JPH02223599A - 合成抗原およびその製造方法 - Google Patents

合成抗原およびその製造方法

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JPH02223599A
JPH02223599A JP1315525A JP31552589A JPH02223599A JP H02223599 A JPH02223599 A JP H02223599A JP 1315525 A JP1315525 A JP 1315525A JP 31552589 A JP31552589 A JP 31552589A JP H02223599 A JPH02223599 A JP H02223599A
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peptide
conjugate
meningococcus
conjugant
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JP1315525A
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Hermann Pelzer
ヘルマン・ペルツアー
Werner Stueber
ヴエルナー・シユテユーバー
Klaus-Dieter Dr Hungerer
クラウス‐デイーター・フンゲラー
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Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
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Behringwerke AG
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ペプチドと抗原性付与分子としてのナイセリ
アメニンギチジス（ＮｅｉｓｓｅｒｉａＢｌｉｌｇｉｔ
ｉｄｉｓ、髄膜炎菌）からの膜タンパク質とから構成さ
れる合成抗原、その製造方法、抗体を得るためのその使
用、その抗原または抗体の医薬としての使用およびその
抗体の診断の目的での使用に関する。
ＥＰ−Ａ−０、１６１、１８８号には、抗原性を改善す
る目的での、ナイセリアメニンギチジスからの膜タンパ
ク質の多糖への結合の可能性が記載されている。
従来技術においては、抗原性（ハプテン性）のないペプ
チドに対する抗体を発生させる場合には、ペプチドを高
分子量の、通常は可溶性の分子に結合させていわゆる接
合体を生成させ、次にこれで動物たとえば家兎またはマ
ウスを免疫する。何日かまたは何遍かの期間が経過し、
場合によってはブースター工程を経たのち、動物から血
液サンプルを採取して抗体を得る。
高分子量分子としてはタンパク質が最もよく使用され、
とくにキーホールリンペットのヘモシアニンおよびアル
ブミンの例を挙げることができる。
キーホールリンペットヘモシアニンの接合体は、著しく
可溶性であり、キーホールリンペットヘモシアニンに対
する抗体が誘導されるという欠点がある。これらの欠点
は、驚くべきことに、非抗原性ペプチド好ましくは１０
０個までのアミノ酸を有するオリゴペプチドまたはポリ
ペプチドに対する抗原付与タンパク質としてナイセリア
メニンギチジスからの膜タンパク質を用いる本発明によ
って解消することが明らかにされた。
したがって、本発明は、ナイセリアメニンギチジスから
の膜タンパク質とペプチドから構成される接合体に関す
る。
髄膜炎菌タンパク質Ｂ２の使用が好ましい。
ペプチド−タンパク質接合体はそれ自体公知の方法によ
り、たとえばグルタルアルデヒドを介してカップリング
させることにより、またはタンパク質にマレイミド基を
導入しついでペプチドをその遊離スルフヒドリル官能基
を介して結合させることにより製造される。
本発明のペプチド−タンパク質接合体は、グルグルアル
デヒドを用いた場合、たとえば髄膜炎菌Ｂタンパク質を
緩衝液に好ましくはタンパク質１ｍｇをＰＢＳ（リン酸
緩衝食塩溶液）に溶解し、ペプチド好ましくはタンパク
質ｌｒｎｇあたり１〜２ｇのペプチドを添加し、タンパ
ク質１ｍｇあたり２５％濃度のグルタルアルデヒド水溶
液５〜２Ｏ−３＝ 一 μａ好ましくは１０μｇを加えて製造される。この溶液
を室温で３０分〜５時間好ましくは１時間撹拌し、タン
パク質１ｍｇあたリリシン４ｍｇを加えて反応性アルデ
ヒド基を遮断する。さらに１０分間が経過したのち、混
合物を蒸留水に対して透析し、接合体を好ましくは凍結
乾燥によって得る。
チオール基を有するペプチドをタンパク質に結合させる
ためには、チオール基をジスルフィド橋またはチオエー
テル結合を介して髄膜炎菌Ｂタンパク質に結合させるこ
とができる。接合体はチオエーテル結合を介して製造す
るのが好ましい。
接合のとくに好ましい態様においては、タンパク質をま
ずチオール基がタンパ、り質に直接結合できるような誘
導体に導く。この目的では、タンパク質をｐＨ７〜９の
緩衝液中好ましくは炭酸水素ナトリウムまたはリン酸緩
衝液中に溶解し、Ｎ−マレイミド基を含有する物質、好
ましくはＮ−マレイミド酪酸ヒドロキシコハク酸イミド
エステルと反応させる。この方法で「活性化された」タ
ンパク質をたとえば５ｅｐｈａｄｅｘ［Ｆ］Ｇ５０上ゲ
ル浸透によって分離したのち、タンパク質１＋＋＋９あ
たりチオール基含有ペプチド１〜３ｍｇを加え、この混
合物を放置して０．５〜１０時間好ましくは１時間反応
させる。ついでタンパク質−ペプチド接合体を常法によ
り、好ましくは透析および凍結乾燥によって得る。
このようにして製造された接合体で適当な動物を免疫す
ると、合成ペプチドに対する抗体が生成される。この関
連での免疫処置および抗体の取得に好ましい動物種は家
兎である。合成抗原はマウスの免疫にも同様に使用でき
、またハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体
の製造に使用することもできる。
接合体による免疫処置で得られる抗血清は、−６＝ 免疫処置に使用したペプチド配列が由来するタンパク質
と特異的に反応する。
接合体の良好な溶解性に加えて、驚くべきことに、その
ペプチドに対して作られた抗血清は、二重免疫拡散法に
おいて髄膜炎菌タンパク質とは優先的な反応を全く示さ
ないことが明らかにされた。これは、他の抗原性付与タ
ンパク質を用いた場合これらに対する抗体が常に誘導さ
れることから、全く驚くべきことである。
本発明によって得られた抗体は、様々なデザインの多く
のイムノアッセイに使用することができる。
次に本発明を実施例によって説明する。実施例中には以
下の略号を用いる。
ＧＭＢＳ　：γ−マレイミド酪酸Ｎ−ヒドロキシコハク
酸イミドエステル Ｃｙｓ：Ｌ−システィン Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン ５ｅｒ：Ｌ−セリン ｐｒｏ：Ｌ−プロリン Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸 Ｌｙｓ：Ｌ−リシン Ｇｌｙニゲリシン Ｖａｌ：Ｌ−バリン Ａｌａ：Ｌ−アラニン Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸 Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン ＫＬＨ：キーホールリンペットヘモシアニンＡＴＩＩＩ
　＋抗トロンビン■ 実施例　１ ａ）髄膜炎菌Ｂタンパク質のマレイミド基による誘導体
化 髄膜炎菌Ｂタンパク質４０ｍ９を０．０５ｍＭリン酸す
一 トリウム緩衝液ｐＨ８、０に溶解し、（ＪＢＳ５＋＋＋
ｇで１時間活性化した。粗生成物を５ｅｐｈａｄｅｘ■
Ｇ５０カラム（２Ｘ　３０ｃ＋＋＋）上、０．１Ｍリン
酸ナトリウム／　０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ６，０を
用いてクロマトグラフィーに付した。タンパク質分画を
集め、約８ｍ（ｌに濃縮する。
ｂ）髄膜炎菌Ｂタンパク質−（ＡＴ　ＩＩ［３４３〜３
６３）ペプチド−タンパク質接合体の調製 固相ペプチド合成法を用いて製造された構造Ｃｙｓ−Ｌ
ｅｕ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−５ｅ
ｒ−Ｌｙｓ−ＬｅｕＰｒｏ−Ｇ　ｌｙ−１１ｅ−Ｖａ　
１−Ａ　Ｉａ−Ａ　１　ａ−に　Ｉｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ａｒ
ｇ−ＡｓｐＡｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ＡＴ　ｍ　３４３
−３６３）のペプチド４０ｍｇをタンパク質分画（例１
ａ参照）に加え、この混合物を、酸素を排除して１時間
撹拌した。透析、凍結乾燥すると４８ｍｇのペプチド−
タンパク質接合体が生じた。
実施例　２ ａ）　　キーホールリンペットヘモシアニンのマレイミ
ド基による誘導体化 ＫＬＨ４０ｍｇを例１ａと同様にして誘導体化した。
ｂ）　　ＫＬＨ−（ＡＴ　ＩＩＩ　　３４３〜３６３）
の製造ＡＴ　ＩＩ［３４３〜３６３ペプチド４０ｍｇを
例１ｂと同様にして、例２ａで誘導体化したＫＬＨとカ
ップリングさせた。収量４５ｍｇ 実施例　３ 髄膜炎菌Ｂタンパク質−（ＡＴ　Ｉ［［１２９〜１４０
）の製造 Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａ
ｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−３ｅｒＳｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ
（ＡＴ　ｍ　１２９−１４０）で示されるペプチド４０
ｍｇを例１と同様にして「活性化ｊ髄膜炎菌Ｂタンパク
質にカップリングさせた。収量４７ｇ 実施例　４ ＫＬＨ−（ＡＴ　ＩＩＩ　１２（１〜１４０）の製造Ａ
Ｔ　ＩＩＩ　　１２９〜１４０ペプチドを例３と同様に
してＯ− ＧＭＢＳ−誘導体化したＫＬＨにカップリングさせた。
収量４９ｍｇ 実施例　５ 家兎の免疫処置および抗血清の試験 ５羽の家兎を２ｍｇの抗原で８週の期間免疫し、接合体
は皮下または静脈内に投与した。ついで動物を瀉血し、
生成した抗血清をプールして防腐剤で安定化した。
実施例　６ ａ）　　酵素イムノアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）を用いた
抗血清の試験 生成した抗血清の免疫反応をＥＬ　Ｉ　ＳＡ法を用いて
試験した。高度に精製したＡＴ　　Ｉ［［抗原をＴｒｉ
ｓ緩衝液（０，０２５ｍｏｆ２／　Ｑ）で濃度１０μｇ
／ｍＱに希釈し、ポリスチレン試験管に吸着させて固定
化した。
試験すべき抗血清はインキュベーション緩衝液ＣＯ，Ｏ
１ｍｏＩ２／　Ｑ　Ｔｒｉｓ、　０．０５％Ｔｗｅｅｎ
、　ｐＨ７，６）で１＋１に希釈し、各試験管に２００
μρずつ加えて３７０Ｃで３０分間インキュベートした
。次にインキュベーション溶液を除去し、試験管を各回
５００μｇの洗浄溶液（０，０２ｍｏｆ２１０．リン酸
ナトリウム。
０．０５％Ｔｗｅｅｎ、　ｐＨ７，６）で２回洗浄した
。次ニベルオキシダーゼ接合抗−家兎γ−グロブリン抗
体２００μＱを加えて、試験管を３７°Ｃで３０分間イ
ンキュベートした。接合体溶液を除去し２回洗浄したの
ち、基質／色原体溶液（過酸化水素、０フエニレンジア
ミン）を加えて、試験管を１８〜２２°Ｃでインキュベ
ートした。３０分後にペルオキシダーゼを硫酸で不活性
化し、反応溶液の４９２ｎｍにおける吸収を測定した。
実施例１ｂ、２ｂ、３および４に記載したペプチド−タ
ンパク質接合体を用いて得られたすべての抗血清を試験
するためにＥＬ　Ｉ　ＳＡ法を使用した。抗血清はこの
ために種々の希釈度（ｌ：１０’〜１　：　１０’）で
用いた。
抗血清希釈度の関数として４９２ｎｍの吸収を、緩衝液
を含む試験管の吸収とともに以下の表に示す。
特定の希釈段階における吸収の測定値の類似性は、ＫＬ
Ｈおよび髄膜炎菌タンパク質の両者が抗原性を付与する
高分子量タンパク質として等しく適当であることを示し
ている。しかしながら、髄膜炎菌タンパク質接合体によ
って得られた抗血清は二重免疫拡散法において髄膜菌タ
ンパク質とは反応しない（ｂ参照）。
ペプチド接合髄膜炎菌 Ｂタンパク質（ＡＴＩ［［３４３ 〜３６３） ペプチド接合髄膜炎菌 Ｂタンパク質（ＡＴＩ　１２９ 〜１４０） ペプチド接合ＫＬＨ （ＡＴｎＩ３４３〜３６３） ペプチド接合ＩＨ （ＡＴ１１１１２９〜１４０） 緩衝液ブランク 第 １表 ＝１０ ：　１００ ：　１０００ ：　１００００ ：　１０００００ ２、Ｏ １，６８ １，３０ ０，７７ ０，６３ ：ｌＯ ：１００ ：　１０００ ：　１００００ １．２８ ０．８３ ０．２６ ０．０９ ＝ｌＯ ：１００ ：　１０００ ：　１ｏｏｏ。
：　１０００００ ２．０ １．７６ １．３２ ０．７９ ０．７２ ：１０ ：１００ ：　１０００ ：　１００００ １．０３ ０．８４ ０．３４ ０．１４ ０．０３ ｂ）抗血清の二重免疫拡散法による試験実施例６ａに記
載した抗血清について、担体タンパク質との沈降の生成
を、二重免疫拡散法を用いて検討した。
ＫＬＨ−ペプチド接合体によって得られた抗血清は、希
釈度ｌ：１６まで、アガロースゲル中のＫＬＨ抗原によ
り明瞭な沈降線を示した。これに対し、髄膜炎菌タンパ
ク質−ペプチド接合体によって得られた抗血清は髄膜炎
菌Ｂタンパク質と免疫沈降を生じることはなかった。
特許出願人　　ベーリングヴエルケ・アクチェンゲゼル
シャフト 外 名

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）ナイセリアメニンギチジスからの膜タンパク質とペ
    プチドから構成される接合体。 ２）タンパク質は髄膜炎菌タンパク質Ｂ＿２である請求
    項１記載の接合体。 ３）ペプチドは１００個までのアミノ酸から構成されて
    いる請求項１記載の接合体。 ４）ペプチドは抗トロンビンIIIからのペプチドである
    請求項１記載の接合体。 ５）医薬としての請求項１記載の接合体。 ６）ナイセリアメニンギチジスからの膜タンパク質とペ
    プチドから構成される接合体を製造するにあたり、ペプ
    チド化学の方法を用いてタンパク質とペプチドの間の結
    合を生成させる方法。 ７）抗体製造のための請求項１記載の接合体の使用。 ８）医薬または診断補助剤としての、請求項７記載の抗
    体の使用。
JP1315525A 1988-12-07 1989-12-06 合成抗原およびその製造方法 Pending JPH02223599A (ja)

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