JPH0222300A - 免疫原性接合体およびその製法ならびに免疫を生ぜしめる方法 - Google Patents

免疫原性接合体およびその製法ならびに免疫を生ぜしめる方法

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JPH0222300A
JPH0222300A JP63022669A JP2266988A JPH0222300A JP H0222300 A JPH0222300 A JP H0222300A JP 63022669 A JP63022669 A JP 63022669A JP 2266988 A JP2266988 A JP 2266988A JP H0222300 A JPH0222300 A JP H0222300A
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protein
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asn
pro
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JP63022669A
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Jerald C Sadoff
ジェラルド・シー・サドフ
Stanley J Cryz Jr
スタンレイ・ジェイ・クライズ・ジュニア
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Cilag GmbH International
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Schweiz Serum und Impfinstitut Bern
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は免疫原性接合体の製造およびその生産方法に関
する。特に本発明は少くとも１つのスペーサー分子を介
してヒトのワクチンに適した担体タンパク質に結合した
スポロゾイト表面皮膜タンパク質を特徴とする接合体ワ
クチンに関する。
従来の技術 衰弱性でしばしば致死的疾病であるマラリアはプラスモ
ジウム（Ｐｌａｍｏｄｉｕｍ）層の寄生虫による感染に
より起こされる。国家的および国際的保健機関の精力的
な努力にもかかわらず、世界の熱帯および亜熱帯地域に
おける罹病率および死亡率の原因の第１位は引き続きマ
ラリアである。１９８２年の表では全世界の人口の５４
％の人がマラリアが地方流行性である地域に居住してお
り、それ故この疾病にかかる危険性がある。全世界では
一年当り二千五百〜三千万のマラリアの新症例が報告さ
れていると推定される。アフリカのみでも一年につき百
万人がマラリアで死亡している。これらの数字は過去十
年間大体一定のままである。
ヒトマラリアの病因学的因子は熱帯熱マラリア原虫（Ｐ
、　ｆａｌｃｉｐａｎｕｍ、世界的にみて約８０チの症
例を起こしている）および三日熱マラリア原虫（Ｐ、Ｖ
ｉｖａｘ）である。マラリア原虫の発育環は複雑であり
、蚊およびヒトの２つの宿主で数段階の分化を行なう。
ヒトに感染する段階はスポロゾイト９と称され、蚊の咬
創によりヒトへ伝播される。スポロゾイトは他の細胞に
入る前短時間血流に存在する。初感染は肝朦の感染と考
えられている。分化後この器官が赤血球細胞を感染させ
、そこで細胞内原虫として存続する。この形で存在する
時はマラリア原虫は免疫余から隔離されており、弱い非
保護的抗体応答しか起こすことができない。
原則として、マラリアの制圧を目的とする取組みは３つ
の標的に向けられている；１）蚊媒介動物の根絶、１１
）感染者の治療または管理、および１１１）危険を冒し
ても人々へ免疫を与える。殺虫剤はアノフェレス蚊媒介
動物の制圧に対して最初に考えられる有望な事である。
しかしながら、これらの７ｒＪ４剤に対する耐性の増加
、有害な環境への衝撃、散布の費用、薄地地域へ近づき
がたいことなどを合わせるとマラリアへの殺虫剤対策に
は大きな限界がある。
種々の抗マラリア剤を使用するマラリア治療または管理
の試みは最近薬剤耐性株の出現により妨げられている。
”】１択される薬剤”であるクロロキンの耐性が広範囲
に広がり、スルホンアミドピリメタミンを使用する第２
の養生法の場合も同様である。最近、新しい抗マラリア
剤、メルホキンが導入された。異った地理的領域の熱帯
熱マラリア原虫間でのメルホキン≧に剤感受性が一定し
ないため、メルホキシの使用にも限界がある。
マラリアに対する活性な免疫反応を誘起しようとする最
初の試みは１９４０年代になされ、熱帯熱マラリア原虫
からの不活性化スポロゾイトで免疫すると鳥マラリアに
対する防御が得られる事が示された。続いて不活性化ス
ポロゾイトでマウス、サルおよびヒトを免疫するとスポ
ロゾイト段階の原虫による攻げきに対する防御が与えら
れる事が示された。前記の研究で使用されたスポロゾイ
ト免疫原は蚊の唾液腺から得られた成熟スポロゾイトで
あった。これらの研究は抗スポロゾイト抗体がマラリア
に対しての防御を与える能力がある事を示したが、以下
の点を考えると免疫原としての不活性化スポロゾイトの
使用は実際的ではない；１）唾液腺からのスポロゾイト
の単離では非常に少景の原虫しか得られない、１１）ス
ポロゾイトは合成または半合成培地では培養できない、
および１１１）高い力価の抗−スポロゾイト抗体はくり
返しの静脈内免疫化または強力なアジ−パントの使用で
のみ引き出せるが、両方の方法ともヒトのワクチン投与
法としては不適である。
現在、スポロゾイトによる防御抗原発現は原虫の表面に
局在しているスポロゾイト表面皮膜タンパク質（ｃｓｐ
　）である事が認められている、Ｊ、Ｆ。
ヤングらサイエンス、２２８，９５８（１９８５）。熱
帯熱マラリア原虫のＣ３Ｐの合成を含む遺伝子がクロー
ン化され配列決ボされている。Ｃ８Ｐは４１のテトラＲ
プチド（り返し単位から成っている；３７の（ＡＳＮ−
ＡＬＡ−ＡＳＮ−ＰＲＯ）および熱帯熱マラリア原虫お
よびＰ、ノウレジ（ｋｎｏｗｌｅｓｉ）により１共有さ
れ”ている２つの領域が側面についた４つの（ＡＳＮ−
ＶＡＬ−ＡＳＰ−ＰＲＯ）。Ｃ３Ｐ（７）　２　ツノ共
有サレタ領域に対する抗体は何の防御効果も持たない事
が示されている。反対にＡＳＮ−ＡＬＡ−ＡＳＮ−ＰＲ
Ｏ領域に対する抗体は生のスポロゾイトと反応し、肝臓
細胞へのそれらの侵入を防護する事が見い出されている
、Ｗ、Ｒ，バロウらサイエンス２２８　、９９６　（１
９８５）。
これらの発見に基づき、マラリア　ワクチン展開の試み
はＣ３ＰのＡＳＮ−ＡＬＡ−ＡＳＮ−ＰＲＯ領域を認識
する抗体応答を誘発できる抗原の産生の周囲に集中した
。１５　（ＡＳＮ−ＡＬＡ−ＡＳＮ−ＰＲＯ）に加える
ことのｌ　（ＡＳＮ−ＶＡＬ−ＡＳＰ−ＰＲＯ）をコー
ドする遺伝子セグメントは合成されており、遺伝子の２
つのコピーは一緒にスプライシングされている。この配
列はＲ３２と称される。Ｒ３２はテトラサイクリン耐性
（Ｔ、ＴＲ）をコードシているプラスミド９中ヘスプラ
イシングされた。Ｒ３２に加えてＴ。ＴＲ遺伝子産物の
３２のアミノ酸をコードする融合産物はＲ３２−ＴｅＴ
３２と称される。マウスの免疫化に使用した場合、Ｒ３
２−ＴｅＴ３２は生のスポロゾイトのＣ８Ｐを認識し、
肝臓細胞へのスポロゾイト侵入を防護する抗体応答を発
生せしめた。免疫応答の誘発にはＴｅＴ３２遺伝子産物
の存在が必要であった。もし、ＴｅＴ３２領域が除かれ
た場合は、強力な油基剤アジュバントが免疫応答の誘発
に必要であった。続いてＲ３２−ＴｅＴａｚをＡｌ　（
ＯＨ）　３（アジ−パントとして働くため）に吸着せし
め、種々の量で（１０μｙから１，０００μｇ）ヒト志
願者に筋肉内に投与した。Ｒ３２−ＴθＴ３２は試験し
た最も多い用量でも弱い抗−スポロゾイト免疫応答を誘
発したにすぎなかった。この弱い免疫応答とそれを発生
せしめるのに必要な相対的に多量の抗原の事を合わせる
と公衆衛生使用のためのヒトワクチンとしては不適であ
る。
抗スポロゾイト免疫応答を発生させる異った試みは、Ａ
ＳＮ−ＡＬＡ−ＡＳＮ−ＰＲＯ＜り返し単位から成る人
工合成低分子量ペプチド９の使用である。その低分子量
のため、これらのにプチビ自身のみは免疫原とはならな
い。従ってベプチビを担体タンパク質に共有結合で結合
し、接合体ワクチンを作る。
一つの研究例では、ｋプチト”　（ＡＳＮ−ＡＬＡ−Ａ
ＳＮ−ＰＲＯの２から４つのくり返し単位から成る）ス
クシンイミジル４（Ｎ−マレイミド９メチル）シクロヘ
キサン−１−カルボキシラード（ＳＭＣＣ）およびｍ−
マレイミドベンゾイル　Ｎ−ヒビロキシスクシンイミド
エステル（ＭＢＳ）を結合剤として用い、ウシ血清アル
ブミンまたはサイログロブリンへ結合せしめる。Ｗ、Ｒ
，バロウら１９８５　（上記文ｒ：メ。これらの接合体
は強力なアジ−パントと伴に投与した場合、マウスに抗
スポロゾイト抗体応答を引き出す事ができた。免疫抗体
はスポロゾイトの肝臓細胞への侵入を防止できた。再び
これらの複合体は以下のごとき理由でヒトへの使用には
適当でない；１）担体タンノξり質に対して引き出され
た抗体は共通の決定基を共有するヒトタン・ξり質と反
応する、またはウシ血清アルブミンの場合は摂取された
食品と反応する。１り用いた２つの結合剤（ＳＭＧＣお
よびＭＢＳ　）は非常に反応活性な基を持つており、そ
れらが宿主組織と反応する事が予想される（これらは接
合体中へ取り込まれていると思われるので）、および１
１１）アジバント９不在下またはヒトへの使用に適した
アジュバント９の存在下でのこれらの接合体の免疫原性
が示されていない。
ヨーロッパ特許出願第１６６．４１０号および米国ＰＣ
Ｔ出願第８４１００１４４号、米国ＰＯＴ出願８５１０
１７３３号および米国ＰＣＴ出願８６１００６２７号は
担体タンパク質へのペプチドの一般的な結合方法につい
て記載している。多糖類と結合した髄膜炎菌（Ｎｅｉｓ
ｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）タンパク質か
ら成る摺合体ワクチンも作製されている、アインホーン
らランセット、８月９日、　１９８６．７）２９９゜し
かしながらこの型のタンパク質はまた投プチドと結合さ
れていない。ここで参照したこれらおよびその他の文献
は参照文献としてここに包含されている。
三日熱マラリア原虫のスポロゾイト表面皮膜タンパク質
の産生を含む遺伝子もまた同定されている。配列のくり
返し単位はＧＬＹ　：ＡＳＰ　：　ＡＲＧ　：　ＡＬＡ
　：ＡＳＰ　：　ＧＬＹ　：　（：、ＬＵ　：　ＰＲＯ
：　ＡＬＡである。
発明が解決しようとする課題 本発明は免疫原調製およびそれから作製されるワクチン
に関する。熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト表面皮膜
タンパク質および／または三日熱マラリア原虫のスポロ
ゾイト表面皮膜タンパク質から誘導されるペプチドをス
ペーサー分子を通してキャリアータンパク質に共有結合
で結合せしめる。熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラ
リア原虫ワクチンおよび熱帯熱マラリア原虫−三日熱マ
ラリア原虫二価ワクチンについて記載する。
一つの実施態様において、本発明は（ＡＳＮ　：　ＡＬ
Ａ　：ＡＳＮ：ＰＲＯ）ｎ（式中ｎ＝ｔ−５ｏ）の組成
のアミノ酸を無水コハク酸および／またはアジピン酸ジ
ヒト９ラジド（以下ＡＤＨと略記）のごときスペーサー
分子を用い、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピル
カルボジイミド塩酸塩（以後ＥＤＥＣと略記）のごとき
結合剤を用いてＣＲＭ　１　ｇ　ｙ　、ジフテリア毒素
、トキシンＡ１コレラグノイド、および、髄膜炎菌Ｂ群
外皮膜タンパク質のごときキャリアータンパク質として
適したタンパク質へ結合せしめる。
他の実施態様において本発明は以下の組成のアミ／　ｆ
ｉヲ：　Ｈ−ＡＳＮ：ＰＲＯ：ＡＳＮ：ＡＬＡ：ＡＳＮ
：ＰＲＯ：ＡＳＮ：ＡＬＡ：ＡＳＮ：ＰＲＯ：ＡＳＮ：
ＡＬＡ−ＯＨ（以後Ｍｐｅｐ＆略記）塩化アンモニウム
とｐＨ４−６で反応せしめ、生成物を以後Ｍｐｅｐ　（
Ｎ）と略記する。ＭｐｅｐまたはＭｐｅｐ（Ｎ）は、ス
ペーサー分子および結合剤を用い、ＣＲＭ１ｇ７、ジフ
テリア毒素、毒素Ａ１コレラゲノイドおよび髄膜炎菌Ｂ
群外皮膜タンパク質のごときキャリアー（担体）へ結合
せしめる。
さらに他の実施態様において、本発明は以下のアミノ酸
組成物ＭＥＴ　：　ＡＳＰ　：　ＰＲＯ（（ＡＳＮ　：
　ＡＬＡ　：　ＡＳＮ　：ＰＲＯ）１５（ＡＳＮ：ＶＡ
Ｌ：ＡＳＰ：ＰＲＯ））２ＬＥＵ：ＡＲＧ　（以後Ｒ３
２−ＬｅｕＡＲＧと略記）をスペーサー分子および結合
剤を用い適したキャリアータン・ξり質に結合せしめる
。
さらに本発明の他の実施態様において、ペプチド”　（
ＧＬＹ：ＡＳＰ：ＡＲＧ：ＡＬＡ：ＡＳＰ：ＧＬＹ：Ｇ
ＬＵ：ＰＲＯ：ＡＬＡ）”（以後”ｐｅｐと略記、式中
ｎ　＝　１−５０　）をスペーサー分子および結合剤を
用いて適したキャリアータンパク質に結合せしめる。
さらに本発明の他の実施態様においては、グラム陰性菌
外皮膜タンパク質の無水物による可溶化および無毒化の
方法（この事により処理タンパク質をキャリアータンパ
ク質として使用できる）を記載する。
課題を解決するための手段 本発明は熱帯熱マラリア原虫または三日熱マラリア原虫
のスポロゾイト表面皮膜（ａｓｐ）を抗原決定基として
共有するペプチドからなる免疫化調製試料を目的とする
。これらの新規免疫剤は、熱帯熱マラリア原虫または三
日熱マラリア原虫のＣ８Ｐと相同性を持つ既知のアミノ
酸配列から合成される投プチビにより誘導される。これ
らの非免疫性はプチト９をスペーサー分子および結合剤
を使用して担体タンノξり質に結合せしめて免疫原性を
与え、ヒトに使用するワクチンとして適したものにする
。
これらのワクチンは非経口、経口または鼻咽腔を経由し
て投与した場合、熱帯熱マラリア原虫または三日熱マラ
リア原虫により起こされるマラリアに対する活性免疫と
して有用である。
複合ワクチンの組成物は以下のとと（して調製する。担
体タンパク質としては都合のよいように無毒で、非発熱
性で、不可溶で、医薬として適し、ヒト免疫応答をおこ
すことができる大きさで、第２の感染症に対する抗体に
関係なく、ＰＨ２−１２で安定であり、低アレルギー性
で、結合に対して比較的多（の反応基を持っているもの
から選択すべきである。ジフテリア毒素、ＣＲＭ１９７
、トキシンＡ１コレラグノイド、および髄膜炎菌８群外
皮膜タンパク質のごときグラム陰性菌外皮膜タンパク質
のごときキャリアータンパク質が本発明で使用できる。
ジフテリア毒素はジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
θｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｖｉｕｅ）　ＰＷ　３の培養
上清を、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグ
ラフィーおよびゲル濾過して精製できる、Ｒ，に；ホル
メス　インフェクションアンビイミュニティ　１２：１
３９２（１９７５）。
無毒化はホルマリンを添加し、３５℃で１ケ月インキ二
（−トして毒素溶液へ溶解せしめる事により達成できる
。得られた拷素は、ジフテリア拷素のヒトへの使用のた
め世界保健機構により定められた必要性を満足せしめる
。
ＣＲＭｌ１５７（ジフテリア毒素と免疫的に交叉反応す
る無毒タン・ξり質）はＲ，に、ホルメスにより（上記
文献、１９７５　）記載されたごとくしてジフテリア菌
Ｃ７（βｔｏｘ−１９７）の培養上清から精製する。
トキシンＡは緑膿菌（Ｐｓｅｕａｏｍｏｎａｓ　ａｅｒ
ｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡ１０３　の培養上清から、　Ｓ、
Ｊ、クリッノらにより記載されているごとくして〔イン
フェクションアンドイミュニティ　３９　：　１０７２
（１９８３））、硫酸アンモニウム沈殿の濾過およびイ
オン交換クロマトグラフィーにより精製できる。他の免
疫的に関連ある交叉反応性物質にもまた使用される。
コレラゲノイドは精製コレラ毒素を酸性条件で処理し、
続いてゲル濾過する事により単離できるＣＫ、Ｈ，ウォ
ンら、バイオロジカル　スタンダード９５　：　１９７
（１９７７））。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉ）Ｂサブユニット熱不安定性青紫のごとき他のコ
レラゲノイド類似物質にも使用できる。
髄膜炎菌Ｂ群舞皮膜タン／ξり質は髄膜炎菌（Ｎｅｉｓ
ｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎ　１ｔｉｄｉｓ）から以下のご
とくして精製できる。殺した細菌をトリス−ＥＤＴＡ緩
衝液中ホモゲナイズする。上澄を１００，０ＯＯＸＦで
２時間遠心分トまし、ｋレットを集める。外皮膜含有ベ
レットを１チエムピゲンＢＢにＰＨ８にて懸濁し、４℃
にて１６時間インキュベートする。溶液を超音波処理す
る。５００５’／Ｌになるまで硫酸アンモニウムを添加
する。沈殿をトリス−ＮａＣｌＥＤＴＡ　、エムピゲン
援衝液に溶解し、超音波処理する。超音波処理液を上記
緩衝液に対して透析する。
溶液を０．２２μＭメンブランフィルターを通して濾過
する。３容量の冷エタノールと混合し、沈殿を集める。
Ｋレットをリン酸ナトリウム、ＮａＣ７！、ツビイッタ
ーゼント（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）　緩衝液（７）Ｆ
（８）に懸濁する。他の可溶化グラム陰性菌外皮膜タン
パク質にも使用できる。淋菌（Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅ
ａθ）または他の髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｇｉｔｉａｉ
ｓ）のごときナイセリア、ｆｉ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）
からの都合のよいタン・ξり質にも使用できる。
下記のアミノ酸組成の深プチド Ｈ−ＡＳＮ　：　ＰＲＯ：　ＡＳＮ　：　ＡＬＡ　：　
ＡＳＮ　：　ＰＲＯ：　ＡＳＮ　：　ＡＬＡ　：　ＡＳ
Ｎ　：ＰＲＯ：ＡＳＮ：ＡＬＡ−ＯＨ（即ちＭｐｅ　ｐ
）ｌ’！、固相レジｙ系で合成でき、Ｂａｃｈｅｍ　Ｆ
ｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｅｎ　ＡＧ、バーセル、スイス
から入手可能である。
使用する結合剤は都合がよいように不可溶性カルボジイ
ミド９である。都合の良い結合剤の例は下記の式 の構造を持つ、１−エチル−３−（：）メチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド”　（ＥＤＥＣ）である。
都合の良い率に本結合剤はキャリアータンパク質および
スは−サー分子間の反応を可能にするキャリアータンパ
ク質の反応活性中間体を生じせしめる。
使用するスイーサー分子は都合が良いように、無毒、非
発熱性（７）Ｈ２−１２）および１つまたはそれ以上の
反応基を持つものが良い。
使用するス（−サー分子は便利なように式；ＮＨ２−Ｎ
Ｈ−Ｃ：Ｏ−（ＯＨ２）　ｎ−Ｃｏ−ＮＨ−ＮＨ２（式
中ｎ＝ｘ−ｚＯ） の構造を持つジカルボン酸ジヒト９ラジト９である。
都合の良いスペーサーの例は、アジピン酸ジヒビラジビ
（ＡＤ）Ｉ）　、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マ
レイン酸および無水フタル酸、他の適した無水物または
１−２０の炭素数からなるモノまたはジヒビラ：）ヒで
ある。これらのスペーサーの使用により高い比率で（プ
チドが担体タンパク質に結合する。
髄膜炎菌外皮膜タンパク質の場合、無水コハク酸または
他の適した無水物処理によりタンパク質が水可溶性とな
る。このスペーサー／可溶化剤処理は、髄膜炎菌および
淋菌のごときすべてのナイセリア属からのタンパク質を
含むグラム陰性菌外皮膜タンパク質を可溶性無毒担体に
なすのに使用できる事に注意されたい。髄膜炎菌タンパ
ク質または他のグラム陰性菌外皮膜タンパク質（ＯＭＰ
）は界面活性剤またはポリサッカライドまたは他の親水
性領域を持つ他の可溶化剤の不在下では不溶性である。
無水コノ・り酸処理ＯＭＰは可溶性で複合体も可溶性を
保持している。複合体は無水コノ・り酸処理前の髄膜炎
菌タンパク質に比ベウサギにおいてより低い発熱性を示
し、この事は可溶化同様これらのタンパク質が無胃化さ
れている事を示しており担体としての使用を可能にして
いる。
ペプチドを担体に結合する前に、ペプチドは塩化アンモ
ニウムのごとき化合物で前処理し、カルボキシ基を保護
せねばならない。更に、はプチドは無水コハク酸のごと
き化合物で処理し、ペプチドのアミノ基を保護せねばな
らない。この方法において無水コハク酸のごとき化合物
を使用すれば、またスペーサー機能にも寄与する。
以下に記載するマラリア複合ワクチンは、熱帯熱マラリ
ア原虫または三日熱マラリア原虫のＣ８Ｐと免疫的に交
叉するはプチドの種々の担体タンパク質への共有結合を
容易にする為に、５無水コノ・り酸および／またはアジ
ピン酸ジヒドラジｌ−”　（ＡＤＨ）をスペーサー分子
として利用して合成される。
本発明の一部として用いられる接合条件は、マラリアに
ブチどまたはＲ３２Ｌθｕ　ＡＲＧの種々のキャリアー
タンパク質への共有結合に効果的である。
Ｒプチドのキャリアータンパク質に対するモル比は５：
１から１８：１であり、一方Ｒ３２−Ｌｅ己ｍのトキシ
ンＡに対する比は１３：１である。
図１−４のウェスタンプロットに見られるごとく、接合
体の結合は種々の分子量で複雑に起こっている。
本発明のワクチンは水酸化アルミニウムまたはリン酸ア
ルミニウムのごとき適したア：）Ｓバンドと混合できる
。
以下に本発明をより詳細に記載するが、例示した実施例
に制限されるわけではない。
ＣＲＪＡ　１　ｇ　７は０．Ｉ　Ｍ　ＮａＰＯ，ｓ　、
　ＰＨ６，５で長く透析する。
材料を１２５ｆｆｌＪのエルレンマイヤーフラスコに移
し、ｐＨを８．０に上げる。
無水コハク酸は７０ｍ１の沸とう酢酸を１０．９の無水
コハク酸に加え再結晶せしめる。溶液を放置して４℃ま
で冷却すると結晶が生成する。過剰の液体を除去し、結
晶を無水エーテルで３回洗浄した後、結晶を乳鉢と乳棒
でひき窒素雰囲気下−２０℃にて保存する。
再結晶した無水コハク酸４５０ηを３０＋ｎｌの水に入
れた３０■ＣＲＭ１９７に添加し、その間連続的に攪拌
する。ＮａＯＨの添加によりｐＨを８．２に維持する。
２時間後、更に４５０■の無水コハク酸を添加し、ｐＨ
は２時間８．２を維持する。これらの反応は２５℃で実
施し、この生成物は以後ＣＲＭ１９７（Ｓ）と称する。
反応混合液を透析チューブに移し、２Ｌの０６１Ｍ　Ｎ
ａＰＯ４ｐＨ６，５の援衝液に対して透析する。液体は
４回交換する。透析チー−ブから取り出し、０．４５μ
Ｍフィルターを通して無菌化し、４℃にて保存する。容
儀は約６０ｒｎｌである。
６０■のＭｐｏｐを１２ｍ１の２Ｍ塩化アンモニウム溶
液に溶解する。この過程でペプチドゝのカルボキシ末端
が保護され、即ち、Ｍｐｓｐ（Ｎ）が形成される。
それ故以下に記載する続いての工程では、カルボキシ末
端以外のはプチト９の反応活性基を通して反応が進行し
ており、それにより、強力にはプチビの抗原変化および
自己重合を制限している。
２５０〜の１−エチル−３−（：、）メチルアミノプロ
ピル）カルボジイミビ塩酸塩（ＥＤＥＣ：　）を２プチ
ビ溶液に添加する。ｐＨを０．２　Ｍ　ＨＣｌにて４．
７に下げる。ｐＨを監視し、４．７を保つ。３０分後、
更に２５０■のＥＤＥＣを添加し、ｐＨを４．７に維持
する。さらに３０分後、新たに２５０ｍｇのＥＤＥＣを
添加し、ｐＨを４．７に維持する。さらに３時間後、Ｎ
ａＯＨＴ　ｐＨを６．９に上げ、混合物は４℃にて保存
する。冷凍貯蔵しく一７０℃）凍結乾燥する。
塩化アンモニウム処理イプチド（Ｍｐｅｐ（Ｎ）　）　
ヲ１２ｍ１の無菌水に溶解し、セファデックスＧＩＯカ
ラムで２回精製する。この事により未反応の試薬が除去
される。４プチドを含有する分画はＵＶ吸収（ＯＤ２２
０）で同定し、集め、凍結乾燥する。
以下の方法によりＣＲ１ｖｆ１ｇ７（３）は共有結合的
にＭｐｅｐ（Ｎ）に結合される。３０ｒｒＭｉの無水コ
ハク酸処ｆｊＪ　ＣＲＭ１９７（ＣＲＭｘ　９７　（Ｓ
）　）を溶解した６０ｒｎｌの水溶液を３０■の塩化ア
ンモニウム処理Ｒプチビを溶解したＩＱｍｌの水溶液と
混合する。７）Ｈを２　Ｎ　ＨＣｌにて５．５に下げる
。５００７ｎｇノＥＤＥＣを添加シ、混合物は緩かに５
時間撹拌する。次にｓｏｏｍ９のＥＤＥＣを添加し、２
０分間攪拌する。再び５００■のＥＤＥＣを添加し２０
分攪拌する。さらに５００■のＥＤＥＣを添加し１時間
攪拌する。この時点でｐＨは５．４である。反応混合物
は透析チューブに移し、（１３）ＭＮａＰＯ４，７）Ｈ
７，０５に対して透析する。無菌状態で溶液を透析袋か
ら除去し、０．８μＭ　Ｐ、Ｅ、フィルターを動の力だ
けで濾過せしめ、続いて０．４５μＭフィルターを通す
。無菌オートクレーブアミコン濃縮装置およびＹＭ　３
　Ｑ膜を用いて溶液を２５ｍ１に濃縮する。０．２２μ
Ｍフィルターを通過せしめて４℃にて貯蔵する。
コレラゲノイト“は４℃にて（１３）　ＭＮａＰＯ４、
ＰＨ６，５に対して長時間透析する。４５■の透析コレ
ラゲノイドを５０ａｔのエルレ／メイヤーフラスコに置
きｐＨを８．０に上げる。２００ｍｇの無水コハク酸を
添加し、Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨにてｐＨを８．２に保つ。３
０分後さらに２００■の無水コハク酸を添加しｌＮＮａ
ＯＨにてｐＨを８．２にもどす。１時間後、２００■の
無水コハク酸を添加し、続いての１時間ｐＨを８．１に
維持する。溶液を透析袋に移し、Ｑ、　ｌ　Ｍ　ＮａＰ
Ｏ４、ｐＨ６，５に対して透析する。
Ｍｐｅｐ（Ｎ）は実施例１で合成されている。４５〜の
コレラゲノイ）−”（Ｓ）を２５０ｍｇのエルレンマイ
ヤーフラスコに脱塩したＭｐｅｐ（Ｎ）と伴に入れる。
２　ＮＨＣｅ　ＫテＰＨヲ５．４　Ｋ下げ、５０　ｏｎ
ｙｚノＥＤＥＣヲ添加する。３０分間緩かに攪拌後、さ
らに５００■のＥＤＥＣを添加する。３０分間隔で更に
２回５００■のＥＤＥＣを添加し、４℃にて５時間緩か
に攪拌する。反応混合物を透析チューブに移し、（１３
）　ＭＮａＰＯ４、ｐＨ７，０５に対して透析する。材
料を透析袋から除去し、０．２２μＭフィルターを通し
た後４℃にて貯蔵する。
３７ｍ１の水に加えた９００の髄膜炎菌２Ｂタンノξり
質ヲ１２５ｍ／エルレンマイヤーフラスコに入れる。
４５０■の無水コハク酸を添加し、ｌＮＮａＯＨにより
ｐＨを９．２に戻す。髄膜炎菌Ｂ群外皮膜タンパク質は
無水コハク酸処理により水可溶タンパク質となる。この
時点でタンパク質溶液は非常に透明となる。１時間ｐＨ
を８．１に維持する。その後４５０ｍ９の無水コハク酸
を添加し、２時間、ｔ）Ｈ８，Ｏに保つ。反応混合物は
更に３時間緩かに攪拌すると、その間ＰＨは７．０に落
ちる。混合物をＱ、ｌ　ＭＮａＰＯ４、ｐＨ７，０５緩
衝液に対して透析する。界面活性剤不動もタンパク質は
可溶のままである。
１０ｍ１（７）７Ｘに加えた３０ｍ１のＭｐｅｐ（Ｎ）
をエルシンマイヤーフラスコ中４０■の無水コハク酸処
理髄膜炎菌２Ｂタンパク質に添加する。２ＮＨＣｌにて
ｐＨを５．５に下げ、５００■のＥＤＥＣを添加し、２
５℃にて５時間緩かに攪拌する。２０分間隔でさらに３
回５００〜のＥＤＥＣを添加し、その後１時間攪拌する
。反応混合物を透析チューブに移し、ｏ、ＩＭ　ＮａＰ
Ｏ４、ｐＨ７，０５に対して透析する。材料を透析袋か
ら取り出し、０．２２μＭフィルターを通過せしめた後
４℃にて保存する。
実施例４ コレラゲノイド（ＡＤＨ）−Ｍｐｅｐ（Ｓ）　（アジピ
ン酸ジヒビラジドおよび無水コハク酸をスＲ−サー分子
として使用） ５．４　ｍｌのＱ、ｌ　Ｍ　ＮａＰＯ４、ｐＨ７，０に
加えた１３■のコレラゲノイドを２５ｍ１のフラスコに
入れる。
３００■のアジピン酸ジヒト９ラジト”　（ＡＤＨ）を
添加しｐＨを５．２に下げる。１２０■のＥＤＥＣを添
加し、（１３）　Ｎ　ＨＣＩＫ　テｐＨを５．５に保つ
。３０分後、１２０■のＥＤＥＣを添加し、ｐＨを５．
５−５．８の間に保つ。
１時間後１２０■のＥＤＥＣを添加し、　１時間攪拌し
た後透析袋に移す。反応混合物は（１３）　Ｍ　ＮａＰ
Ｏ４。
ＰＨ６，５に対して透析する。得られる生成物はコレラ
ゲノイド（ＡＤＨ）と称する。
２０■のＭｐｅｐをＱ、　ｌ　Ｍ　ＮａＰ○４５ｒｎｌ
に懸濁し、ＩＮ　ＮａＯＨにて７）Ｈを８．２に上げる
。１５０■の無水コハク酸を添加し、ｌＮＮａＯＨにて
ｐＨを８．０に保つ。９０分後、１５０■の無水コハク
酸を添加し次の６０分間ｐＨを８．０に維持する。２．
５　時間緩かに攪拌するとｐＨが７．０となる。溶液は
セファデックスＧＩＯカラムで精製し、適当な分画を凍
結乾燥する。得たる生成物はＭｐｅｐ（Ｓ）と称する。
２５ｍ＃）　０．ｔ　ＭＮａＰＯ４、ｐＨ６，５溶液に
入れた１３〜のコレラゲノイ）”（ＡＤＨ）に２０ｍ９
のＭｐｅｐ（Ｓ）を添加する。ｐＨを４．５に下げる。
５００■のＥＤＥＣを添加し、ｐＨを４，５に下げる。
２０分間隔で３回５００■の量のＥＤＥＣを添加し、そ
の後２０分さらに攪拌する。ｐＨを６．０に調整し、４
℃にて５時間攪拌する。反応混合物を透析袋に移し、（
１３）Ｍ　ＮａＰＯ４、ｐＨ７，０５に対して透析する
。内容物はＰＭＩＱアミコンフィルタで２０ｍ１に濃縮
した後０２２μＭフィルターで濾過する。
ｓｏＴ！ｇのＲ３２−Ｌ　ｅ　ｕ　ＡＲＣｒを５０ｍ１
のフラスコに入れ、ＰＨを８．０に調整する。２２５■
の無水コハク酸を添加し、ｐＨは８．０を維持する。１
時間後、１８０■の無水コ・・り酸を添加し、ｐＨを調
整し、続いて１時間後さらに新しい１８０■の無水コノ
ヅ酸を添加する。反応液は５時間緩かに攪拌する。
０、１　Ｍ　ＮａＰＯ４、ｐＨ６，５に対して透析する
。透析袋から取り出し、０．４５μＭフィルターを通し
て濾過する。これをＲ３２−Ｌｅｕ　ＡＲＧ　（Ｓ）と
称する。
Ｒ３２−ＬｅｕＡＲＧ　（Ｓ　）を５０　ｍｌのフラス
コに入れ、ｐＨを４．４に下げ、３００ｍ９のＥＤＥＣ
を添加する。
３２■のＡＤＨ結合毒素Ａ（毒素Ａ　（ＡＤＨ））を緩
かに攪拌しながら３０分以上かけて徐々に添加する。
毒素Ａ　（ＡＤＨ）が−度添加されたら溶液はい（分濁
る。３００■のＥＤＥＣを添加し、続いて１時間間隔で
２回さらに３００〜のＥＤＥＣを添加する。最後にＥＤ
ＥＣを添加してから３０分後間Ｈを７．０に上げ、混合
物を透析袋に移し、０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＰＯＨ緩衝液ｐ
Ｈ７，０１に対して透析する。
に置く。２３ｍ１の２Ｍ塩化アンモニウム溶液を添加す
る。溶液のｐＨはＨＣＩにて４．５に下げる。５００■
のＥＤＥＣを添加し、７１）Ｈを４．５に調整する。９
０分後、５００■のＥＤＥＣを添加し、７）Ｈを４．５
に下げる。
６０分後間００ｍ９のＥＤＥＣを添加し、ｐＨは４．６
を維持する。最後のＥＤＦ、Ｃ添加から１時間後、内容
物を透析袋に移し、（１３）　Ｍ　ＮａＰＯ４、ｐＨ６
，５に対して透析する。
３０ｒｎｌのコレラゲノイ）−”（Ｓ）（約２５■）を
３１ｍ１のＲ３２−Ｌｅｕ　ＡＲＣ（Ｎ）と混合する。
２　Ｎ　ＨＣＩ　０．５　ｍｌにてｐＨを５．４５に下
げる。５００■のＥＤＥＣを３０分毎９０分にわたり添
加する。最後のＥＤＥＣ添加後添加量１時間ら内容物を
（１，ＩＭＮａＰ○４　、　ＰＨ７，０５に対して、分
子量５０，０００でカントオフする透析チューブを用い
て透析する。０．２２７１Ｍフィルターを通す。
前記のごとく（実施例４）コレヲゲノイドを無水コハク
酸と結合せしめる。２３　ｍｌの水に９０■のＲ３２−
Ｌｅ　ｕ　ＡＲＧを入れ、１２５ｍ１の無菌フラスコ中
髄膜炎菌外皮膜タンパク質（○ＭＰ）は実施例３に記載
したごとく無水コハク酸で処理する。この生放物を髄膜
炎菌２Ｂ（Ｓ）と称する。
５０■のタン・ξり質を含有する２７ｍ７！の髄膜炎菌
２Ｂ（Ｓ）溶液を前もって３　ｍｌ　ｔｒ）　Ｒ２０に
溶解した２５ｍりのｌ＼！ｐｅｐに混合する。混合物の
ｐＨを下げる。１００■のＥＤＥＣを添加し、４時間攪
拌する。次に２００ｑノＥＤＥｃを添加する。３０分後
、２００ｍｇノＥＤＥＣおよび２５〜のＭｐｅｐを添加
する。３０分後２００■のＥＤＥＣ：を添加する。３時
間後２００■のＥＤＥＣを添加する。混合物は３時間攪
拌した後５リツトルのＰＢＳを３回替える透析を行う。
４５ｍ７の髄膜炎菌ＯＭＰを実施例３に記載した方法（
７）Ｈは注意深＜６．１０に下げる）により無水コハク
酸処理を行う。２００■のＥＤＥＣ：を添加する。
水に溶解した５０■のＶｐｅｐを１５分以上かけて滴加
する。ｐＨを５．５に下げる。１時間牛後１００■のＥ
ＤＥＣを添加する。溶液はいく分乳白となる。
反応開止３時間後、溶液は５リツトルのＰＢＳに対して
透析する。
実施例９ 実施例５記載の方法で調製したｌＯ〜の毒素Ａ（ＡＤＨ
）の２．７　ｍｌ　ｉ　ｉと５０〜のＲ３２Ｌ　ｅ　ｕ
　ＡＲＧを混合する。１ＭＨ（ＪにてｐＨを４．８０に
下げ、１００ｍｇのＥＤＥＣを添加する。２０分一定速
度で攪拌後、１００〜のＥＤＥＣを添加し、７）Ｈを４
．８に下げる。反応開始６（１３）００および１４０４
０分後１００■ＤＥＣを添加する。２５℃にて一定の攪
拌を維持し、反応開始７時間後、５リツトルのＰＢＳを
３回交換する透析を行う。溶液はアミコンＰＭ３Ｑ膜で
３０　ｍｌ容量まで限外濾過し、非共有結合しているＲ
３２ＬθＵＡＲＧを除去し、ＰＢＳに対し再び透析する
。最終的なワクチンは０．２２μフイルターで濾過する
。
実施例５に記載した方法で調製した５０■の毒素Ａ　（
ＡＤＨ）溶液１３８ｍ１のｐＨを４．８３０に下げる。
５０■のＭｐｅｐを３ｍｌのＲ２０に溶解する。１０分
以上かけて５００μｌの投プチビを滴加する。ｐＨを４
．７００に下げた後１００　ｍ９ノＥＤＥＣを添加する
。２０分以上かけて１，５ｍＪのにプチビを滴加する。
１００ｍ７のＥＤＥＣを添加し、続いて残りの５００μ
ｇのはプチドを添加する。総反応時間で５時間後、溶液
は５リツトルのＰＢＳを４回交換する透析を行う。
５０ηのトキシ７　Ａ　（ＡＤＨ）の１３．８ｍｌ溶液
を調製し、上に記載したごと＜　ｐＨを４．８に下げる
。２００ｍｇ　（７）　ＥＤＥＣを添加する。５０■の
Ｖｐｅｐ　（ｎ＝２　）を３ｍｌのＲ２０に溶解する。
２ｍｌのペプチド９溶液ヲ２０分以上かけて滴加する。
１ｏｏ■のＥＤＦ、Ｃを添加し、残りのｍｌを１０分以
上かけて滴加する。反応開始４０および６０分後、１０
０ｍｇノＥＤＥＣを添加する。
反応開始３時間後、５リツトルのＰＢＳ　（４回交換）
に対する透析を行う。
以下に記載する本発明の良好な実施態様の詳細な記述を
添付した表と結び合わせて読むと本発明の特色が完全に
明らかになるであろう：表Ａは調製されたいくつかのワ
クチンの組成を示している。
表 Ａ 接合体 ワクチン ａ）　Ｒ３２ＬｅｕＡＲＧ（Ｓｌ　トキシ７Ａ（ＡＤＨ
）ｂ）Ｒ３２ＬｅｕＡＲＧ（Ｎ）　コＶラゲノイ）ｉｓ
ｌクチン組成物 イプチビ Ｒ３２Ｌｅ　ｕＡＲＧ 無水コハク酸 キャリアー トキシンＡ アジピン酸ジヒビラ：）ビ ｄ）　Ｍｐｅｐ約髄膜炎菌 ｅ）　Ｍｐｅｐ（Ｎ）ＣＲＭ　１９７（Ｓ）ｆ）　Ｍｐ
ｅｐ（Ｎ）コレラゲノイト’（Ｓ）ｇ）　”ｐｏｐ（Ｓ
ｌコレラゲノイト”（ＡＤＨ）ｈ）　Ｒ３２ＬｅｕＡＲ
Ｇ　）キシンＡ（ＡＤＨ）ｉ）Ｍｐｅｐ髄１卓炎閑２Ｂ
（Ｓ） ｊ　）　Ｍｐｅ　ｐＣＲＭ　＋　９７　（Ｓｌｋ）Ｍｐ
ｅｐＤＴ（ＡＤＨ） １）　Ｍｐｅｐ破傷風（ＡＤＨ） ｍ）　Ｍｐｅｐ　コＬｙラゲノイ）”（ＡＤＨ）ｎ）　
Ｖｐｓｐ髄模炎菌２Ｂ（Ｓ＋ ｐｅｐ Ｍｐｅｐ Ｍｐｅｐ Ｍｐｅｐ Ｒ３２ＬｅｕＡＲＧ Ｍｐｅｐ Ｍｐｅｐ Ｍｐｅｐ Ｍｐｅｐ Ｍｐｅｐ 塩化アンモニウム 塩化アンモニウム 無水コハク酸 ＶｉＶａｖ（ｎ＝２ 〕ｈ２ば１品行） ＲＭ１９７ コレラゲノイト９ コレラゲノイド トキシンＡ メニンイコツカルＯＭＰ ＣＲＭ　１　ｇ　７ ジフテリアトキソイド 破傷風トキソイド９ コレラゲノイト９ メニンゴコッカル２Ｂ ｔノビ−：イシー；） 無水コハク酸 無水コハク酸 アジピン酸ジヒビラジビ アジピン酸ジヒビラジビ 無水コハク酸 無水コハク酸 アジピン酸ジヒト９ラジド アジピン酸ジヒｌ−”ラジト々 アジピン酸ジヒビラジビ 無水コハク酸 トキシンＡ コレラゲノイド 無水コハク酸 コレラゲノイド ＣＲＭ　１９７ アジピン酸ジヒトリジト９ アジピン酸ジヒビラジビ アジピン酸ジヒビラジビ 無水コハク酸 （ｎ　＝　２　） 表１は本発明の一実施例におけるキャリアータンパク質
あたりのマラリアにプチドのモル比として接合体ワクチ
ンの化学組成を示すものである。
表　　　１ 選択された接合体マラリアワクチンの組成接合体　　　
　　　　　　　、ヤ比１ （梗プチビ／ キャリアータンパク匍 ）　キ’／７Ａ（ＡＤＨ）−Ｒ３２−ＬｅｕＡＲＧ（Ｓ
）　　　　１３：１コｖラゲノイトｉｓ）−Ｍｐｅｐ（
Ｎ）　　　　　　　　　１２．５　：　１コレラゲノイ
ト”（ＡＤＨ）−Ｍｐｅｐ（Ｓ）　　　　　　　　５　
：　ＩＣＲＭｉ９７（Ｓ）−Ｍｐｅｐ（Ｎ）　　　　　
　　　　　　１８　：　１１アス・ξラギン酸含量に基
づくアミノ酸分析によって測定 表２は本発明の第２の実施例としてヒトワクチンとして
使用した場合の安定性に関する接合体ワクチンの生物学
的性質を示すものである。
表２ マラリアにプチビ接合体ワクチンの生物学的性質Ｒ３２
−ＬｅｕＡＲＧ　（重合） 髄膜炎菌２Ｂ（Ｓ）−Ｍｐｅｐ（Ｎ） ＣＲＭ１ｇ７　（Ｓ）−Ｍｐｅｐ（Ｎ）コレラゲノイト
”（Ｓ）　−Ｍｐｅ　ｐ　（Ｎ）非毒性　無菌 ０．３　　　非毒性　無菌 ０．３　　　非毒性　無菌 ０　　非毒性　無菌 １接合体（予めＡｌ（ＯＨ）３で吸収）を食塩水に溶解
し、最終濃度１０μｊｉ／ｍｌにした。ただし、Ｒ３２
−Ｌｅｕ　ＡＲＧ−コレラゲノイド抱合体は２μｇ／ｍ
ｌにした。各家兎に体重１　ｋｇあたり１　ｍｌの試料
を静脈内に投与した。
２１０μ／／ｋｇ（体重）の投与後４時間で記録された
体温の最高上昇。コレラゲノイト’　（ＡＤＨ）　−Ｍ
ｐｅｐ（Ｓ）は２μＡ９　（体重）で体温を上昇させな
かった。
表Ａの接合体１）−ｐ）及びｅ）は全て５０μ７ｋｇで
適（即ち＜０．２）であった。
３マウス（１８〜２０ｙ）及びモルモット（２５０〜３
００ｇ）にそれぞれ１００μｓの試料を腹腔内に投与し
た。死亡したものはなく、そして全ての動物は体重が増
加した。ヨーロッパ薬局方（ＥｕｒｏｐｅａｎＰｈａｒ
ｍａｃｏｐｏｅｉａ）のＶ、２．１．５に従って判定し
た。
４ヨ一ロツパ薬局方Ｖ、２．１．１に従って判定した。
第３表は接合体、ワクチンマラリアイプチド部分に対す
る兎における免疫反応の強さを示す。
第　　３　表 接合ワクチンによる免疫後のウサギにおけるＲ３２−Ｌ
ｅｕＡＳＧ　（重合されている）４８トキシ７Ａ（ＡＤ
Ｈ）Ｒ３２−ＬｅｕＡＲＧ（Ｓ）　　８１０７コレラゲ
ノイｈ”（ｓ）−Ｒ３２−ＬｅｕＡＲＧ（Ｎ）　　　５
２９ジフテリアトキソイド”（ＡＤＨ）−Ｍｐｅｐ　３
１２６髄膜炎菌Ｂ（Ｓ）−Ｍｐｅｐ（Ｎ）　　　　　　
３００５０ＲＭ、９７（Ｓ）−Ｍｐｅｐ（Ｎ）　　　　
　　　　　１６７４コレラゲノイＫ（Ｓ）−Ｍｐｅｐ（
Ｎ）　　　　　　　９８８コレラゲノイ）−”（ＡＤＨ
）−Ｍｐｅｐ（Ｓ）　　　１４５２（５７１２−１５，
０１７） （５３，４−８５１） １、ウサギ（１群３匹）を４％（ｗｔ／υＯ乙）　ｋｌ
　（ＯＨ）　３中のワクチン１００μｌで０日及び２８
日に免疫し、４２日日目血清を採取した。使用したカッ
プリング剤は全事例においてＥＤＥＣであった。
２、ＥＬＩＳＡ抗体力価は単位（光学濃度×血清稀釈／
ｍｌ　）として表わした。抗体反応は、スポロゾイト表
面皮膜蛋白質（Ｃ３Ｐ）と交叉反応する（プチド抗原を
用いて検出した。
第４表は接合体ワクチンのキャリヤー蛋白部分に対する
ウサギでの免疫反応の強さを示す。
第４表 マラリアにプチビ接合体によるワクチン注射の後でのウ
サギにおけるキャリヤー蛋白質に対する免疫グロブリン
Ｇ抗体反応 正常ウサギ血清 トキシンＡ（ＡＤＨ）−Ｒ３２−ＬｅｕＡＧＲ（Ｓ）コ
レラゲナイド（Ｓ）−Ｒ３２−ＬｅｕＡＧＲ（Ｎ）ジフ
テリアトキソイビ（ＡＤＨ）−Ｍｐｅｐ髄膜炎菌Ｂ（Ｓ
）−Ｍｐｅｐ（Ｎ） ＣＲＭｌ　ｇ　７　（Ｓ）　−Ｍ　ｐ　ｅ　ｐ　（Ｎ）
コレラゲナイド（Ｓ）−Ｍｐｅｐ（社）８．３（１，２
−４４） １２６．６（７９−２０８） １０　　（２，５−２４，５） １５７．３　（４５−３２２） ２０５．３　（９７−３４０） ２５．６　　（２，５−３０） １、ウサギ（１群３匹を４％（ｗｔ　／ｖｏｌ）　Ａ／
Ｎ○Ｈ）３中のワクチン１００μｙ″′ｃｏ日及び２８
日に免疫した。
血清は４２日目に採取した。使用カップリング剤は全事
例でＥＤＥＣであった。
２、ＥＬＩＳＡ抗体力価は単位（光学濃度Ｘ血清稀釈／
　ｍｌ）として表わした。抗体反応は対応蛋白キャリヤ
ーについて示す。
第５表は第３及び４表のワクチン及び方法に関する第２
番目の組のデータである 第　　５　表 マラリア投プチト９接合体によるワクチン注射の後にに
プチド部分及び蛋白キャリーヤーに対するウサギにおけ
るＲ３２ＬｅｕＡＲＧ　（重合されている）トキシンＡ
　（ＡＤＨ）　−Ｒ３２ＬＥ逝ｍ（ｓ）コレラゲノイ）
’（Ｓ）−Ｒ３２ＬｅｕＡＲＧ（Ｎ）ＤＴ（ＡＤＨ）−
Ｍｐｅｐ 髄膜炎菌２Ｂ（Ｓ）−Ｍｐｅｐ（Ｎ） ＣＲＭｔ　９７　（Ｓ）−Ｍｐｅｐ　（Ｎ）コレラゲノ
イトペＳνｐｅｐ（Ｎ） ８０　１．２５　　　　０ ６８１９　１３．７　　　４．００ ６７４　１０．５　　　４００ ３０１９　１４．８　　　４００ ２９５０　３６．９　　　４００ ２０００　４４．６　　　１００ １１９２　１１．９　　　１００ ５．６ ４１．４ ２１．３ ９１．５ 力価は幾何平均を示す。
木本ホールドライズは幾何平均ボールドライズを表わす
。
＊＊＊螢光検定：ファルシパラム（Ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ）マラリアからのスポロゾイトをスライド９に固定す
る。ウサギ抗体の稀釈物をスポロゾイトと共ニインキユ
ヘートする。スライドを洗浄シ、螢光化した山羊抗ウサ
ギ抗体をスポロゾイトと共にインキエベートする。スラ
イ）”　全洗浄した後、螢光反応を与える血清の最大稀
釈について、前記スライドを螢光顕微鐘で読み取る。
第６表は２種の異なるキャリヤー蛋白に対して結合させ
たＭｐｅ　ｐを同時に投与した。結果を示す。
第６表 ２価ワクチンによるウサギの免疫後の 抗−Ｍｐｅｐ　ＥＬＩＳＡ力価 Ｍｐｅｐ−ＡＤＨ−ＣＨＯＬ　　　　　　１１０６６ｌ
１０６６（６３００−１９０００）大ＤＨ−破傷風一ト
キソイド１、ウサギ（３匹）を０日及び１４日に１００
／μ９のワクチンで筋肉内注射で免疫した。血清を２８
日目に採取した。混合ワクチン群に関しては、各成分か
らの５０μｙのワクチンを２つの異なる部位に投与した
。
第７表はキャリヤー蛋白に結合した合成投プチドに対す
るヒトでの抗体反応を示す。
第　　７　　表 ヒトへの使用に適してアジュバントＡｌ（ＯＨ）３によ
り接合されたマラリアにプチト９をワクチン注射した後
のヒトにおける抗体反応 ワクチン　　　　月う汗イア光学濃度（ＥＬＩＳＡ）反
応を起す ボラ／ティア数 ２．５　　３　　２５ ６．５　　７　　　６．５ ８　　　８．５　　８ ワクチン１：髄膜炎菌の外皮膜蛋白をキャリヤーとして
使用（Ｍｐｅｐ−ＭＥＮＩＮＧ　−Ｂ　）ワクチン２：
コレラゲノイドをＡＤＨを経由したＮＡＮＰに結合され
たキャリヤーとして使用した。（Ｍｐｅｐ−ＡＤＨ−Ｃ
ＨＯＬ）ワクチン３　：　ＣＲＭ１９７　（遺伝的に誘
導されたジフテリアトキソイド″）をキャリヤーとし て使用した。（Ｍｐｅｐ−ＣＲＭ１９７）ワクチン４：
コレラゲノイト９をキャリヤー蛋白として使用し、かつ
ＡＤＨおよび無水コ ハク酸の両者を使用することにより Ｍｐｅｐに結合させた。
（Ｍｐｅｐ−ＡＤＨ−３ｕｃ−ＣＨＯＬ）上述の接合体
はヒトに使用するのに適当なようにつ（られた。したが
って、マラリア抗原、キャリアー蛋白質、スペーサー分
子および反応条件は受容し得る最終生成物の生成を最適
にするように選択された。しかし、上記試薬自体は毒性
も発熱性もないが、−旦共有結合してしまうと１つ以上
の組合せが、分子量の増大あるいは新しい抗原決定基ま
たは反応性基の生成に帰因して毒性および／または発熱
性があることが証明された。したがつて、各接合体ワク
チンの毒性および発熱性が試験された。すべての接合体
が非発熱性で、〉２μｇ／ｋｇの投与量で０５℃未満し
か体温を上昇せしめない。この投与量レベルは髄膜炎菌
（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）ＡおよびＣのようなヒ
トに使用するための他のワクチンについての適用量（０
０５μＩＡｙ）を越えている。接合体ワクチンは、マウ
スあるいはモルモットのいずれかに１００μｇ腹腔内投
与する場合接合体ワクチンは無毒性であった。これらの
試験は国際的調整ガイドライン（ヨーロッパ薬局方）に
よって行なわれた。ここで得られた知見により、これら
の接合体ワクチンはヒトに非経口投与する場合耐性が犬
であることが示唆された。
次いで、上記マラリア接合体ワクチンによる免疫後ウサ
ギで誘発された免疫反応を評価した。まず、ワクチンの
マラリア抗原成分に対する抗体反応を研究した。もとの
（すなわち非接合体）Ｒ３２−ＬｅｕＡＲＧは非免疫原
性（４８平均ＥＬＩＳＡユニット／ｍｅ　（血清））で
あることがわかった。しかし、Ｒ３２−Ｌｅｕ　ＡＲＧ
およびトキシンＡまたはコラゲノイビからなる接合体は
高度に免疫原性（各々８１０７および３１２６平均ＥＬ
工ＳＡ　：ｓ−＝　７ト／ｍｌ（血清））であった。同
様に、未接合体の形のはプトド、すなわち ＡＳＮ　：　ＰＲＯ：　ＡＳＮ　：　ＡＬＡ　：　ＡＳ
Ｎ　：　ＰＲＯ：　ＡＳＮ　：　ＡＬＡ　：　ＡＳＮ　
：ＰＲＯ：　ＡＳＮ　：　ＡＬＡ でウサギを免疫しても抗体反応を生起せしめない。
上記にプチト９をジフテリアトキソイド９、トキシ／Ａ
、髄膜炎菌群Ｂ外皮膜蛋白質、ＣＲＭ　ｔ　９７または
コレラゲノイト９のいずれかに共有結合させて製造され
た接合体はキャリアー蛋白質に対する抗体を生ぜしめ今
ことができる。しかし、コレラゲノイト９が無水コハク
酸を介してＲ３２−ＬｅｕＡＲＧまたは上記ベプチビに
結合されると、非常に弱い抗キャリアー反応が生じた。
このことは、これら２つの接合体を形成するのに使用さ
れた方法は、コレラゲノイドによって発現される免疫優
性抗原決定基の大部分を消滅させたことを示している。
これにもかかわらず、これら２つの接合体は良好な抗マ
ラリアペプチド９反応を誘発できた。
上記接合体がマラリアに対する活性なワクチンとして使
用するのに有効であることを示すために、駆足された試
みを行ってヒトボランティア−におけるいくつかの接合
体の安全性と免疫原性を評価した。ボランティア−達は
下記接合体で免疫された： ＣＲＭ１ｇ７−　Ｍｐｅ　ｐ コレラゲノイド−Ｍｐθｐ コレラゲノイド−Ｍｐｅｐ（ＡＤＨ） 髄膜炎菌Ｂ　−Ｍｐｅｐ これらのワクチンをアジュバントとして作用するＡｌ（
○Ｈ）３に吸着し、各ボランティア−に１００μｇのキ
ャリアー蛋白質を０．５　ｍｌとして筋肉内投与した。
ワクチン接種後の反応は穏かで一時的で、主として局所
の痛みがある。全身的な毒性がないことを示すために、
免疫時及び１週間後の免疫時に次のような分析を行なっ
た：ヘモグロビン、ヘマトクリツト、赤血球計数、白血
球数、血球別計数、血清グルタメート−オキザルアセテ
ート−トランスアミナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ
、クレアチニン、およびビリルビン。ワクチン接種によ
ってこれらのパラメーターのいずれも変化せず、毒性が
ないことが示された。
本発明の好適具体例をここに記載したが、スポロゾイト
表面皮膜蛋白質の抗原決定基を形成するはプチドの代り
に、ａ）淋菌（Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）または緑
膿菌（Ｐ、ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のような微生物から
の細菌の毛（付加小器官（ｕｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｏｒ
ｇａ−ｎｅｌｌｅｓ）、ｂ）Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ）Ｈ
ＴＬ■■／しＷウィルス（たとえば、ｇｐ　１２０）、
ｄ）インターナル・イメージ・抗イデイオタイプ抗体、
の抗原決定基を形成するペプチドを使用して接合体を形
成できることは当業者に明らかであろう。特に、使用さ
れたスペーサー分子、２プチト９部分のアミノ酸繰返し
単位の数についての変化および修飾、ならびにキャリア
ー蛋白質に共有結合する前に反応性基をブロックするた
めの該投プチドの修飾が本発明の精神から離れることな
く可能である。
【図面の簡単な説明】
第１図はマラリアペプチドに対するモノクローナル抗体
で展開したマラリア接合体ワクチン及びキャリアー蛋白
質のウェスタン・プロットである。 各ゲルにつ（・ての説明は次のとおりである＝１）　Ｒ
３２ＬｅｕＡＲＣ ２）　Ｒ３２ＬｅｕＡＲＧ（Ｎ） ３）　Ｒ３２ＬｅｕＡＲＧ（Ｓ） ４）　Ｒ３２ＬｅｕＡＲＧ（Ｓ）−トキシＡ（ＡＤＨ）
５）　Ｒ３２ＬｅｕＡＲＧ（Ｎ）　−コＬ／ラゲノイト
９（Ｓ）６）　Ｍｐｅｐ（Ｎ）−コレラゲノイド（Ｓ）
７）　Ｍｐｅｐ（Ｓ）　−−Ｉ　Ｌ／ラゲノイ）−”（
ＡＤＨ）８）　Ｍｐｅｐ（Ｎ）−Ｎｔｌｌ炎菌Ｂ（Ｓ）
ｇ）Ｍｐｅｐ（Ｎ）−ＣＲＭ１９７（Ｓ）１０）分子標
準物 １１）トキシンＡ　（ＡＤＨ） １２）コレラゲノイド（Ｓ） １３）コレラゲノイト真ＡＤＨ） １４）髄膜炎菌Ｂ　（Ｓ） １５）　ＣＲＭ１９７（Ｓ） 第２図はキャリアー蛋白質に対するモノクローナル抗体
の混合物対ワクチンのウェスタン・プロットである。 各ゲルは次のように説明される： １）　　Ｒ３２ＬｅｕＡＲＧ ２）　　Ｒ３２ＬｅｕＡＲＧ（Ｎ） ３）　　Ｒ３２ＬｅｕＡＲＧ（Ｓ） ４）　　Ｒ３２ＬｅｕＡＲＧ（Ｓ）−）キシ７Ａ（ＡＤ
Ｈ）５）　　Ｒ３２ＬｅｕＡＲＧ（Ｎ）　−：Ｉ　ｖラ
ゲノイビ（Ｓ）６）　　Ｍｐｅｐ（Ｎ）−コレラゲノイ
）’（Ｓ１７）　　Ｍｐｅｐ（Ｓ）−コｖラゲノイド（
ＡＤＨ）８）　　Ｍｐｅｐ（Ｎ）−髄膜炎菌Ｂ　（Ｓ）
９）　　Ｍｐｅｐ（Ｎ）　−ＧＲＭｔ９ｔ　（Ｓ）１０
）　　分子標準物 １１）トキシンＡ　（ＡＤＨ） １２）　　コレラゲノイト９（Ｓ） １３）　　コレラゲノイトハＡＤＨ） １４）髄膜炎菌Ｂ　（Ｓ） １５）　　ＣＲＭ１９７　（Ｓ） 第３図はビバッラス（Ｖｉｖａｘ）およびファルシパル
ム（Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）　＜プチビに対するモノク
ローナル抗体で展開されたファルシ・ξルムおよびビバ
ッラス接合体ワクチンのウェスタン・プロットテある。 各ゲルの説明は次のとおりである。 １）髄膜炎菌２Ｂ（Ｓ） ２）　　ｃＲＭ１９７（Ｓ） ３）コレラゲノイド（ＡＤＨ） ４）　　Ｖｐｅｐ（Ｖ＝２１髄膜炎菌２Ｂ（Ｓ）５）　
　Ｖｐｅｐ（Ｖ＝２）　ＣＲＭ１９７（Ｓ）６）Ｖｐｅ
ｐ（Ｖ＝２）：’Ｌ’ラゲノイト”（ＡＤＨ）７）Ｖｐ
ｅｐ（Ｖ＝２）　コｖラゲノイド（ＡＤＨ）８）　　Ｍ
ｐｅｐコレラゲノイド（Ｓ）９）　Ｍｐｅｐ髄膜炎菌２
Ｂ（Ｓ） １０）　　Ｍｐｅｐ　ＣＲＭ１ｇ７　（Ｓ）第４図はキ
ャリヤー蛋白質に対する抗体で展開されたビバッラス（
Ｖｉｖａｘ）およびファルシパルム（Ｆａｌｃｉｐａｒ
ｕｍ）接合体ワクチンのウェスタン・プロットである。 各ゲルは次のように説明される： １）髄膜炎菌２Ｂ（Ｓ） ２）　ＣＲＭ１９７（Ｓ） コレラゲノイド（ＡＤＨ） Ｖｐｅｐ（Ｖ＝２）髄膜炎菌２８（Ｓ）Ｖｐｅｐ　（Ｖ
＝　２　）　ＣＲＭ１９７　（Ｓ）Ｖｐｅｐ　（Ｖ＝２
）　コレラ’ｆ／イ）’（ＡＤＨ）Ｖｐｅｐ　（Ｖ＝２
）：ｙｖラゲノイ）”（ＡＤＨ）Ｍｐｅｐコレラゲノイ
ト９（Ｓ） Ｍｐｅｐ髄膜炎菌２Ｂ（Ｓ） Ｍｐ　ｅ　ｐ　ＣＲＭ　１　ｇ　７　（Ｓ）ア 阜３ 図 第４図

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）免疫原性接合体を製造する方法であつて、（ｉ）
    キャリアー蛋白質を（ｉｉ）サーカムスポロゾイド蛋白
    質の抗原決定基を形成するペプチドに、（ｉｉｉ）少く
    とも１つのスペーサー分子を介して共有結合させること
    からなる方法。
  2. （２）上記結合段階が、上記少くとも１つのスペーサー
    分子を上記キャリアー蛋白質と上記ペプチドのうちの一
    方に共有結合させて複合体Ａを形成し；次いで上記複合
    体Ａを上記キャリアー蛋白質と上記ペプチドのうちの他
    方と共有結合させることからなる特許請求の範囲第１項
    の方法。
  3. （３）上記結合段階が、第一スペーサー分子を上記キャ
    リアー蛋白質に共役結合させて複合体Ａを形成し、第二
    スペーサー分子を上記ペプチドに共役結合させて複合体
    Ｂを形成し、次いで複合体Ａを複合体Ｂに共役結合して
    上記接合体を形成することからなる特許請求の範囲第１
    項の方法。
  4. （４）上記ペプチドが下記アミノ酸配列： （ＡＳＮ：ＡＬＡ：ＡＳＮ：ＰＢＯ）＾ｎ（ここでｎは
    １〜５０）からなる特許請求の範囲第１項の方法。
  5. （５）ペプチドが下記アミノ酸配列： （ＧＬＹ：ＡＳＰ：ＡＲＧ：ＡＬＡ：ＡＳＰ：ＧＬＹ：
    ＧＬＵ：ＰＲＯ：ＡＬＡ）＾ｎ（ここでｎは１〜５０で
    ある） からなる特許請求の範囲第１項の方法。
  6. （６）ペプチドが下記アミノ酸配列： ＭＥＴ：ＡＳＰ：ＰＢＯ〔（ＡＳＮ：ＡＬＡ：ＡＳＮ：
    ＰＢＯ）＿１＿５ＡＳＮ：ＶＡＬ：ＡＳＰ：ＰＲＯ）＿
    ２ からなる特許請求の範囲第１項の方法。
  7. （７）ペプチドが下記アミノ酸配列： ＭＥＴ：ＡＳＰ：ＰＲＯ〔（ＡＳＮ：ＡＬＡ：ＡＳＮ：
    ＰＲＯ）＿１＿５ＡＳＮ：ＶＡＬ：ＡＳＰ：ＰＲＯ〕＿
    ２ＬＥＵ：ＡＲＧ からなる特許請求の範囲第１項の方法。
  8. （８）結合段階において、スポロゾイト表面皮膜蛋白質
    の抗原決定基を形成するもう１つの蛋白質がキャリアー
    蛋白質に直接結合される特許請求の範囲第１項の方法。
  9. （９）結合段階の前に、ペプチドを、アミノ基またはカ
    ルボキシル基を選択的にブロックする薬剤で前処理する
    特許請求の範囲第１項の方法。
  10. （１０）ペプチドを塩化アンモニウムで前処理する特許
    請求の範囲第９項の方法。
  11. （１１）ペプチドを無水コハク酸で前処理する特許請求
    の範囲第９項の方法。
  12. （１２）キャリアー蛋白質が、ジフテリアトキソイド、
    ＣＲＭ１９７、トキシンＡ、コレラゲノイド、大腸菌（
    Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）易熱性毒素のＢサ
    ブユニットおよび髄膜炎菌群Ｂ外皮膜蛋白質からなる群
    より選択される特許請求の範囲第１項の方法。
  13. （１３）キャリアー蛋白質がグラム陰性外皮膜蛋白質で
    ある特許請求の範囲第１項の方法。
  14. （１４）キャリアー蛋白質が髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒ
    ｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）外皮膜蛋白質である特
    許請求の範囲第１項の方法。
  15. （１５）上記少くとも１つのスペーサー分子が下記組成
    ： ＮＨ＿２−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ＿２）＿ｎ−ＣＯ−ＮＨ
    −ＮＨ＿２（式中ｎは１〜２０である） のジカルボン酸ジヒドラジドである特許請求の範囲第１
    項の方法。
  16. （１６）上記少くとも１つのスペーサー分子が無水コハ
    ク酸、アジピン酸ジヒドラジド、無水修酸、無水フター
    ル酸、無水マレイン酸またはそれらの混合物である特許
    請求の範囲第１項の方法。
  17. （１７）結合段階が結合剤として水溶性カルボジイミド
    を使用して行なわれる特許請求の範囲第１項の方法。
  18. （１８）水溶性カルボジイミドが１−エチル−３−（ジ
    メチルアミノプロピル）カルボジイミドである特許請求
    の範囲第１７項の方法。
  19. （１９）哺乳類にマラリア感染症に対する防御反応を誘
    導せしめることができる免疫原性接合体であって、（ｉ
    ｉ）スポロゾイト表面皮膜蛋白質の少くとも１つの抗原
    決定基からなるペプチドに（ｉｉｉ）少くとも１つのス
    ペーサー分子を介して共有結合した（ｉ）キャリアー蛋
    白質からなる接合体。
  20. （２０）ペプトドが下記アミノ酸配列： （ＡＳＮ：ＡＬＡ：ＡＳＮ：ＰＲＯ）＾ｎ（ここでｎは
    １〜５０である） からなる特許請求の範囲第１９項の接合体。
  21. （２１）ペプチドが下記アミノ酸配列： （ＧＬＹ：ＡＳＰ：ＡＲＧ：ＡＬＡ：ＡＳＰ：ＧＬＹ：
    ＧＬＵ：ＰＲＯ：ＡＬＡ）＾ｎ（ここでｎは１〜５０） からなる特許請求の範囲第１９項の接合体。
  22. （２２）ペプチドが下記アミノ酸配列： ＭＥＴ：ＡＳＰ：ＡＬＡ〔（ＡＳＮ：ＡＬＡ：ＡＳＮ：
    ＰＲＯ）＿１＿５ＡＳＮ：ＶＡＬ：ＡＳＰ：ＰＲＯ〕＿
    ２ からなる特許請求の範囲第１９項の接合体。
  23. （２３）ペプチドが下記アミノ酸配列： ＭＥＴ：ＡＳＰ：ＰＲＯ〔（ＡＳＮ：ＡＬＡ：ＡＳＮ：
    ＰＲＯ）＿１＿５ＡＳＮ：ＶＡＬ：ＡＳＰ：ＰＲＯ〕＿
    ２ＬＥＵ：ＡＲＧ からなる特許請求の範囲第１９項の接合体。
  24. （２４）キャリアー蛋白質が、ジフテリアトキソイド、
    ＣＲＭ１９７、トキシンＡ、コレラゲノイド、大腸菌易
    熱性毒素のＢサブユニットおよび髄膜炎菌群Ｂ外皮膜蛋
    白質からなる群より選択される特許請求の範囲第１９項
    の接合体。
  25. （２５）キャリアー蛋白質がグラム陰性外皮膜蛋白質で
    ある特許請求の範囲第１９項の接合体。
  26. （２６）キャリアー蛋白質が髄膜炎菌外皮膜蛋白質であ
    る特許請求の範囲第１９項の接合体。
  27. （２７）上記少くとも１つのスペーサー分子が下記組成
    のジカルボン酸ジヒドラジド： ＮＨ＿２−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ＿２）＿ｎ−ＣＯ−ＮＨ
    −ＮＨ＿２（ここでｎは１〜２０である） である特許請求の範囲第１９項の接合体。
  28. （２８）上記少くとも１つのスペーサー分子が、無水コ
    ハク酸、無水修酸、無水フタール酸、無マレイン酸、ア
    ジピン酸ジヒドラシドまたはこれらの混合物である特許
    請求の範囲第１９項の接合体。
  29. （２９）スポロゾイト表面皮膜蛋白質の抗原決定基を形
    成するもう１つのペプチドが上記キャリアー蛋白質に直
    接結合されている特許請求の範囲第１９項の接合体。
  30. （３０）さらにアジュバントを含む特許請求の範囲第１
    ９項の接合体。
  31. （３１）アジュバントが水酸化アルミニウムおよびリン
    酸アルミニウムからなる群より選択される特許請求の範
    囲第３０項の接合体。
  32. （３２）特許請求の範囲第１９項の接合体を温血動物に
    投与することからなる温血動物においてマラリアに対す
    る免疫を生ぜしめる方法。
  33. （３３）グラム陰性菌の外皮膜蛋白質を無水物で処理す
    ることからなる、接合体ワクチンにおいて使用するため
    の水溶性無毒性キャリアー蛋白質を形成する方法。
  34. （３４）無水物が、無水コハク酸、無水マレイン酸、無
    水修酸および無水フタール酸からなる群より選択される
    特許請求の範囲第３３項の方法。
  35. （３５）グラム陰性菌外皮膜蛋白質がナイセリア（Ｎｅ
    ｉｓｓｅｒｉａ）属からの蛋白質である特許請求の範囲
    第３３項の方法。
  36. （３６）特許請求の範囲第１９項の接合体少くとも２つ
    を温血動物に投与することからなり、該接合体のキャリ
    アー蛋白質は各々異なっている、温血動物においてマラ
    リアに対する免疫を生ぜしめる方法。
JP63022669A 1987-02-02 1988-02-02 免疫原性接合体およびその製法ならびに免疫を生ぜしめる方法 Pending JPH0222300A (ja)

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0625300A (ja) * 1990-07-19 1994-02-01 Merck & Co Inc 免疫原性タンパク質、ｈｉｖ関連ペプチド及びアニオン性部分からなる共複合体ワクチン
JP2009543846A (ja) * 2006-07-18 2009-12-10 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム マラリア用ワクチン

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JPS5559A (en) * 1978-06-14 1980-01-05 Nippi:Kk Preparation of immobilized bio-active substance
JPS61181387A (ja) * 1985-02-07 1986-08-14 スミスクライン・ベツクマン・コーポレイシヨン マラリアワクチン用ポリペプチドのイー・コリにおけるクローニングおよび発現

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