JPH02223859A - 生化学分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明は、生化学分析方法に関する。さら詳しくは、
ことに血清、血漿、尿、リンパ液等の多成分を含む生化
学試料中の所定成分を定量するのに有用な分析方法に関
する。

（ロ）従来の技術 従来から上記のごとき生化学試料中の所定成分の分析方
法として、試料液中に１種又は２種以上の所定の反応試
薬を混合して反応させ、反応終了後の該試料液の光学濃
度値（吸光度値、蛍光光度値、散乱光強変値等）に基づ
いて所定成分の濃度を算出する方法が知られている。

そして、具体的な分析方法として、目的成分濃度がゼロ
のブランク液についての反応後の光学濃度値と、分析対
象試料についての反応後の光学濃度値との差から目的成
分を定量する方法がいわゆるエンドポイント法として知
られている。

（ハ）発明が解決しようとする課題 しかし、上記エンドポイント法においては、反応試薬の
状態変化や測定装置系の出力変動等によってブランク液
の光学濃度値自体が変動し易いため、定期的にブランク
液の光学濃度値を測定して定量のベースラインを較正す
る必要があり、煩雑であった。さらにこの方法では、試
料中に共存しうる光学的な干渉成分、例えばビリルビン
、ヘモグロビン、濁り成分等の影響により定量値に大き
な誤差が生じる問題があった。

この点を解消すべく反応開始から所定時間後の反応途中
の光学濃度を測定し、この値と、反応終了後の光学濃度
との差に基づいて定量するいわゆる２ポイント法も知ら
れている。そして、２ポイント法における反応途中の光
学濃度測定時点は、反応終了後の光学濃度との充分な差
を確保して定量精度を向上させるために、反応開始の直
後とされているが、この時点では測定値が不安定である
ため、不測の誤差が生じる場合があった。また、反応が
著しく速い項目についての適用は困難であった。

さらに、２種の反応試薬を用いる場合においては、第１
試薬と試料液を混合しくこの状態では反応は進行しない
）、この光学濃度を測定した後、第２試薬を加え反応を
開始させて反応終了後の光学濃度の測定を行ない、これ
らの差に基づいて定量を行なう方法も、いわゆる検体ブ
ランク法として知られている。しかし、この方法では、
測定に必要な液量を確保するために第１試薬の量を多く
する必要があり、感度が低下すると共に液！ｌｋＭ正を
行なう必要がある等の問題があった。

この発明は、かかる状況下なされたものであり、ブラン
ク液の調製や液量補正等を行なうことなく、簡便かつ正
確に目的成分の定量を行なうことができる生化学分析法
を機供しようとするものである。

（ニ）課題を解決するための手段 かくしてこの発明によれば、試料液に所定の反応試薬を
混合して反応させ、この反応に伴なう該試料液の光学濃
度の変化に基づいて試料液中の所定成分の濃度を測定す
ることからなり、上記反応開始後の光学濃度変動領域に
おける複数の実測光学濃度値とその反応時間との関係か
ら反応時間セと光学濃度値Ｙｔを変数とする回帰式を最
小自乗法で求め、この回帰式に基づいて反応開始時（ｔ
＝０）での推定光学濃度値Ｙｏを求め、次いでこの推定
光学濃度値Ｙｏと反応終了後の実測光学濃度値Ｙ９との
差に基づいて上記試料液中の所定成分を定量することを
特徴とする生化学分析方法が提供される。

この発明においては、まず光学濃度変動領域の複数の実
測光学濃度値とその反応時間との関係から回帰式が最小
自乗法で求められ、得られた回帰式から反応開始時、す
なわち反応時間１＝０での光学濃度が算出される。ここ
で反応開始時とは、２試料系の反応試薬を用いる場合に
は、第２反応試薬添加時を１試薬系の反応試薬を用いる
場合には、その反応試薬添加時をいう。

回帰式は、−次回帰でもよく二次、三次等の多次元回帰
でもよく、各々の目的成分についての反応途中の光学濃
度変動領域のプロフィールに最も近似したものが適して
いる。通常の生化学分析項目については二次回帰式（Ｙ
＝ａ　ｔ’＋ｂ　ｔ＋ｃ）又は三次回帰式（Ｙ＝ａｔ’
＋ｂｔ’＋ｃｔ＋ｄ）を用いるのが適している。

上記回帰式を決定するための複数の測定点（ｔ、ｙｔ）
は、反応開始後から反応終了後の間の変動領域の任意の
点に設定でき、そのサンプル数はできるだけ多くするの
が好ましい。ただし、反応終了直前は実際は変曲点が存
在しうるため、測定点とするのは適さない。従って、測
定点は、通常反応開始直後から、反応終了時の光学濃度
一定割合、例えば９０％の光学濃度に到達した時点との
間で複数設定するのが適している。

このようにして得られた１＝０での推定光学濃度値Ｙｏ
と反応終了後の光学濃度値Ｙ８との差値に、所定の換算
値を乗算するか、予め作成した検量線と比較対照するこ
とにより、目的成分の濃度が算出されることとなる。

（ホ）作用 この発明においては、反応途中の光学濃度の変化に基づ
く光学濃度変動領域の回帰式により反応開始時の推定光
学濃度Ｙｏが求められ、この光学濃度Ｙ。と反応終了後
の光学濃度Ｙｓとの値を用いてあたかも１＝０の時点で
の光学濃度を用いた２ポイント法のようにして目的成分
か定量される。

そして、ｔ＝０の時点での光学濃度は実測されたもので
はなく、多点の実測値から回帰して得られたものである
ため従来の反応初期の実測光学濃度を用いる２ポイント
法に比して反応初期の変動等による測定値への悪影響が
回避又は減少されることとなると同時に反応が速い場合
にも感度低下を回避することができる。

（へ）実施例 第１図は、この発明の方法の実施に用いる生化学自動分
析装置の一例の構成説明図である。第１図においてｌは
試料分注ポンプ、２は試料分注ノズル、３は試料分注ノ
ズル移動機構、４．５はそれぞれ標準試料容器および標
準試料、６は試料用ターンテーブル、７．８はそれぞれ
試料容器および試料、９は反応ディスク、ｉｏ、（ｔｏ
”、ｔｏ″）は反応セル、１１は第１試薬分注ポンプ、
１２は第１試薬分注ノズル、１３は第１試薬分注ノズル
移動機構、１４は試薬庫、１５．１６はそれぞれ第１試
薬１６および第１試薬、！７は分光器、１８は分光器移
動機構、１９は制御およびデータ処理コンピュータ、２
０は第２試薬分注ポンプ、２■は第２試薬分注ノズル、
２２は第２試薬分注ノズル移動機構、２３．２４はそれ
ぞれ第２試薬容器および第２試薬、２５は洗浄ポンプ、
２６は洗浄ノズル上下機構、２７は洗浄ノズルである。

かかる装置において、試料分注ポンプｌと連結されてい
る試料分注ノズル２か試料分注ノズル移動機構３によっ
て移動し、標準試料容器４から一定量の標準試料５を吸
引し、続いて試料用ターンテーブル６にセットされた試
料容器７から一定量の試料８を吸引し、反応ディスク９
に配置されている反応セル１０の中に試料８および標準
試料５を分注する。反応ディスク９が回転して反応セル
ｌＯが１ステップ進んだところで、第１試薬分注ポンプ
１１と連結されている第１試薬分注ノズル１２が第１試
薬分注ノズル移動機構１３によって移動し、試薬庫１４
内にセットされている第１試薬容器１５から一定量の第
１試薬１６を吸引し、続いて反応セルｌＯ′のところに
移動して反応セルｌＯ′内に分注する。このとき、−試
薬系の反応試薬を用いる項目の反応セルについて、分光
器１７が分光器移動機ｌ１１Ｂにより反応ディスク９と
同じ袖の回りに往復回転しながら、吸光度（Ｙｔ）を順
次経時的に測定しながら制御およびデータ処理コンピュ
ータ１９に記憶する。

次いで反応セル１０が反応セル１０″の位置にきたとこ
ろで第２試薬分注ポンプ２０と連結した第２試薬分注ノ
ズル２１が第２試薬分注ノズル移動機構２２に上がって
移動し、試薬庫１４内にセットされている第２試薬容器
２３から一定量の第２試薬２４を吸引し、続いて反応セ
ルｌＯ″のところに移動して２試薬系の反応試薬を用い
る項目の反応セルｌＯ″内に分注する。第２試薬添加後
に反応セル１０″が洗浄ポンプ２５に連結され、洗浄ノ
ズル上下機構２６により上下する洗浄ノズル２７の位置
に進むまでの間も前記のごとき各位置での吸光度Ｙｔが
測定されコンピュータ１９に記憶されている。そして、
制御およびデータ処理コンピュータ！９は、各部の動作
を同期制御すると同時に、！試薬系の項目については第
１試薬分注後（反応開始後）からの吸光度データＹｔの
時間変化に基づいて、２試薬系の項目については第２試
薬分注後（反応開始後）の吸光度データＹｔの時間変化
に基づいて、その吸光度の変動領域の回帰式を求めかつ
これに基づいて１＝０での推定吸光度値Ｙｏを算出し、
次いでこのＹｏと反応終了後の定常状態（エンドポイン
ト）での吸光度値Ｙｓとの差に基づいて各々所定成分に
ついての濃度を算出する。

この測定原理を第２図に示した。すなわち、第１試薬系
、第２試薬系のいずれについても、吸光度変動領域Ａ内
の多数の測定値即ち、反応開始直後の測定値αからβの
測定群について最小自乗法によって二次回帰式（Ｙ＝ａ
ｔ”＋ｂｔ＋ｃ）（図中の実線Ｌ）を求め、この式から
ｔ＝０（反応開始時）の際の値Ｙ。を求める。そして、
反応終了後の吸光度定常領域Ｂの吸光度ＹｓからこのＹ
ｏ（推定吸光度）を減算し、この減算値に所定の換算係
数ｆを乗算することにより濃度算出を行なう。

以下、実際に実施した際のデータについて説明する。

尿酸の測定 尿酸含有試料（８，０１９／１２）にヘモグロビンの希
釈系列を添加し、ヘモグロビンの最終１度がｏ、ｔｏｏ
。

２００．３００，４００．５００ｘ９／ｄ１２になるよ
うに調製し前記生化学分析装置を用いて測定した。

反応試薬としては、２試薬系の尿酸反応試薬（ヤトロン
（株）製）を用い試料１０μＱと第１試薬２００μｅを
混合後、第２試薬２００μＱを添加して反応を開始した
。また測定周期は第２試薬添加の２０秒後、３８秒後に
行い、続いて２４秒間隔で１４回（合計１６周期）とし
た。得られた吸光度と時間との関係で最小自乗法で一次
回帰式（’／＝ａ　ｔ＋ｂ）を求め、これから各々１＝
０における吸光度値（ｂ）を求めた。また試薬の代わり
に水を用いて検体ブランクを測定した。これらの結果は
下表の通りであった。

このように干渉成分の物理的（光学的）な影響を補償で
きることが分かる。

（以下余白） 上記各々の吸光度値（ｂ）と各々の反応終了後の吸光度
値との差を求め、これに各々濃度換算定数を乗算するこ
とにより、尿酸濃度が算出された。

従来のエンドポイント法による測定と本法による測定の
結果を以下に示す。

このように干渉成分のヘモグロビンの化学的（反応に及
ぼす）影響を正しく測定することができると考えられる
。

アポ蛋白の測定 アポＢを１３０ｉ９／ｄｆ２含有する試料に、前記尿酸
測定手法と同様にヘモグロビンの希釈系列を添加し、ヘ
モグロビンの濃度が０．１００．２００，３００，４０
０，５００朽／ｄＱになるように調製したものを測定し
た。反応試薬としては、２試薬系のアポＢ反応試薬（第
１化学薬品（味）製）を用い、試料２０μＱと第１試薬
３５０μＱを混合後、第２試薬５０μＱを添加して、反
応を開始した。

得られた吸光度と時間との関係で最小自乗法によって二
次回帰式（Ｙ＝ａ、ｔ”＋ｂ　ｊ＋ｃ）を求め、これか
ら各々ｔ＝０における吸光度値（ｃ）と求め、この吸光
度値（ｃ）と各々の反応終了後の吸光度値との差を求め
濃度換算定数を乗算することにより、アポＢＱ濃度が算
出された。従来の検体ブランク法と本法による測定結果
は以下の通りであった。

この場合、さらに本法に採用により試薬ブランク測定を
省略できるので、高価な試薬の節約が可能である。

（ト）発明の効果 この発明によれば、ブランク液の調製や液量補正等を行
なうことなく、簡便かつ正確に目的成分の定量を行なう
ことができる。そして従来のエンドポイント法や２ポイ
ント法のような干渉成分や反応の不安定性による測定値
への悪影響も防止又は低減化することができろ。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の生化学分析方法を実施する装置を
例示する構成説明図、第２図は、この発明の方法の原理
説明図、 第３図は同じ〈実施例で 得られた吸光度と時間の関係を示すグラフ図である。 反応開始 第２図 経過時間（ｔ）□

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料液に所定の反応試薬を混合して反応させ、この
   反応に伴なう該試料液の光学濃度の変化に基づいて試料
   液中の所定成分の濃度を測定することからなり、 上記反応開始後の光学濃度変動領域における複数の実測
   光学濃度値とその反応時間との関係から反応時間をと光
   学濃度値Ｙ＿ｔを変数とする回帰式を最小自乗法で求め
   、この回帰式に基づいて反応開始時（ｔ＝０）での推定
   光学濃度値Ｙ＿ｏを求め、次いでこの推定光学濃度値Ｙ
   ＿ｏと反応終了後の実測光学濃度値Ｙ＿ｓとの差に基づ
   いて上記試料液中の所定成分を定量することを特徴とす
   る生化学分析方法。