち、濃度比で表
わせば、 〔２―ピリジルチオ基〕／〔BSA〕＝0.089／8080 ／0.725／4.3600＝0.66 ２―(ハ) マイトマイシン―Ｃ（以後MMCと省略）
を結合したBSA（２―２〜）の調製 ２―(イ)で得られた２―ピリジルジチオ基を有
するBSA14.1mgを溶解した0.03M―リン酸緩衡
液―0.03M NaCl（PH7.6）1.5mlに、1a―（４―
サクシンイミジルオキシカルボニルブチリル）
―７―アミノ―9a―メトキシマイトサン4.1 １
mgをDMF50μに溶解して加え、4゜で５時間攪
拌した後、同じバツフアーに溶かした1Mジチ
オスレイトール4.28μを加えて、1.5時間４℃
に保つた。反応液を0.01M酢酸緩衡液―0.14M
NaCl―0.01mMEDTA（PH5.25）に対して４℃
で17時間透析した。回収液1.60mlに含有される
MMC結合BSAの量は、280nmでの吸光度測度
により14mgであつた。 さらに、回収液に含有されるMMC結合BSA
（２―２〜）について、回収液の一部を使つて下
記の定量を行なつた。 BSA分子に結合したMMCの数（MMC／
BSA）MMCの吸収極大360nmにおける吸光度
よりMMC残基量を、BSAの吸収極大280nmお
ける吸光度よりBSA量を求めた。ただし、
280nmにおけるMMCの吸光度は極大値360nm
の吸収の4.1％として、BSAの吸光度を補正し
た。その結果 〔MMC残基〕／〔BSA〕＝959μM／137μM＝7.0 BSA分子に再生したチオールの数（HS−／
BSA）反応生成物の１部を0.1Mリン酸緩衡液
―0.1M NaCl―1m MEDTA（PH7.6）の溶液
中、過剰の５，5′―ジチオビス―（２―ニトロ
安息香酸）〔DTNB〕を加え、４℃で一夜反応
した。反応液をセフアデツクスＧ―25（0.01M
―リン酸ナトリウム緩衡液―0.14M NaCl―
1m MEDTA）に通し、蛋白部をプールする。
このものについて、280nmの吸収よりBSAの
濃度を求め、さらに、過剰のジチオスレイトー
ルを加えることにより遊離した５―メルカプト
―２―ニトロ安息香酸に由来する412nmにおけ
る吸収を測定することによつて、MMC結合
BSAに含有されるチオール基の濃度を定量で
きた。これらの比を求めると、 〔チオール残基〕／〔BSA〕 ＝〔1.47〕／〔2.10〕＝0.70 以上の定量値より、得られたMMC結合アル
ブミンは、 ２―２〜式で表わされる。 ２―(ニ) SMB化IgGとMMC結合BSAの反応によ
る複合体（２―３〜）の調製 上記２―(イ)で得られたマレイミド基を平均
3.33個含有するIgGの溶液（0.1Mリン酸緩衡液
―0.1M NaCl、PH6.5）1.5ml、上記２―(ハ)で得
られた、MMを平均7.0個結合したBSAの溶液
（0.01M酢酸緩衡液0.14M NaCl―0.01m
MEDTA，PH5.25）1.5mlを混合し、４℃で１
夜反応せしめた。反応液をナトリウムドデシル
サルフエート（以下SDSと省略する）電気泳動
で調べることにより、生成物は、IgGにMMC
結合BSAが１〜３個結合した複合体（２−３〜）
を主成分とすることが判明した。セフアデツク
スＧ―150スーパーフアインのカラム（1.8×80
cm）を用いることにより、複合体を精製した。 ２―(ホ) L1210細胞に対する複合体（２―３〜）の
細胞毒性 上記２―(ニ)の如くして得られた複合体（２―
３〜）の標的細胞L1210に対する細胞毒性を検討
した。 24穴の培養プレートに、５×104個のL1210
細胞を含むロズウエルパークメモリアルインス
テチユート1640（以下RPMI 1640と省略する）
培地（10％牛胎児血清、20μMの２―メルカプ
トエタノールと0.1mg／mlのカナマイシンを含
む）0.9mlを分注し、更に種々の濃度の被検サ
ンプル0.1mlを加え、５％CO2雰囲気下で37℃
で48時間培養後、トリパンブルー染色法により
生細胞数を測定した。 その結果、第１表に示す如く、複合体（２―
３〜）は、標的細胞L1210に対し濃度依存的に著
しい細胞増殖抑制効果を示した。尚、培養は２
系列行ない、値はその平均で示した。
ルフイド を挙げることができる。 また、前述のＦ（ab′）2のヒンジ部分のジスルフ
イド結合を、例えば亜硫酸イオンによりスルホ化
分解して分子中にＳ―スルホ基（―Ｓ―SO3 -）
を有するFab′を得ることができるが、この物も、
式〔〕で表わされる細胞毒性物質を結合した血
清アルブミンと好適に反応して、式〔―１〕で
表わされる細胞毒性複合体を生成する。 式〔〕または〔〕で表わされる細胞毒性物
質を結合した血清アルブミンの製造方法について
は後述する。 また、本発明の細胞毒性複合体の内式〔―
２〕で表わされる複合体は、例えば、前記式
〔〕で表わされる発生または導入したチオール
基を有する免疫グロブリンまたはそのフラグメン
トと、前記式〔〕で表わされる細胞毒性物質を
結合した血清アルブミンを、チオール基と反応し
得る官能基を２個有する架橋剤を用いて結合する
ことにより製造することができる。本反応を行な
う場合は、２段階の反応として行なうのが好まし
い。即ち、最初に、式〔〕で表わされる発生ま
たは導入したチオール基を有する免疫グロブリン
またはそのフラグメントか、或いは式〔〕で表
わされる細胞毒性物質を結合した血清アルブミン
に、過剰の、例えば式〔〕で表わされる架橋剤
を反応させ、精製処理をほどこした後、得られた
中間体に他方の蛋白を作用せしめる。以上の反応
手順により、目的とする式〔―２〕で表わされ
る細胞毒性複合体を得ることができる。 さらに、本発明の細胞毒性複合体の内式〔〕
で表わされる複合体は、例えば、上記式〔〕で
表わされる細胞毒性物質を結合した血清アルブミ
ンと、下記式〔〕 〔Abの定義は式〔〕に同じ。n′の定義は式
〔〕に同じ。B4の定義は式〔〕に同じ。〕 で表わされる導入されたマレイミド基をもつ免疫
グロブリンまたはそのフラグメントを反応せしめ
ることにより製造することができる。 上記式〔〕で表わされる導入されたマレイミ
ド基をもつ免疫グロブリンまたはそのフラグメン
トは、例えば、免疫グロブリンまたはそのフラグ
メントに前記式〔〕で表わされるマレイミド
基を有する架橋剤を反応せしめることにより製造
することができる。 次に、前記式〔〕または〔〕で表わされる
細胞毒性物質を結合した血清アルブミンの製造方
法について述べる。かかる細胞毒性物質を結合し
た血清アルブミンは各種の方法により製造できる
が、例示すれば以下の通りである。 先ず血清アルブミンが有するチオール基に、前
記式〔〕で表わされる活性ジスルフイド基を有
する免疫グロブリンまたはそのフラグメントの製
造法の項で例示した２―ピリジルジスルフイド
基、４―ピリジルジスルフイド等の活性ジスルフ
イド化合物を反応させて、下記式〔〕 XS1―Al ……〔〕 〔Al，S1及びＸの定義は式〔〕に同じ。〕 で表わされる活性ジスルフイド基を有する血清ア
ルブミンを得る。次いでこれを適当な細胞毒性物
質と反応させて、アルブミンのアミノ基に細胞毒
性物質を結合せしめることにより、前記式〔〕
で表わされる細胞毒性物質を結合した活性ジスル
フイド基を有する血清アルブミンを得る。前記式
〔〕で表わされる血清アルブミン誘導体は、例
えば、上記の如くして得た式〔〕で表わされる
活性ジスルフイド基を有するアルブミン誘導体を
２―メルカブトエタノールまたはジチオスレイト
ールで処理することにより得ることができる。 また、下記の方法によつても前記式〔〕また
は〔〕で表わされる細胞毒性物質を結合した血
清アルブミンを製造することができる。血清アル
ブミンを、そのチオール基を活性ジスルフイド基
に変換することなく、直ちに適当な細胞毒性物質
と反応させて、アルブミンのアミノ基に細胞毒性
物質を結合せしめ、次いで、２―メルカプトエタ
ノールまたはジチオスレイトール等のチオール試
薬で処理し、アルブミンのジスルフイド基または
アルブミンのチオール基にシステインやグルタチ
オンが結合して生じたジスルフイド基を切断する
ことにより前記式〔〕で表わされる血清アルブ
ミン誘導体を得る。前記式〔〕で表わされる細
胞毒性物質を結合した活性ジスルフイド基を有す
る血清アルブミンは、例えば、上記の如くして得
た式〔〕で表わされる誘導体のチオール基に、
２―ピリジルジスルフイド、４―ピリジルジスル
フイド、５，5′―ジチオビス（２―ニトロ安息香
酸）等の活性ジスルフイド化合物を反応させて製
造することができる。 本発明の細胞毒性複合体の製造法を例示すれば
次の通りである。 (1) 式〔〕で表わされる発生または導入したチ
オール基を有する免疫グロブリンまたはそのフ
ラグメントと式〔〕で表わされる細胞毒性物
質を結合した活性ジスルフイド基を有する血清
アルブミンを反応させるか、式〔〕で表わさ
れる活性ジスルフイド基を有する免疫グロブリ
ンまたはそのフラグメントと式〔〕で表わさ
れる細胞毒性物質を結合した血清アルブミンを
反応させる方法。 これらの方法においては、式〔〕で表わさ
れるチオール基を有する免疫グロブリンまたは
そのフラグメント１モルに対し、式〔〕で表
わされる細胞毒性物質を結合した活性ジスルフ
イド基を有する血清アルブミンを0.3〜20モル
の割合で使用するのが好ましい。反応は、両蛋
白をPH５〜10の緩衡液に合計の蛋白濃度が0.5
〜100mg／ml（より好ましくは１〜20mg／ml）
になるように混じ、０〜60℃でで静置、もしく
は反応混液と同じPHの緩衡液に対し透析するこ
とにより行なうことができる。反応時間は反応
スケール、反応条件によるが、一般には４時間
〜３日間である。得られた細胞毒性複合体の、
反応混合物からの分離、精製は通常用いられる
操作、例えば透析、分子ふるいのカラムクロマ
トグラフイーによつて行なうことができる。 (2) 式〔〕で表わされるチオール基を有する免
疫グロブリンまたはそのフラグメントと式
〔〕で表わされる細胞毒性物質を結合した血
清アルブミンを、両者のチオール基と反応しう
る前述した式〔〕の架橋剤を用いて結合する
方法。 この方法において、反応はチオール基を有す
る免疫グロブリンまたはそのフラグメント、架
橋剤、細胞毒性物質を結合した血清アルブミン
三者を同時に接触させて行なうこともできる
が、好ましくはどちらか一方の蛋白に架橋剤を
反応させた後、次いで、その生成物に他方の蛋
白を反応せしめることにより製造される。まず
架橋剤を反応させる蛋白１モルに対し、好まし
くは、架橋剤及び他方の蛋白がそれぞれ0.8〜
50モル、0.8〜10モル用いられる。反応はまず、
チオール基を有する免疫グロブリンまたはその
フラグメント或いは細胞毒性物質を結合した血
清アルブミンのPH５〜10の緩衡液の溶液（蛋白
濃度は好ましくは0.5〜100mg／ml、より好まし
くは１〜20mg／mlに調製する）に、０〜60℃で
攪拌しながら、少量の溶媒、例えば、Ｎ，
N′―ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホ
キシド、１，２―ジメトキシエタン、メタノー
ル、エタノール、アセトン等に溶かした架橋剤
を添加して行なわれる。次いで、透析または分
子ふるいのカラムクロマトグラフイーにより、
未反応の架橋剤を除いた後、もう一方の蛋白の
PH６〜10の緩衡液の溶液（好ましい蛋白濃度の
範囲は上に記載したのと同じである）を添加し
て、０〜60℃で反応せしめる。上記方法によつ
て得られる細胞毒性複合体の、反応混合物から
の分離、精製は通常用いられる操作、例えば分
子ふるいのカラムクロマトグラフイーによつて
行なうことができる。 (3) 式〔〕で表わされる細胞毒性物質を結合し
た血清アルブミンと式〔〕で表わされる導入
されたマレイミド基をもつ免疫グロブリンまた
はそのフラグメントを反応させる方法。 この方法においては、式〔〕で表わされる
導入されたマレイミド基をもつ免疫グロブリン
またはそのフラグメント１モルに対し式〔〕
で表わされる細胞毒性物質を結合した血清アル
ブミンを0.3〜10モルの割合で使用するのが好
ましい。反応は、両蛋白をPH５〜10の緩衡液に
合計の蛋白濃度が0.5〜100mg／ml（より好まし
くは１〜20mg／ml）になるように混じ、０〜60
℃で静置して行なうことができる。反応時間は
反応スケール、反応条件によるが、一般には４
時間〜３日間である。得られた細胞毒性複合体
の、反応混合物からの分離、精製は通常用いら
れる操作、例えば透析、分子ふるいのカラムク
ロマトグラフイーによつて行なうことができ
る。 本発明における化合物は患者に対し、静注、動
注等の投与方法により投薬される。 製薬は、無菌の水性液剤として与えられる。こ
のような製剤はまた、防腐剤、安定剤のような補
助剤を含むことができる。 これらの溶液剤は、例えばバクテリア保留フイ
ルターをとおす濾過、殺菌剤の配合、あるいは照
射等の処理を適宜行うことによつて無菌化でき
る。また無菌の固形製剤を製造し、使用直前に無
菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用する
ことができる。 本発明の癌用治療用の有効投与量は年令、性
別、患者の状態により異なるが、一般には102〜
105μｇ／人／day程度に投与するのがよい。 本発明の癌治療用剤の実験動物に対する毒性
は、結合する細胞毒の種類にもよるが、一般に、
細胞毒そのものの毒性よりも弱い。例えば、マイ
トマシンＣとの結合体のマウスに対するLD50値
は、約3000mg／Kgである。 以下実施例により本発明を詳述する。 参考例 １ (イ) 抗マウス白血病L1210 IgGの精製 マウス白血病L1210細胞１×106個をフロイ
ント完全アジユバンドとのエマルジヨンとし、
家兎に静脈注射した。その後更に、１週間間隔
で３回、それぞれ約１×106個のL1210細胞を
アジユバンドと共に皮下注射し、最終投与日か
ら８日後に採血した。得られた血液をプール
し、血清を分離し、その血清を56℃、30分間加
熱、非働化した。こうして得られた抗L1210血
清200mlに、硫安の飽和水溶液200mlを加えて、
生じた沈澱を遠心分離によつて分取した。この
沈澱を0.01Mリン酸緩衡液（PH7.6）50mlに溶
解し、更に同緩衡液に対して十分に透析した。
この透析内液を同じ緩衡液で平衡化したジエチ
ルアミノエチルセルロースカラムクロマトグラ
フイー（カラムサイズ３cm×94cm）かけて、未
吸着分画として抗L1210 IgGを含む溶液を得
た。 (ロ) 免疫グロブリンよりＦ（ab′）2フラグメントの
分離 上記(イ)の如くして得られた抗L1210 IgGの
1.2ｇを0.1M酢酸緩衡液（PH4.5）40mlに溶解
し、24mgのペプシンを添加して、37℃で約18時
間分解した後、分解生成物を生理食塩水中でセ
フアデツクスG200カラムクロマトグラフイー
（カラムサイズ3.5cm×140cm）にかけて、分子
量約10万のところに流出する蛋白として純粋な
Ｆ（ab′）2フラグメントを得た。 (ハ) Fab′フラグメントの調製 上記(ロ)の如くして得られたＦ（ab′）2フラグメ
ント18.4mgを含む0.01Mトリス・塩酸―0.14M
塩化ナトリウム（以後NaClと省略する）―
2mMエチレンジアミン四酢酸（以後EDTAと
省略する）溶液（PH8.3）2.0mlに、150nMの２
―メルカプトエタノール水溶液を0.02ml加え
て、37℃で１時間還元した。反応後、その溶液
を5mM酢酸緩衡液―0.14M塩化ナトリウム―
1mMEDTA溶液（PH5.5）（以下、ANE緩衡液
と略す）で平衡化したセフアデツクスG25カラ
ムクロマトグラフイー（1.0cm×20cm）にかけ
て２―メルカプトエタノールを除去し、チオー
ル基１個を有するFab′フラグメントを得た。 (ニ) IgMの精製 (イ)の如くして、得られた抗L1210抗血清100
mlに飽和硫安溶液100mlを添加し、生じた沈澱
を遠心分離した。沈澱を、少量の0.9％塩化ナ
トリウム溶液に溶解し、1mM塩化マンガン、
1mM塩化マグネシウム、1mM塩化カルシウム
及び0.5M塩化ナトリウムを含む0.1Mトリス塩
酸緩衡液（PH7.4）に十分に透析した。次いで
同緩衡液に平衡化したCon Ａセフアロース
（1.5×20cmにかけ、0.5Mメチル―α―Ｄ―グ
リコシドの存在下、37℃にて溶出した。溶出画
分に同容積の飽和硫安溶液を加え、生じた沈澱
を遠心分離し、0.9％塩化ナトリウムに溶解し
た。更に、遠心分離して生じた不溶液を除いた
のち、0.9％塩化ナトリウム溶液に平衡化した
セフアデツクＧ・200カラムクロマトグラフイ
ー（2.2cm×102cm）にかけ、第１ピークにIgM
画分をえた。 こうして得たIgM画分は、同容積の飽和硫安
溶液を加えて生じた沈澱を遠心分離した後、少
量の0.9％塩化ナトリウム溶液にかし、0.9％塩
化ナトリウム溶液に充分透析した。 (ホ) IgM5の調製 0.9％塩化ナトリウム溶液に溶解したウサギ
IgM（9.5mg／ml）1.8mlに、1Mトリス塩酸緩衡
液（PH8.6）に溶解した0.2Mシステイン0.2mlを
混合し、室温16時間還元した後、セフアデツク
スＧ―25（0.8×43cm）を用いるゲル２過
（2mM酢酸緩衡溶液―0.14M NaCl―1mM
EDTA（PH5.5）により、過剰のシステインを除
いた。 (ヘ) 抗マウス乳癌MM46Ig2bモノクローン抗体の
調製 細胞融合法により得られた抗MM46 IgG2b
抗体産生性ハイブリドーマ（瀬戸加大ら、ジヤ
ーナル オブ イムノロジー（J.Immunol）、
第128巻、201〜205頁、1982年参照）を、ヌー
ドマウス15匹の腹腔に、一匹当り２×107個接
種し、10日後に腹水液を採取し、得られた腹水
液50mlを遠心し、その上清を５の0.1Mリン
酸緩衡液（PH8.0）に十分透析した。透析内液
を同じ緩衡液で十分に平衡化されたプロテイン
Ａ・セフアロースカラム（カラムサイズ1.5×
12.5cm）にかけて、十分に素通り蛋白を流し出
した後、0.1Mクエン酸緩衡液（PH5.0）で不純
蛋白を溶出し、その後0.1Mクエン酸緩衡液
（PH3.0）で吸着していたIgG2bを溶出し、溶出
液のPHを2M Tris―HCl緩衡液（PH8.2）で中
性にもどし、その後５の20mMリン酸緩衡液
（PH7.5）に十分透析し、105mg（17.7ml）の抗
MM46モノクローン抗体（IgG2b）を得た。ま
た、正常マウス血清50mlより、上記と同様にし
て非免疫IgG2b25mg（7.0ml）を得た。 (ト) 抗マウス乳癌MM46 IgMモノクローン抗体
の調製 細胞融合法により得られた抗MM46 IgM抗
体産生性ハイブリードーマ（瀬戸加大ら、ジヤ
ーナル オブ イムノロジー（J.Jmmunol.）、
第128巻、201〜205頁、1982年参照）を、ヌー
ドマウスの腹腔に、一匹当り１×106個接種し、
14日後より１日おきに３回腹水液を採取し、全
マウスより得られた腹水液を遠心し、得られた
上清100mlに0.9％食塩水100mlと飽和硫酸アン
モニウム水200mlを加えて４℃に一夜放置した。
生じた沈殿を遠心分離により分離し、0.9％食
塩水40mlに溶かして、0.1Mトリス・塩酸緩衡
液―1mM塩化マンガン―1mM塩化カルシウム
―1mM塩化カルシウム―1mM塩化マグネシウ
ム―0.5M塩化ナトリウム（PH7.8）（緩衡液Ｉ）
に対して透析した。得られた溶液を、緩衡液Ｉ
に平衡化されたコンA.セフアロースカラム
（カラムサイズ1.5×16cm）に４℃でかけた。カ
ラムより緩衡液Ｉで十分に素通り蛋白を流し出
した後、カラムを37℃に加温し、0.5Mメチル
―α―Ｄ―グルコシドを含む緩衡液ＩでIgM蛋
白を溶出させた。溶出液を濃縮し、３回に分け
て、0.9％食塩水中でセフアロース4Bカラム
（カラムサイズ2.0×92cm）を用いてゲル過を
行い、IgM分画を濃縮し、0.9％食塩水に透析
して抗MM46Ig抗体を得た。 (チ) 抗MM46IgMモノクローン抗体のIgMsフラ
グメントの調製 上記(ト)の如くして得られたMM46IgM抗体の
溶液（10.0mg／ml）3.8mlに、0.4ML―システイ
ンの1Mトリス・塩酸緩衡液（PH8.0）溶液0.2
mlを加え、24時間37℃に放置し、次いで0.5M
ヨードアセトアミドの1Mトリス・塩酸緩衡液
（PH8.0）溶液0.2mlで10分処理した。反応液を
0.1Mリン塩緩衡液―0.1M塩化ナトリウム（PH
7.0）（緩衡液）に対して透析して、抗
MM46IgMモノクローン抗体のIgMsフラグメ
ントを得た。 実施例 １ １―(イ) 参考例１―(ホ)で得られたIgMs12.4mgを溶解
した緩衡液（5mM酢酸緩衡液―0.14M塩化ナ
トリウム、PH5.5、以下緩衡液Ａと省略する）
1.8mlに、緩衡液Ａに溶解した、架橋剤Ｎ，
N′―ビス（マレイミドメチル）エーテル（以
下BMEと省略する）の飽和溶液1.8mlを混合
し、室温で30分反応させた後、過剰のBMEを、
セフアデツクスＧ―25（0.8×43m、溶媒は緩衡
液Ａ）を用いるゲルろ過により除いた。相当す
る画分を集め修飾IgMs10.2mgを含有する溶液
7.7mlが得られた（１〜１〜）。この溶液は、直ち
に、１―(ハ)における反応に使用した。 １―(ロ) 一方、公知の方法（シージエイバーネツトら
（C.J.Barnett）、ジヤーナル オブ メデイシ
ナル ケミストーリ、（Jurnal of Medicinal
Chemistry）第21巻、第88〜96頁、1978年参
照）により、式１―２〜で示されるデスアセチル
ビンブラスチン酸アジド中間体を得た。即ち、
デスアセチルビンプラスチン酸ヒドラジド10mg
を、1N塩酸0.5mlに溶解し、0゜にて0.1N亜硝酸
ソーダ溶液を0.15ml加えた。５分間反応後0゜に
てテトラヒドロフラン0.5mlを加え、1N水酸化
ナトリウム0.5mlで中和すると、式１〜２で示
される反応性のデスアセチルビンブラスチン酸
アジド中間体を含む溶液が得られた。上記溶液
に、下記実施例３―(イ)で得られた２―チオピリ
ジル化した人血清アルブミン46mgを含有する
0.2Mホウ酸緩衡液（PH9.0）5.0mlを加え、室温
にて２時間攪拌した。次いで1Nのアンモニア
0.1mlを加えてさらに２時間反応せしめた。反
応液をセフアデツクスＧ―25のカラム（１cm×
40cm、溶媒は0.1Mリン酸―0.1M塩化ナトリウ
ム緩衡液PH7.5）に通して溶媒を交換し、相当
する画分を集めた（12.5ml）。 次いで4゜にて1Mジチオスレイトール
（DTT）（溶媒は、0.1Mリン酸緩衡液PH7.5）
4.0μを加え、1.5時間反応せしめたのち（１
―３〜）、反応液をセロフアンチユーブに入れ、
緩衡液Ａに対して4゜にて充分透析した。回収液
（13.0ml）に含有される生成物の蛋白質及び薬
剤濃度は、２つの波長、即ち、280nmと270nm
における吸光度を測定し、得られた値を同じ２
波長に対する非修飾人血アルブミンおよび非修
飾ビンブラスチンの吸光度に関連づけて決定し
た。人血清アルブミン蛋白質量は、35mg、デス
アセチルビンブラスチン残基量と、蛋白量の比
より、人血清アルブミン１分子には薬剤が平均
4.9個結合していることが判明した。又、人血
清アルブミンのチオール基は下記実施例２―(ハ)
の方法で定量した結果、平均0.67個であつた。 １―(ハ) １―(イ)で得られた修飾IgMsの溶液2.0mlと、
１―(ロ)で得られたデスアセチルビンブラスチン
を結合した人血清アルブミンの溶液3.0mlを混
合し、4゜で一夜反応せしめた。反応液をソデウ
ムドデシルサルフエート電気泳動により調べる
と、生成物はIgMsにHSAが結合した式１―４〜
で表わされる複合体を含有する事が判明した。
セフアデツクスＧ―150スーパーフアインのカ
ラム（1.5×90cm）を用いるゲルろ過により精
製して複合体を得た。 実施例 ２ ２―(イ) マレイミド基を導入したIgG抗体の調製 上記参考例１―(イ)で得られたウサギIgG30mg
0.1Mリン酸緩衡液―0.1M塩化ナトリウム（以
後NaClと省略する）（PH7.0）1.0mlの溶液とし、
これにＮ―サクシイミジルｍ―マレイミドベン
ゾエート（以下SMBと略す）の100mMジメチ
ルホルムアミド（以下DMFと省略）溶液20μl
を室温下に加え、35分間ゆつくり攪拌したの
ち、素速くセフアデツクスＧ―25のカラム
（1.0×40cm、0.1Mリン酸緩衡液PH6.5）に通し、
低分子を除くと、マレイミド基を導入されたウ
サギIgGを含む溶液9.5mlが得られた（２―１〜）。 かくして得られた溶液に含有される蛋白質の
量及び、IgG分子に導入されたマレイミド基の
数は下記のごとく定量した。 IgGの量は280nmの吸光度測定より29.2mgで
あつた。 IgGの分子に導入されたマレイミド基の数
は、下記のごとく、適当量のサンプル中のIgG
及びマレイミド基の量を定量して求めた。溶液
1.0mlを取り、Ｎ―（２，４―ジニトロフエニ
ル）システイン（以下DNPシステインと省略）
100mM DMF溶液5μを加え、4゜で一夜放置
した。反応液をセフアデツクスＧ―25（0.01M
―リン酸ナトリウム緩衡液―0.14M NaClPH
7.0）に0.01M―リン酸ナトリウム緩衡液―
0.14M NaClで通し、蛋白溶出部をプールし
た。280nmの吸収極大よりIgGの濃度を、
360nmの吸収極大より、マレイミド基に反応し
たDNP―システイン残基の濃度を求めた。た
だし、DNP―システイン残基の280nmにおけ
る吸光度は、360nmの極大値の28.1％として、
IgG濃度の算出値を補正した。 以上の手続きにより、IgG分子に導入された
DNP―システインと反応性のマレイミ基の数
を求めた。 〔DNP〕／〔IgG〕＝DNPの吸光度／DNPの分子吸光係数／
IgGの吸光度／IgGの分子吸光係数＝0.237／17000／0.80
2／2.025×105＝3.52 一方、マレイミド基量の定量に用いたDNP
一方システインのIgGへの非特異的吸着による
測定値誤差を修正するために、次の実験を行な
つた。 ウサギIgG3.15mgの0.1Mリン酸緩衡液0.14M
NaCl（PH6.5）1.0mlに、上記DNP―システイン
溶液5.0μを加え、4゜で１夜放置したのち、セ
フアデツクスＧ―25で、上記と同様に分離し、
蛋白質溶出部をまとめた。280nmと360nmの吸
光度よりIgG1分子に吸着したDNP―システイ
ンの数を求めると、 〔DNP〕／〔IgG〕＝0.008／17000／0.504／2.025×10
5＝0.19 この値によつて、上で求めたマレイミド基数
を補正すると、3.52―0.19＝3.33 即ち、IgG分子に導入されたマレイミド基の
数は3.33コである。 ２―(ロ) ２―ピリジルジチオ基を含有する牛血清
アルブミンの調製 牛血清アルブミン（以下BSAと省略する）
の結晶（市販品）132mgを0.1Mリン酸ナトリウ
ム緩衡液―0.1M NaCl―1mMEDTA溶液（PH
7.0）5.0mlに溶解し、２―ピリジルジスルフイ
ド4.4mgをDMF0.1mlに溶解した溶液を添加し、
4゜で１夜反応した。反応液をセロフアンチユー
ブに入れ、４℃にて２日間、0.01Mリン酸緩衡
液―0.4M NaCl―1m MEDTA（PH7.0）に対し
て透析した。透析回収液をセフアデツクスＧ―
25（0.01Mリン酸緩衡液―0.14M NaCl―
1mMEDTA、PH7.0）（１cm×40cm）のカラム
に通し、蛋白質溶出部10.2mlを得た。回収BSA
量、96.3mg（280nmの吸光度による）。 得られた２―ピリジルジチオ基を有する
BSA上の活性ジスルフイド残基の量は、１部
のサンプルに過剰のジチオスレイトールを作用
させ、遊離したチオピリドンの吸収極大値
（343nm）における吸収度を測定して定量した。
１方、該サンプル中のBSAの量は、280nmに
おける吸光度を測定して求めた。BSA1分子に
存在する活性ジスルフイド残基の数は、これら
の測定値の比で表わされる。即ち、濃度比で表
わせば、 〔２―ピリジルチオ基〕／〔BSA〕＝0.089／8080 ／0.725／4.3600＝0.66 ２―(ハ) マイトマイシン―Ｃ（以後MMCと省略）
を結合したBSA（２―２〜）の調製 ２―(イ)で得られた２―ピリジルジチオ基を有
するBSA14.1mgを溶解した0.03M―リン酸緩衡
液―0.03M NaCl（PH7.6）1.5mlに、1a―（４―
サクシンイミジルオキシカルボニルブチリル）
―７―アミノ―9a―メトキシマイトサン4.1 １
mgをDMF50μに溶解して加え、4゜で５時間攪
拌した後、同じバツフアーに溶かした1Mジチ
オスレイトール4.28μを加えて、1.5時間４℃
に保つた。反応液を0.01M酢酸緩衡液―0.14M
NaCl―0.01mMEDTA（PH5.25）に対して４℃
で17時間透析した。回収液1.60mlに含有される
MMC結合BSAの量は、280nmでの吸光度測度
により14mgであつた。 さらに、回収液に含有されるMMC結合BSA
（２―２〜）について、回収液の一部を使つて下
記の定量を行なつた。 BSA分子に結合したMMCの数（MMC／
BSA）MMCの吸収極大360nmにおける吸光度
よりMMC残基量を、BSAの吸収極大280nmお
ける吸光度よりBSA量を求めた。ただし、
280nmにおけるMMCの吸光度は極大値360nm
の吸収の4.1％として、BSAの吸光度を補正し
た。その結果 〔MMC残基〕／〔BSA〕＝959μM／137μM＝7.0 BSA分子に再生したチオールの数（HS−／
BSA）反応生成物の１部を0.1Mリン酸緩衡液
―0.1M NaCl―1m MEDTA（PH7.6）の溶液
中、過剰の５，5′―ジチオビス―（２―ニトロ
安息香酸）〔DTNB〕を加え、４℃で一夜反応
した。反応液をセフアデツクスＧ―25（0.01M
―リン酸ナトリウム緩衡液―0.14M NaCl―
1m MEDTA）に通し、蛋白部をプールする。
このものについて、280nmの吸収よりBSAの
濃度を求め、さらに、過剰のジチオスレイトー
ルを加えることにより遊離した５―メルカプト
―２―ニトロ安息香酸に由来する412nmにおけ
る吸収を測定することによつて、MMC結合
BSAに含有されるチオール基の濃度を定量で
きた。これらの比を求めると、 〔チオール残基〕／〔BSA〕 ＝〔1.47〕／〔2.10〕＝0.70 以上の定量値より、得られたMMC結合アル
ブミンは、 ２―２〜式で表わされる。 ２―(ニ) SMB化IgGとMMC結合BSAの反応によ
る複合体（２―３〜）の調製 上記２―(イ)で得られたマレイミド基を平均
3.33個含有するIgGの溶液（0.1Mリン酸緩衡液
―0.1M NaCl、PH6.5）1.5ml、上記２―(ハ)で得
られた、MMを平均7.0個結合したBSAの溶液
（0.01M酢酸緩衡液0.14M NaCl―0.01m
MEDTA，PH5.25）1.5mlを混合し、４℃で１
夜反応せしめた。反応液をナトリウムドデシル
サルフエート（以下SDSと省略する）電気泳動
で調べることにより、生成物は、IgGにMMC
結合BSAが１〜３個結合した複合体（２−３〜）
を主成分とすることが判明した。セフアデツク
スＧ―150スーパーフアインのカラム（1.8×80
cm）を用いることにより、複合体を精製した。 ２―(ホ) L1210細胞に対する複合体（２―３〜）の
細胞毒性 上記２―(ニ)の如くして得られた複合体（２―
３〜）の標的細胞L1210に対する細胞毒性を検討
した。 24穴の培養プレートに、５×104個のL1210
細胞を含むロズウエルパークメモリアルインス
テチユート1640（以下RPMI 1640と省略する）
培地（10％牛胎児血清、20μMの２―メルカプ
トエタノールと0.1mg／mlのカナマイシンを含
む）0.9mlを分注し、更に種々の濃度の被検サ
ンプル0.1mlを加え、５％CO2雰囲気下で37℃
で48時間培養後、トリパンブルー染色法により
生細胞数を測定した。 その結果、第１表に示す如く、複合体（２―
３〜）は、標的細胞L1210に対し濃度依存的に著
しい細胞増殖抑制効果を示した。尚、培養は２
系列行ない、値はその平均で示した。
【表】
実施例 ３
３―１〜（実施例２―(イ)で調製したもの）
３―(イ) ２―ピリジルジチオ基を有する人血清ア
ルブミンの調製 人血清アルブミン（以下HSAと省略する）
の凍結乾燥品132.0mgを、0.1Mリン酸緩衡液―
0.1M NaCl―1m MEDTA（PH7.0）5.0mlに溶
解し、２―ピリジルジスルフイド4.0mgを
DMF0.1mlに溶解した溶液を添加し、４℃で１
夜反応した。反応液をセフアデツクスＧ―25
（0.01Mリン酸緩衡液―0.14M NaCl―1m
MEDTA，PH7.0）（１cm×40cm）のカラムに通
し、蛋白質溶出部8.7mlを得た。回収HSA量、
122mg（280nmの吸光度測定による）。 得られた２―チオピリジル化HSA上の活性
ジスルフイド残基の量は、実施例２―(イ)の２―
ピリジルジチオ化BSAの場合と全く同様な手
法で定量した結果 〔２―ピリジルジチオ基〕／〔HSA〕＝0.67 であつた。 ３―(ロ) ニトロソウレア基を結合したHSA（３―
２）の調製 前記２―(イ)によつて得られた、２―ピリジル
ジスルフイド基をHSA1分子あたり平均0.67個
含有するHSA（―SS―2py）0.6713.2mgを溶解した
0.1Mリン酸ナトリウム―0.1M NaCl（PH7.5）
の緩衡液2.0mlに、Ｎ―サクシイミジル２―
〔（３―クロロエチル）―３―ニトロソウレイ
ド〕プロピオネート1.0mgを溶解したジメチル
ホルムアミド溶液20μを４℃にて加え、その
まま８時間反応せしめた後、同じ緩衡液に溶か
した1Mジチオスレイトール4.0μCを加えて、
４℃で1.5時間反応した。反応液をセロフアン
チユーブに入れ0.9％食塩水―1mMEDTAに対
して４℃で充分透析して低分子物質を除くと、
ニトロソウレア基を結合したHSA（３―２）を
含む回収液3.1mlを得た。 280nmでの吸光度の測定により、溶液中に
11.7mgのBSAを含有すること、及び得られた修
飾BSAは、アルキル化能測定（ジーピーウイ
ーラら（G.P.Wheeler）、キヤンサーリサーチ
（Cancer Research）、第34巻、第194〜200頁、
1974年参照）より、1moleのHSAあたりＮ―
サクシイミジル２―〔（３―クロロエチル）―
３―ニトロソウレイド〕プロピオネート
12mole分のアルキル化能を有することが明ら
かとなつた。 又、HSA分子に再生したチオールの数は実
施例１―(ハ)と同じ方法により定量した結果、
HSA1分子に平均0.65個含有されることが判明
した。従つて得られたニトロソウレア基を結合
したHSA（３―２〜）は下記式のごとくに表わさ
れる。 ３―(ハ) マレイミド基を導入したIgGと、ニトロ
ソウレア基を結合したHSAの反応による複合
体（３―３〜）の調製 実施例２―(イ)で得られたマレイミド基が平均
3.33個導入されたIgGの0.1M リン酸緩衡液―
0.1MNaCl（PH6.5）の溶液1.0mlに上記３―(イ)で
得られたニトロソウレア基を平均12個結合した
HSA（３―２〜）の溶液（0.9％食塩水）1.8mlを
混合し、４℃で１夜反応した。反応液をSDS電
気泳動で調べることにより、生成物は、IgGに
ニトロソウレア基結合HSAが１〜３個結合し
た式３―３〜で表わされる複合体を主成物とする
ことが判明した。 セフアデツクスＧ―150スーパーフアインの
カラム（1.5×80cm）を用いることにより、複
合体を精製した。 ３―(ニ) L1210細胞に対する複合体（３―３〜）の
細胞毒性 上記３―(ハ)の如くして得られた複合体（３―
３〜）の標的細胞L1210に対する細胞毒性を検討
した。 24穴の培養プレートに、５×104個のL1210
細胞を含むRPMI 1640培地（10％牛胎児血清，
20μMの２―メルカプトエタノールと0.1mg／ml
のカナマイシンを含む）0.9mlを分注し、更に
種々の濃度の被検サンプル0.1mlを加え、５％
CO2雰囲気下で37℃で48時間培養後、トリパン
ブルー染色法により生細胞数を測定した。 その結果、第２表に示す如く複合体（３―
３〜）は、標的細胞L1210に対し濃度依存的に著
しい細胞増殖抑制効果を示した。尚、培養は２
系列行ない、値はその平均で示した。
ルブミンの調製 人血清アルブミン（以下HSAと省略する）
の凍結乾燥品132.0mgを、0.1Mリン酸緩衡液―
0.1M NaCl―1m MEDTA（PH7.0）5.0mlに溶
解し、２―ピリジルジスルフイド4.0mgを
DMF0.1mlに溶解した溶液を添加し、４℃で１
夜反応した。反応液をセフアデツクスＧ―25
（0.01Mリン酸緩衡液―0.14M NaCl―1m
MEDTA，PH7.0）（１cm×40cm）のカラムに通
し、蛋白質溶出部8.7mlを得た。回収HSA量、
122mg（280nmの吸光度測定による）。 得られた２―チオピリジル化HSA上の活性
ジスルフイド残基の量は、実施例２―(イ)の２―
ピリジルジチオ化BSAの場合と全く同様な手
法で定量した結果 〔２―ピリジルジチオ基〕／〔HSA〕＝0.67 であつた。 ３―(ロ) ニトロソウレア基を結合したHSA（３―
２）の調製 前記２―(イ)によつて得られた、２―ピリジル
ジスルフイド基をHSA1分子あたり平均0.67個
含有するHSA（―SS―2py）0.6713.2mgを溶解した
0.1Mリン酸ナトリウム―0.1M NaCl（PH7.5）
の緩衡液2.0mlに、Ｎ―サクシイミジル２―
〔（３―クロロエチル）―３―ニトロソウレイ
ド〕プロピオネート1.0mgを溶解したジメチル
ホルムアミド溶液20μを４℃にて加え、その
まま８時間反応せしめた後、同じ緩衡液に溶か
した1Mジチオスレイトール4.0μCを加えて、
４℃で1.5時間反応した。反応液をセロフアン
チユーブに入れ0.9％食塩水―1mMEDTAに対
して４℃で充分透析して低分子物質を除くと、
ニトロソウレア基を結合したHSA（３―２）を
含む回収液3.1mlを得た。 280nmでの吸光度の測定により、溶液中に
11.7mgのBSAを含有すること、及び得られた修
飾BSAは、アルキル化能測定（ジーピーウイ
ーラら（G.P.Wheeler）、キヤンサーリサーチ
（Cancer Research）、第34巻、第194〜200頁、
1974年参照）より、1moleのHSAあたりＮ―
サクシイミジル２―〔（３―クロロエチル）―
３―ニトロソウレイド〕プロピオネート
12mole分のアルキル化能を有することが明ら
かとなつた。 又、HSA分子に再生したチオールの数は実
施例１―(ハ)と同じ方法により定量した結果、
HSA1分子に平均0.65個含有されることが判明
した。従つて得られたニトロソウレア基を結合
したHSA（３―２〜）は下記式のごとくに表わさ
れる。 ３―(ハ) マレイミド基を導入したIgGと、ニトロ
ソウレア基を結合したHSAの反応による複合
体（３―３〜）の調製 実施例２―(イ)で得られたマレイミド基が平均
3.33個導入されたIgGの0.1M リン酸緩衡液―
0.1MNaCl（PH6.5）の溶液1.0mlに上記３―(イ)で
得られたニトロソウレア基を平均12個結合した
HSA（３―２〜）の溶液（0.9％食塩水）1.8mlを
混合し、４℃で１夜反応した。反応液をSDS電
気泳動で調べることにより、生成物は、IgGに
ニトロソウレア基結合HSAが１〜３個結合し
た式３―３〜で表わされる複合体を主成物とする
ことが判明した。 セフアデツクスＧ―150スーパーフアインの
カラム（1.5×80cm）を用いることにより、複
合体を精製した。 ３―(ニ) L1210細胞に対する複合体（３―３〜）の
細胞毒性 上記３―(ハ)の如くして得られた複合体（３―
３〜）の標的細胞L1210に対する細胞毒性を検討
した。 24穴の培養プレートに、５×104個のL1210
細胞を含むRPMI 1640培地（10％牛胎児血清，
20μMの２―メルカプトエタノールと0.1mg／ml
のカナマイシンを含む）0.9mlを分注し、更に
種々の濃度の被検サンプル0.1mlを加え、５％
CO2雰囲気下で37℃で48時間培養後、トリパン
ブルー染色法により生細胞数を測定した。 その結果、第２表に示す如く複合体（３―
３〜）は、標的細胞L1210に対し濃度依存的に著
しい細胞増殖抑制効果を示した。尚、培養は２
系列行ない、値はその平均で示した。
【表】
実施例 ４
４―(イ) マレイミド基を導入したＦ（ab′）2の調製
上記参考例１―(ロ)で得られたウサギＦ
（ab′）220mgを0.1Mリン酸緩衡液―0.1M NaCl
（PH7.0）1.0mlの溶液とし、これに、４―（マ
レイミドメチル）シクロヘキサン―１―カルボ
ン酸Ｎ―ヒドロキシサクシンイミドエステル
（以下MCAEと省略する、加藤兼房、浜口好
考、石川栄治、化学と生物、第14巻第817頁
（1976）参照）の100mMDMF溶液10μを室温
下に加え、30分間ゆつくり攪拌したのち、セフ
アデツクスＧ―25（1.0×30cm、0.1Mリン緩衡
液―0.1M NaCl，PH6.5）に通し、低分子を除
くと、MCAEが反応したウサギＦ（ab′）2を含む
溶液7.6mlが得られた。 得られた溶液に含有されるマレイミド基を含
有するＦ（ab′）2（４―１〜）の蛋白質量は、
280nmの吸光度より求めたところ17.0mgであつ
た。Ｆ（ab′）2分子に導入されたマレイミド基の
数は、実施例２―(イ)におけるIgGに導入された
マレイミド基の定量と全く同じ手順でこれを決
定した結果平均2.1個であつた。 ４―(ロ) メトトレキセート（以後MTXと省略す
る）を結合したHSA（４―２〜）の調製 実施例４―(イ)で得られた、２―ピリジルジチ
オ基を平均0.67個含有するHSA13.2mgを溶解し
た0.1Mリン酸ナトリウム―0.1M NaCl（PH7.5）
の緩衡液2.0mlに、すでに公知の方法（ビー
エヌ クルカルニら（P.N.KulKarni）、キヤン
サーリサーチ（Cancer Research）、第41巻、
第2700〜2706頁参照）に従つて調製したMTX
のＮ―ヒドロキシサクシンイミドエステル3.3
mgを溶解したDMF溶液100μを４℃にて加え、
10時間反応せしめた。次いで同じ緩衡液に溶か
した1M2―メルカプトエタノール5.0μを加
え、４℃で1.5時間反応した。反応液を、セロ
フアンチユーブに入れ0.9％食塩水1mMEDTA
に対して４℃で充分透析して、低分子物質を除
くと、MTXを結合したHSA（４―２〜）を含有
する溶液3.40mlが得られた。 回収溶中に有られたタンパク質及び、MTX
の濃度は２つの波長、即ち280nmと307nmにお
ける吸収を測定し、得られた値を同じ２波長に
対する非修飾HSAおよび非修飾MXTの吸光度
に関連づけて決定した。 次に、HSA分子に再生したチオール基の数
は、実施例２―(ハ)の手順に従つてDTNB法で
決定した。以上の結果、回収液中に得られた蛋
白質量は9.8mg、HSA分子に結合したMTXは
12.4分子、再生したHSAのチオール基は平均
0.69個と決定され、従つて、得られたMTX残
基を結合したHSAは４―２〜のごとくに表わさ
れる。 ４―(ハ) マレイミド基を含有するＦ（ab′）2と
MTX結合HSAの反応による複合体（４―３〜）
の調製 実施例４―(イ)で得られた式４―１〜で表わされ
るマレイミド基が一平均2.1個導入されたＦ
（ab′）2の0.1Mリン酸ナトリウム緩衡液―0.1M
NaCl（PH6.5）の溶液1.0mlに、３―(ロ)で得られ
た式３―２〜で表わされるMTX残基を平均12.4
個結合したHSAを含有する0.9％NaCl―
1mMEDTA溶液2.0mlを４℃で混合し、１夜反
応せしめた。 反応液をSDS電気泳動により調べると、生成
物は、Ｆ（ab′）2にMTX結合HSAが１〜３個結
合した、式４―３〜で表わされる複合体を主成物
とすることが判明した。セフアデツクスＧ―
150スーパーフアインのカラム（1.5×80cm）を
用いることにより、複合体を精製した。 ４―(ニ) L1210細胞に対する複合体（４−３〜）の
細胞毒性 上記４―(ハ)の如くして得られた複合体（４―
３〜）の標的細胞L1210に対する細胞毒性を検討
した。 24穴の培養プレートに、５×104個のL1210
細胞を含むRPMI1640培地（10％牛胎児血清、
20μMの２―メルカプトエタノールと0.1mg／ml
のカナマイシンを含む）0.9mlを分注し、更に
種々の濃度の被検サンプル0.1mlを加え、５％
CO2雰囲気下で37℃で48時間培養後、トリパン
ブルー染色法により生細胞数を測定した。 その結果、第３表に示す如く、複合体（43）
は、標的細胞L1210に対し濃度依存的に著しい
細胞増殖抑制効果を示した。尚、培養は２系列
行ない、値はその平均で示した。
（ab′）220mgを0.1Mリン酸緩衡液―0.1M NaCl
（PH7.0）1.0mlの溶液とし、これに、４―（マ
レイミドメチル）シクロヘキサン―１―カルボ
ン酸Ｎ―ヒドロキシサクシンイミドエステル
（以下MCAEと省略する、加藤兼房、浜口好
考、石川栄治、化学と生物、第14巻第817頁
（1976）参照）の100mMDMF溶液10μを室温
下に加え、30分間ゆつくり攪拌したのち、セフ
アデツクスＧ―25（1.0×30cm、0.1Mリン緩衡
液―0.1M NaCl，PH6.5）に通し、低分子を除
くと、MCAEが反応したウサギＦ（ab′）2を含む
溶液7.6mlが得られた。 得られた溶液に含有されるマレイミド基を含
有するＦ（ab′）2（４―１〜）の蛋白質量は、
280nmの吸光度より求めたところ17.0mgであつ
た。Ｆ（ab′）2分子に導入されたマレイミド基の
数は、実施例２―(イ)におけるIgGに導入された
マレイミド基の定量と全く同じ手順でこれを決
定した結果平均2.1個であつた。 ４―(ロ) メトトレキセート（以後MTXと省略す
る）を結合したHSA（４―２〜）の調製 実施例４―(イ)で得られた、２―ピリジルジチ
オ基を平均0.67個含有するHSA13.2mgを溶解し
た0.1Mリン酸ナトリウム―0.1M NaCl（PH7.5）
の緩衡液2.0mlに、すでに公知の方法（ビー
エヌ クルカルニら（P.N.KulKarni）、キヤン
サーリサーチ（Cancer Research）、第41巻、
第2700〜2706頁参照）に従つて調製したMTX
のＮ―ヒドロキシサクシンイミドエステル3.3
mgを溶解したDMF溶液100μを４℃にて加え、
10時間反応せしめた。次いで同じ緩衡液に溶か
した1M2―メルカプトエタノール5.0μを加
え、４℃で1.5時間反応した。反応液を、セロ
フアンチユーブに入れ0.9％食塩水1mMEDTA
に対して４℃で充分透析して、低分子物質を除
くと、MTXを結合したHSA（４―２〜）を含有
する溶液3.40mlが得られた。 回収溶中に有られたタンパク質及び、MTX
の濃度は２つの波長、即ち280nmと307nmにお
ける吸収を測定し、得られた値を同じ２波長に
対する非修飾HSAおよび非修飾MXTの吸光度
に関連づけて決定した。 次に、HSA分子に再生したチオール基の数
は、実施例２―(ハ)の手順に従つてDTNB法で
決定した。以上の結果、回収液中に得られた蛋
白質量は9.8mg、HSA分子に結合したMTXは
12.4分子、再生したHSAのチオール基は平均
0.69個と決定され、従つて、得られたMTX残
基を結合したHSAは４―２〜のごとくに表わさ
れる。 ４―(ハ) マレイミド基を含有するＦ（ab′）2と
MTX結合HSAの反応による複合体（４―３〜）
の調製 実施例４―(イ)で得られた式４―１〜で表わされ
るマレイミド基が一平均2.1個導入されたＦ
（ab′）2の0.1Mリン酸ナトリウム緩衡液―0.1M
NaCl（PH6.5）の溶液1.0mlに、３―(ロ)で得られ
た式３―２〜で表わされるMTX残基を平均12.4
個結合したHSAを含有する0.9％NaCl―
1mMEDTA溶液2.0mlを４℃で混合し、１夜反
応せしめた。 反応液をSDS電気泳動により調べると、生成
物は、Ｆ（ab′）2にMTX結合HSAが１〜３個結
合した、式４―３〜で表わされる複合体を主成物
とすることが判明した。セフアデツクスＧ―
150スーパーフアインのカラム（1.5×80cm）を
用いることにより、複合体を精製した。 ４―(ニ) L1210細胞に対する複合体（４−３〜）の
細胞毒性 上記４―(ハ)の如くして得られた複合体（４―
３〜）の標的細胞L1210に対する細胞毒性を検討
した。 24穴の培養プレートに、５×104個のL1210
細胞を含むRPMI1640培地（10％牛胎児血清、
20μMの２―メルカプトエタノールと0.1mg／ml
のカナマイシンを含む）0.9mlを分注し、更に
種々の濃度の被検サンプル0.1mlを加え、５％
CO2雰囲気下で37℃で48時間培養後、トリパン
ブルー染色法により生細胞数を測定した。 その結果、第３表に示す如く、複合体（43）
は、標的細胞L1210に対し濃度依存的に著しい
細胞増殖抑制効果を示した。尚、培養は２系列
行ない、値はその平均で示した。
【表】
実施例 ５
実施例４で用いたMCAEの代わりに、SMBを
用い、その他は実施例３の場合と同様にして、フ
ラグメントＦ（ab′）2と、MTX結合HSAが、それ
ぞれアミノ基とチオール基にて、架橋剤SMBを
介して結合している抗腫瘍性複合体を得た。 実施例 ６ ６―(イ) IgGへ活性ジスルフイド基の導入（５―
１〜の調製） 上記参考例１―(ヘ)で得られた、マウスモノク
ローンIgG2b抗体20mgを0.1Mリン酸緩衡液―
0.1M NaCl（PH7.5）1.0mlに溶解し、Ｎ―サク
シイミジル―３―（２―ピリジルチオ）プロピ
オネート（以下SPDPと省略する）の
100mMDMF溶液8.0μを室温下に加え、30分
間ゆつくり攪拌したのち、セフアデツクスＧ―
25のカラム（1.0×30cm、0.1Mリン酸緩衡液―
0.1M NaCl，PH6.5）に通し、低分子を除くと、
活性ジスルフイド基が導入されたマウスIgG
（６―１〜）の溶液7.5mlが得られた。 かくして得られた溶液中のIgGの量は、
280nmの吸光度より求めたところ18mgであつ
た。IgGに導入された活性ジスルフイド基の数
は以下の手順で定量した。 溶液の１部を同一緩衡液で希釈し280nmの吸
光度より、先づIgGのモル濃度を求めた。次い
で、溶液の過剰の２―メルカプトニタノールを
加え、１分間放置の後遊離した２―メルカプト
ピリジンに由来する343nmの吸光度を測定する
ことにより、活性ジスルフイド基の濃度を求め
た。これらの比より式６―１〜で表わされる生成
物においては、IgG分子に平均3.7個の２―ピリ
ジルジチオ基が導入されていることを決定し
た。 ６―(ロ) 活性ジスルフイド含有IgG2bとAlaNU
結合HSA（６―２〜）の反応による複合体（６―
３〜）の調製 上記６―(イ)で得られた、２―ピリジルジチオ
基を平均3.7個含有するIgGの溶液0.5mlに、実
施例３―(ロ)と全く同じ手順で調製した式６―２〜
で表わされるニトロソウレア基を結合した人血
清アルブミン5.3mgの溶液（0.9％NaCl―
1mMEDTA溶液）1.5mlを混合し、４℃で１夜
反応した。反応液をSDS電気泳動で調べると、
生成物は、ニトロソウレア基結合HSAが１〜
３個結合した式６〜３〜で表わされる複合体を主
成物とすることが判明した。セフアデツクスＧ
―150スーパーフアインのカラム（1.5×80cm）
を用いることにより、複合体を精製した。 ６―(ハ) MM46細胞に対する複合体（６―３〜）の
細胞毒性 上記６―(ロ)の如くして得られた複合体（６―
３〜）の標的細胞MM46に対する細胞毒性を検討
した。 96穴の培養プレートに、５×103個のMM46
細胞を含むRPMI1640培地（10％牛胎児血清、
20μMの２―メルカプトエタノールと0.1mg／ml
のカナマイシンを含む）0.2mlを分注し、更に
種々の濃度の被検サンプル20μを加え、５％
CO2雰囲気下で37℃で48時間培養後、トリパン
ブルー染色法により生細胞数を測定した。 その結果、第４表に示す如く、複合体（６―
３〜）は、標的細胞MM46に対し濃度依存的に著
しい細胞増殖抑制効果を示した。尚、培養は２
系列行ない、値はその平均で示した。
用い、その他は実施例３の場合と同様にして、フ
ラグメントＦ（ab′）2と、MTX結合HSAが、それ
ぞれアミノ基とチオール基にて、架橋剤SMBを
介して結合している抗腫瘍性複合体を得た。 実施例 ６ ６―(イ) IgGへ活性ジスルフイド基の導入（５―
１〜の調製） 上記参考例１―(ヘ)で得られた、マウスモノク
ローンIgG2b抗体20mgを0.1Mリン酸緩衡液―
0.1M NaCl（PH7.5）1.0mlに溶解し、Ｎ―サク
シイミジル―３―（２―ピリジルチオ）プロピ
オネート（以下SPDPと省略する）の
100mMDMF溶液8.0μを室温下に加え、30分
間ゆつくり攪拌したのち、セフアデツクスＧ―
25のカラム（1.0×30cm、0.1Mリン酸緩衡液―
0.1M NaCl，PH6.5）に通し、低分子を除くと、
活性ジスルフイド基が導入されたマウスIgG
（６―１〜）の溶液7.5mlが得られた。 かくして得られた溶液中のIgGの量は、
280nmの吸光度より求めたところ18mgであつ
た。IgGに導入された活性ジスルフイド基の数
は以下の手順で定量した。 溶液の１部を同一緩衡液で希釈し280nmの吸
光度より、先づIgGのモル濃度を求めた。次い
で、溶液の過剰の２―メルカプトニタノールを
加え、１分間放置の後遊離した２―メルカプト
ピリジンに由来する343nmの吸光度を測定する
ことにより、活性ジスルフイド基の濃度を求め
た。これらの比より式６―１〜で表わされる生成
物においては、IgG分子に平均3.7個の２―ピリ
ジルジチオ基が導入されていることを決定し
た。 ６―(ロ) 活性ジスルフイド含有IgG2bとAlaNU
結合HSA（６―２〜）の反応による複合体（６―
３〜）の調製 上記６―(イ)で得られた、２―ピリジルジチオ
基を平均3.7個含有するIgGの溶液0.5mlに、実
施例３―(ロ)と全く同じ手順で調製した式６―２〜
で表わされるニトロソウレア基を結合した人血
清アルブミン5.3mgの溶液（0.9％NaCl―
1mMEDTA溶液）1.5mlを混合し、４℃で１夜
反応した。反応液をSDS電気泳動で調べると、
生成物は、ニトロソウレア基結合HSAが１〜
３個結合した式６〜３〜で表わされる複合体を主
成物とすることが判明した。セフアデツクスＧ
―150スーパーフアインのカラム（1.5×80cm）
を用いることにより、複合体を精製した。 ６―(ハ) MM46細胞に対する複合体（６―３〜）の
細胞毒性 上記６―(ロ)の如くして得られた複合体（６―
３〜）の標的細胞MM46に対する細胞毒性を検討
した。 96穴の培養プレートに、５×103個のMM46
細胞を含むRPMI1640培地（10％牛胎児血清、
20μMの２―メルカプトエタノールと0.1mg／ml
のカナマイシンを含む）0.2mlを分注し、更に
種々の濃度の被検サンプル20μを加え、５％
CO2雰囲気下で37℃で48時間培養後、トリパン
ブルー染色法により生細胞数を測定した。 その結果、第４表に示す如く、複合体（６―
３〜）は、標的細胞MM46に対し濃度依存的に著
しい細胞増殖抑制効果を示した。尚、培養は２
系列行ない、値はその平均で示した。
【表】
実施例 ７
７―(イ) マレイミド基を含有するＦ（ab′）2の調製
上記参考例１―(ロ)で得られたウサギＦ
（ab′）220mgを0.1Mリン酸緩衡液―0.1M NaCl
（PH7.0）1.0mlの溶液とし、これにSMBの
100mMDMF溶液20μを室温下に加え、30分
間ゆつくり攪拌したのち、素速くセフアデツク
スＧ―25のカラム（1.0×30cm，0.1Mリン酸緩
衡液―0.1M NaCl，PH6.5）に通し、低分子を
除くと、SMB化されたウサギIgGを含む溶液
6.7mlが得られた。 かくして得られた溶液に含有されるSMB化
Ｆ（ab′）2（７―１〜）の蛋白質量は280nmの吸光
度より求めたところ16.1mgであつた。Ｆ（ab′）2
分子に導入されたマレイミド基の数は、実施例
２―(イ)におけるSMB化IgGの定量と全く同じ
手順でこれを決定した結果、平均2.4個であつ
た。 ７―(ロ) マレイミド基を含有するＦ（ab′）2（７―
１〜）とMMC結合BSA（７―２〜）の反応による
複合体（６―３〜）の調製 上記７―(イ)で得られたマレイミド基を平均24
個含有するＦ（ab′）2の溶液（0.1Mリン酸緩衡
液―0.1M NaCl，PH6.5）2.0mlと、実施例２―
(ハ)と全く同様にして得られた、MMCを平均8.5
個結合したBSA19mgを含む溶液（0.01M
AcONa―0.14M NaCl―0.01mMEDTA，PH
5.25）2.8mlを混合し、４℃で１夜反応せしめ
た。反応液をSDS電気泳動で調べることによ
り、生成物はＦ（ab′）2にMMC結合BSAが１〜
２個結合した複合体（７―３〜）を主成分とする
ことが判明した。セフアデツクスＧ―150スー
パーフアインのカラム（1.8×80cm）を用いる
ことにより、複合体を精製した。 ７―(ハ) L1210細胞に対する複合体（７―３〜）の
細胞毒性 上記７―(ロ)の如くして得られた複合体（７―
３〜）の標的細胞L1210に対する細胞毒性を検討
した。 24穴の培養プレートに、５×104個のL1210
細胞を含むRPMI1640培地（10％牛胎児血清、
20μMの２―メルカプトエタノールと0.1mg／ml
のカナマイシンを含む）0.9mlを分注し、更に
種々の濃度の被検サンプル0.1mlを加え、５％
CO2雰囲気下で37℃48時間培養後、トリパンブ
ルー染色法により生細胞数を測定した。 その結果、第５表に示す如く、複合体７―３〜
は、標的細胞L1210に対し濃度依存的に著しい
細胞増殖抑制効果を示した。尚、培養は２系列
行ない、値はその平均で示した。
（ab′）220mgを0.1Mリン酸緩衡液―0.1M NaCl
（PH7.0）1.0mlの溶液とし、これにSMBの
100mMDMF溶液20μを室温下に加え、30分
間ゆつくり攪拌したのち、素速くセフアデツク
スＧ―25のカラム（1.0×30cm，0.1Mリン酸緩
衡液―0.1M NaCl，PH6.5）に通し、低分子を
除くと、SMB化されたウサギIgGを含む溶液
6.7mlが得られた。 かくして得られた溶液に含有されるSMB化
Ｆ（ab′）2（７―１〜）の蛋白質量は280nmの吸光
度より求めたところ16.1mgであつた。Ｆ（ab′）2
分子に導入されたマレイミド基の数は、実施例
２―(イ)におけるSMB化IgGの定量と全く同じ
手順でこれを決定した結果、平均2.4個であつ
た。 ７―(ロ) マレイミド基を含有するＦ（ab′）2（７―
１〜）とMMC結合BSA（７―２〜）の反応による
複合体（６―３〜）の調製 上記７―(イ)で得られたマレイミド基を平均24
個含有するＦ（ab′）2の溶液（0.1Mリン酸緩衡
液―0.1M NaCl，PH6.5）2.0mlと、実施例２―
(ハ)と全く同様にして得られた、MMCを平均8.5
個結合したBSA19mgを含む溶液（0.01M
AcONa―0.14M NaCl―0.01mMEDTA，PH
5.25）2.8mlを混合し、４℃で１夜反応せしめ
た。反応液をSDS電気泳動で調べることによ
り、生成物はＦ（ab′）2にMMC結合BSAが１〜
２個結合した複合体（７―３〜）を主成分とする
ことが判明した。セフアデツクスＧ―150スー
パーフアインのカラム（1.8×80cm）を用いる
ことにより、複合体を精製した。 ７―(ハ) L1210細胞に対する複合体（７―３〜）の
細胞毒性 上記７―(ロ)の如くして得られた複合体（７―
３〜）の標的細胞L1210に対する細胞毒性を検討
した。 24穴の培養プレートに、５×104個のL1210
細胞を含むRPMI1640培地（10％牛胎児血清、
20μMの２―メルカプトエタノールと0.1mg／ml
のカナマイシンを含む）0.9mlを分注し、更に
種々の濃度の被検サンプル0.1mlを加え、５％
CO2雰囲気下で37℃48時間培養後、トリパンブ
ルー染色法により生細胞数を測定した。 その結果、第５表に示す如く、複合体７―３〜
は、標的細胞L1210に対し濃度依存的に著しい
細胞増殖抑制効果を示した。尚、培養は２系列
行ない、値はその平均で示した。
【表】
実施例 ８
実施例２で用いたSMBの代わりに、MCAEを
用い、その他は実施例２の場合と同様にして、
IgGとMMC結合BSAが、それぞれアミノ基とチ
オール基にて架橋剤MCAEを介して結合してい
る抗腫瘍性複合体を得た。 実施例 ９ 実施例３で用いたSMBの代わりにMCAEを用
い、その他は実施例３の場合と同様にして、IgG
ニトロソウレア結合HSAが、それぞれアミノ基
とチオール基にて、架橋剤SMBを介して結合し
ている抗腫瘍性複合体を得た。 実施例 10 参考例１―(ハ)で得られたウサギIgGのフラグメ
ントFab′13.0mgを含む溶液（5mMAcONa―
0.14M NaCl，PH5.5，以下緩衡液Ａと省略する）
1.5mlに、Ｎ，N′―０―フエニレンジマレイミド
（以下PDAと省略する）の飽和溶液（溶媒は、緩
衡液Ａ）1.5mlを加えて室温中で30分間反応させ、
過剰試薬をセフアデツクスＧ―25（0.8×44cm、緩
衡液Ａ）により除去して、式10―１〜で表わされる
マレイミド基を含有するFab′を含む溶液8.6mlを
得た。 一方、式10―２〜で表わされるMMCを平均9.6個
結合したHSAを、実施例２におけると同じ方法
で、ただしBSAの代りにHSAを用いることによ
りこれを調製した。なお該HSAの含有するチオ
ール基の定量値は実施例２におけると同様に定量
した結果0.72個であつた。該MMC結合HSAを
7.9mg含有する溶液（0.01MAcONa―0.14M
NaCl―0.01mMEDTA（PH5.25））2.0mlを上記の
式10―１〜で表わされるマレイミド基を含有する
Fab′の溶液2.0mlに混合し、４℃で一夜反応せし
めた。反応液をSDS電気泳動により調べると、生
成物は、Fab′にHSAが結合した式10―３〜で表わ
される複合体を含有することが判明した。セフア
デツクスＧ―150スーパーフアインのカラム（1.5
×80cm）を用いることにより複合体を精製した。 実施例 11 実施例10で用いた架橋剤PDMの代わりに、架
橋剤Ｎ，N′―ビス（マレイミドメチル）エーテ
ル（以下BMEと省略する）（ダブリユービーフリ
ードベルグら（W.B.Freedberg）、ジヤーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー（Jurnal
of Biological Chemistry）第246巻、第1449〜
1459頁、1971年参照）を用い、その他は実施例10
の場合と同様にして、フラグメントFab′とMMC
結合HSAがそれぞれのチオール基にて、架橋剤
BME
用い、その他は実施例２の場合と同様にして、
IgGとMMC結合BSAが、それぞれアミノ基とチ
オール基にて架橋剤MCAEを介して結合してい
る抗腫瘍性複合体を得た。 実施例 ９ 実施例３で用いたSMBの代わりにMCAEを用
い、その他は実施例３の場合と同様にして、IgG
ニトロソウレア結合HSAが、それぞれアミノ基
とチオール基にて、架橋剤SMBを介して結合し
ている抗腫瘍性複合体を得た。 実施例 10 参考例１―(ハ)で得られたウサギIgGのフラグメ
ントFab′13.0mgを含む溶液（5mMAcONa―
0.14M NaCl，PH5.5，以下緩衡液Ａと省略する）
1.5mlに、Ｎ，N′―０―フエニレンジマレイミド
（以下PDAと省略する）の飽和溶液（溶媒は、緩
衡液Ａ）1.5mlを加えて室温中で30分間反応させ、
過剰試薬をセフアデツクスＧ―25（0.8×44cm、緩
衡液Ａ）により除去して、式10―１〜で表わされる
マレイミド基を含有するFab′を含む溶液8.6mlを
得た。 一方、式10―２〜で表わされるMMCを平均9.6個
結合したHSAを、実施例２におけると同じ方法
で、ただしBSAの代りにHSAを用いることによ
りこれを調製した。なお該HSAの含有するチオ
ール基の定量値は実施例２におけると同様に定量
した結果0.72個であつた。該MMC結合HSAを
7.9mg含有する溶液（0.01MAcONa―0.14M
NaCl―0.01mMEDTA（PH5.25））2.0mlを上記の
式10―１〜で表わされるマレイミド基を含有する
Fab′の溶液2.0mlに混合し、４℃で一夜反応せし
めた。反応液をSDS電気泳動により調べると、生
成物は、Fab′にHSAが結合した式10―３〜で表わ
される複合体を含有することが判明した。セフア
デツクスＧ―150スーパーフアインのカラム（1.5
×80cm）を用いることにより複合体を精製した。 実施例 11 実施例10で用いた架橋剤PDMの代わりに、架
橋剤Ｎ，N′―ビス（マレイミドメチル）エーテ
ル（以下BMEと省略する）（ダブリユービーフリ
ードベルグら（W.B.Freedberg）、ジヤーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー（Jurnal
of Biological Chemistry）第246巻、第1449〜
1459頁、1971年参照）を用い、その他は実施例10
の場合と同様にして、フラグメントFab′とMMC
結合HSAがそれぞれのチオール基にて、架橋剤
BME
【式】を介して
結合している抗腫瘍性複合体を得た。
実施例 12
12―(イ) マレイミド基を導入した抗MM46 IgMs
（12―１〜）の作製 参考例１―(4)で得られた、抗MM46IgMsの
0.1Mリン酸緩衡液―0.1M塩化ナトリウム（PH
7.0）（緩衡液）（7.33mg／ml）3.5mlに、
8.4mMのSMBのDMF溶液0.2mlを加え、25℃
で30分間放置後、緩衡液中でセフアデツクス
Ｇ―25カラム（カラムサイズ1.0×49cm）を用
いてゲル過を行い、マレイミド基が導入され
た抗MM46IgMs（12―１〜）を得た。IgMs １分
子当りに導入されたマレイミド基の数は、実施
例２―(イ)に記載した方法を用い、平均3.8個と
定量された。 12―(ロ) チオール基を有する牛血清アルブミン―
マイトマイシンＣ結合体（12―２〜）の作製 BSA市販品より、0.9％食塩水中でセフアデ
ツクスＧ―150を用いるゲル過により二重体
を除いた。こうして得た精製BSAの0.9％食塩
水溶液（10.4mg／ml）４ml、63.1mM2―ピリジ
ルジスフイドのエタノール溶液0.1mlと0.5Mリ
ン酸緩衡液―5mMEDTA（PH7.5）１mlを加え、
25℃に20分間放置後、0.1Mリン酸緩衡液―
0.1M塩化ナトリウム（PH7.5）（緩衡液）中
で、セフアデツクスＧ―25カラム（カラムサイ
ズ1.0×49cm）を用いてゲル過を行つた。 得られた２―ピリジルチオ基を含むBSAの
溶液（4.82mg／ml）6.1mlに、78mM1a―〔４―
（Ｎサクシンイミドカルボニル）ブチリル〕マ
イトマシンＣのDMF溶液0.4mlを加え、４℃で
６時間反応させた。次いで遊離チオール基を生
ぜしめるために、反応液に89mMジチオスレイ
トールの緩衡液溶液0.1mlを加えて、４℃で
１時間処理し、10mMリン酸緩衡液―0.14M塩
化ナトリウム（PH7.0）に対して透析して、チ
オール基を有するBSA―マイトマイシンＣ
（MMC）結合体（MMC／BSA平均モル結合
比29）（12―２〜）を得た。BSA結合したMMC
の定量は、363nmの吸光度より求めた。BSA
の定量は、クーマジーブリリアントブル
（Coomassie Brilliant Blue）の酸性溶液の吸
収極大が、蛋白への色素の結合に伴い、465nm
から595nmに移動することに基づいたバイオー
ラツド（Bio―Red）の蛋白定量（ブラツドフ
オード（N.m.Bradford）、アナリテイカル
バイオケミストリー（Anal.Biochem.），第72
巻、248〜254頁、1976年参照）法によつた。 12―(ハ) マレイミド基が導入された抗
MM46IgMsとMMCの結合したBSAとの結合
による複合体（12―３〜）の作製 上記(イ)で得たマレイミド基が導入された抗
MM46 IgMsの溶液（6.37mg／ml）3.55mlに、
上記(ロ)で得られたBSA―mmCの10mMリン酸
緩衡液―0.14M塩化ナトリウム（PH7.0）溶液
（BSA相当で3.6mg／ml）3.56mlを加え、４℃で
24時間放置し、0.9％食塩水中でセフアクリル
Ｓ―400カラム（カラムサイズ1.8×138cm）を
用いてゲル過を行い、抗MM46 IgMs―
BSA―mmC複合体（mmC／BSA／IgMs平均
モル結合比32／1.1／1.0）（12―３〜）を得た。
複合体の363nmの吸光度に、BSA―mmC結合
体での280nmと363nmの吸光度の比を乗じて、
複合体中のBSAに基づく280nmの吸光度を求
め、この値を複合体の280nmの吸光度から減じ
てIgMsに基づく吸光度を求めた。この値より
IgMsの量を算出した。 12―(ニ) MM46細胞に対する複合体（12―３〜）の
細胞毒性 上記12―(ハ)の如くして得られた、複合体（12
―３〜）の標的細胞MM46に対する細胞毒性を検
討した。 96穴の細胞培養プレートを用い、2.5×104
個／mlのMM46細胞をRPMI1640培地（10％牛
胎児血清、20μMの２―メルカプトエタノール
及び0.1mg／mlのカナマイシンを含む）中で
種々の濃度の複合体（12―３〜）と共に５％CO2
雰囲気下３℃で48時間培養後、トリパンブルー
染色法により生細胞数を測定した。その結果
を、対照サンプルとして複合体（12―３〜）に対
応する抗MM46 IgMsとBSA―mmCの混合物
を用いた場合の生細胞数と比較して、第６表に
示した。 第６表に示した如く、複合体（12―３〜）は強
い細胞毒活性を示し、その活性は抗MM46
IgMsとBSA―mmCの混合物より強く、活性
発現には両者が血清アルブミン中の硫黄原子を
介した共有結合で結ばれていることの重要性も
示された。
（12―１〜）の作製 参考例１―(4)で得られた、抗MM46IgMsの
0.1Mリン酸緩衡液―0.1M塩化ナトリウム（PH
7.0）（緩衡液）（7.33mg／ml）3.5mlに、
8.4mMのSMBのDMF溶液0.2mlを加え、25℃
で30分間放置後、緩衡液中でセフアデツクス
Ｇ―25カラム（カラムサイズ1.0×49cm）を用
いてゲル過を行い、マレイミド基が導入され
た抗MM46IgMs（12―１〜）を得た。IgMs １分
子当りに導入されたマレイミド基の数は、実施
例２―(イ)に記載した方法を用い、平均3.8個と
定量された。 12―(ロ) チオール基を有する牛血清アルブミン―
マイトマイシンＣ結合体（12―２〜）の作製 BSA市販品より、0.9％食塩水中でセフアデ
ツクスＧ―150を用いるゲル過により二重体
を除いた。こうして得た精製BSAの0.9％食塩
水溶液（10.4mg／ml）４ml、63.1mM2―ピリジ
ルジスフイドのエタノール溶液0.1mlと0.5Mリ
ン酸緩衡液―5mMEDTA（PH7.5）１mlを加え、
25℃に20分間放置後、0.1Mリン酸緩衡液―
0.1M塩化ナトリウム（PH7.5）（緩衡液）中
で、セフアデツクスＧ―25カラム（カラムサイ
ズ1.0×49cm）を用いてゲル過を行つた。 得られた２―ピリジルチオ基を含むBSAの
溶液（4.82mg／ml）6.1mlに、78mM1a―〔４―
（Ｎサクシンイミドカルボニル）ブチリル〕マ
イトマシンＣのDMF溶液0.4mlを加え、４℃で
６時間反応させた。次いで遊離チオール基を生
ぜしめるために、反応液に89mMジチオスレイ
トールの緩衡液溶液0.1mlを加えて、４℃で
１時間処理し、10mMリン酸緩衡液―0.14M塩
化ナトリウム（PH7.0）に対して透析して、チ
オール基を有するBSA―マイトマイシンＣ
（MMC）結合体（MMC／BSA平均モル結合
比29）（12―２〜）を得た。BSA結合したMMC
の定量は、363nmの吸光度より求めた。BSA
の定量は、クーマジーブリリアントブル
（Coomassie Brilliant Blue）の酸性溶液の吸
収極大が、蛋白への色素の結合に伴い、465nm
から595nmに移動することに基づいたバイオー
ラツド（Bio―Red）の蛋白定量（ブラツドフ
オード（N.m.Bradford）、アナリテイカル
バイオケミストリー（Anal.Biochem.），第72
巻、248〜254頁、1976年参照）法によつた。 12―(ハ) マレイミド基が導入された抗
MM46IgMsとMMCの結合したBSAとの結合
による複合体（12―３〜）の作製 上記(イ)で得たマレイミド基が導入された抗
MM46 IgMsの溶液（6.37mg／ml）3.55mlに、
上記(ロ)で得られたBSA―mmCの10mMリン酸
緩衡液―0.14M塩化ナトリウム（PH7.0）溶液
（BSA相当で3.6mg／ml）3.56mlを加え、４℃で
24時間放置し、0.9％食塩水中でセフアクリル
Ｓ―400カラム（カラムサイズ1.8×138cm）を
用いてゲル過を行い、抗MM46 IgMs―
BSA―mmC複合体（mmC／BSA／IgMs平均
モル結合比32／1.1／1.0）（12―３〜）を得た。
複合体の363nmの吸光度に、BSA―mmC結合
体での280nmと363nmの吸光度の比を乗じて、
複合体中のBSAに基づく280nmの吸光度を求
め、この値を複合体の280nmの吸光度から減じ
てIgMsに基づく吸光度を求めた。この値より
IgMsの量を算出した。 12―(ニ) MM46細胞に対する複合体（12―３〜）の
細胞毒性 上記12―(ハ)の如くして得られた、複合体（12
―３〜）の標的細胞MM46に対する細胞毒性を検
討した。 96穴の細胞培養プレートを用い、2.5×104
個／mlのMM46細胞をRPMI1640培地（10％牛
胎児血清、20μMの２―メルカプトエタノール
及び0.1mg／mlのカナマイシンを含む）中で
種々の濃度の複合体（12―３〜）と共に５％CO2
雰囲気下３℃で48時間培養後、トリパンブルー
染色法により生細胞数を測定した。その結果
を、対照サンプルとして複合体（12―３〜）に対
応する抗MM46 IgMsとBSA―mmCの混合物
を用いた場合の生細胞数と比較して、第６表に
示した。 第６表に示した如く、複合体（12―３〜）は強
い細胞毒活性を示し、その活性は抗MM46
IgMsとBSA―mmCの混合物より強く、活性
発現には両者が血清アルブミン中の硫黄原子を
介した共有結合で結ばれていることの重要性も
示された。
【表】
実施例 13
13―(イ) マレイミド基を導入した抗MM46IgGs
（13―１〜）の作製 実施例13―(イ)で用いた抗MM46IgGsの代り
に参考例１―(ヘ)で得られた抗MM46IgG2bを、
またSMBの代りにＮ―サクシンイミジル４―
（Ｎ―マレイミド）ブチレート（SMBU）を用
い、その他は実施例13―(イ)の場合と同様にし
て、マレイミド基が１抗体分子当り平均4.5個
導入された抗MM46IgG2b（13―１〜）を得た。 13―(ロ) チオール基を有する牛血清アルブミン―
マイトマイシンＣ結合体（13―２〜）の作製 BSAの0.1Mリン酸緩衡液―0.1M塩化ナトリ
ウム（PH7.5）溶液（緩衡液）（5.0mg／ml）
６mlに45.5mM 1a〔４―（Ｎ―サクシンイミド
キシカルボニル）ブチリル〕マイトマイシンＣ
のDMF溶液0.4mlを加え、４℃で６時間反応さ
せた。次いで遊離チオール基を生ぜしめるため
に、反応液に91.2mMジチオスレイトールの緩
衡液溶液0.1mlを加えて４℃で１時間処理し、
10mMリン酸緩衡液―0.14M塩化ナトリウム
（PH7.0）に対して透析してチオール基を有する
BSA―mmC結合体（13―２〜）を得た。12―(ロ)
に記載した方法によりBSAとMMCを定量した
結果、mmC／BSA平均モル結合比は26であつ
た。 13―(ハ) マレイミド基が導入された抗
MM46IgG2b（13―１〜）とmmCの結合したBSA
（13―２〜）との結合による複合体（13―３〜）の
作製 上記(イ)で作製したマレイミド基が導入された
抗MM46IgG2b（13―１〜）の溶液（6.74mg／ml）
0.5mlに上記(ロ)で得られたBSA―mmC（13―２〜）
の10mMリン酸緩衡液―0.14M塩化ナトリウム
（PH7.0）溶液（3.70mg／ml）0.8mlを加え、４℃
で24時間放置し、0.9％食塩水中でセフアクリ
ルＳ―400カラム（カラムサイズ1.8×138cm）
を用いてゲル過を行い、抗MM46IgG2b―
BSA―mmC複合体（13―２〜）を得た。12―(ハ)
に記載した方法によりIgG2bを、また363nmの
吸光度よりMMCを定量した結果、mmC／
BSA／IgG2b平均モル結合比は10.4／0.4／1.0
であつた。
（13―１〜）の作製 実施例13―(イ)で用いた抗MM46IgGsの代り
に参考例１―(ヘ)で得られた抗MM46IgG2bを、
またSMBの代りにＮ―サクシンイミジル４―
（Ｎ―マレイミド）ブチレート（SMBU）を用
い、その他は実施例13―(イ)の場合と同様にし
て、マレイミド基が１抗体分子当り平均4.5個
導入された抗MM46IgG2b（13―１〜）を得た。 13―(ロ) チオール基を有する牛血清アルブミン―
マイトマイシンＣ結合体（13―２〜）の作製 BSAの0.1Mリン酸緩衡液―0.1M塩化ナトリ
ウム（PH7.5）溶液（緩衡液）（5.0mg／ml）
６mlに45.5mM 1a〔４―（Ｎ―サクシンイミド
キシカルボニル）ブチリル〕マイトマイシンＣ
のDMF溶液0.4mlを加え、４℃で６時間反応さ
せた。次いで遊離チオール基を生ぜしめるため
に、反応液に91.2mMジチオスレイトールの緩
衡液溶液0.1mlを加えて４℃で１時間処理し、
10mMリン酸緩衡液―0.14M塩化ナトリウム
（PH7.0）に対して透析してチオール基を有する
BSA―mmC結合体（13―２〜）を得た。12―(ロ)
に記載した方法によりBSAとMMCを定量した
結果、mmC／BSA平均モル結合比は26であつ
た。 13―(ハ) マレイミド基が導入された抗
MM46IgG2b（13―１〜）とmmCの結合したBSA
（13―２〜）との結合による複合体（13―３〜）の
作製 上記(イ)で作製したマレイミド基が導入された
抗MM46IgG2b（13―１〜）の溶液（6.74mg／ml）
0.5mlに上記(ロ)で得られたBSA―mmC（13―２〜）
の10mMリン酸緩衡液―0.14M塩化ナトリウム
（PH7.0）溶液（3.70mg／ml）0.8mlを加え、４℃
で24時間放置し、0.9％食塩水中でセフアクリ
ルＳ―400カラム（カラムサイズ1.8×138cm）
を用いてゲル過を行い、抗MM46IgG2b―
BSA―mmC複合体（13―２〜）を得た。12―(ハ)
に記載した方法によりIgG2bを、また363nmの
吸光度よりMMCを定量した結果、mmC／
BSA／IgG2b平均モル結合比は10.4／0.4／1.0
であつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 殺すべき細胞のもつている特定の抗原と特異
的に結合し得る免疫グロブリンまたはそのフラグ
メントと、細胞毒性物質をイミノ基によつて結合
せしめた血清アルブミンを、少なくとも１つの硫
黄原子を介して共有結合させてなる細胞毒性複合
体を活性成分とする癌治療用剤。 ２ 血清アルブミンが人または牛の血清アルブミ
ンである、特許請求の範囲第１項記載の細胞毒性
複合体を活性成分とする癌治療用剤。 ３ 下記式〔〕 Ab〔―B1―S1―Al（―NH―Cy）n〕o ……〔〕 〔Abは免疫グロブリンまたはそのフラグメント
を、Alは血清アルブミンを、Cyは細胞毒性物質
を表す。S1及びNHはそれぞれ血清アルブミン中
の硫黄原子及びイミノ基を表す。B1は２価の有
機基を表す。ｍは１〜30の整数を、ｎは１〜10の
整数を表す。〕 で表される、特許請求の範囲第１項および第２項
記載の細胞毒性複合体を活性成分とする癌治療用
剤。 ４ 下記式〔〕 Ab〔―（B2）t2―S2―（B3）t3―S1 ―Al（―NH―Cy）n〕o ……〔〕 〔Ab，Al，Cy，S1，NH，ｍ及びｎの定義は式
〔〕の場合と同じ。S2は硫黄原子を、B2及びB3
は２価の有機基を、t2及びt3は同一または異なつ
て０または１を表す。〕 で表される、特許請求の範囲第１項、第２項又は
第３項記載の細胞毒性複合体を活性成分とする癌
治療用剤。 ５ 下記式〔〕 〔Ab，Al，Cy，S1，NH，ｍ及びｎの定義は式
〔〕の場合と同じ。B4は２価の有機基を表す。〕 で表される、特許請求の範囲第１項、第２項又は
第３項記載の細胞毒性複合体を活性成分とする癌
治療用剤。 ６ 発生または導入したチオール基を有する下記
式〔〕 Ab〔―（B2）t2―S2H〕o′ ……〔〕 〔Abは免疫グロブリンまたはそのフラグメント
を、B2は２価の有機基を、S2は硫黄原子を、t2は
０または１を、n′は１〜10の整数を表す。〕 で表される免疫グロブリンまたはそのフラグメン
トと、下記式〔〕 XS1―Al（―NH―Cy）n ……〔〕 〔Alは血清アルブミンを、Cyは細胞毒性物質を
表す。S1及びNHはそれぞれ血清アルブミン中の
硫黄原子及びイミノ基を表し、Ｘは隣接する硫黄
原子と共に活性ジスルフイド結合を形成しうる基
を、ｍは１〜30の整数を表す。〕 で表される細胞毒性物質を結合した活性ジスルフ
イド基を有する血清アルブミンを反応せしめるこ
とを特徴とする、下記式〔―１〕 Ab〔―（B2）t2―S2―S1 ―Al（―NH―Cy）n〕o ……〔―１〕 〔Ab，Al，B2，Cy，S1，S2，NH，ｍ及びt2の
定義は前記のとおりであり、ｎは１〜10の整数を
表す。〕 で表される細胞毒性複合体を活性成分とする癌治
療用剤の製造法。 ７ 誘導または導入した活性ジスルフイド基を有
する下記式〔〕 Ab〔―（B2）t2―S2X〕o′ ……〔〕 〔Abは免疫グロブリンまたはそのフラグメント
を、S2は硫黄原子を、B2は２価の有機基を、t2は
０または１を、n′は１〜10の整数を表す。Ｘは隣
接する硫黄原子と共に活性ジスルフイド結合を形
成しうる基を表す。〕 で表される免疫グロブリンまたはフラグメント
と、下記式〔〕 HS1―Al（―NH―Cy）n ……〔〕 〔Alは血清アルブミンを、Cyは細胞毒性物質を
表す。S1及びNHはそれぞれ血清アルブミン中の
硫黄原子及びイミノ基を表す。ｍは１〜30の整数
を表す。〕 で表される細胞毒性物質を結合した血清アルブミ
ンを反応せしめることを特徴とする、下記式〔
―１〕 Ab〔―（B2）t2―S2―S1 ―Al（―NH―Cy）n〕o ……〔―１〕 〔Ab，Al，Cy，B2，S1，S2，NH，及びｍの定
義は前記のとおりであり、ｎは１〜10の整数を表
す。〕 で表される細胞毒性複合体を活性成分とする癌治
療用剤の製造法。 ８ 発生または導入したチオール基を有する下記
式〔〕 Ab〔―（B2）t2―S2H〕o′ ……〔〕 〔Abは疫グロブリンまたはそのフラグメントを、
B2は２価の有機基を、S2は硫黄原子を、t2は０ま
たは１を、n′は１〜10の整数を表す。〕 で表される免疫グロブリンまたはそのフラグメン
トと、下記式〔〕 HS1―Al（―NH―Cy）n ……〔〕 〔Alは血清アルブミンを、Cyは細胞毒性物質を
表す。S1及びNHはそれぞれ血清アルブミン中の
硫黄原子及びイミノ基を表す。ｍは１〜30の整数
を表す。〕 で表される細胞毒性物質を結合した血清アルブミ
ンを、チオール基と反応し得る官能基を２個有す
る架橋剤を用いて結合することを特徴とする、下
記式〔―２〕 Ab〔―（B2）t2―S2―B3―S1 ―Al（―NH―Cy）n〕o ……〔―２〕 〔Ab，Al，Cy，B2，S1，S2，NH，ｍ、および
t2の定義は前記のとおりであり、B3は２価の有機
基を、ｎは１〜10の整数を表す。〕 で表される組細胞毒性複合体を活性成分とする癌
治療用剤の製造法。 ９ 下記式〔〕 HS1―Al（―NH―Cy）n ……〔〕 〔Alは血清アルブミンを、Cyは細胞毒性物質を
表す。S1及びNHはそれぞれ血清アルブミン中の
硫黄原子及びイミノ基を表す。ｍは１〜30の整数
を表す。〕 で表される細胞毒性物質を結合した血清アルブミ
ンと、下記式〔〕 〔Abは免疫グロブリンまたはそのフラグメント
を、B4は２価の有機基を、n′は１〜10の整数を表
す。〕 で表される導入されたマレイミド基をもつ免疫グ
ロブリンまたはそのフラグメントを反応せしめる
ことを特徴とする、下記式〔〕 〔Ab，Al，Cy，S1，NH，B4及びｍの定義は前
記のとおりであり、ｎは１〜10の整数を表す。〕 で表される細胞毒性複合体を活性成分とする癌治
療用剤の製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57226236A JPS59116229A (ja) | 1982-12-24 | 1982-12-24 | 細胞毒性複合体を活性成分とする癌治療用剤およびその製造法 |
| DE8383307812T DE3381471D1 (de) | 1982-12-24 | 1983-12-21 | Konjugat mit zytotoxizitaet und verfahren zu seiner herstellung. |
| EP83307812A EP0115171B1 (en) | 1982-12-24 | 1983-12-21 | Conjugate having cytotoxicity and process for the preparation thereof |
| US06/563,860 US4507234A (en) | 1982-12-24 | 1983-12-21 | Conjugate having cytotoxicity and process for the preparation thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57226236A JPS59116229A (ja) | 1982-12-24 | 1982-12-24 | 細胞毒性複合体を活性成分とする癌治療用剤およびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59116229A JPS59116229A (ja) | 1984-07-05 |
| JPH021808B2 true JPH021808B2 (ja) | 1990-01-12 |
Family
ID=16842022
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57226236A Granted JPS59116229A (ja) | 1982-12-24 | 1982-12-24 | 細胞毒性複合体を活性成分とする癌治療用剤およびその製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4507234A (ja) |
| EP (1) | EP0115171B1 (ja) |
| JP (1) | JPS59116229A (ja) |
| DE (1) | DE3381471D1 (ja) |
Families Citing this family (63)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2137210B (en) * | 1983-03-30 | 1986-11-19 | Lilly Industries Ltd | Immunoglobulin conjugates |
| JPS60172935A (ja) * | 1984-02-16 | 1985-09-06 | Green Cross Corp:The | 制癌作用物質複合体の製造方法 |
| CA1314245C (en) * | 1984-05-23 | 1993-03-09 | Franz Jansen | Process for the preparation of conjugates in which a monovalent carboxylic ionophore is associated by means of a covalent bond with a macromolecule, which are useful as immunotoxin potentiators |
| US4542225A (en) * | 1984-08-29 | 1985-09-17 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Acid-cleavable compound |
| US4698420A (en) * | 1985-02-25 | 1987-10-06 | Xoma Corporation | Antibody hybrid molecules and process for their preparation |
| US4744981A (en) * | 1985-10-17 | 1988-05-17 | Neorx Corporation | Trichothecene antibody conjugates |
| US5405966A (en) * | 1985-10-17 | 1995-04-11 | Theodore; Louis J. | Trichothecene conjugates |
| US4751286A (en) * | 1985-11-19 | 1988-06-14 | The Johns Hopkins University | Protein label and drug delivery system |
| EP0232693A3 (fr) * | 1985-12-16 | 1988-04-06 | La Region Wallonne | Conjugués de la vinblastine et de ses dérivés, procédé pour leur préparation et compositions pharmaceutiques les contenant |
| JPS63502112A (ja) * | 1986-01-03 | 1988-08-18 | コンソリデイテツド・フアーマシユーテイカルズ・リミテツド | メルファラン誘導体 |
| US5260203A (en) * | 1986-09-02 | 1993-11-09 | Enzon, Inc. | Single polypeptide chain binding molecules |
| US4808705A (en) * | 1986-12-19 | 1989-02-28 | Cetus Corporation | Stable formulations of ricin toxin a chain and of RTA-immunoconjugates and stabilizer screening methods therefor |
| CA1335227C (en) * | 1987-06-22 | 1995-04-11 | Wylie W. Vale, Jr. | Crf analog conjugates |
| US4981979A (en) * | 1987-09-10 | 1991-01-01 | Neorx Corporation | Immunoconjugates joined by thioether bonds having reduced toxicity and improved selectivity |
| DE3873887T2 (de) * | 1987-12-02 | 1993-02-04 | Neorx Corp | Spaltbare immun-conjugate fuer die abgabe und freisetzung von agenzien in natuerlicher form. |
| US5563250A (en) * | 1987-12-02 | 1996-10-08 | Neorx Corporation | Cleavable conjugates for the delivery and release of agents in native form |
| US5141648A (en) * | 1987-12-02 | 1992-08-25 | Neorx Corporation | Methods for isolating compounds using cleavable linker bound matrices |
| US5017693A (en) * | 1987-12-02 | 1991-05-21 | Neorx Corporation | Methods for introducing a sulfhydryl amino or hydroxyl groups to a compound |
| EP0329184A3 (en) * | 1988-02-19 | 1990-05-23 | Neorx Corporation | Antimers and antimeric conjugation |
| US5057301A (en) * | 1988-04-06 | 1991-10-15 | Neorx Corporation | Modified cellular substrates used as linkers for increased cell retention of diagnostic and therapeutic agents |
| US5066490A (en) * | 1988-06-01 | 1991-11-19 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health & Human Services | Protein crosslinking reagents cleavable within acidified intracellular vesicles |
| US5171563A (en) * | 1988-09-30 | 1992-12-15 | Neorx Corporation | Cleavable linkers for the reduction of non-target organ retention of immunoconjugates |
| DE68919366T2 (de) * | 1988-09-30 | 1995-05-18 | Neorx Corp | Spaltbare linker zur reduzierung der akkumulierung von immunokonjugaten in nicht-zielorganen. |
| US5288855A (en) * | 1989-01-23 | 1994-02-22 | Farmitalia Carlo Erba | Extracellular form of the human fibroblast growth factor receptor |
| US5116944A (en) * | 1989-12-29 | 1992-05-26 | Neorx Corporation | Conjugates having improved characteristics for in vivo administration |
| US5466681A (en) * | 1990-02-23 | 1995-11-14 | Microcarb, Inc. | Receptor conjugates for targeting penicillin antibiotics to bacteria |
| US5185433A (en) * | 1990-04-09 | 1993-02-09 | Centocor, Inc. | Cross-linking protein compositions having two or more identical binding sites |
| US5155210A (en) * | 1990-09-11 | 1992-10-13 | Brunswick Corporation | Methods of conjugating actinomycin d |
| US5612034A (en) * | 1990-10-03 | 1997-03-18 | Redcell, Inc. | Super-globuling for in vivo extended lifetimes |
| DE4122210C2 (de) * | 1991-07-04 | 1999-04-01 | Deutsches Krebsforsch | Konjugate aus tumoraktiver Verbindung und Serumalbumin sowie Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung |
| DE4433890C2 (de) * | 1994-09-22 | 1999-02-18 | Deutsches Krebsforsch | Konjugat aus einem Wirkstoff und einem nicht als körperfremd angesehenen, nativen Protein |
| DE19636889A1 (de) | 1996-09-11 | 1998-03-12 | Felix Dr Kratz | Antineoplastisch wirkende Transferrin- und Albuminkonjugate zytostatischer Verbindungen aus der Gruppe der Anthrazykline, Alkylantien, Antimetabolite und Cisplatin-Analoga und diese enthaltende Arzneimittel |
| US6261562B1 (en) | 1997-02-25 | 2001-07-17 | Corixa Corporation | Compounds for immunotherapy of prostate cancer and methods for their use |
| WO1999033869A2 (en) | 1997-12-24 | 1999-07-08 | Corixa Corporation | Compounds for immunotherapy and diagnosis of breast cancer and methods for their use |
| US20020147143A1 (en) | 1998-03-18 | 2002-10-10 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer |
| AR020318A1 (es) | 1998-03-18 | 2002-05-08 | Corixa Corp | Una molecula polinucleotidica aislada, un polipeptido aislado codificado por dicha molecula, un vector de expresion, una celula huesped transformada, unaproteina de fusion, una composicion farmaceutica y una vacuna que comprenden dicho polipeptido o proteina; metodos para el tratamiento, deteccion, |
| US6375952B1 (en) | 1998-08-07 | 2002-04-23 | University Of Washington | Immunological herpes simplex virus antigens and methods for use thereof |
| US20030235557A1 (en) | 1998-09-30 | 2003-12-25 | Corixa Corporation | Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy |
| JP2002531129A (ja) | 1998-12-08 | 2002-09-24 | コリクサ コーポレイション | クラミジア感染の処置および診断のための化合物および方法 |
| US20020119158A1 (en) | 1998-12-17 | 2002-08-29 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer |
| US6579973B1 (en) | 1998-12-28 | 2003-06-17 | Corixa Corporation | Compositions for the treatment and diagnosis of breast cancer and methods for their use |
| EA005140B1 (ru) | 1999-04-02 | 2004-12-30 | Корикса Корпорейшн | Соединения и способы для лечения и диагностики рака легкого |
| US6706892B1 (en) * | 1999-09-07 | 2004-03-16 | Conjuchem, Inc. | Pulmonary delivery for bioconjugation |
| US20040002068A1 (en) | 2000-03-01 | 2004-01-01 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies |
| AR029540A1 (es) | 2000-06-28 | 2003-07-02 | Corixa Corp | COMPOSICIONES Y METODOS PARA EL DIAGNoSTICO Y LA TERAPIA DE CA NCER DE PULMoN |
| US20020102617A1 (en) * | 2000-08-03 | 2002-08-01 | Macbeath Gavin | Protein microarrays |
| JP2004506201A (ja) * | 2000-08-03 | 2004-02-26 | マサチューセッツ・インスティチュート・オブ・テクノロジー | 機能性生体分子のマイクロアレイおよびその使用 |
| JP2005504513A (ja) | 2001-05-09 | 2005-02-17 | コリクサ コーポレイション | 前立腺癌の治療及び診断のための組成物及び方法 |
| DK2224012T3 (da) | 2001-12-17 | 2013-05-13 | Corixa Corp | Sammensætninger og fremgangsmåder til terapi og diagnose af inflammatoriske tarmsygdomme |
| CA2478924A1 (en) * | 2002-03-14 | 2003-09-18 | Qlt Inc. | Cancer associated araf1 protein kinase and its uses |
| DK1523582T3 (da) | 2002-07-18 | 2009-03-02 | Univ Washington | Hurtig, effektiv rensning af HSV-specifikke T-lymfocytter samt HSV-antigener identificeret derved |
| US9259463B2 (en) | 2006-01-16 | 2016-02-16 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Chlamydia vaccine |
| US9044461B2 (en) | 2006-04-07 | 2015-06-02 | The Research Foundation Of State University Of New York | Transcobalamin receptor polypeptides, nucleic acids, and modulators thereof, and related methods of use in modulating cell growth and treating cancer and cobalamin deficiency |
| WO2007117657A2 (en) | 2006-04-07 | 2007-10-18 | The Research Foundation Of State University Of New York | Transcobalamin receptor polypeptides, nucleic acids, and modulators thereof, and related methods of use in modulating cell growth and treating cancer and cobalamin deficiency |
| EP3115469B1 (en) | 2007-11-19 | 2020-04-29 | Celera Corporation | Lung cancer markers and uses thereof |
| CA2771336C (en) | 2009-09-15 | 2019-11-26 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Synergistic anti-cd47 therapy for hematologic cancers |
| AU2012225246B2 (en) | 2011-03-10 | 2016-01-21 | Omeros Corporation | Generation of anti-FN14 monoclonal antibodies by ex-vivo accelerated antibody evolution |
| CA2837651A1 (en) | 2011-06-21 | 2012-12-27 | Oncofactor Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of cancer |
| US9120858B2 (en) | 2011-07-22 | 2015-09-01 | The Research Foundation Of State University Of New York | Antibodies to the B12-transcobalamin receptor |
| WO2013025446A2 (en) | 2011-08-12 | 2013-02-21 | Omeros Corporation | Anti-fzd10 monoclonal antibodies and methods for their use |
| CN106456748A (zh) | 2014-01-08 | 2017-02-22 | 小利兰·斯坦福大学托管委员会 | 小细胞肺癌的靶向疗法 |
| US12428457B2 (en) | 2021-01-29 | 2025-09-30 | University Of South Florida | Cold-shock protein scaffold for engineering non-antibody binding proteins |
| JP7610223B2 (ja) * | 2021-10-29 | 2025-01-08 | 日東紡績株式会社 | 血清または血漿中の還元型アルブミン濃度または酸化型もしくは還元型アルブミンの割合を測定する方法およびキット |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH564031A5 (ja) * | 1968-03-29 | 1975-07-15 | Anvar | |
| GB1541435A (en) * | 1975-02-04 | 1979-02-28 | Searle & Co | Immunological materials |
| GB1541436A (en) * | 1976-02-02 | 1979-02-28 | Searle & Co | Immunological materials |
| EP0040506B1 (en) * | 1980-05-21 | 1986-08-20 | Teijin Limited | Reactive polymer and process for the preparation thereof |
| EP0044167A3 (en) * | 1980-07-14 | 1982-04-21 | The Regents Of The University Of California | Antibody targeted cytotoxic agent |
| JPS57106625A (en) * | 1980-12-22 | 1982-07-02 | Teijin Ltd | Cytotoxic protein complex and its preparation |
| FR2498192A2 (fr) * | 1981-01-22 | 1982-07-23 | Pasteur Institut | Nouveau compose polypeptidique thiole provenant d'un fragment de la toxine tetanique, son procede d'obtention et ses applications |
| CA1203164A (en) * | 1982-03-09 | 1986-04-15 | Thomas J. Mckearn | Antibody conjugates |
-
1982
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